檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒的可視化基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒的可視化基因芯片 以及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 多病原混合感染是當(dāng)前豬場(chǎng)疫病的普遍現(xiàn)象，豬瘟、豬流行性乙型腦炎這兩種豬 病毒引起的疾病癥狀相似且常常呈混合感染，是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的兩種重要病毒性疾病， 因此早期鑒別診斷并及時(shí)了解流行狀況對(duì)控制這兩種病的流行顯得尤其重要。目前對(duì)這兩 種病的診斷多采用病原的分離及常規(guī)的血清學(xué)方法，但需時(shí)間較長(zhǎng)。最近國(guó)外和國(guó)內(nèi)均建 立了病原的分離鑒定、免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、血清中和實(shí)驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng) 等，但是還不能更加快速的檢測(cè)多種病原的混合感染。
[0003] 基因芯片技術(shù)是近年來(lái)新興起的一種生物高新技術(shù)，該技術(shù)可以同時(shí)定量或定性 的檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因信息，具有無(wú)選擇性、客觀、高通量的特點(diǎn)?；蛐酒?jì)劃開(kāi)展后， 許多部門、大學(xué)、重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及制藥公司參與了該項(xiàng)目的研發(fā)，我國(guó)相繼也成立了一大批 基因芯片公司。隨著基因組數(shù)據(jù)的增長(zhǎng)以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，基因芯片技 術(shù)得到迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用。但生物芯片技術(shù)發(fā)展時(shí)間較短，很多技術(shù)還處于初級(jí)研發(fā)階 段，要成為實(shí)驗(yàn)室研究或臨床可以普遍采用的技術(shù)仍有諸多關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決。（1)基因芯 片的特異性的提高；（2)增加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度；(3)簡(jiǎn)化樣品制備和標(biāo)記操作；(4)設(shè)備 與操作人員的要求較高；（5)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)豬流行性 乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒的可視化基因芯片和試劑盒。
[0006] 本發(fā)明檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒的可視化基因芯片，其特征在 于：它包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；
[0007] 所述探針包括SEQ ID NO : 1所示寡核苷酸片段和/或SEQ ID NO :2所示寡核苷酸 片段，用于檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒；
[0008] 所述基因芯片按照如下方法制備：
[0009] (1)制備探針溶液：取探針，用稀釋至200ng/ul，得探針溶液；
[0010] ⑵采用微噴頭噴點(diǎn)方式，在壓力為IOKPa的情況下，將探針溶液點(diǎn)樣于氨基玻片 上，重復(fù)兩次，即可。
[0011] 微噴頭噴點(diǎn)方式：通過(guò)微噴頭將樣品點(diǎn)到基片上的方式。
[0012] 其中，它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID NO :3所示的基因片段。
[0013] 本發(fā)明檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒的試劑盒，它包括前述的可視 化基因芯片、擴(kuò)增試劑以及顯色試劑；
[0014] 其中，擴(kuò)增試劑包括SEQ ID NO :4~5和/或6~7所示引物對(duì)，用于分別擴(kuò)增豬 流行性乙型腦炎病毒和/或豬瘟病毒；
[0015] 顯色試劑包括金標(biāo)鏈霉親和素以及銀染試劑。
[0016] 其中，所述擴(kuò)增試劑還包括SEQ ID NO :8~9所示引物對(duì)。
[0017] 所述金標(biāo)鏈霉親和素是Nanogold-Streptavidin稀釋10~40倍后的溶液。優(yōu)選 地，所述金標(biāo)鏈霉親和素的是Nanogold-Streptavidin稀釋40倍后的溶液。
[0018] 本發(fā)明特定方法制備的可視化基因芯片能夠準(zhǔn)確檢測(cè)豬流行性乙型腦炎病毒、豬 瘟病毒，可以用肉眼直觀地看到檢測(cè)結(jié)果，不需要價(jià)格昂貴的激光共聚掃描儀，成本低廉， 同時(shí)，靈敏度較高，與現(xiàn)有熒光標(biāo)記方法的靈敏度相當(dāng)，特異性強(qiáng)，耗時(shí)短，檢測(cè)快速，臨床 應(yīng)用前景良好。
[0019] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1點(diǎn)樣儀的位置標(biāo)定
[0021] 圖2點(diǎn)樣儀的噴樣參數(shù)
[0022] 圖3因芯片陣列點(diǎn)樣模式圖
[0023] 圖4圖2-4基因芯片點(diǎn)制的基本參數(shù)設(shè)置。A:玻片設(shè)置B:點(diǎn)陣設(shè)置C:陣列設(shè)置 D:清洗設(shè)置E:樣品設(shè)置
[0024] 圖5質(zhì)粒菌的復(fù)蘇與鑒定結(jié)果。M: IOObp DNA Ladder ;1 :JEV基因；2 :PS8基因。 M:100bp DNA Ladder ；1 ： ADNA
[0025] 圖6基因芯片的有效性檢測(cè)結(jié)果。A :陽(yáng)性質(zhì)控單獨(dú)雜交結(jié)果；B :全部探針雜交結(jié) 果
[0026] 圖7基因芯片的特異性檢測(cè)結(jié)果。A:乙腦病毒質(zhì)粒雜交結(jié)果；B:豬瘟病毒質(zhì)粒雜 交結(jié)果
[0027] 圖8基因芯片靈敏性檢測(cè)結(jié)果
[0028] 圖9基因芯片的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
[0029] 圖10點(diǎn)樣緩沖液的選擇結(jié)果。A:無(wú)菌超純水；B:3XSSC ;C:博奧點(diǎn)樣緩沖液
[0030] 圖11點(diǎn)樣次數(shù)的優(yōu)化結(jié)果
[0031] 圖12基因芯片雜交溫度的優(yōu)化結(jié)果
[0032] 圖13雜交時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果
[0033] 圖14 Nanogold-Streptavidin稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0034] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0035] I. 1生物材料
[0036] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)毒株、豬瘟病毒（CSFV)毒株和豬流行性乙型腦 炎病毒（JEV)毒株，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。
[0037] 1. 2主要試劑
[0038] 氨基基片：Bak藤氨基載玻片，購(gòu)自上海百傲生物科技股份有限公司；點(diǎn)樣緩沖液： Baio?點(diǎn)樣緩沖液，購(gòu)自上海百傲生物科技股份有限公司，晶芯芯片點(diǎn)樣液，購(gòu)自北京博 奧生物有限公司；雜交緩沖液：雜交緩沖液，購(gòu)自上海百傲生物科技股份有限公司； 銀染試劑：Silver buffer A，Silver buffer B，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；金標(biāo)鏈霉親和素： Nanogold-Streptavidin，購(gòu)自美國(guó)Nanogold公司；陽(yáng)性質(zhì)控（ADNA)為寶生物工程（大 連）有限公司產(chǎn)品；小量質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。
[0039] 1. 3主要儀器設(shè)備
[0040] 空氣恒溫?fù)u床，美國(guó)Thermo公司；AllegraTM64R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公 司；POWER PacTM電泳儀及水平電泳槽，美國(guó)BIO-RAD公司；UNIVERSAL H00D凝膠成像系統(tǒng)， 美國(guó) BIO-RAD 公司；MyCyclerTMPCR 儀，美國(guó) BIO-RAD 公司；SmartSpecTMPlus 核酸蛋白儀， 美國(guó)BIO-RAD公司；超純水儀，Milli Qplus，法國(guó)產(chǎn)；梯度PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司；分 子雜交儀，美國(guó)Thermo公司；晶芯? SmartArrayer? 16,微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)：Capitalbio Corporation，北京博奧生物公司；eS:芯:?LuxScan? IOK微陣列芯片掃描儀：Capitalbio Corporation，北京博奧生物有限公司；多樣品圍欄、多樣品圍欄粘貼工具、多樣品圍欄蓋 片，芯片雜交盒均為北京博奧生物有限公司。
[0041] 實(shí)施例1本發(fā)明可視化基因芯片的制備及用其檢測(cè)的方法
[0042] 1、材料和儀器
[0043] 同前述實(shí)驗(yàn)材料和儀器。
[0044] 2本發(fā)明基因芯片的制備及性能檢測(cè)
[0045] 2.1引物與探針的制備
[0046] 本研究將固定到氨基基片上的病毒特異DNA片段稱作探針，而用生物素標(biāo)記的待 檢樣品稱為革G基因。
[0047] 2. Ll引物的合成
[0048]引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中反向引物合成兩條，一條無(wú)標(biāo)記，一 條5'端用生物素 Biotin標(biāo)記修飾。
[0049] 表1靶基因擴(kuò)增引物
[0051] 表2定位基因引物
[0063] 制備好的探針