專利名稱：：一種聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物試劑，具體涉及檢測(cè)臨床樣品中乙型腦炎的病毒(JEV)，登革病毒(DEV)及西尼羅病毒(WNV)存在的方法及試劑盒。特別涉及一種聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：黃病毒科中多種病毒能引起人類和動(dòng)物的嚴(yán)重疾病，特別是腦炎和出血熱，有較高的死亡率。該類病毒感染的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，常常被誤診或冠以"無(wú)名熱"。目前常見(jiàn)的黃病毒感染為登革熱和乙型腦炎，可能還會(huì)有新的黃病毒出現(xiàn)，如西尼羅病毒目前在全球范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)繼續(xù)擴(kuò)散的趨勢(shì)，帶來(lái)突發(fā)傳染病的嚴(yán)重威脅，可預(yù)見(jiàn)的后果非常嚴(yán)重。因此有必要進(jìn)行完善的技術(shù)儲(chǔ)備，加強(qiáng)突發(fā)傳染病病原體來(lái)源追蹤和早期快速偵檢研究對(duì)及時(shí)控制急性傳染病疫情和生物災(zāi)難意義重大，但目前對(duì)于這些疾病的早期快速診斷尚無(wú)完善的方法。1.流行性乙型腦炎(乙腦)病毒又稱日本腦炎病毒(Japaneseenc印halitisvirus,JEV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)，有包膜的單正鏈RNA病毒，三帶喙庫(kù)蚊為主要傳播媒介，主要在亞洲流行，可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，致死率高達(dá)30%左右；另有50%的患者會(huì)留下永久性的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞洲每年乙腦發(fā)病人數(shù)達(dá)16000例左右，死亡5000例左右，中國(guó)除新疆、西藏、青海外，其它各省均有發(fā)病與流行，腦炎發(fā)病數(shù)占世界總發(fā)病數(shù)的80%以上，是危害人民生命及畜牧業(yè)的最重要的蟲媒病毒之一，近年澳大利亞本土和美國(guó)的關(guān)島地區(qū)也出現(xiàn)乙腦病例，說(shuō)明該病的流行區(qū)域在不斷擴(kuò)大，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和診斷是十分重要的。乙型腦炎病例的診斷主要依靠流行病學(xué)、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢査三方面證據(jù)。實(shí)驗(yàn)室檢査主要有血清學(xué)診斷、分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法，然而，主要針對(duì)抗體的血清學(xué)診斷方法不能在疾病早期提供有力的診斷證據(jù)。不利于病人的早期診斷和治療。病毒分離培養(yǎng)方法耗時(shí)、費(fèi)力，檢出率低。RT—PCR方法雖然靈敏并能在早期對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，但是因其歩驟繁瑣且容易造成污染，從而使用受到限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)雖然具有特異性和精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。但由于實(shí)驗(yàn)成本高，使用儀器精良而不宜在基層7和現(xiàn)場(chǎng)使用。2.登革病毒(denguevirus,DV)屬黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)，根據(jù)抗原性不同，可將登革病毒分為l、2、3、4四個(gè)血清型。登革病毒感染(denguevirusinfect,DVI)可引起登革熱(denguefever,DF)和登革出血熱(denguehemorrhagefever,DHF)，后者死亡率較高。登革熱是一種熱帶傳染?。恢饕砂＜耙廖煤桶准y伊蚊為傳播媒介，其傳染性僅次于艾滋病和非典。近年來(lái)，登革熱廣泛流行于100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，特別是東南亞一帶的流行甚為嚴(yán)重。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年約有O.81億例DVI，50萬(wàn)例DHF，2.5力人死l!:，t5億人受到威脅。由于登革熱臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、傳播迅速、發(fā)病率高、人群易感染，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量和身體健康。由于登革熱沒(méi)有特異性的治療方法，也沒(méi)有有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防，因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)登革熱疫情、阻止或減少本地登革熱疫情傳播就變得尤為重要。研究快速檢測(cè)方法在登革熱的預(yù)防和控制中具有重要意義。目前，登革病毒感染的診斷，主要依靠病毒分離和血清學(xué)檢測(cè)。但病毒分離法費(fèi)時(shí)繁瑣、至少需1周時(shí)間才能出結(jié)果，達(dá)不到早期快速診斷的目的。血清學(xué)診斷因與其他黃病毒存在廣泛的交叉反應(yīng)而受到干擾。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，以及技術(shù)服務(wù)市場(chǎng)化，對(duì)登革病毒感染的診斷，己經(jīng)從傳統(tǒng)的病毒分離、血清學(xué)檢査，進(jìn)入到對(duì)病毒RNA進(jìn)行分子檢測(cè)的新階段，為登革熱早期診斷和流行監(jiān)測(cè)提供了有效手段，如RT-PCR，nested—PCR，Real—timePCR，TaqMan探針，基因芯片等，但這些技術(shù)方法可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，并由于檢測(cè)煩瑣，成本高，實(shí)驗(yàn)室及儀器設(shè)備要求精良等，不適宜在基層和現(xiàn)場(chǎng)使用。3.西尼羅病毒(WestNilevirus,WNV)屬黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)，為西尼羅病毒病病原體。西尼羅病毒是以鳥類為主要宿主，經(jīng)庫(kù)蚊等嗜鳥蚊傳播的蟲媒病毒，可引起人和馬的西尼羅腦炎。該病毒廣泛分布于非洲、中東、歐亞大陸及澳大利亞，近期又傳人北美。特別是在美國(guó)，自1999年發(fā)現(xiàn)首例患者以來(lái)，西尼羅腦炎己連續(xù)流行5個(gè)季節(jié)，發(fā)病人數(shù)逐年攀升。西尼羅病毒病目前在全球范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)繼續(xù)擴(kuò)散的趨勢(shì)，加拿大和歐洲一些國(guó)家相繼出現(xiàn)了人感染而死于西尼羅腦炎的報(bào)道。西尼羅病毒病的危害已迫使各有關(guān)國(guó)家加大了對(duì)其研究的力度。因此開展WNV相關(guān)研究，建立WNV快速檢測(cè)方法，對(duì)于WNV控制流行意義重大。目前，己初步建立了一系列針對(duì)WNV的檢測(cè)方法，PCR、TaqManRT—PCR、NASBA(Nucleicacidsequence—basedamplification)、SYBRGreenRT—PCR等核酸檢測(cè)以及病毒分離、血清學(xué)分析等，核酸檢測(cè)、活病毒分離培養(yǎng)等方法較成熟，但這些方法耗時(shí)較長(zhǎng),.不能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行快速檢測(cè)和大范圍篩査，使wnv的早期監(jiān)測(cè)受到了影響。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop—mediatedIsothermalamplification,LAMP)技術(shù)是近年來(lái)建立的一種快速檢測(cè)方法。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速且成本低等優(yōu)點(diǎn)，其原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)部位設(shè)定3對(duì)引物，利用鏈置換反應(yīng)在恒溫下使靶基因高效擴(kuò)增((圖l，圖2)。最終產(chǎn)物形成不同柄一環(huán)結(jié)構(gòu)的DNAs和不同分子量的如菜花樣的多環(huán)產(chǎn)物(電泳結(jié)果如圖3)。擴(kuò)增效率較PCR大大提高(目的基因每半個(gè)循環(huán)被放大3倍)，可以擴(kuò)增幾個(gè)拷貝數(shù)的目的基因，檢測(cè)的靈敏度是常規(guī)PCR的10—100倍(圖4)。由于其反應(yīng)是多種引物共同啟動(dòng)，使得反應(yīng)結(jié)果比pcr更特異，另外，由于實(shí)行的是等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)在恒溫水浴箱內(nèi)便可完成，不僅節(jié)約儀器成本，而且操作方法更簡(jiǎn)單，適于基層單位及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，利用lamp反應(yīng)原理研究設(shè)計(jì)快速，特異，靈敏，簡(jiǎn)便的相關(guān)黃熱病毒的檢測(cè)方法及所使用的試劑盒。本發(fā)明提供了一種聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒。本發(fā)明試劑盒由主反應(yīng)液和特異性引物組成(1)主反應(yīng)液的組成10X等溫反應(yīng)緩沖液(Buffer)、濃度為5U/y1的禽類成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、濃度為40U/ul的核酸酶抑制劑(Rnasin))、濃度為8U/ul的BstDNA聚合酶、濃度為10mM的dNTP、濃度為100mM的硫酸鎂(MgS04)、和濃度為5M的酣菜堿(betaine)和1.25ul焦碳酸二乙脂(DEPC)處理水，總體積量為16ul。其中IOX等溫反應(yīng)緩沖液含有濃度為200mM、pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(200mMTris-HCl，pH8.8)、濃度為100mM的氯化鉀(100mMKC1)、濃度為lOOmM硫酸按(100mM(NH4)2S04)、濃度為20mM的硫酸鎂(20mMMgS04)和濃度為1X的曲拉通X—100(1%TritonX—100)。(2)特異性引物特異性引物l，特異性引物2，特異性引物3。每組特異性引物都共有3對(duì)引物，它們分別為內(nèi)引物l(Forwardinternalprimer，F(xiàn)IP)禾口內(nèi)弓i物2(Backwardinternalprimer,BIP);夕卜弓l物1(Forwardouterprimer,F3)禾口夕卜弓l斗勿2(Backwardouterprimer，B3);環(huán)弓I4勿1(Forwardloopprimer,FLP)和環(huán)引物2(Backwardloopprimer,BLP)特異性引物1為特異性擴(kuò)增乙腦病毒引物(PJEV);特異性引物2為特異性擴(kuò)增登革病毒引物(PDV)，包括特異性擴(kuò)增i型登革病毒引物(pdvi)'n型登革病毒引物(rav2)，m型登革病毒引物(pdv3)，iv特異性引物3為特異性擴(kuò)增引物西尼羅病毒引物(PWNV)。所述各引物濃度及序列分別如下1)特異性引物l(乙腦病毒特異引物PJEV):包括20yM乙腦病毒內(nèi)引物1(PJEVFIP)，20yM乙腦病毒內(nèi)引物2(PJEVBIP)，10uM乙腦病毒外引物1(PJEVF3)，10uM乙腦病毒外引物2(PJEVB3),20uM乙腦病毒環(huán)引物1(PJEVFLP)，20uM乙腦病毒環(huán)引物2(PJEVBLP)總體積量為7ul。PJEV包括PJEVFIP:GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGTTTTGCCACTTGGGTGGACTTGPJEVBIP:AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTTTTTCGTCGAGATGTCAGTGACTGPJEVF3:GGAATGGGCAATCGTGACTPJEVB3:CGTTGTGAGCTTCTCCAGTPJEVFLP:TCGTTTGCCATGATTGTCPJEVBLP:GAAGTTACTGCTATCATGCT2)特異性引物2(登革病毒特異引物PDV):包括I型登革病毒引物(PDV1),n型登革病毒引物(PDV2),III型登革病毒引物(PDV3)，IV型登革病毒引物(PDV4)。I型登革病毒引物PDVl包括20uMI型登革病毒內(nèi)引物1(PDV1FIP)，20pMI型登革病毒內(nèi)引物2(PDV1BIP)，10uMI型登革病毒外引物KPDV1F3)，10uMI型登革病毒外引物2(PDV1B3),20yMI型登革病毒環(huán)引物1(PDV1FLP)和20yMI型登革病毒環(huán)引物2(PDV1BLP)，總體積量為7ul。II型登革病毒引物PDV2包括20yMII型登革病毒內(nèi)引物1(PDV2FIP),20uMH型登革病毒內(nèi)引物2(PDV2BIP),10uMII型登革病毒外引物KPDV2F3)，10uMU型登革病毒外引物2(PDV2B3),20uMII型登革病毒環(huán)引物1(PDV2FLP)和20uMII型登革病毒環(huán)引物2(PDV2BLP)，總體積量為7ti1。III型登革病毒引物PDV3包括20uMIII型登革病毒內(nèi)引物1(PDV3FIP),20uMm型登革病毒內(nèi)引物2(PDV3BIP)，lOiiMIII型登革病毒外引物1(PDV3F3)，10uMm型登革病毒外引物2(PDV3B3),20uMIII型登革病毒環(huán)引物1(PDV3FLP)和20uMIII型登革病毒環(huán)引物2(PDV3BLP)，總體積量為7ul。IV型登革病毒引物PDV4包括20uMIV型登革病毒內(nèi)引物1(PDV4FIP)，20uMIV型登革病毒內(nèi)引物2(PDV4BIP),10uMIV型登革病毒外引物1(PDV4F3)，10uMIV型登革病毒外引物2(PDV4B3)，20iiMIV型登革病毒環(huán)引物1(PDV4FLP)和20uMIV型登革病毒環(huán)引物2(PDV4BLP),總體積量為7ul。PDV1包括PDV1FIP:GCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGCPDV1BIP:CCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGGPDV1FLP:CTCCTCTAACCACTAGTCPDV1BLP:GGTGGTAAGGACTAGAGGPDV1F3:GAGGCTGCAAACCATGGAAPDV1B3;CAGCAGGATCTCTGGTCTCTPDV2包括P頻FIP:TTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGGPDV2BIP:GGTTAGAGGAGACCCC(XCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGGPDV2FLP:GATCTGTAAGGGAGGGGPDV2BLP:(;CATATTGACGCTGGGAPDV2F3:TGGAAGCTGTACGCATGGPDV2B3:GTGCCTGGAATGATGCTGPDV3包括PDV3FIP:TGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTGTOV3BIP:CTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGCPDV3FLP:CCTTGGACGGGGCTPDV3BLP:GGAGGCTGCAAACCGTGPDV3F3:GCCACCTTAAGCCACAGTAPDV3B3:GTTGTGTCATGGGAGGGPDV4包括PDV4FIP:TGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACCPDV4BIP:GGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCGPDV機(jī)P:GGCGGAGCTACAGGCAGPDV4BLP:TCACCAACAAAACGCAGPDV4F3:CTATTGAAGTCAGGCCACPDV4B3:ACCTCTAGTCCTTCCACC3)特異性引物3(西尼羅病毒特異引物PWNV):包括20uM西尼羅病毒內(nèi)引物l(PWNVFIP)，20uM西尼羅病毒內(nèi)引物2(PWNVBIP)，10uM西尼羅病毒外引物l(PWNVF3)，10uM西尼羅病毒外引物2(P麗VB3),20wM西尼羅病毒環(huán)引物l(PWNVFLP)，20uM西尼羅病毒環(huán)引物2(PWNVBLP)。總體積量為7ul。PWNV包括PWNVFIPTTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGTPW鵬IPTGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCGPWNVFLPCATCGATGGTAGGCTTGTC剛VBLPTCTCCACCAAAGCTGCGTPWNVF3TGGATTTGGTTCTCGAAGGPW畫3GGTCAGCACGTTTGTCATT其中，主反應(yīng)液最佳組成是2.5ul10XBuffer,l.OplAMV(5U/u1)，0.25y1Rnasin(40U/yl)，2.0iilBstDNA聚合酶(8U/u1),3.5y110mMdNTP，1.5ul100mM的MgS04，4.0u15M的betaine和1.25ulDEPC處理水?？傮w積量為16yl。特異性引物的最佳組成包括特異性引物1(乙腦病毒特異引物PJEV)最佳組成為2!il20uM內(nèi)引物PJEVFIP，120yM內(nèi)引物PJEVBIP，O.5y110uM外引物PJEVF3，0.5lU10yM外引物PJEVB3,l.Ou120"M環(huán)引物PJEVFLP和l.Oy120yM環(huán)引物PJEVBLP?？傮w積量為7u1。特異性引物2L登革病毒特異引物PDV)最佳組成為包括I型登革病毒引物PDV1最佳組成為2ul20uM內(nèi)引物PDV1FIP,2ul20uM內(nèi)引物PDV1BIP，0.5ul10uM外引物PDV1F3，0.5u110yM外引物PDV1B3'l.Ou120uM環(huán)引物PDVlFLP和l.Ou120uM環(huán)引物PDV1BLP?？傮w積量為7ii1。II型登革病毒引物PDV2最佳組成為2ul20uM內(nèi)引物PDV2FIP,2ul20yM內(nèi)引物PDV2BIP，0.5yl10uM外引物PDV2F3，0.5yl10uM外引物PDV2B3，1.On120uM環(huán)引物PDV2FLP和1.On120uM環(huán)引物PDV2BLP。總體積量為7ul。III型登革病毒引物PDV3最佳組成為2ul20uM內(nèi)引物PDV3FIP,2ul20uM內(nèi)引物PDV3BIP，0.5ul10uM外引物PDV3F3，0.5u110"M外引物PDV3B3'l.Oy120yM環(huán)引物PDV3FLP和l.Ou120uM環(huán)引物PDV3BLP。總體積量為7lU。IV型登革病毒引物PDV4最佳組成為2u120uM內(nèi)引物PDV4FIP，120wM內(nèi)引物PDV4BIP，0.5ul10uM外引物PDV4F3，0.5u110uM外引物PDV4B3，1.0u120uM環(huán)引物PDV4FLP和1.0u120uM環(huán)弓|物PDV4BLP?？傮w積量為7y1。特異性引物3(西尼羅病毒特異引物PWNV)最佳組成為2ul20UM內(nèi)引物PWNVFIP，2u120yM內(nèi)引物PWNVBIP，0.5U110uM外引物PWNVF3，0.5nl10nM外引物P聰VB3，l.Ou120uM環(huán)引物PWNVFLP禾卩l(xiāng).Ou120yM環(huán)引物PWNVBLP?？傮w積量為7ul。本發(fā)明提供了聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒的檢測(cè)方法與結(jié)果判定具體步驟如下(一)樣品中RNA的提取1)病人血清樣本及細(xì)胞培養(yǎng)上清和鼠腦脊液中提取RNA:在裝有250ul細(xì)胞培養(yǎng)上清液的1.5ralE卯endorf管中加入750ulTRIzol*LSReagen(invitrogen)漩渦混合器混勻；在該Eppendorf管中加入200yl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-15min，4°C12000r/min離心15min;小心取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500ul異丙醇，漩渦混合器混勻，室溫靜置10min;4'C12000r/min離心10min,棄上清，保留管底白色RNA沉淀；以DEPC處理的去離子水配置的75%乙醇lml洗滌所得RNA沉淀，4°C7500r/min離心5min，棄上清，室溫靜置5-10min，使乙醇揮發(fā)；用20y1Nudease-FreeWater溶解RNA沉淀，保存?zhèn)溆?)組織樣品中提取RNA:取一70'C冷凍的樣品組織標(biāo)本室溫下加入TRIzorReagen(invitrogen)，在研缽中研磨(100mg組織樣品加2mlTRIzo1，研缽使用前要用DEPC水處理)，勻漿加入1.5mlEppendorf管中，室溫放置5min，加入200uI/mlTRIzo氯仿，用力振蕩3-5min，室溫靜置15min，4°C12000r/min離心15min;取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500u1/mlTRIzo異丙醇，漩渦混合器混勻，室溫靜置10min;4°C12000r/min離心IOmin，棄上清，白色RNA沉淀于管底；以DEPC處理的去離子水配置的75%乙醇lml/mlTRIzo洗滌所得RNA沉淀，4'C7500r/min離心5min，棄上清，室溫靜置5-10min,使乙醇揮發(fā)；用20u1Nudease-FreeWater溶解RNA沉淀，保存?zhèn)溆谩?二)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有16yl主反應(yīng)液A和7ul特異性引物P的反應(yīng)管中，加入2ul待檢RNA，充分混合后，于63°C恒溫水浴箱中放置30分鐘。同時(shí)設(shè)立RNA陰性對(duì)照?？偡磻?yīng)體系為25"1，各成分如下特異性引物:主反應(yīng)液:成分用量終濃度FlP(20yM)2u140pmo1BIP(20uM)2u140pmo1F3(IOuM)0.5u15pmolB3(10uM)0.5y15pmolFLP(20uM)1"20pmolBLP(20uM)lu120pmol10XBuffer2.1IXdNTP(10mM)11.4mMMgS04U00mM)1.5u16mMBetaine(5M)4.0"0.8mMAMV(5U/ii1)1.0u15UBstDNA聚合酶(8U/ul)2.0ul16URnasin(40U/"1)0.25y110UH20檢測(cè)RNA1.25u12ti125ti1三、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè).-紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)400rm波長(zhǎng)檢測(cè)最終反應(yīng)體系的吸光度(OD)值。步驟如下1)丌機(jī)，儀器自檢結(jié)束后，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)400nm，2)用DEPC處理水調(diào)節(jié)零和調(diào)百，向比色皿中加入99u1DEPC處理水和1"1待檢樣品(樣品要充分漩渦混勻)，讀取的吸光度值/100即為樣品的檢測(cè)0D值。四、結(jié)果判定測(cè)定管吸光度(OD)〉0.4為結(jié)果判定陽(yáng)性。RNA陰性對(duì)照管吸光度OD值為0.2.通常以O(shè)D值超過(guò)陰性對(duì)照OD值2倍以上的者為判定陽(yáng)性。上述發(fā)明基于以下試驗(yàn)1)LAMP反應(yīng)中焦磷酸鎂生成量的檢測(cè)根據(jù)LAMP反應(yīng)DNA擴(kuò)增的同時(shí)產(chǎn)生大量焦磷酸鎂(MagnesiumPyrophosphate)的原理，反應(yīng)體系呈現(xiàn)一定的混濁度，因此可以通過(guò)檢測(cè)濁度即焦磷酸鎂鹽的吸光度OD值(吸收波長(zhǎng)400nm)間接反應(yīng)DNA的擴(kuò)增情況。方法將已知病毒的RNA作10M咅比稀釋(10—110—:'10—510_710—910_1'10—''10—'—')，取16ul的主反應(yīng)液和7yl的特異性引物混合，各管分別加入經(jīng)102倍比稀釋的不同濃度的RNA2ul，總體積為25ul，混勻后置于63。C恒溫水浴箱中放置60分鐘，利用紫外一可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)體系的OD值，每隔5分鐘檢測(cè)一次，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行管，取各時(shí)間點(diǎn)3個(gè)平行管0D值的平均值計(jì)為檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)設(shè)立RNA陰性對(duì)照。(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5，圖7，圖9)2)LAMP反應(yīng)real—time(染料熒光強(qiáng)度)檢測(cè)SYBRGreenI熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后，能產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號(hào)，在real—time擴(kuò)增儀上，SYBRGreenI的熒光可被實(shí)時(shí)檢測(cè)，因此通過(guò)檢測(cè)SYBRGreenI的熒光信號(hào)強(qiáng)度反應(yīng)LAMP反應(yīng)中DNA的擴(kuò)增情況。方法按上述方法配制25ul不同RNA濃度(10—110—:'10—510—710—910—1110—I:i10—'"的LAMP反應(yīng)體系，各體系中分別加入lU120XSYBRGreenI染料(使用濃度為0.8X)，每個(gè)濃度作3個(gè)平行孔，放入Real—time儀中(Rochelightcycler480)，63°Cfor60min(每間隔l分鐘為l個(gè)循環(huán))。收集檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。同時(shí)設(shè)立RNA陰性對(duì)照。(檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6，圖8，圖IO)3)同一反應(yīng)體系中OD值與熒光值檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析將同一RNA濃度相同時(shí)間點(diǎn)LAMP反應(yīng)體系中吸光度的檢測(cè)結(jié)果(OD值)與real—time檢測(cè)結(jié)果(染料熒光強(qiáng)度)進(jìn)行相關(guān)性分析，若兩者存在數(shù)量上的相關(guān)關(guān)系，可以通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系0D值的檢測(cè)間接反應(yīng)DNA的擴(kuò)增情況。(結(jié)果見(jiàn)表l，表2，圖ll，圖12，圖13，圖14，圖15，圖16)結(jié)果表明①3中黃熱病毒RNA的LAMP擴(kuò)增中，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度(OD值)的檢測(cè)結(jié)果(反應(yīng)濁度變化)與同一時(shí)間點(diǎn)real—time兩種熒光染料的檢測(cè)結(jié)果(DNA的生成量)呈現(xiàn)高度的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r在0.90以上。因此可以通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物中濁度的變化間接反應(yīng)LAMP的擴(kuò)增情況。②所有不同濃度的RNA陽(yáng)性的病毒在LAMP反應(yīng)進(jìn)行30分鐘內(nèi)均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增，0D》0.4，RNA陰性對(duì)照的平均OD值為0.2。③以檢測(cè)樣品吸光度超出陰性對(duì)照吸光度2倍以上者為檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，考慮到所用樣本LAMP反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性的時(shí)間(thetimeofpositivity，Tp)均在30分鐘內(nèi)，規(guī)定LAMP反應(yīng)陽(yáng)性結(jié)果的CUTOFF值為.LAMP反應(yīng)進(jìn)行30分鐘內(nèi)，檢測(cè)樣品的OD值>0.4以上者為結(jié)果陽(yáng)性。表l3種黃病毒(RAN10—LAMP反應(yīng)紫外一可見(jiàn)光分光光度計(jì)吸光度檢測(cè)結(jié)果NTimeJEVDV1DV2DV3DV4WNVRNA(-)000.20.20.20.20.20.20.2150.20.20.20.20.20.20.22100.40.20.20.20.40.20.23150.60.20.20.21.20.40.24201.20.20.21.21.51.40.25251.80,60.91.61.51.60.26302.21.21.51.81.51.60.27352.21.51.61.71.61.60.28402.41.71.71.81.61.60.29452,41.71.71.81.61.60.210502.41.71.71.81.61.60.211552.41.71.71.81.61.60.212602.41.71.71.81.61.60.2表23種黃病毒(RANl(T')L層P反應(yīng)real—time熒光檢測(cè)結(jié)果NTimeJEVDV1DV2DV3DV4麗靈(-)0015.920611.466312.587910.26278.739220.68599.304132126.994011.696612.667010.31929.438321.24149.42516521033.552411.838212.865210.488312.791321.53449.4211751536.064411.965512.990614.406721.441830.40669.42903742069.041213.177314.386429.127521.553379.93209.4441912582.292924.454429.524830.860721.493280.37099.57463863083.843433.892940.412530.598921.717880.02669.5882313585.024336.213242.360430.493721,531979.76809.52372984084.798936.573842.923230.473021.682679.7269.585505<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，特異性強(qiáng)，且比PCR檢測(cè)方法有更高的靈敏度，不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬鍋或水浴箱即可，結(jié)果不必用凝膠電泳方法或使用熒光染料來(lái)觀察，只需用普通的分光光度計(jì)即可，快速、準(zhǔn)確性高、靈敏性好、應(yīng)用方便，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、出入境檢疫等領(lǐng)域。本發(fā)明的流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒不僅適用于病人的診斷，還適用于對(duì)蚊體內(nèi)病毒的檢測(cè)。對(duì)于了解蚊體內(nèi)病毒的攜帶情況以及可攜帶和傳播病毒的蚊種具有重要意義。圖丄LAMP反應(yīng)原理圖2:LAMP反應(yīng)引物設(shè)計(jì)圖3:LAMP反應(yīng)結(jié)果電泳圖(showsaladder-likepattern,Lanes:M，100-bpDNAladder;1,10,000PFU;2,1,000PFU;3，100PFU;4,10PFU;5,1PFU;6,0.1PFU;7，0.01PFU;8,0.001PFU;9，0.0001PFU;10,0PFU)圖4:常規(guī)PCR反應(yīng)結(jié)果電泳圖(showsa201-bpamplificationproduct.Lanes:M，100-bpDNAladder;1,10,000PFU;2,1,000PFU:3'100PFU;4,10PFU;5，1PFU;6，0.1PFU;7,0.01PFU;8，0.001PFU:9，0.0001PFU;10,0PFU)圖5:乙腦病毒LAMP反應(yīng)OD值檢測(cè)(圖中A:RNA10—'，B-RNA10—3，C:RNAl(T''，D:RNA10—7,E:RNAIO、F:RNA1(T'，G:RNA10—13，H:RNAl(T仏，I:RNA(-))圖6:乙腦病毒LAMP反應(yīng)real—time檢測(cè)圖7:登革病毒LAMP反應(yīng)OD值檢測(cè)(圖中A:RNA10—1，B:RNA10—3，C:RNA10—:'，D:RNAIO-7，E:RNAICT9，F(xiàn):RNA1(T'，G:RNAIO-13，H:RNAIO,I:RNA(-))圖8:登革病毒LAMP反應(yīng)real—time檢測(cè)圖9:西尼羅病毒LAMP反應(yīng)OD值檢測(cè)J(圖中A:RNA1(T'，B:RNA1(T，C:RNA10—,，D:RNA1(T7，E:RNA10—9，F(xiàn):RNA10—"，G:RNA10—'3，H:RNAl(T5，I:RNA(-))圖10:西尼羅病毒LAMP反應(yīng)real—time檢測(cè)圖ll:乙腦病毒LAMP反應(yīng)OD值與real—tirae檢測(cè)相關(guān)性(r=0.970，p<0.001)圖12:I登革病毒LAMP反應(yīng)OD值與rea1—time檢測(cè)值相關(guān)性(F0.983，p<0.001)圖13:II登革病毒LAMP反應(yīng)OD值與real—time檢測(cè)值相關(guān)性(r-0.997，po.001)圖14:III登革病毒LAMP反應(yīng)OD值與real—time檢測(cè)值相關(guān)性(F0.975，P<0.001)圖15:IV登革病毒LAMP反應(yīng)0D值與rea1—time檢測(cè)值相關(guān)性(^0.980，p<0.001)圖16:西尼羅病毒LAMP反應(yīng)OD值與real—time檢測(cè)值相關(guān)性(r=0.996,p<0.001)具體實(shí)施例方式實(shí)施例1按下列配方制作流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒聯(lián)合快速檢測(cè)的LAMP試劑盒(1)16ul主反應(yīng)液2.5u1lOXBuffer,1.0u1AMV(5U/u1)，0.25u1Rnasin(40U/u1)，2.Ou1BstDNA聚合酶(8U/u1),3.110mMdNTP，1.5u1100mM的MgS04，4.0ul5M的betaine禾BL25ylDEPC處理水總體積量為16n1。射IOX等溫反應(yīng)緩沖液含有濃度為200mM、pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽(200mMTris-HC1,pH8.8)、濃度為lOOmM的氯化鉀(lOOmMKCl)、濃度為100mM硫酸按(lOOmM(NH4)2S04)、濃度為20mM的硫酸鎂(20mMMgS04)和濃度為1X的曲拉通X—100(1%TritonX—IOO)。(2)特異性引物包括特異性擴(kuò)增乙腦病毒，登革病毒，西尼羅病毒的LAMP特異性引物PJEV，PDV(包括PDV1，PDV2，PDV3，PDV4)和PWNV。PJEV引物組成為2yl20yM內(nèi)引物PJEVFIP,2yl20uM內(nèi)引物PJEVBIP，0.5ul10uM外引物PJEVF3，0.5u110uM外引物PJEVB3，1.0ul20uM環(huán)弓l物PJEVFLP，l.Oyl20nM環(huán)引物PJEVBLP?？傮w積量為7ul。PDV1引物組成為2u120yM內(nèi)引物PDV1FIP，120pM內(nèi)引物PDV1BIP，0.5ullOyM外引物PDV1F3，0.5yl10uM夕卜弓l物PDVlB3，1.0yl20uM環(huán)弓l物PDV1FLP，l.Oiil20uM環(huán)引物PDVlBLP。總體積量為7pl。PDV2引物組成為2u120uM內(nèi)引物PDV2FIP,2u120tiM內(nèi)引物PDV2BIP，0.110uM外引物PDV2F3，0.5u110uM外引物PDV2B3,l.Ou120uM環(huán)弓l物PDV2FLP，l.Oyl20uM環(huán)引物PDV2BLP。總體積量為7ul。PDV3引物組成為2p120yM內(nèi)引物PDV3FIP，120iiM內(nèi)引物PDV3BIP，0.5ul10yM外引物PDV3F3，0.5ul10uM外引物PDV3B3,l.Oul20uM環(huán)弓i物PDV3FLP，l.Oul20uM環(huán)引物PDV3BLP?？傮w積量為7ul。PDV4引物組成為2"120uM內(nèi)引物PDV4FIP,120tiM內(nèi)引物PDV4BIP，0.5ul10uM外引物PDV4F3，0.5u110uM外引物PDV4B3,l.Oul20uM環(huán)弓l物PDV4FLP,1.0til20uM環(huán)引物PDV4BLP?？傮w積量為7ul。P謂V引物組成為:2"120yM內(nèi)引物PWNVFIP,2u120"M內(nèi)引物PWNVBIP，0.5u110nM外引物PWNVF3，0.5y110yM夕卜弓l物PWNVB3,l.Oy120uM環(huán)弓l物PWNVFLP，l.Oul20uM環(huán)引物PWNVBLP。總體積量為7ul。各引物序列分別如下1)PJEV:PJEVFIP::GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGTTTTGCCACTTGGGTGGACTTGPJEVBIP:AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTTTTTCGTCGAGATGTCAGTGACTGPJEVF3:GGAATGGGCAATCGTGACTPJEVB3:CGTTGTGAGCTTCTCCAGTPJEVFLP:TCGTTTGCCATGATTGTCPJEVBLP:GAAGTTACTGCTATCATGCT2)PDV:包括PDV1，PDV2，PDV3,PDV4PDV1:PDV1FIPGCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGCPDV1BIPCCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGGPDV1FLPCTCCTCTAACCACTAGTCPDV1BLPGGTGGTAAGGACTAGAGGPDV1F3GAGGCTGCAAACCATGGAA-TOV1B3CAGCAGGATCTCTGGTCTCTPDV2:PDV2FIPTTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGGPDV2BIPGGTTAGAGGAGACCCCCCCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGGPDV2FLPGATCTGTAAGGGAGGGGPDV2BLPGCATATTGACGCTGGGAPDV2F3TGGAAGCTGTACGCATGGPDV2B3GTGCCTGGAATGATGCTGPDV3:PDV3FIPTGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTGPDV3BIPCTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGCPDV3FLPCCTTGGACGGGGCTPDV3BLPGGAGGCTGCAAACCGTGPDV3F3GCCACCTTAAGCCACAGTAPDV3B3GTTGTGTCATGGGAGGGPDV3:PDV4FIPTGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACCPDV4BIPGGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCGPDV4FLPGGCGGAGCTACAGGCAGPDV4BLPTCACCAACAAAACGCAGPDV4F3CTATTGAAGTCAGGCCACPDV4B3ACCTCTAGTCCTTCCACC3)PWNV:PWNVFIPTTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGTPWNVBIPTGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCG剛VFLPCATCGATGGTAGGCTTGTCPW,LPTCTCCACCAAAGCTGCGTPWNVF3TGGATTTGGTTCTCGAAGGP麗VB3GGTCAGCACGTTTGTCATT實(shí)施例2.用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒一、樣品中RNA的提取1)病人血清樣本及細(xì)胞培養(yǎng)上清和鼠腦脊液中提取乙型腦炎病毒、登革病毒、西尼羅病毒RNA:在裝有250y1細(xì)胞培養(yǎng)上清液的1.5mlEppendorf管屮加入750ulTRlzol*LSReagen(invitrogen)漩渦混合器混勻；在該Eppendorf管中加入200u1氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-15min，4'C12000r/min離心15min;小心取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500ul異丙醇，漩渦混合器混勻，室溫靜置10min;4'C12000r/min離心10min，棄上清，保留管底白色RNA沉淀；以DEPC處理的去離子水配置的75%乙醇lml洗滌所得RNA沉淀，4°C7500r/min離心5min，棄上清，室溫靜置5-10min，使乙醇揮發(fā)；用20y1Nuclease-FreeWater溶解RNA沉淀，保存?zhèn)溆?)組織樣品中提取乙型腦炎病毒、登革病毒、西尼羅病毒RNA:取一7(TC冷凍的樣品組織標(biāo)本室溫下加入TRIzorReagen(invitrogen)，在研缽中研磨(100mg組織樣品加2mlTRIzo1，研缽使用前要用DEPC水處理)，勻漿加入1.5mlEppendorf管中，室溫放置5min，加入200u1AnlTRIzo氯仿，用力振蕩3-5min，室溫靜置15min，4°C12000r/min離心15min;小心取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500u1/mlTRIzo異丙醇，漩渦混合器混勻，室溫靜置10min;4'C12000r/min離心10min，棄上清，白色RNA沉淀于管底；以DEPC處理的去離子水配置的75%乙醇lml/mlTRIzo洗滌所得RNA沉淀，4°C7500r/min離心5min，棄上清，室溫靜置5-10min，使乙醇揮發(fā)；用20Nuclease-FreeWater溶解RNA沉淀，保存?zhèn)溆?。二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有16iU主反應(yīng)液A和7ul特異性引物P的反應(yīng)管中，加入2yl待檢RNA,充分混合后，于63°C恒溫水浴箱中放置30分鐘。同時(shí)設(shè)立RNA陰性對(duì)照。總反應(yīng)體系為25"1，各成分如下成分用量終濃度特異性引物P:FIP(20uM)2ul40pmo1BIP(20iiM)2ul40pmo1主反應(yīng)液A:檢測(cè)RNAF3(10uM)0.5"15pmolB3(10uM)0.5u15pmolFLP(20uM)1"120pmolBLP(20uM)lu120pmol10XBuffer2.5u1IXcJNTP(10mM)3.5ul1.4mMMgS04(100mM)1.16mMBetaine(5M)4.On10.8mMAMV(5U/ti1)1.0"5UBstDNA聚合酶(8U/y1)2.0ul16URnasin(40U/y1)0.25u1丄0U咖125u1三、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)-紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)400nm波長(zhǎng)檢測(cè)最終反應(yīng)體系的吸光度(0D)值。步驟如下1)開機(jī)，儀器自檢結(jié)束后，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)400nm，2)用DEPC處理水調(diào)節(jié)零和調(diào)百，向比色皿中加入99u1DEPC處理水和1u1待檢樣品(樣品要充分漩渦混勻)，讀取的吸光度值/100即為樣品的檢測(cè)0D值。四、結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RNA陰性對(duì)照管吸光度OD值為0.2.通常以O(shè)D值超過(guò)陰性對(duì)照OD值2倍以上的者為判定陽(yáng)性。即測(cè)定管吸光度(OD)〉0.4為結(jié)果判定陽(yáng)性。權(quán)利要求1、一種聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒，其特征在于所述試劑盒由主反應(yīng)液和特異性引物組成所述主反應(yīng)液的組成10×等溫反應(yīng)緩沖液、濃度為5U/μl的禽類成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶、濃度為40U/μl的核酸酶抑制劑、濃度為8U/μl的BstDNA聚合酶、濃度為10mM的dNTP、濃度為100mM的硫酸鎂、和濃度為5M的酣菜堿和1.25μl焦碳酸二乙脂處理水，總體積量為16μl；所述特異性引物包括特異性引物1，特異性引物2，特異性引物3；每組特異性引物都共有3對(duì)引物，它們分別為內(nèi)引物1FIP和內(nèi)引物2BIP；外引物1F3和外引物2B3；環(huán)引物1FLP和環(huán)引物2BLP。2、根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征在于所述主反應(yīng)液的組成為2.5U110X等溫反應(yīng)緩沖液、l.Oyl禽類成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶5U/y1,0.25ul核酸酶抑制劑40U/iU，2.0ulBstDNA聚合酶8U/ul，3.5ul10mMdNTP，1.5ul100mM的硫酸鎂，4.Oul5M的酣菜堿和1.25ul焦碳酸二乙脂處理水；總體積量為16u1。3、根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其特征在于所述主反應(yīng)液的IOX等溫反應(yīng)緩沖液為濃度為200mM、pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、濃度為100mM'的氯化鉀、濃度為100mM硫酸按、濃度為20mM的硫酸鎂和濃度為1X的曲拉通X一亂4、根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于所述特異性引物1為特異性擴(kuò)增乙腦病毒引物；特異性引物2為特異性擴(kuò)增登革病毒引物；特異性引物3為特異性擴(kuò)增西尼羅病毒引物；所述特異性引物2包括特異性擴(kuò)增I型登革病毒引物、II型登革病毒引物、m型登革病毒引物，IV型登革病毒引物。5、根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于所述特異性引物濃度分別如下所述乙腦病毒特異引物PJEV包括20uM內(nèi)引物1PJEVFIP、20uM內(nèi)引物2PJEVBIP、10uM外引物1PJEVF3、10uM外引物2PJEVB3，、20uM環(huán)引物1PJEVFLP和20uM環(huán)引物2PJEVBLP;所述I型登革病毒引物PDV1包括20uM內(nèi)引物1PDV1FIP、20uM內(nèi)引物2PDV1BIP、10uM外引物1PDV1F3、10yM外引物2PDV1B3、20uM環(huán)引物lPDV1FLP、20uM環(huán)引物2PDV1BLP，總體積量為7yl;所述II型登革病毒引物PDV2包括20uM內(nèi)引物1PDV2FIP、20ixM內(nèi)引物2PDV2BIP、l()iiM外引物lPDV2F3、10uM外引物2PDV2B3、20uM環(huán)弓l物lPDV2FLP、20wM環(huán)引物2PDV2BLP，總體積量為7ul;所述III型登革病毒引物PDV3包括20uM內(nèi)引物1PDV3FIP、20uM內(nèi)引物2PDV3BIP、10uM外引物1PDV3F3、10yM外引物2PDV3B3、20pM環(huán)引物1PDV3FLP、20iiM環(huán)引物2PDV3BLP，總體積量為7u1;所述工V型登革病毒引物PDV4包括20uM內(nèi)引物1PDV4FIP、20uM內(nèi)引物2PDV4BIP、10uM外引物1PDV4F3、10uM外引物2PDV4B3、20uM環(huán)引物1PDV4FLP、20PM環(huán)引物2PDV4BLP，總體積量為7ti1;所述西尼羅病毒特異引物P麗V包括20uM內(nèi)引物1PWNVFIP、20uM內(nèi)引物2PW扁IP、10nM夕卜弓l物lPWNVF3、10yM外引物2PWNVB3、20uM環(huán)引物lPWNVFLP、20uM環(huán)引物2PWNVBLP,總體積量為7ul。6、根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征在于所述特異性引物的組成為所述乙腦病毒特異引物PJEV組成為2ul20uM內(nèi)引物PJEVFIP、2ul20uM內(nèi)引物PJEVBIP、0.5ul10yM外引物PJEVF3、0.5ul10yM外引物PJEVB3、l.Oy120uM環(huán)引物PJEVFLP和l.Ou120uM環(huán)引物PJEVBLP，總體積量為7"1;登革病毒I型引物PDV1組成為2u120uM內(nèi)引物PDV1FIP、2u120uM內(nèi)引物PDV1BIP、0.5yl10uM外引物PDVlF3、0.5y110uM外引物PDV1B3、l.Oul20nM環(huán)引物PDV1FLP和l.Oul20uM環(huán)引物PDV1BLP，總體積量為7u1;登革病毒II型引物PDV2組成為2y120yM內(nèi)引物PDV2FIP、2u120yM內(nèi)引物PDV2BIP、0.5lil10uM外引物PDV2F3、0.5ti110uM夕卜弓l物PDV2B3、l.Oul20uM環(huán)引物PDV2FLP和l.Oul20uM環(huán)引物PDV2BLP，總體積量為7u1;登革病毒III型引物raV3組成為2ul20uM內(nèi)引物PDV3FIP、2ul20pM內(nèi)引物PDV3BIP、0.5yl10uM外引物PDV3F3、0.5ylIOpM夕卜弓I物PDV3B3、l.O皿ul20—uM環(huán)引物PDV3FLP和1.0—ul20uM環(huán)引物PDV3BLP，總體積量為7u1;登革病毒IV型引物PDV4組成為2u120yM內(nèi)引物PDV4FIP、2u120uM內(nèi)引物PDV4BIP、0.5ul10uM外引物PDV4F3、0.5u110uM夕卜弓l物PDV4B3、l.Owl20uM環(huán)引物PDV4FLP禾卩l(xiāng).Oul20uM環(huán)引物PDV4BLP，總體積量為7y1;西尼羅病毒特異引物PWNV組成為2ul20uM內(nèi)引物PWNVFIP、2ul20uM內(nèi)引物PWNVBIP、0.5ul10uM外引物PWNVF3、0.5^110uM外引物PWNVB3、1.0u120pM環(huán)弓|物PWNVFLP和1.0u120uM環(huán)引物PWNVBLP，總體積量為7iil。7、根據(jù)權(quán)利要求l、4、5或6的試劑盒，其特征在于所述特異性引物序列分別如下所述PJEV包括PJEVFIP:GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGTTTTGCCACTTGGGTGGACTTGPJEVBIP:AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTTTTTCGTCGAGATGTCAGTGACTGPJEVF3:GGAATGGGCAATCGTGACTPJEVB3:CGTTGTGAGCTTCTCCAGTPJEVFLP:TCGTTTGCCATGATTGTCPJEVBLP:GAAGTTACTGCTATCATGCT所述PDV1包括PDV1FIPGCTGCGTTGTGTCTTGGGAGGTTTTCTGTACGCATGGGGTAGCPDV1BIPCCCAACACCAGGGGAAGCTGTTTTTTTGTTGTTGTGCGGGGGPDV1FLPCTCCTCTAACCACTAGTCPDV1BLPGGTGGTAAGGACTAGAGGPDV1F3GAGGCTGCAAACCATGGAAPDV1B3CAGCAGGATCTCTGGTCTCT所述PDV2包括PDV2FIPTTGGGCCCCCATTGTTGCTGTTTTAGTGGACTAGCGGTTAGAGGPDV2BIPGGTTAGAGGAGACCCCCCCAATTTTGGAGACAGCAGGATCTCTGGPDV2FLPGATCTGTAAGGGAGGGGPDV2BLPGCATATTGACGCTGGGAPDV2F3TGGAAGCTGTACGCATGGPDV2B3GTGCCTGGAATGATGCTG所述PDV3包括PDV3FIPTGGCTTTTGGGCCTGACTTCTTTTTTGAAGAAGCTGTGCAGCCTGPDV3BIPCTGTAGCTCCGTCGTGGGGATTTTCTAGTCTGCTACACCGTGCPDV3FLPCCTTGGACGGGGCTPDV3BLPGGAGGCTGCAAACCGTGPDV3F3GCCACCTTAAGCCACAGTAPDV3B3GTTGTGTCATGGGAGGGfC二-丄'-r>r>、,/1/fcn+壬/71J^ruv4tiTO:PDV4FIPTGGGAATTATAACGCCTCCCGTTTTTTCCACGGCTTGAGCAAACCPDV4BIPGGTTAGAGGAGACCCCTCCCTTTTAGCTTCCTCCTGGCTTCGPDV4FLPGGCGGAGCTACAGGCAGPDV4BLPTCACCAACAAAACGCAGPDV4F3CTATTGAAGTCAGGCCACPDV4B3ACCTCTAGTCCTTCCACC所述PWNV包括PWNVFIPTTGGCCGCCTCCATATTCATCATTTTCAGCTGCGTGACTATCATGTPWNVBIPTGCTATTTGGCTACCGTCAGCGTTTTTGAGCTTCTCCCATGGTCG剛VFLPCATCGATGGTAGGCTTGTCPWNVBLPTCTCCACCAAAGCTGCGTPWNVF3TGGATTTGGTTCTCGAAGGPWNVB3GGTCAGCACGTTTGTCATT。8.—種如權(quán)利要求1所述聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟一、樣品中RNA的提取1)病人血清樣本及細(xì)胞培養(yǎng)上清和鼠腦脊液中提取RNA:在裝有250ul細(xì)胞培養(yǎng)上清液的i.5mlEppendorf管中加入750ulTRIzol*LSReagen漩渦混合器混勻；在該Eppendorf管中加入200ul氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-15min，4'C12000r/min離心15min;小心取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500iU異丙醇，漩渦混合器混勻，室溫靜置10min;4°C12000r/min離心10min，棄上清，保留管底白色RNA沉淀；以DEPC處理的去離子水配置的75%乙醇lml洗滌所得RNA沉淀，4°C7500r/min離心5min，棄上清，室溫靜置5-10min，使乙醇揮發(fā)；用20u1Nuclease-FreeWater溶解RNA沉淀，保存?zhèn)溆茫?)組織樣品中提取RNA:取一70'C冷凍的樣品組織標(biāo)本室溫下加入TRIzorReagen，在研缽中研磨100mg組織樣品加2mlTRIzo1，研缽使用前用DEPC水處理，勻漿加入1.5mlEppendorf管中，室溫放置5min，加入200ul/mlTRIzo氯仿，用力振蕩3-5min，室溫靜置15min，4°C12000r/min離心15min;小心取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至另一新1.5mlEppendorf管中，加入500y1/mlTRIzo異丙醇，漩渦混合器混勻，室溫靜置10min;4'Cl2000r/min離心10min，棄上清，白色RNA沉淀于管底；以DEPC處理的去離子水配置的75%乙醇lml/mlTRIzo洗滌所得RNA沉淀，4。C7500r/min離心5min，棄上清，室溫靜置5-10min，使乙醇揮發(fā)；用20y1Nuclease-FreeWater溶解RNA沉淀，保存?zhèn)溆?；二、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在裝有16u1主反應(yīng)液A和1特異性引物P的反應(yīng)管中，加入2ul待檢RNA,于63。C恒溫水浴箱中放置30分鐘。同時(shí)設(shè)立RNA陰性對(duì)照；總反應(yīng)體系為25ul，各成分如下成分用量終濃度特異性引物p:FIP(20uM)2ul40pmo1BIP(20uM)2ul40prao1F3(lOyM)0.5u15pmolB3(IOpM)0.15pmolFLP(20uM)1li120pmolBLP(20uM)1y120pmol主反應(yīng)液A:10xBuffer2.5ulIXdNTP(l()mM)3.11.4mMMgS04U00mM)1.5tU6mMBetaine(5M)4.Oti10.8mMAMV(r)L7u1)1.Ou15UBs1IAA聚合酶(8L7u丄)2.Oii116UKnasin(40U/u1)0.25u110uH201.25u1檢測(cè)RNA:2u1共計(jì)25u1。三、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)紫外一可見(jiàn)分光光度計(jì)400匿波長(zhǎng)檢測(cè)最終反應(yīng)體系的吸光度OD值，步驟如下1)丌機(jī)，儀器自檢結(jié)束后，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)400nm，2)用DEPC處理水調(diào)節(jié)零和調(diào)百，向比色皿中加入99u1DEPC處理水和1y1待檢樣品樣品充分漩渦混勻，讀取的吸光度值/100即為樣品的檢測(cè)OD值；四、結(jié)果判定測(cè)定管吸光度X).4為結(jié)果判定陽(yáng)性。全文摘要本發(fā)明涉及一種聯(lián)合快速檢測(cè)流行性乙型腦炎病毒、登革病毒和西尼羅病毒試劑盒，由主反應(yīng)液和特異性引物組成。主反應(yīng)液包括反應(yīng)緩沖液、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶抑制劑、BstDNA聚合酶、dNTP、硫酸鎂、酣菜堿、焦碳酸二乙脂和處理水；特異性引物包括特異性擴(kuò)增乙腦病毒引物、特異性擴(kuò)增登革病毒引物和特異性擴(kuò)增西尼羅病毒引物。本發(fā)明用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，設(shè)計(jì)高度特異性引物，快速檢測(cè)3種黃病毒，達(dá)到高效特異性擴(kuò)增的目的。本發(fā)明提供了檢測(cè)方法，利用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)體系的吸光度值，間接反應(yīng)目的基因的DNA擴(kuò)增情況。適于基層和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，有較大的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101629215SQ20091004718公開日2010年1月20日申請(qǐng)日期2009年3月6日優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日發(fā)明者劉世建,常文軍,張宏偉,曹廣文,李淑華申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)