專利名稱：一種中藥活性組群的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
應用于中藥活性組群篩選及提取分離過程。
背景技術(shù)：
中藥學作為中醫(yī)學不可分割的組成部分，幾千年來，在中醫(yī)整體觀和辨證論治原 則的指導下，為人類的健康事業(yè)作出重要貢獻。現(xiàn)代醫(yī)學認為中藥是以多途徑、多靶點、多 受體形式發(fā)揮作用，也決定了藥物作用成分的復雜性。相關(guān)參考文獻如下
[1]漢斯莫利特、阿諾德*固本訂著，楊光譯.乳液，懸浮液，固本配合技術(shù)與應用。 化學工業(yè)出版社.北京化學工業(yè)出版社，2003年版267。 [2]匡海學主編.新世紀全國高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材 中藥化學(供中藥類專 業(yè)用)，北京中國中醫(yī)藥出版社，2003年版，2005年第5次印刷21。 溶劑提取法[2]作為中藥傳統(tǒng)提取方法之一，與藥理學相結(jié)合，為活性成分的發(fā) 現(xiàn)與分離作出積極貢獻；近年，高通量藥物篩選技術(shù)的發(fā)展與應用，大大加快藥物活性成分 的篩選速度，發(fā)現(xiàn)了一大批活性成分。但我們應看到，天然藥物的提取技術(shù)在某種意義上 偏離了中醫(yī)理論的指導和范疇，將中藥成分"科學"的肢解為單味成分的簡單加和。例如 生脈飲中五羥基糠醛認為是藥物發(fā)揮作用的新產(chǎn)物，已超出原藥成分的范疇；另外實驗也 存在將已知成分活性和理化性質(zhì)作為選擇溶媒和提取方法的依據(jù)，忽略中藥配伍及整體發(fā) 揮作用的科學內(nèi)涵。高通量藥物篩選在活性組分的篩選上，取得了長足的發(fā)展，但目前受 中藥分離純化技術(shù)、資金、技術(shù)普及等層面的影響，國內(nèi)尚需要一段的發(fā)展歷程。鑒于上述 因素，本專利參照黑箱理論，引入"溶解度參數(shù)法"篩選中藥或復方藥物有效部位群的提取 方法，將中藥作為具有科學內(nèi)涵但尚不知其內(nèi)涵的統(tǒng)一體加以全面研究。"溶解度參數(shù)"是 Hildebrand J H等在20世紀中期提出的概念，它被定義為物質(zhì)內(nèi)聚能密度的平方根，是表 征簡單液體分子間相互作用強度特征的重要參數(shù)。半個多世紀以來，溶解度參數(shù)概念得到 不斷擴展與修正，以最初的Scatchard-Hildebrand正規(guī)溶液理論為依據(jù)，Hansen CM建立 了三維溶解度參數(shù)體系。1971年，Bag-ley E B等提出以液體的內(nèi)壓替代內(nèi)聚能密度并建 立了相應的二維溶解度參數(shù)體系，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的理論使溶解度參數(shù)成為研究混合 物體系的重要部分。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，溶解度參數(shù)作為衡量物質(zhì)之間相容性的重 要參數(shù)之一，在高分子及相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛應用。本文則將溶解度參數(shù)發(fā)展并引入中藥 提取領(lǐng)域，拓展其應用空間與范疇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中藥活性組群提取分離的實驗方法，其特征在于 1)確定待查藥物的藥理學指標； 2)以溶解度參數(shù)梯度分布為依據(jù)，選擇一組溶媒； 3)將上述待查藥物溶入上述溶媒中，分別提取中藥活性組份； 4)將上述中藥活性組份分別進行藥理學試驗，獲得相應的藥理學參數(shù)；
5)將溶解度參數(shù)對藥理學參數(shù)進行數(shù)據(jù)回歸，以獲得藥理學最佳理論值及最佳的 溶解度參數(shù)，并以該溶解度參數(shù)為依據(jù)，獲取最佳的溶媒； 6)將上述確定待查藥物溶于上述最佳的溶媒中，提取中藥活性組份，再進行藥理 學評價，以驗證該待查藥物活性。 以溶媒溶解度參數(shù)梯度分布作為溶媒選擇手段，所選定的溶媒溶解度參數(shù)依據(jù)現(xiàn) 有文獻資料應盡可能涵蓋全程，例如參照文獻1確定溶解度參數(shù)范圍為9. 9 47. 8，選擇 較大范圍溶解度參數(shù)溶媒對中藥活性組分進行提取，以保證活性組群篩選的全面性，同時 隨著溶劑種類的不斷增加，這一溶解度參數(shù)范圍也必將逐漸擴大。本試驗過程選定的溶解 度參數(shù)范圍為14. 9 47. 8 ;溶解度參數(shù)的選擇即可為均度或近似均度梯度，也可為非均度 梯度，但最少不得少于5個梯度，以便于線性回歸的準確性。 以各溶媒提取物所對應的藥理學實驗數(shù)據(jù)為考查指標，根據(jù)中醫(yī)的證或病，可以 選擇一個或幾個指標進行考查，此實驗可參考《中藥新藥研究指南》藥理學、毒理學所確定 考查指標進行考查，但均應以量的形式體現(xiàn)，以定性的形式經(jīng)權(quán)重后賦分所優(yōu)化的參數(shù)不 會特別準確，但可看一般趨勢。 以溶解度參數(shù)對藥理學指標進行回歸及理論值優(yōu)化為數(shù)據(jù)處理手段，本方法所確 定的線性回歸，可以是簡單的線性回歸，也可是多元的線性回歸，處理的軟件可以為SPSS、 SAS、Qbasic均勻設(shè)計軟件，因其數(shù)據(jù)處理原理基本相同，本實驗采用了 Qbasic均勻設(shè)計軟 件，進行處理。 本法"經(jīng)試驗確證后提取中藥活性組群的實驗方法"，所確定的理論值必須經(jīng)所確 定溶媒進行提取，經(jīng)提取物藥理學上述指標考查，并與優(yōu)化實驗組比對確定。另驗證組不得 少于3組，便于確定提取工藝的優(yōu)越性與實驗的穩(wěn)定性。 本法"經(jīng)試驗確證后提取中藥活性組群"，應用范圍廣泛，可用于中藥活性組分中 間體質(zhì)量控制研究；用于中藥活性組分組方配伍研究；用于中藥活性組分物質(zhì)基礎(chǔ)研究； 用于中藥活性組分制備工藝研究；用于中藥活性組分藥代學研究等，也可直接用于中藥制 劑研究，直接產(chǎn)生經(jīng)濟利益。 故此，本實驗方法擬解決的技術(shù)問題1.本發(fā)明擬體現(xiàn)出中醫(yī)整體觀與中藥多組 分、多靶點、多途徑發(fā)揮作用的科學內(nèi)涵，為一種具有中醫(yī)特色活性組群的提取分離的方 法，克服現(xiàn)有活性組群篩選、分離的片面性和高成本性，便于普及與應用，在中藥組分提取 領(lǐng)域?qū)⒌玫捷^為廣泛的應用。2.引入統(tǒng)計分析手段，避免傳統(tǒng)提取工藝條件優(yōu)化設(shè)計的主 觀性與片面性，篩選結(jié)果更接近真正活性組群。 本發(fā)明擬解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案中藥主要來源于天然藥及其加工品， 其中包括的中成藥則是中藥復方或單方使用的成品制劑。藥物所含成分繁雜，藥物配伍發(fā) 揮作用物質(zhì)基礎(chǔ)不明，作用機理不清。藥效產(chǎn)生可能是藥物中主流成分，如有機酸、黃酮類、 生物堿、皂苷等的直接作用；也可能是藥物中的次要成分，在藥物配伍中激發(fā)了某些藥物反 應而體現(xiàn)出的治療作用；也可能是藥物配伍產(chǎn)生新的化合物發(fā)揮作用；也有可能是藥物激 發(fā)人體受體而發(fā)揮的某些生化反應，等等。上述諸多都是一種科學的猜想，有些猜想證明 是正確的，但大家相信，藥物發(fā)揮作用的機理絕不局限于人們的猜想。如果按照我們猜想 的途徑進行研究，可能會產(chǎn)生一定的積極結(jié)果，有一定的提示作用，但提示往往不能說明全 部。為此我們設(shè)想，無論藥物是以何種方式發(fā)揮作用，但相信藥物的最原始物質(zhì)基礎(chǔ)總是與中藥配伍或藥材自身組成有關(guān)。這些藥物成分性質(zhì)各異，相互間作用復雜，我們?yōu)榇艘肓?"黑箱理論"，對藥物整體進行提取篩選研究。 根據(jù)"相似相溶原理"，活性組分的提取與溶劑的性質(zhì)有關(guān)，而溶劑與提取物之間 的作用，主要通過溶劑自身的氫鍵作用、極性作用、范德華力等形式發(fā)生，并以參數(shù)的形式 體現(xiàn)。上述各參數(shù)則以溶解度參數(shù)的形式表現(xiàn)出來，為此將此法命名為"溶解度參數(shù)法"或 "溶度系數(shù)法"。實驗中所選定溶媒溶解度參數(shù)可通過查表或自己計算而得到，根據(jù)不同的 系數(shù)確定不同的提取水平，以不同溶解度參數(shù)提取物產(chǎn)生的藥理活性為指標，進行多元回 歸，確定各溶解度參數(shù)的最佳值，并以此為依據(jù)，選定最佳提取溶媒進行提取，獲得活性物 質(zhì)基礎(chǔ)，作為中藥發(fā)揮作用的部位群應用或進行進一步分析。 本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明克服了參照中藥代表性成分性質(zhì)及藥理活性進行提取的束 縛，比較全面的梳理了組分與藥效學之間的關(guān)系，通過多元回歸更逼近了藥物活性組群的 最佳提取方式；同時將不同提取物進行深入研究或簡單合并，突出了中藥多途徑、多靶點、 多組分發(fā)揮作用的思想與中醫(yī)的整體觀。為此此方法的提出，是一項具有中醫(yī)特色的提取 方法與手段。為此，突出中醫(yī)特色，降低實驗成本，便于方法普及，為中藥活性組分分析提供 科學方法，會產(chǎn)生有益試驗結(jié)果。方案如圖1所示。


圖1為中藥活性組群的篩選流程圖。
具體實施方式

實施例1 單味中藥枳殼利膽活性組群篩選 (1)提取溶媒及溶解度參數(shù)的確定參照有關(guān)文獻[1]，溶劑的溶解度參數(shù)范圍選定 為14. 9 47. 8(4. 1868J/cm3)1/2(未修正)，實驗分別選擇提取溶媒為正己烷(14. 9) 、二乙 醚(15. 8)、乙酸乙酯(18. 1)、丙酮(20)、2-丁醇(22. 2)、甲醇(29. 6)、水(47. 8)，共7組，分 設(shè)7個水平安排實驗。 (2)不同溶解度參數(shù)溶媒提取物對大鼠膽汁分泌的影響 分別取枳殼藥材，粉成細粉(過60目篩)，加十倍量上述溶媒，冷浸24小時，超聲 提取40分鐘，濾過，并減壓濃縮近干，加水及助溶劑溶解，稀釋成10g生藥/mL混懸溶液，備 用。取大鼠63只，體重283. 54± 32. 18g，隨機分成7組，每組9只，分別為實驗1 7組，實 驗前16h禁食不禁水，實驗時大鼠以10%烏拉坦lmL/100g ip麻醉，行膽管插管術(shù)后，按試 驗設(shè)計要求十二指腸給藥，(4. 89g生藥/kg)給藥1次，給藥后收集、計算1. 5h時間內(nèi)膽汁 流量，結(jié)果見表l. (3)均勻設(shè)計水平的確定及考查結(jié)果實驗采用U7(76)表，設(shè)定溶解度參數(shù)組成各 參數(shù)為單一因素，分占均勻設(shè)計表第1、2、3列，安排實驗，以大鼠膽汁排泄量為考查指標， 結(jié)果見表l。 表1.利膽作用考查結(jié)果
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實驗號5d6p6t膽汁排泄量(S±S， n—沖L)
114.90014.91.18±0.38
214.52.95.115.81.30±0.44
315.85.37.218.10.46±0.14
415.510.470200.75±0.09
15.85.714.522.21.25±0.42
615.112.322.329.60.30±0.11
715.616.042.347.80.64±0.17 將上述試驗結(jié)果代入Qbasic均勻設(shè)計軟件，進行逐步回歸，膽汁排泄量回歸方程 為 Y = -22. 9940+4. 1416X「2. 2871X2_0. 1691X2「0. 0091X22+0. 1551XA， R2為0. 9648。 最佳理論值為1. 4981mL，優(yōu)化結(jié)果為A(14. 5000) 、B(0. 0000) 、C(0. 0000)，通過查閱有關(guān)文 獻[1]初步確定溶解度參數(shù)為14. 5的溶媒為正戊烷，分別以此為溶媒進行上述提取，并分 別取280±23大鼠36只進行驗證試驗，膽樂(0. 324g/kg)為陽性對照進行試驗，結(jié)果分別 為1.32±0. 45 ;1.29士0. 57 ;1.38士0. 56，陽性對照為1.21±0. 57，結(jié)果顯示篩選結(jié)果利膽 效果較佳，好于對照組，但沒有顯著性差別(p>0.05).最終確定枳殼的正戊烷提取部分為 利膽的活性組群，并作為中間體，展開中藥活性組群物質(zhì)基礎(chǔ)研究。
實施例2 復方活血排石湯鎮(zhèn)痛、利膽活性組群篩選
處方組成赤芍30g香附15g枳殼13g (1)提取溶媒及溶解度參數(shù)的確定參照有關(guān)文獻[1]，溶劑的溶解度參數(shù)范圍選定 為47. 8 15. 3(4. 1868J/cm3)1/2(未修正)，實驗按照公比近似為0. 75梯度分別選擇溶媒 為正庚烷(15. 3)、二氯甲烷(20. 3)、乙醇(26. 5)、甲酰胺(36. 6)、水(47. 8)，共5組，分設(shè)5 個水平安排實驗。 (2)不同溶解度參數(shù)溶媒提取物的制備按照處方配伍比例分別取赤芍、香附、枳殼 3味，粉成細粉(過60目篩)，加十倍量上述溶媒，冷浸24小時，超聲提取40分鐘，濾過，并 減壓濃縮近干，加水及助溶劑溶解，稀釋成10g生藥/mL混懸溶液，備用。
(3)對大鼠膽汁分泌的影響取大鼠50只，體重259. 33±43. 32g，隨機分成5組，每 組10只，分別為實驗1 5組，實驗前16h禁食不禁水，實驗時大鼠以10%烏拉坦lml/100g ip麻醉，行膽管插管術(shù)后，按試驗設(shè)計要求十二指腸給藥，(7. 89g生藥/kg)給藥l次，給藥 后收集、計算1. 5h時間內(nèi)膽汁流量(mL)，結(jié)果見表2. (4)不同劑量配比對小鼠化學致痛的影響取昆明種小鼠50只，早、$各半，體重 18 22g，隨機分為5組，每組10只，分別為實驗1 5組，按均勻設(shè)計表實驗安排20m1/ kgig給藥，給藥45mi后，每只小鼠ipO. 6%醋酸0. lml/10g，觀察20min內(nèi)各組出現(xiàn)的扭體 反應次數(shù)。實驗采用U7 (76)表，設(shè)定溶解度參數(shù)為單一因素，并分占均勻設(shè)計表第1、2、3列， 安排實驗，以小鼠扭體數(shù)為考查指標，結(jié)果見表2。
表2. U7(76)均勻設(shè)計利膽、鎮(zhèn)痛作用考察結(jié)果
6
實驗號5d5p8h5t膽汁排泄量(5士S,iFlO,mL)鵬數(shù)陶,iFlO,次)
115.30015.31.30±0.4412.91±6.82
218.26.36.120.31.28±0.3817.91±5.82
315.88.819.426.50.46±0.1413.39±4.34
417.226.219.036.60.95±0.0910.20±3.27
515.616.042.347.80.34*0.178.40±4.82 將上述膽汁排泄量結(jié)果代入Qbasic均勻設(shè)計軟件，進行逐步回歸，膽汁排泄量 回歸方程為Y = 1. 4130-0. 0636X3+0. 0004X32+0. 0012X2X3， Q = 0. 0583， S = 0. 2414， R2為 0. 9633。最佳理論值為1. 4130mL，優(yōu)化結(jié)果為A(15. 3000) 、B(0. 0000) 、C(0. 0000)，通過查 閱有關(guān)文獻[1]初步確定溶解度參數(shù)為15. 3的溶媒為正庚烷。 將上述扭體次數(shù)結(jié)果代入Qbasic均勻設(shè)計軟件，進行逐步回歸，得回歸方程為Y =1. 4102+0. 1494X3+0. 0487X/+0. 0167X2X3， Q = 0. 1046， S = 0. 3235， R2為0. 9990。最佳 理論值為0. 5878次，優(yōu)化結(jié)果為A(15. 3000) 、 B(26. 2000) 、 C(42. 0000)，通過計算，確定溶 解度參數(shù)為52. 05，查閱有關(guān)文獻[1]，水的溶解度參數(shù)較大為47. 8，與此接近，故選擇水為 溶媒，進行提取。 通過上述實驗篩選所確定的溶媒，進行3批驗證，結(jié)果顯示，膽汁排泄、扭體次數(shù)
優(yōu)于上述實驗組，統(tǒng)計學檢測具有顯著差別(P < 0. 05)。 分別將上述提取物合并，干燥，加敷料制粒，裝膠囊備用，即得。
權(quán)利要求
一種中藥活性組群的篩選方法，其特征在于1)確定待查藥物的藥理學指標；2)以溶解度參數(shù)梯度分布為依據(jù)，選擇一組溶媒；3)將上述待查藥物溶入上述溶媒中，分別提取中藥活性組份；4)將上述中藥活性組份分別進行藥理學試驗，獲得相應的藥理學參數(shù)；5)將溶解度參數(shù)對藥理學參數(shù)進行數(shù)據(jù)回歸，以獲得藥理學最佳理論值和最佳的溶解度參數(shù)，并以該溶解度參數(shù)為依據(jù)，獲取最佳的溶媒；6)將上述確定待查藥物溶于上述最佳的溶媒中，提取中藥活性組份，再進行藥理學評價，以驗證該待查藥物活性。
2. 按照權(quán)利要求l所述中藥活性組群的篩選方法 均度或非均度梯度，且梯度數(shù)量^ 5。
3. 按照權(quán)利要求1所述中藥活性組群的篩選方法 一指標或多個指標。
4. 按照權(quán)利要求l所述中藥活性組群的篩選方法 性回歸，為單元的或多元的。
5. 按照權(quán)利要求l所述中藥活性組群的篩選方法 或復方。
6. 按照權(quán)利要求1所述中藥活性組群的篩選方法 對藥理學參數(shù)進行回歸及數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS或SAS或Qbasic均勻設(shè)計軟件。
7. 權(quán)利要求1所述中藥活性組群的篩選方法，用于經(jīng)實驗確證后提取中藥活性組群用 于中藥活性組分中間體質(zhì)量控制研究；用于中藥活性組分組方配伍研究；用于中藥活性組 分物質(zhì)基礎(chǔ)研究；用于中藥活性組分制備工藝研究；用于中藥活性組分藥代學研究。，其特征在于溶解度參數(shù)的選擇為 ，其特征在于采用藥理學指標是單 ，其特征在于所用的數(shù)據(jù)回歸為線 ，其特征在于所述待查中藥是一味 ，其特征在于所述的以溶解度參數(shù)
全文摘要
一種中藥活性組群的篩選方法，以溶媒溶解度參數(shù)梯度分布作為溶媒選擇手段，以各溶媒提取物所對應的藥理學實驗數(shù)據(jù)為考查指標，以溶解度參數(shù)對藥理學指標進行回歸及理論值優(yōu)化為數(shù)據(jù)處理手段，確定溶媒種類并提取，經(jīng)試驗確證后提取中藥活性組群的實驗方法?？梢詰糜诮?jīng)實驗確證后提取中藥活性組群用于中藥活性組分中間體質(zhì)量控制研究；用于中藥活性組分組方配伍研究；用于中藥活性組分物質(zhì)基礎(chǔ)研究；用于中藥活性組分制備工藝研究；用于中藥活性組分藥代學研究。
文檔編號A61K36/00GK101780112SQ200910010230
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者喬敏, 劉晶, 孟麗, 尤獻民, 張會宗, 李國信, 項紹杰 申請人:遼寧省中醫(yī)藥研究院