專利名稱：：淫羊藿總黃酮在制備靶器官保護藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬中藥領域，涉及中藥有效成分淫羊藿總黃酮的新藥用用途，具體涉及中藥有效成分淫羊藿總黃酮在防治呼吸道過敏性疾病中的新用途，尤其是淫羊藿總黃酮在制備耙器官保護藥物中的用途
背景技術：
：隨著現(xiàn)代工業(yè)化進程的加速，人們生活水平的提高，環(huán)境的改變，呼吸道過敏性疾病(過敏性鼻炎、哮喘)的發(fā)病率不斷升高。過敏性鼻炎、哮喘是一種變態(tài)反應性疾病，臨床以鼻癢、反復噴嚏，清水鼻涕、鼻塞或呼吸困難為特征，發(fā)作時極其痛苦，重癥哮喘可危及生命，嚴重影響人們生活質量，給社會帶來沉重的經濟負擔。呼吸道粘膜變態(tài)反應性炎癥改變是過敏性鼻炎、哮喘患者發(fā)生臨床癥狀的主要病理基礎之一。淋巴細胞是機體發(fā)生變態(tài)反應性炎癥的主要效應細胞，在變應原的刺激下發(fā)生克隆增殖、活化，CD4+T淋巴細胞數(shù)目增多，形成T輔助細胞2(Th2)偏移，是過敏性鼻炎、哮喘患者免疫功能紊亂的主要特征。已有研究表明過敏性鼻炎患者局部的T輔助細胞數(shù)目增多，其中大部分是Th2細胞。Th2細胞分泌IL-4、IL_5、IL-13等細胞因子，介導B細胞分泌IgE，促使肥大細胞脫顆粒，募集嗜酸性粒細胞，最終導致一系列病理生理變化。Thl細胞分泌IFN，和IL-2，促進Th0細胞向Thl分化，同時拮抗Th2型細胞因子的分泌。隨著Th2效應的增強和Thl效應的減弱，其相應的細胞因子比例也發(fā)生改變，尤其IL-4/IFN-Y的比值與疾病的進展、轉歸密切相關，并隨有效治療而下降。二者產生的不平衡與過敏性鼻炎、哮喘患者體內IgE升高關系密切，是導致IgE異常及過敏性鼻炎、哮喘發(fā)作的主要原因。抑制Th2，促進Thl,調節(jié)Th2/Thl細胞比例平衡，是目前治療呼吸道變態(tài)反應性疾病的策略之一。由于變態(tài)反應所致的呼吸道粘膜炎性病變由多種獨立的因素引起，目前的化學合成藥品多是針對其中某一條途徑而設計，因此往往只能獲得部分療效。淫羊藿是我國傳統(tǒng)的中草藥，性溫，味辛、甘甜，入肝、腎二經。有補腎壯陽，強筋骨，祛風濕的作用，用于陽痿，婦人宮冷不孕，腎陽虛性高血壓，更年期癥候群，腰膝無力，牙齒松動，頭發(fā)脫落以及風濕筋骨疼痛等癥。淫羊藿總黃酮(EF)是小檗科植物淫羊蕾epimediumbrevicornummaxim、箭葉淫羊蘼epimedi亂sagit'taUim.(sieb.et.zucc)maxim、柔毛淫羊蘊epimediumpubescens.maxin、巫山淫羊藿印imedium.wushanense.t.s.ying或卓月魚羊淫羊藿印imedium.nakai.的干燥地上部分曬干或陰干后的乙醇提取物，是淫羊藿的主要有效成分，性狀為棕黃色精細粉末，具有增加腦血流量和冠脈流量、抗腫瘤、抗氧化和增強機體免疫力等作用。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供中藥有效成分淫羊藿總黃酮在防治呼吸道過敏性疾病中的新用途，尤其是淫羊藿總黃酮在制備靶器官保護藥物中的用途。本發(fā)明的淫羊藿總黃酮采用常規(guī)水提法提取取朝鮮淫羊藿epimedium.nakai的干燥地上部分，曬干后打成粗粉，加水煎煮，合并提取液，用大孔吸附樹脂柱(內徑10cm，長100cm)純化，以的蒸餾水洗脫，流速為2BV/h,棄去水洗脫液，再以60。/。乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，相對密度為1.30-1.35,減壓干燥、粉碎、過篩，即得所述的淫羊藿總黃酮(EF)。按2005版藥典紫外一可見分光光度法，以淫羊藿苷為標準品，在270nm波長下測定吸光度，計算總黃酮含量；結果在0.15mg0.52rug范圍內，淫羊藿苷mg數(shù)與吸光度A值線性關系良好,平均回收率為100.1%,RSD=1.61%,r=0.998。本發(fā)明的淫羊藿總黃酮經動物實驗，結果表明，能改善致敏實驗小鼠臨床癥狀和局部細胞浸潤，調節(jié)血清細胞因子和Thl/Th2平衡；能抑制致敏實驗大鼠脾淋巴細胞增殖的量效關系；抑制D10.G4.1細胞系增殖分化，調節(jié)相應細胞因子。實驗結果證實，所述的淫羊藿總黃酮具有提高機體免疫力，防治變態(tài)反應狀態(tài)呼吸道炎癥的作用。本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮可作為藥物制劑的原料；進一步制備靶器官保護藥物，尤其是制備提高機體免疫力、防治呼吸道過敏性的藥物。圖1是淫羊藿總黃酮對致敏小鼠肺組織形態(tài)學的影響，其中，1正常組個別淋巴細胞浸潤，未見其他異常；2模型組中等量淋巴細胞浸潤，細支氣管平滑肌增厚，部分細支氣管上皮增生；3EF組少量淋巴細胞浸潤，個別細支氣管平滑肌增厚；5地塞米松組個別淋巴細胞浸潤，未見明顯細支氣管平滑肌增厚。圖2是淫羊藿總黃酮對抑制致敏大鼠脾淋巴增殖量效關系的影響。具體實施例方式實施例1淫羊藿總黃酮對致敏小鼠行為學、形態(tài)學以及血清細胞因子的影響實驗提取制備淫羊藿總黃酮取朝鮮淫羊藿epimedium.nakai的干燥地上部分，曬干后打成粗粉，加10倍水量煎煮2小時，共3次，合并提取液，用大孔吸附樹脂柱(內徑10cm，長100cm)純化，以5倍柱床體積量的蒸餾水洗脫，流速為2BV/h，棄去水洗脫液，再以10倍柱床體積量的60%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集洗脫液，回收乙醇并濃縮至稠膏，相對密度為1.30-1.35，減壓干燥、粉碎、過篩，即得所述的淫羊藿總黃酮(EF)。按2005版藥典紫外一可見分光光度法，以淫羊藿苷為標準品，在270nm波長下測定吸光度，計算總黃酮含量；結果在0.15mg0.52rug范圍內，淫羊藿苷mg數(shù)與吸光度A值線性關系良好，平均回收率為100.1%，RSD=1.61%，r=0.998。采用6周齡SPF級雄性BALB/C小鼠，體重20士2g，隨機分成正常對照組、模型對照組、淫羊藿總黃酮組和地塞米松組每組各6只。模型組和各用藥組小鼠于第一天腹腔注射卵清蛋白(OVA)100ug與氫氧化鋁凝膠混合液0.3ml使之致敏，第7天、第14天用同樣方法加強致敏2次。第21天至第27天每日給予2.5%0VA生理鹽水溶液20yl滴鼻激發(fā)。正常組給予生理鹽水腹腔注射及滴鼻，方式與其它各組相同。將淫羊藿總黃酮和地塞米松粉末用無菌水溶解，配成混懸液(淫羊藿總黃酮60mg/Kg,地塞米松組為lmg/Kg)，各用藥組小鼠從第一天開始灌服，至第27天結束，每日每只小鼠灌胃體積0.5ml，正常組和模型組小鼠給予飲用水0.5ml灌胃。觀察淫羊藿總黃酮對致敏小鼠行為學的影響-在造模與給藥結束后(即第27天)，對各組小鼠滴鼻結束后5min內的噴嚏及抓鼻次數(shù)進行計數(shù)。結果顯示模型組小鼠無論是噴嚏數(shù)還是抓鼻數(shù)都顯著增加；淫羊藿總黃酮組小鼠噴嚏數(shù)、抓鼻數(shù)均明顯低于明顯模型對照組；地塞米松組噴嚏數(shù)、抓鼻數(shù)均明顯低于明顯模型對照組。結果表明經淫羊藿總黃酮、地塞米松治療，致敏小鼠的臨床癥狀均有不同程度地改善。表1是淫羊藿總黃酮對致敏小鼠噴嚏及抓鼻數(shù)的影響(次/5min;±S)。_組另lj_^_噴嚏數(shù)_抓鼻數(shù)_正常對照組60.40土0.69"0.10±0.32"模型對照組68.33±1.735.56±2.01淫羊藿總黃酮組65.36土3.01'2.55±1.75"地塞米松組62.30土0.95"1.60±2.4廣注與模型對照組比較*P<0.05;**P<0.01觀察淫羊藿總黃酮對致敏小鼠肺組織形態(tài)學的影響造模28天后，小鼠經戊巴比妥鈉麻醉，取肺組織，經福爾馬林固定，制作石蠟、切片、常規(guī)he染色并觀察。光鏡下觀察肺組織內淋巴細胞浸潤、支氣管平滑肌和上皮增生、支氣管腔內滲出情況，并對每個組織標本隨機選取5個視野，進行嗜酸性粒細胞計數(shù)，取其均值。照片采用德國zeiss顯微鏡拍攝。結果顯示(圖l):正常對照組小鼠肺組織未見明顯異常；模型對照組小鼠肺組織見大量嗜酸性細胞的浸潤，中等量淋巴細胞浸潤，細支氣管平滑肌增厚，部分細支氣管縮窄，上皮增生、脫落；淫羊藿總黃酮組小鼠嗜酸性粒細胞降低，淋巴細胞浸潤減少；地塞米松組小鼠肺組織個別淋巴細胞浸潤，未見明顯細支氣管平滑肌增厚。結果證實經淫羊藿總黃酮、地塞米松治療，致敏小鼠肺部變應性炎癥有不同程度改善。表2是淫羊藿總黃酮對致敏小鼠肺組織嗜酸性粒細胞計數(shù)的影響(S土s)。表2組另lj_2_嗜酸細胞數(shù)(個/HP)正常對照組61.97±2.42'模型對照組619.00±6.36淫羊藿總黃酮62.36±1.02*地塞米松組61.87±1.05'注與模型組比較*P<0.01觀察淫羊藿總黃酮對致敏小鼠血清細胞因子的影響-造模28天后，小鼠經戊巴比妥鈉麻醉取血，3000轉/分，離心15分鐘，分離血清，-20。C留存，待測細胞因子。小鼠血清IL-4、IL-5、IFN-y、TGF-P采用Biosource公司小鼠eia試劑盒，采用雙抗體夾心abc-elisa法，用抗小鼠單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的il-4、il-5、ifn-y、tgf-e與單抗結合，加入生物素化的抗小鼠IL-4、IL-5、IFN-y、TGF-P形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Str印tavidin與生物素結合，加入酶底物0PD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測0D值，IL-4濃度與0D值成正比，通過繪制的標準曲線求出標本中IL-4、IL-5、IFN-y、TGF-e濃度。結果顯示與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清IFN-y顯著降低，IL-4、IL-5顯著升高，TGF-e含量顯著下降；與模型對照組比較，淫羊藿總黃酮組IFN-y回升，IL-4、IL-5下降，TGF-P明顯升高；地塞米松組與模型對照組比較，IL-4、IL-5顯著降低，TGF-P明顯升高。結果證實淫羊藿總黃酮能調節(jié)致敏小鼠血清細胞因子向正常狀態(tài)轉化，與淫羊藿總黃酮能改善致敏小鼠行為學和呼吸道變應性炎癥相一致；地塞米松也有該作用。表3是淫羊藿總黃酮對小鼠血清IFN-y、IL-4、IL-5含量的影響(；士s)。表4淫羊藿總黃酮對小鼠血清IL-10、TGF-e含量的影響(S土s)。表^_組另ij_nIFN-y(pg/ml)_IL-4(pg/ml)IL-5(pg/ml)正常對照組6109.43±18.15"49.90土5.54"21.51土1.54"模型對照組648.50±11.3773.53±8.4739.47±13.74淫羊藿總黃酮組685.89±10.40*66.21±5.66*26.63±3.48*地塞米松組660.37±15.1257.68±6.12"21.95土3.01"注與模型組比較，*尸<0.05,**尸<0.01表4組另ljnIL-IO(pg/ml)TGF-P(ng/ml)正常對照組620.20±0.81*33.77±1.82"模型對照組614.63±4.8125.55±5.59黃芩苷組615.90±4.3141.66士5.49"淫羊藿總黃酮組622.95土1.45'32.03±2.98"地塞米松組638.65±1.14**33.63±4.37'*注與模型組比較，'尸<0.05,''*尸<0.01致敏小鼠脾臟Thl/Th2流式熒光抗體檢測造模28天后，按常規(guī)方法用Ficoll淋巴細胞分離液以梯度密度離心法分離脾臟淋巴細胞。(1)'淫羊藿總黃酮對小鼠脾臟Thl(IFN-y+CD4+)、Th2(IL-4+CD4+)細胞分類計數(shù)的影響調整細胞濃度為5X107ml，接種于24孔板，每孔lml，以佛波醇乙酯(PMA終濃度20ng/ml)為剌激劑培養(yǎng)12小時，最后4小時加入離子霉素(1Wg/ml)及蛋白轉運抑制劑莫能霉素(2"mol/ml)共培養(yǎng)，收集后分別標記FITCanti-mouseCD4和PEanti-mouseIFN-Y或PEanti-mouseIL_4。收集細胞等分于2個離心管中用染色緩沖液洗滌l次(2000r/min，5min)后棄上清，每管加入FITCanti-mouseCD4，細胞混勻，室溫避光放置30分鐘。加入染色緩沖液洗滌，2000r/rain離心5min后棄上清，每管加入500ul預冷(4°C)固定液，室溫孵育10min,離心后棄上清，每管加入1.5ml破膜劑，室溫避光放置15min，離心去上清，加PEanti-mouseIFN-Y或PEanti-mouseIL-4，室溫避光放置30min，1ml洗滌液洗滌2次，離心去上清，用350ul固定液固定，24h內進行流式細胞儀檢測分析。結果表明與正常組小鼠比較，模型組Th2細胞百分率及Th2/Thl比值顯著增高，Thl細胞百分率顯著下降；與模型組比較，淫羊藿總黃酮組Thl細胞百分率顯著增高，Th2細胞百分率、Th2/Thl比值均顯著下降。結果證實淫羊藿總黃酮能調節(jié)致敏小鼠T輔助細胞亞群向正常狀態(tài)轉化，與淫羊藿總黃酮能改善致敏小鼠行為學和呼吸道變應性炎癥、血清細胞因子向正常狀態(tài)轉化相一致；地塞米松也有此作用。表5是淫羊藿總黃酮對小鼠脾臟TH1/TH2細胞分類計數(shù)的影響(；±s)。表5組另lj_2_TH1(%)_TH2(%)_TH2/TH1正常對照63.39±0.48*1.24±0.17"0.39±0.11"模型對照62.69±0.442.51±0.580.95±0.23淫羊藿總黃酮63.85士0.4(T1.69土0.4r0.46±0.21*地塞米松63.02±0.761.21土0.52"_0.41±0.16"注與模型組比較，*尸<0.05，"尸<0.01(2)淫羊藿總黃酮對小鼠脾臟CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞計數(shù)的影響取1X106個脾臟淋巴細胞，用直接染色法標記FITCanti-mouseCD4、PEanti-mouseCD25。收集細胞于離心管中，用染色緩沖液洗滌(2000r/rain，5min)后棄上清，每管加入FITCanti-mouseCD4和PEanti-mouseCD25,細胞混勻，室溫避光放置30分鐘。加入染色緩沖液洗滌2次，2000r/min離心5min后棄上清，用350ul固定液固定，進行流式細胞儀檢測分析。8另取1X1()6個細胞，經表面標記FITCanti-mouseCD4后，破膜后胞內染AlexaFluor647anti-mouse/ratFoxp3。管中加入FITCanti-mouseCD4,細胞混勻，室溫避光放置30分鐘。加入染色緩沖液洗滌，2000r/min離心5min后棄上清，每管加入500ul預冷(4°C)固定液，室溫孵育10min。離心后棄上清，每管加入1.5ml破膜劑，室溫避光放置15min。離心去上清，加AlexaFluor647anti-mouse/ratFoxp3，室溫避光放置30min，lml洗滌液洗滌2次，離心去上清，用350ul固定液固定，進行流式細胞儀檢測分析。結果顯示與正常組小鼠比較，模型組CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞顯著下降；與模型組比較，EF組CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞顯著升高。結果證實淫羊藿總黃酮能調節(jié)致敏小鼠脾臟CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞分類計數(shù)向正常狀態(tài)轉化，與淫羊藿總黃酮能改善致敏小鼠行為學和呼吸道變應性炎癥、血清細胞因子、T輔助細胞亞群向正常狀態(tài)轉化相一致；地塞米松也有該作用。表6是淫羊藿總黃酮對小鼠脾臟CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞分類計數(shù)的影響G±s)。表6組另ij_5_CD4tD25+T(%)_Foxp3WT(%)正常對照組68.12±2.56*4.40土1.67"模型對照組65.98±0.782.66±0.79淫羊藿總黃酮組67.22±1.12'3.29土0.60'地塞米松組_§_7.38±0.48*_4.62±1.69"注與模型組比較，*尸<0.05，材尸<0.01致敏小鼠脾臟CD4+CD25+T細胞抑制功能檢測(1)淫羊藿總黃酮對小鼠脾臟CD4+CD25+T抑制模型組CD4+CD25—T細胞增殖的影響用CD4+CD25+T細胞磁珠分離試劑盒分離脾臟CD4+T細胞、CD4+CD25+T及CD4+CD25—T細胞。小鼠全脾細胞經3000Rad放射性照射后用作抗原遞呈細胞(APC5*106/ml)。在抗原OVA(100ug/ml)刺激下，加入APC后各組小鼠CD4+CD25+T細胞分別與模型組CD4tD25—T細胞(5W07ml)按1:4比例混合培養(yǎng)72小時。其中，部分培養(yǎng)于24孔板中，檢測上清細胞因子IFN-y、IL-4、IL-5含量；另外一部分培養(yǎng)于96孔板中，在培養(yǎng)結束前12小時摻入M-TdR，檢測細胞增殖。每個樣本三復份。用磁珠分離法，分出小鼠脾臟CD4+CD25+T細胞，純度〉95%。結果表明各組小鼠脾臟CD4+CD25+T對模型組CD4+CD25T的增殖均有抑制能力。與正常組比較，模型組CD4+CD25+T對模型組CD4+CD25—T細胞增殖的抑制能力減弱。與模型組比較，EF組CD4+CD25+T對模型組CD4+CD25—T細胞增殖的抑制能力增強，地塞米松組CD4tD25+T對模型組CD4+CD25T細胞增殖的抑制能力增強。結果證實淫羊藿總黃酮能調節(jié)致敏小鼠脾臟CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞分類計數(shù)向正常狀態(tài)轉化，與淫羊藿總黃酮能改善致敏小鼠行為學和呼吸道變應性炎癥，使血清細胞因子、T輔助細胞亞群向正常狀態(tài)轉化相一致；地塞米松也有該作用。表7是各組小鼠脾臟CD4+CD25+T與模型組CD4+CD25—T共培養(yǎng)CPM計數(shù)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注control為模型組小鼠脾臟CM+CD25T細胞。其余組均為各組CD4+CD25+T與control細胞共培養(yǎng)CPM計數(shù)。與control比較，厶尸<0.05，厶，<0.01;與模型組比較，*尸<0.05，**尸<0.01(2)淫羊藿總黃酮對小鼠脾臟CD4+CD25+T對CD4+CD25T細胞產生細胞因子的影響上述細胞培養(yǎng)上清液檢測細胞因子，方法同上。結果顯示各組小鼠脾臟CD4+CD25+T對CD4+CD25—T產生細胞因子IFN-y、IL-4、IL-5均有抑制能力。與正常組比較，模型組CD4+CD25+T對CD4+CD25—T產生細胞因子的抑制能力減弱。EF組CD4+CD25+T對CD4+CD25—T細胞產生細胞因子的抑制能力增強。地塞米松組CD4+CD25+T對CD4+CD25—T細胞產生細胞因子的抑制能力增強。結果證實淫羊藿總黃酮能使致敏小鼠脾臟CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T分泌的細胞因子向正常狀態(tài)轉化，與淫羊藿總黃酮能改善致敏小鼠行為學和呼吸道變應性炎癥，使血清細胞因子、T抑制細胞亞群、脾臟CD4+CD25+T及。04卞0鄧3+T細胞分類計數(shù)向正常狀態(tài)轉化相一致；地塞米松也有這一作用。表8是各組小鼠CD4+CD25+T對CD4+CD25T細胞產生細胞因子的影響(；土s)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注control為模型組小鼠脾臟CD4+CD25—T細胞。其余組均為各組CD4+CD25'T與control細胞共培養(yǎng)CPM計數(shù)。與control比較，&尸<0.05，*V<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**尸<0.01實施例2.淫羊藿總黃酮抑制致敏大鼠脾淋巴細胞增殖的量效關系實驗淫羊藿總黃酮粉末20mg用200ulDMS0溶解后，調整PH值為7.0，再用RPMI-1640定容，濃度為10mg/ral，DMS0含量小于1%>。淫羊藿總黃酮溶液經0.2ura微濾器過濾除菌后，用RPMI-1640倍比稀釋至0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0g/L。6只SD雄性大鼠250g，用卵白蛋白(0VA)lmg、氫氧化鋁凝膠0.5ml的生理鹽水混懸液lml腹腔注射使動物致敏，七天后用同樣的方法加強致敏一次，至28天，按常規(guī)方法，用Ficoll淋巴細胞分離液分離脾臟淋巴細胞，調整細胞濃度為2X107ml，接種于96孔板，每孔100u1。加入0VA(終濃度25ug/ml)促進淋巴細胞增殖，每孔10iU。加入淫羊藿總黃酮溶液,每孔10y1，每個樣品均做雙復份，培養(yǎng)48h后加3H-TdRluCi/孔，繼續(xù)培養(yǎng)18h后，將細胞收集在濾膜上，通過液閃計數(shù)儀測cpm數(shù)。結果顯示(圖2):隨著淫羊藿總黃酮劑量的加大，因致敏引起的脾淋巴細胞增殖被逐步地抑制，并呈現(xiàn)出良好的量效關系。結果證實淫羊藿總黃酮在抑制致敏引起的脾淋巴細胞增殖時有明顯的量效關系。實施例3.淫羊藿總黃酮抑制D10.G4.1細胞系增殖分化，調節(jié)相應細胞因子的平衡實驗設淫羊藿總黃酮低、中、高劑量組(0.5ug、5ug、50ug/ml)、地塞米松組(地塞米松郭」量為lug/ml)和空白對照組。采用的D10.G4.1細胞系(ATCCNUMBER:TIB-224)購自ATCC公司。淫羊藿總黃酮粉末用少量PBS溶解后，調整PH值為7.0，再用RPMI-1640定容,濃度為10mg/ml。地塞米松用少量聚乙二醇溶解，再用RPMI-1640定容，濃度為lmg/ml，聚乙二醇含量小于1%。。上述藥品經0.2um微濾器過濾除菌后，4'C冰箱保存。兩周內使用，使用時稀釋至所需濃度。觀察淫羊藿總黃酮.對D10.G4.1細胞增殖的影響實驗前用Ficoll淋巴細胞分離液分離D10.G4.1細胞，去除碎片與死細胞。調整D10.G4.1細胞濃度為2Xl()S細胞/nil,接種于96孔板，每孔100ixl。加入APC/10ul以刺激D10.G4.1細胞，然后分別加入各藥液10y1，對照組加同體積RPMI-1640培養(yǎng)液，各樣品均做三復份,培養(yǎng)72h，在最后18h加3H-TdRluCi/孔。而后用多頭吸濾器將細胞收集在濾膜上，通過液閃計數(shù)儀測cpm數(shù)。實驗另重復一次。結果顯示淫羊藿總黃酮(EF)在0.5ug/ml、5ug/ml對細胞增殖無明顯抑制作用，50ug/ml能顯著抑制D10G4.1細胞增殖；地塞米松能明顯抑制D10G4.1細胞增殖。結果證實淫羊藿總黃酮在一定濃度內對D10G4.1細胞增殖有抑制作用。表9是淫羊藿總黃酮對D10G4.l細胞增殖的影響(；士s)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注與對照比較，*尸<0.05，''*尸<0.01觀察淫羊藿總黃酮對D10G4.1細胞分泌細胞因子的影響-調整細胞濃度為2Xl()5細胞/ml，接種于24孔板，每孔lml。分別加入各組濃度藥物，以培養(yǎng)液為對照，各樣品均做三復份。培養(yǎng)72h，離心收集培養(yǎng)上清液，保存于-20r冰箱。細胞因子IFN-y、IL-4、IL-5、TGF-0檢測應用ELISA試劑盒，根據(jù)說明書指示操作。實驗重復二次。"結果顯示淫羊藿總黃酮組與對照組相比培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5水平明顯降低;TGF-P水平明顯升高;而對IFN-y無變化。地塞米松組與對照組相比培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5、IFN-y水平明顯下降，而TGF-e水平明顯上升。結果證實淫羊藿總黃酮不僅能抑制D10G4.1細胞增殖，而且能改變其所分泌的細胞因子。表10是淫羊藿總黃酮對D10G4.1細胞培養(yǎng)上清IL-4、IL-5、IFN-y、TGF-P含量變化(pg/ml，；c土s)。表10分組nIL-4IL-5IFN-、/TGF-P對照組688.98±6.9781.80±13.7078.08±6.942279.00±585.50EF低劑量組667.02±5.45*63.15±39.8467.51±7.63*3388.00±406.5"EF中劑量組664,11±4.28"57.41±9.54'58.71±13.97**3844.00±682.5"EF高劑量組663.12士1.43"55.49±16.05*58.55±6.76"3804.5±1092.0"地塞米松組660.22±4.3廣46.06±5.26'47.02±3.19***5336.50±660.00"注與對照比較，*尸<0.05,**尸<0.011權利要求1、中藥有效部位淫羊藿總黃酮在制備保護靶器官藥物中的用途。2、按權利要求1的用途，其中所述的靶器官是致敏狀態(tài)下的呼吸道粘膜和脾臟淋巴細胞。3、按權利要求1的用途，其中所述的靶器官保護是改善致敏癥狀和呼吸道變應性炎性細胞浸潤，調節(jié)相應血清細胞因子、T抑制細胞亞群、脾臟CD4+CD25+T及CD4+Foxp3+T細胞分類計數(shù)向正常狀態(tài)轉化。4、按權利要求l的用途，其中所述的靶器官保護是抑制D10.G4.l細胞系增殖分化，并調節(jié)相應細胞因子。5、淫羊藿總黃酮在制備防治呼吸道變應性炎癥藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明屬中藥領域，涉及中藥有效部位淫羊藿總黃酮在制備靶器官保護藥物中的新用途，具體涉及淫羊藿總黃酮在制備防治呼吸道變態(tài)反應性疾病藥物中的新用途。本發(fā)明所述的淫羊藿總黃酮經動物實驗，結果證明，所述淫羊藿總黃酮具有改善致敏小鼠臨床癥狀和呼吸道變應性炎性細胞浸潤、抑制致敏狀態(tài)下的脾淋巴細胞增殖、調節(jié)Th1/Th2平衡和相應細胞因子，以及血清細胞因子向正常狀態(tài)轉化；抑制D10.G4.1細胞系增殖分化、調節(jié)相應細胞因子的平衡。本發(fā)明淫羊藿總黃酮可作為藥物制劑的原料，制備保護靶器官的藥物及制備防治呼吸道變態(tài)反應性疾病的藥物。文檔編號A61K36/185GK101450093SQ20081020784公開日2009年6月10日申請日期2008年12月25日優(yōu)先權日2008年12月25日發(fā)明者劉閏紅,張衛(wèi)東,張新民,張素琴,顧一峰申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院