專利名稱：：抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及單克隆抗體領域，尤其涉及抗人甲狀腺球蛋白的特異性單克隆抗體及其應用。
背景技術：
：甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率女性多于男性。目前對分化型的甲狀腺癌常規(guī)以碘放射治療為主要方法，但對不能攝取mI的分化差和未分化型的甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移灶的定性、定位顯像及治療尚無有效方法。隨著雜交瘤技術的發(fā)展，腫瘤放射免疫診斷和導向治療作為一種系統(tǒng)的特異靶向性的腫瘤診斷和治療手段，正受到人們的重視。近年來，隨著高親和力單克隆抗體(McAb)的制備，核素標記技術的改進，腫瘤微環(huán)境的改善，腫瘤放射免疫診斷和靶向治療的研究已經(jīng)取得了令人矚目的成績。單克隆抗體(McAb，簡稱單抗)通過特殊的識別系統(tǒng)辨別出腫瘤細胞致命的信息，識別它們特異的靶腫瘤組織表面的蛋白結(jié)構(gòu)。但是，對于由小鼠或大鼠的B細胞產(chǎn)生出來的單抗，對人類機體而言，其自身就是強抗原。鼠源性單克隆抗體在應用于人體治療時有諸多限制一是不能有效地激活人體中補體和Fc受體相關的效應系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(h咖anantigenmouseantibody,HAMA);三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。因此，在保持對特異性抗原表位高親和力的基礎上進行人源化改造，減少異源抗體的免疫原性，成為單克隆抗體研究的熱點。目前在甲狀腺癌的診斷和治療領域，迫切需要提供一種特異性強、同時免疫原性低的針對人甲狀腺球蛋白(humanthyroglobulin，hTg)的單克隆抗體，從而使不能攝取mI的分化差和未分化型的甲狀腺癌及其轉(zhuǎn)移灶的定性、定位顯像及治療獲得實現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的提供一種特異性抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性檢測人甲狀腺球蛋白的試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白，它具有VH鏈，VJ連的互補決定區(qū)CDR的氨基酸序列選自下組SEQIDN0:3所示的CDR1，SEQIDN0:4所示的CDR2，SEQIDN0:5所示的CDR3。在另一優(yōu)選例中，VH鏈具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫球蛋白，它具有、鏈，、鏈的互補決定區(qū)CDR的氨基酸序列選自下組SEQIDN0:6所示的CDR1，SEQIDN0:7所示的CDR2，SEQIDN0:8所示的CDR3。在另一優(yōu)選例中，Vl鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種免疫球蛋白，其VH鏈和VJ連分別具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物具有VH鏈，該VH鏈的CDR的氨基酸序列選自下組SEQIDN0:3所示的CDR1，SEQIDNO:4所示的CDR2，SEQIDNO:5所示的CDR3;或者，該免疫偶聯(lián)物具有、鏈，該、鏈的CDR的氨基酸序列選自下組SEQIDN0:6所示的CDR1，SEQIDNO:7所示的CDR2，SEQIDN0:8所示的CDR3。在另一優(yōu)選例中，所述的免疫偶聯(lián)物是免疫毒素。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)如上所述的免疫球蛋白VH鏈；VH鏈的互補決定區(qū)CDR的氨基酸序列選自SEQIDNO:3所示的CDRl，SEQIDNO:4所示的CDR2，和SEQIDNO:5所示的CDR3;較佳地，VH鏈具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；如上所述的免疫球蛋白、鏈；、鏈的互補決定區(qū)CDR的氨基酸序列選自SEQIDNO:6所示的CDRl，SEQIDNO:7所示的CDR2，和SEQIDNO:8所示的CDR3;較佳地，VL鏈具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或如上所述的免疫球蛋白；其VH鏈和、鏈分別具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測人甲狀腺球蛋白的試劑盒，所述的試劑盒含有如上所述的免疫球蛋白或如上所述的免疫偶聯(lián)物；所述免疫球蛋白的VH鏈和VJ連分別具有SEQIDNO:l和SEQIDN0:2所示的氨基酸序列；所述免疫偶聯(lián)物具有VH鏈，該VH鏈的CDR的氨基酸序列選自SEQIDNO:3所示的CDRl，SEQIDNO:4所示的CDR2，和SEQIDNO:5所示的CDR3;或者，所述免疫偶聯(lián)物具有、鏈，該VH鏈的CDR的氨基酸序列選自SEQIDNO:6所示的CDRl，SEQIDNO:7所示的CDR2，和SEQIDNO:8所示的CDR3。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種特異性強、同時免疫原性低的針對人甲狀腺球蛋白(humanthyroglobulin，hTg)的單克隆抗體，從而使不能攝取131I的分化差和未分化型的甲狀腺癌及其轉(zhuǎn)移灶的定性、定位顯像及治療獲得實現(xiàn)。圖1顯示了鼠源性單克隆抗體mTg-60雜交瘤細胞株重鏈和輕鏈基因的電泳圖；其中1為重鏈基因，2為輕鏈基因，M為分子量為DL-2000標準物。圖2顯示了人源化單克隆抗體重鏈和輕鏈基因的電泳圖；其中1為重鏈基因，2為輕鏈基因，M為分子量為DL-2000標準物。圖3顯示了人源化hTgVH、VL基因克隆用BamHI和HindIII雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳分析；其中1、2.pCMV_CH-VH克隆用BamHI和Hindi11雙酶切；3、4.pVL_CL_VL克隆用BamHI和Hindi11雙酶切基因；M.DL-2000標準物。圖4顯示人源化單克隆抗體的電泳圖；其中1為純化的抗體，2為陽性對照人IgG，M為標準物。圖5顯示了人源化單克隆抗體的電泳圖；其中1為純化的抗體，2為陽性對照人IgG，3為陰性對照無血清培養(yǎng)基，M為標準物。圖6顯示了熒光標記的人源化單克隆抗體與細胞內(nèi)人甲狀腺球蛋白的結(jié)合；其中[OO46]A為陰性對照(未加一抗)，B為純化抗體(一抗加純化后抗體)。具體實施例方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，利用分泌抗人甲狀腺球蛋白的雜交瘤細胞株獲得鼠源性單克隆抗體mTg-60，此抗體經(jīng)多年研究證實穩(wěn)定性好，和人甲狀腺球蛋白結(jié)合的特異性強。進一步地，發(fā)明人根據(jù)RT-PCR擴增出的鼠源性單克隆抗體mTg-60的Vj連和Vj連基因，經(jīng)基因測序分析，設計出人源化抗體的引物，以mTg-60VH鏈和、鏈基因為模板，PCR擴增獲得人源化抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體hTg-37VH鏈和、鏈基因，并將其克隆入真核表達載體，轉(zhuǎn)染CHO細胞，小量表達人源化抗人甲狀腺球蛋白抗體hTg-37，并成功篩選到能穩(wěn)定分泌人源化抗人甲狀腺球蛋白抗體hTg-37的CHO細胞株。該人源化抗人甲狀腺球蛋白抗體活性檢測證明其保持了鼠源性單抗對特異抗原表位的高親和力。在此基礎上完成了本發(fā)明。定義如本文所用，"鼠源性單克隆抗體"是指由小鼠的B淋巴細胞分化形成的漿細胞合成、分泌的，針對一種抗原決定簇的抗體。即應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫小鼠獲得的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞，這種融合細胞即具有瘤細胞不斷分裂的能力，又具有免疫細胞能產(chǎn)生抗體的能力，融合后的雜交細胞(雜種瘤)產(chǎn)生大量的鼠源性單克隆抗體。如本文所用，"人源化單克隆抗體"(humanizedmonoclonalantibody)都是指利用基因工程技術擴增出鼠源性單克隆抗體輕、重鏈可變區(qū)或?qū)⒖贵w的VH和VL序例人工合成或定點突變，然后與表達載體中人免疫球蛋白恒定區(qū)拼接后制備的單克隆抗體。制備的抗體具有鼠源單抗的特異性，又基本消除了鼠源單抗異種蛋白的免疫原性。如本文所用，"免疫毒素"指對靶細胞有特異性親和力和殺傷力的物質(zhì)，例如免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治療分子與人源化單抗hTg-37或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。具體的例子有例如^I-hTg-37，MTX-hTg-37偶聯(lián)物等。此處鑒定的V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)(complementaritydeterminingregion，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與此處鑒定的CDR具有90%以上5(較佳地95%以上)的同源性。本發(fā)明的鼠源性單克隆抗體mTg-60或其片段可用于甲狀腺癌的放射性定位的診斷成像，還可用于免疫治療，例如通過直接或間接地將鼠源性單克隆抗體mTg-60或其片段與化學治療劑、或放療劑相連從而使其能直接導向腫瘤細胞。為了具有臨床價值，單克隆抗體應滿足下列標準l)標記表面，即結(jié)合于活腫瘤細胞，2)識別細胞周期非依賴的腫瘤特異性抗原，和3)在體外能同樣好地與腫瘤細胞結(jié)合，而不論它們的培養(yǎng)活力、生長特征或培養(yǎng)密度。本發(fā)明的鼠源性單克隆抗體mTg-60滿足這些標準。本發(fā)明的人源化單抗hTg-37或其片段不但具有上述鼠源性單克隆抗體mTg-60或其片段的特點，同時還降低了鼠源性單克隆抗體mTg-60對于人體而言的強免疫原性。本發(fā)明還提供了編碼鼠源性單克隆抗體mTg-60或人源化單抗hTg-37的可變區(qū)的輕鏈和重鏈的cDNA序列。本發(fā)明包括相應的氨基酸序列和具有所述特征的可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物)，只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領域技術人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與鼠源性單克隆抗體mTg-60、人源化單抗hTg-37、或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與本發(fā)明的鼠源性單克隆抗體mTg-60、人源化單抗hTg-37、或其片段結(jié)合的細胞表面標記物或抗原。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab')2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明還提供了編碼上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。本發(fā)明的鼠源性單克隆抗體mTg-60或人源化單抗hTg-37的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，按本領域技術人員已知的常規(guī)方法制備模板，通過擴增而得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體?！┇@得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高6等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、C0S7、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結(jié)合。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測甲狀腺球蛋白的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯(lián)物，或其活性片段。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1鼠源性單克隆抗體mTg-60的制備和純化小鼠免疫取Tg蛋白(lmg/mL)與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，經(jīng)皮下多點注射免疫8周齡雌性BALB/c小鼠，間隔2周用弗氏不完全佐劑乳化抗原加強免疫2次，細胞融合前3天用200g純化蛋白抗原腹腔注射進行加強免疫。細胞融合及雜交瘤細胞的篩選免疫鼠脾細胞與SP2/0細胞進行融合。融合后用HAT選擇培養(yǎng)基于37t:、50mL/LC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合后第3、6d半量換HAT選擇培養(yǎng)基，第9d換HT選擇培養(yǎng)基。待融合細胞長滿1/4至1/2孔時，用Tg蛋白作為檢測抗原，以10ug/mL包被96孔板，對融合細胞培養(yǎng)上清液進行間接ELISA檢測，以篩選陽性細胞克隆。將初步篩選出的陽性細胞用梯度稀釋法進行克隆，以Tg蛋白作為抗原進行ELISA檢測，得到分泌特異性抗體的雜交瘤細胞克隆。單克隆抗體腹水的制備取8周齡昆明小鼠10只，腹腔內(nèi)注入弗氏不完全佐劑(0.2mL/只)，1周后將擴大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細胞分別以1X106/mL劑量注入每只小鼠腹腔，約1周后密切觀察小鼠精神狀態(tài)與腹腔變化，當小鼠腹腔增大時無菌抽取腹水，10000r/min離心取上清。將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清與腹水分別做10倍梯度稀釋，以Tg蛋白為抗原，采用ELISA方法測定抗體效價。單克隆抗體純化取適量腹水，10000rpm/10min離心，取500uL上清，用PBS稀釋8倍，13000rpm/20min離心，取上清過0.22um微孔濾膜，以1.OmL/min流速上經(jīng)過平衡、再生好的ProteinG親和層析柱純化，洗脫液(甘氨酸_HCL，pH2.7)—步洗脫，流速0.5mL/min。接收mAb洗脫峰。實施例2鼠源性單克隆抗體mTg-60的功能鑒定功能檢測采用固相放免法。檢測方法獲得上海市科技成果完成證書(登記號931000948)。實施例3人源化單抗hTg-37的制備和純化(1)人源化單抗hTg-37的制備1、使用PCR技術，擴增鼠單克隆抗體MTg-60雜交瘤細胞株重鏈和輕鏈基因，見圖1;2、經(jīng)過基因測序，測定重鏈、輕鏈基因的序列(SEQIDNO:13和14)，設計人源化引物(重鏈SEQIDNO:9禾P10)禾P(輕鏈SEQIDNO:11禾P12);3、擴增人源化單抗hTg-37重鏈、輕鏈基因，見圖2;4、將回收的人源化的VH、VL基因PCR產(chǎn)物BamHI和HindIII雙酶切并分別克隆到經(jīng)相同酶切的pCMV_CH及pVL_CL載體中，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，于37。C倒置培養(yǎng)過夜。挑取克隆，抽提質(zhì)粒，用BamHI和HindIII雙酶切酶切鑒定，可見有約400bp左右的條帶切出(見圖3)。5、將正確克隆送上海生物工程有限公司測序，經(jīng)過基因測序，測定人源化單抗hTg-37重鏈、輕鏈基因序列(SEQIDNO:1和2)，結(jié)果完全正確。6、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術，將構(gòu)建好的人源化單抗hTg-37重鏈、輕鏈表達載體轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中，使用抗生素G418和HT缺乏雙重壓力篩選，制備單克隆細胞板篩選單克隆細胞株，最終篩選出可分泌人源化單抗hTg-37的單克隆細胞株。(2)人源化單抗hTg-37的純化單克隆抗體純化取細胞培養(yǎng)上清過0.22um微孔濾膜，以1.OmL/min流速上經(jīng)過平衡、再生好的ProteinG親和層析柱純化，洗脫液(甘氨酸_HCL，pH2.7)—步洗脫，流速lmL/min，接收mAb洗脫峰。實施例4人源化單抗hTg-37的結(jié)構(gòu)檢測1、利用SDS-PAGE技術，取20ul細胞培養(yǎng)上清，加入5X上樣緩沖液5ul，沸水中處理5min。煮沸后的樣品進行SDS-PAGE電泳分離，最后考馬斯亮藍染色檢測實施例3獲得的純化后人源化單抗hTg-37。結(jié)果見圖4，其中55KD左右為重鏈條帶，27KD左右為輕鏈條帶。2、利用Western-blotting技術，檢測實施例3獲得的純化后人源化單抗hTg_37。取20ul細胞培養(yǎng)上清，加入5X上樣緩沖液5ul，沸水中處理5min。煮沸后的樣品進行SDS-PAGE電泳分離，首先用5%脫脂奶粉封閉過夜，再用PBS洗2次，，加加抗人IgG的標記抗體，室溫作用2h，再用含0.2%Tween-20的PBS洗5次，最后加DAB底物顯色。結(jié)果見圖5，其中55KD左右出現(xiàn)清晰重鏈條帶。結(jié)果表明，重組的抗hTg抗體具有與人抗體相同的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建了人源化抗體。實施例5人源化單抗hTg-37的功能鑒定1、利用放射免疫技術，將標記1251的TG與CHO細胞各單克隆無血清培養(yǎng)液混合37t:孵育一小時，加免疫沉淀劑混合離心后，測定沉淀的放射性(單位cpm)，結(jié)果見表1，其中陰性對照是指用水和標記1251的TG混合37t:孵育一小時，未轉(zhuǎn)染組是指用未轉(zhuǎn)染Tg表達載體的CH0細胞培養(yǎng)上清和標記1251的Tg混合37t:孵育一小時，1-6指的是6個表達Tg的CH0細胞克隆表1陰性未轉(zhuǎn)染123456cpm5535927508948667061055798結(jié)果表明，各克隆均能分泌重組的人源化單抗hTg-37，所分泌的人源化單抗hTg-37均能與hTg相結(jié)合。2、取甲狀腺癌細胞8505C106個，經(jīng)固定、打孔后，加入實施例3獲得的純化后人源化單抗hTg-37，37t:孵育一小時，PBS清洗兩遍，再加入FITC標記的抗人IgG的抗體，37t:孵育半小時，PBS清洗兩遍后利用流式細胞術檢測熒光強度。結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，F(xiàn)ITC熒光標記的抗hTg人源化單克隆抗體hTg-37能夠進入甲狀腺癌細胞與細胞內(nèi)hTg相結(jié)合。3、將原代培養(yǎng)正常甲狀腺細胞、甲狀腺癌細胞株8505C、甲狀腺癌細胞株FTC-133，分別與1251標記的實施例4獲得抗hTg純化單克隆抗體hTg-37、1251標記的rT3(無關蛋白對照，購自北京原子能研究院)、1125標記的PAS單克隆抗體(無關抗體對照，購自北京北方所)，37t:孵育過夜，分別取相同數(shù)量細胞，利用Y計數(shù)器測定放射性(單位cpm)，結(jié)果見表2:表2原代正常甲狀腺FTC-1338505C陰性對照1331451449<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果表明，1251標記的抗hTg人源化單克隆抗體hTg-37能夠在細胞hTg介導的條件下進入甲狀腺細胞以及甲狀腺癌細胞。結(jié)論上述實驗結(jié)果顯示，重組的抗hTg抗體hTg-37具有良好與hTg結(jié)合的親和力，證明人源化過程較好地保存了鼠源性單克隆抗體mTg-60的親和力。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表〈110〉上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院〈120〉抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體及應用〈130>084394〈160>14〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>125〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>MISC_FEATURE〈223〉單克隆抗體重鏈〈400>1GluValGlnLeuValGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530SerlieHisTrpValArgGinAlaProGlyGinArgLeuGluTrpMet354045GlyTrplieAsnGlyAlalieGlyAsnThrLysTyrSerGinAsnPhe505560GinGluArgValThrlieThrArgAspThrSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspMetAlaValTyrTyrCys859095AlaArgGlyProArgAsnAlaGlyAlaAlalieThrGlyAlaAlaLeu100105110AspLeuTrpGlyGinGlyThrMetValThrValSerSer115120125〈210>2〈211>108〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈221>MISC_FEATURE〈223〉單克隆抗體輕鏈〈400>2GluThrThrLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinGlylieSerAsnTyr202530LeuAlaTrpPheGinGinLysProGlyLysAlaProLysSerLeulie354045TyrAlaAlaSerSerLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTyrAsnSerTyrLeuArg859095ThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulieLysArg100105〈210>3〈211>5〈212>PRT〈213〉重鏈CDRl〈400>3SerTyrSerlieHis15〈210>4〈211>17〈212>PRT〈213〉重鏈CDR2〈400>4TrplieAsnGlyAlalieGlyAsnThrLysTyrSerGinAsnPheGin151015Glu〈210>5〈211>16〈212>PRT〈213〉重鏈CDR3〈400>5GlyProArgAsnAlaGlyAlaAlalieThrGlyAlaAlaLeuAspLeu151015〈210>6〈211>11〈212>PRT〈213〉輕鏈CDR1〈400>6ArgAlaSerGinGlylieSerAsnTyrLeuAla1510〈210>7〈211>7〈212>PRT〈213〉輕鏈CDR2〈400>7AlaAlaSerSerLeuGinSer15〈210>8〈211>9〈212>PRT〈213〉輕鏈CDR3〈400>8GinGinTyrAsnSerTyrLeuArgThr15〈210>9〈211>23<212>DNA〈213〉引物〈400>9gaggtgcagctggtggagtctgg23〈210>10〈211>2412〈212>DNA〈213〉引物〈400>10tg朋g3g3Cggtgaccattgtccc24〈210>11〈211>23〈212>DNA〈213〉引物〈400>11g朋3Cg3C3Ctcacgcagtctcc23〈210>12〈211>24〈212>DNA〈213〉引物〈400>12acgtttgatttccaccttggtccc24〈210>13〈211>375〈212>DNA〈213〉小鼠(Musmusculus)〈400>13g3tgtg朋gCttcaggagtctggggctgagtcatgc朋gacctccggatecaccttcactCCCgg3C3朋ggCttg3gtggEltgggEltggtcacagaatttCC3gg朋3g3gtC3CC3tt3tgg朋CtC3gtegccte朋atctg朋gaccggaacgcaggggcggccat雄gggtgcgctcacagtctcctca〈210>14〈211>324〈212>DNA〈213〉小鼠(Musmusculus)〈400>14caaattgttctcacccagtctccatcctcaatcacttgtcgggcg3gtc3gggc3ttegcgggaaagccccteagtccctgatctetgct朋gttcagcggcagtggatctgggacagatg朋gattttgcaacttettectgccaacagggg3C3朋gttgga朋te朋acgggtg郷朋gcctggggcctcactg朋gatt60agttettctetccattgggtgcgccaggcc120atc朋cggtgccattggteateca朋gtec1803CC朋gg3C3catccgcgagtecagtteac240acggctgtctattectgtgcgagaggaccc300gctctggatctctggggcca3ggg3CC3Ct360375ctgtctgcatctgtegg卿cagagtcacc60aattetttegcctggtttcagC3g朋3CC3120gcatccagtttgc腿gtggggtcccatca180ttcactctcaccatcagcagcctgcagcct240teteategttacctecggacgttcggccaa300權利要求一種免疫球蛋白，它具有VH鏈，其特征在于，它的互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列選自下組SEQIDNO3所示的CDR1，SEQIDNO4所示的CDR2，SEQIDNO5所示的CDR3。2.如權利要求l所述的免疫球蛋白，其特征在于，VH鏈具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。3.—種免疫球蛋白，它具有Vj連，其特征在于，它的互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列選自下組SEQIDNO:6所示的CDRl，SEQIDNO:7所示的CDR2，SEQIDNO:8所示的CDR3。4.如權利要求l所述的免疫球蛋白，其特征在于，、鏈具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。5.—種免疫球蛋白，其特征在于，其VH鏈和VL鏈分別具有SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。6.如權利要求5所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。7.—種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物具有VH鏈，該VH鏈的CDR的氨基酸序列選自下組SEQIDNO:3所示的CDRl，SEQIDNO:4所示的CDR2，SEQIDNO:5所示的CDR3;或者，該免疫偶聯(lián)物具有、鏈，該、鏈的CDR的氨基酸序列選自下組SEQIDNO:6所示的CDRl，SEQIDNO:7所示的CDR2，SEQIDNO:8所示的CDR3。8.如權利要求7所述的免疫偶聯(lián)物，其特征在于，所述的免疫偶聯(lián)物是免疫毒素。9.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)權利要求1所述的免疫球蛋白VH鏈；權利要求3所述的免疫球蛋白、鏈；權利要求5所述的免疫球蛋白。10.—種檢測人甲狀腺球蛋白的試劑盒，其特征在于，它含有權利要求5所述的免疫球蛋白或權利要求7所述的免疫偶聯(lián)物。全文摘要本發(fā)明提供了一種抗人甲狀腺球蛋白的特異性單克隆抗體。該單克隆抗體具有和人甲狀腺球蛋白抗原結(jié)合的特異性強以及人源化程度高的特點。本發(fā)明還提供了所述抗人甲狀腺球蛋白單克隆抗體免疫球蛋白、及其片段和免疫偶聯(lián)物以及含有上述免疫球蛋白、片段或免疫偶聯(lián)物的藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種檢測人甲狀腺球蛋白的檢測試劑盒。文檔編號A61K49/00GK101759804SQ20081020780公開日2010年6月30日申請日期2008年12月25日優(yōu)先權日2008年12月25日發(fā)明者康向東申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院