專利名稱：利用抗體結(jié)合蛋白的模式化沉積產(chǎn)生基于光衍射的生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及對(duì)介質(zhì)中的分析物進(jìn)行檢測(cè)的領(lǐng)域，更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明涉及將抗體結(jié)合蛋白微曬圖(micro-contact print)在一種基質(zhì)上，用于產(chǎn)生可表明介質(zhì)中存在該分析物的一次性專用傳感器。
背景技術(shù)：
有多種系統(tǒng)和裝置可用來(lái)檢測(cè)不同介質(zhì)中的多種分析物。這些系統(tǒng)和裝置大多比較昂貴，并且要由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員來(lái)進(jìn)行測(cè)試。在很多情況下，最好是能夠快速而廉價(jià)地測(cè)定分析物的存在情況。而所需要的正是一種易于生產(chǎn)、造價(jià)低廉，并且能夠靈敏可靠地檢測(cè)分析物甚至微量分析物的生物傳感系統(tǒng)。此外還需要一種簡(jiǎn)單靈活的方法來(lái)制備可實(shí)現(xiàn)最佳大規(guī)模處理的生物傳感器。
Sandstrom et al.，24 Applied Optics 472，1985對(duì)一種硅制光學(xué)基質(zhì)的應(yīng)用進(jìn)行了描述，該基質(zhì)含有一層一氧化硅，并含有一層作為介質(zhì)薄膜的硅。文中指出，薄膜的厚度變化可改變光學(xué)基質(zhì)的特性，從而隨薄膜的厚度產(chǎn)生不同的顏色。薄膜的厚度與觀察到的顏色相關(guān)，而光學(xué)基質(zhì)上覆蓋的一層薄膜能夠產(chǎn)生可見(jiàn)的顏色變化。作者指出，顏色變化可利用數(shù)學(xué)模型來(lái)定量，而“利用計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行計(jì)算的結(jié)果表明，使用多層結(jié)構(gòu)不會(huì)引起光學(xué)特性的變化……但表面的生物層幾乎不改變這種結(jié)構(gòu)的反射作用，因?yàn)槠涔鈱W(xué)特性主要由該多層結(jié)構(gòu)的內(nèi)界面決定。盡管可由額外的介質(zhì)層來(lái)實(shí)現(xiàn)其它大多數(shù)應(yīng)用性能，但最靈敏的生物層檢測(cè)系統(tǒng)為單層系統(tǒng)”。
Sandstrom et al.還指出，金屬表面的金屬氧化膜具有一些缺點(diǎn)，并且金屬離子的存在還會(huì)在許多生化應(yīng)用中產(chǎn)生有害作用。他們指出，理想的表層介質(zhì)薄膜是將一氧化硅層置于環(huán)境大氣中時(shí)自然形成的2-3nm厚的二氧化硅層，在玻璃或塑料基質(zhì)上則可采用在40-60nm一氧化硅層上形成70-95nm二氧化硅層的方案。另外，他們還描述了一氧化硅楔的形成，方法是對(duì)一氧化硅進(jìn)行選擇性蝕刻、用二氯二甲基硅烷處理二氧化硅表面，并施加抗原與抗體生物層。他們可通過(guò)該楔形結(jié)構(gòu)由一種偏振光橢圓計(jì)來(lái)測(cè)量薄膜厚度，并指出“最大的反差位于約65nm區(qū)域，這里的干涉色由紫色變?yōu)樗{(lán)色”。他們指出，這種系統(tǒng)的靈敏度之高足以通過(guò)固定化抗體來(lái)檢測(cè)蛋白抗原。他們斷定“提供的該設(shè)計(jì)方案具有足以適用于廣泛應(yīng)用領(lǐng)域的靈敏性”。所用原料，即玻璃、硅和氧化硅，具有化學(xué)惰性，并且不會(huì)影響所研究的生化反應(yīng)。利用上述計(jì)算方法可設(shè)計(jì)出針對(duì)不同應(yīng)用而優(yōu)化的薄片。這種薄片可通過(guò)工業(yè)方法來(lái)生產(chǎn)，并且可確保其品質(zhì)，目前能夠以商品形式購(gòu)買的有兩種設(shè)計(jì)款式。
Kumar et al.發(fā)表的美國(guó)專利5,512,131描述了一種裝置，該裝置含有一種帶金屬涂層的聚合物基質(zhì)?？贵w結(jié)合蛋白層則模壓(stamp)在帶涂層基質(zhì)的表面。該裝置可用于模壓過(guò)程，或可作為一種開(kāi)關(guān)。當(dāng)分析物與該裝置結(jié)合時(shí)可產(chǎn)生一種衍射圖像。因而可使用一種顯象裝置，如攝譜儀(spectrometer)，來(lái)確定該衍射圖像的存在情況。
但Kumar et al.描述的該裝置具有一些缺點(diǎn)。其中之一就是需要額外的顯象裝置來(lái)觀察所有的衍射圖像。由于需要衍射裝置而不能裸眼來(lái)確定分析物的存在情況，所以Kumar et al.的裝置不能對(duì)大量的樣品進(jìn)行測(cè)試。
Bogart et al.的美國(guó)專利號(hào)5,482,830描述了一種裝置，該裝置包含一種帶有光學(xué)活性表面的基質(zhì)，這種光學(xué)活性表面可隨光照而顯示出第一顏色。第一種顏色被定義為發(fā)射光的光譜分布該基質(zhì)還可顯示出與第一顏色不同的第二種顏色(通過(guò)與第一顏色的波長(zhǎng)組合不同的光波長(zhǎng)組合，或不同的光譜分布，或通過(guò)與第一顏色不同的一種或多種波長(zhǎng)的強(qiáng)度)。當(dāng)分析物出現(xiàn)在該表面時(shí)，在相同的光的刺激下可顯示出第二種顏色。由一種顏色向另一種顏色的變化可通過(guò)儀器或眼睛來(lái)測(cè)量。這種靈敏的檢測(cè)方法相對(duì)于上文Sandstrom和Nygren描述的裝置而言是一種進(jìn)步，從商業(yè)角度考慮，使用該裝置更具前途和競(jìng)爭(zhēng)力。
但在Bogart et al.的專利中描述的方法和裝置也有一些缺點(diǎn)。一是該裝置造價(jià)昂貴。另一問(wèn)題是難以控制晶片上的不同薄層以獲得可靠的數(shù)據(jù)。而所需要的正是一種易于生產(chǎn)、造價(jià)低廉，并且能夠靈敏可靠地檢測(cè)待測(cè)分析物的生物傳感裝置。
一旦可使光散射的目標(biāo)分析物與帶有模式化蛋白及抗體的聚合物膜的特定區(qū)域結(jié)合，即可通過(guò)該分析物的確定尺寸和特定精確位置產(chǎn)生透射光衍射和/或反射光衍射。產(chǎn)生的衍射圖像可用眼睛方便地觀察，也可選擇性地使用一種傳感裝置。
本發(fā)明采用模式化抗體結(jié)合蛋白的曬圖方法。這些蛋白能夠與抗體結(jié)合，并將抗體模式化附著于表面，同時(shí)維持受體抗體的最佳取向。這些受體抗體可對(duì)特定的一種或一類分析物具有特異性，這將取決于所使用的蛋白。適用于產(chǎn)生在本發(fā)明所述系統(tǒng)中使用的傳感裝置的曬圖方法完全公開(kāi)于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?8/707,456和08/769,594,在此均全面引入作為參考。但由于這些方法涉及單層膜的自我組裝，而抗體結(jié)合蛋白原料不能自我組裝，因此需要如下文所述將這些方法稍加修改來(lái)印制抗體結(jié)合蛋白原料。
帶有抗體的模式化抗體結(jié)合蛋白層可使分析物在其表面模式化排布或模式化結(jié)合。由此產(chǎn)生的本發(fā)明所述生物傳感裝置可根據(jù)這兩種方式中的一種來(lái)加以使用，這將取決于分析物的大小。當(dāng)諸如微生物等分析物本身可造成衍射時(shí)，該系統(tǒng)的使用方法是，首先將生物傳感裝置暴露于含有選定分析物的介質(zhì)中，然后在保溫適當(dāng)時(shí)間后用一種光，如激光，照射并穿透該薄膜或使其由薄膜反射。如果分析物存在于介質(zhì)中并且與模式化抗體結(jié)合蛋白層上的抗體結(jié)合，那么光就被衍射并產(chǎn)生可見(jiàn)圖像。
對(duì)諸如蛋白等極小的分析物而言，該系統(tǒng)可選擇性地使用能夠與目標(biāo)分析物和生物傳感器結(jié)合并使振幅和/或折射率發(fā)生極大變化的“衍射增強(qiáng)元件”，以此來(lái)提高生物傳感器的衍射效率并使較小分析物的檢測(cè)得以進(jìn)行。在使用時(shí)，目標(biāo)分析物可直接與印有蛋白和抗體的聚合物膜的特定區(qū)域結(jié)合，也可與衍射增強(qiáng)元件結(jié)合，然后該部件與生物傳感器結(jié)合。然后通過(guò)分析物的確定尺寸和特定精確位置產(chǎn)生透射光衍射和/或反射光衍射。產(chǎn)生的衍射圖像可用眼睛方便地觀察，也可選擇性地使用一種傳感裝置。
該傳感器的另一可選用途涉及對(duì)抗體分析物進(jìn)行檢測(cè)。該傳感裝置可只含有模式化抗體結(jié)合蛋白，然后將其暴露于加有衍射增強(qiáng)元件的介質(zhì)中，該衍射增強(qiáng)顆粒需含有待測(cè)抗體的特異性抗體。顆粒上的優(yōu)選抗體應(yīng)不與模式化抗體結(jié)合蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，而是只有在結(jié)合了分析物抗體后才發(fā)生結(jié)合。這樣，衍射增強(qiáng)元件可在分析物抗體存在的情況下使振幅和/或折射率發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化，從而形成衍射圖像。也可預(yù)見(jiàn)將這種方式與其它免疫測(cè)定方式一同使用，如橫流測(cè)定(lateral folw)或微孔板方法等。
換句話說(shuō)，結(jié)合了分析物的抗體結(jié)合蛋白與抗體層可產(chǎn)生光學(xué)衍射圖像來(lái)表明分析物的存在。使用的光可以是可見(jiàn)光，也可以是薄膜的反射光或是透射光，分析物可以是能夠與抗體結(jié)合蛋白層反應(yīng)的任何化合物或顆粒。使用的光可以是白光，也可以是位于可見(jiàn)區(qū)內(nèi)的單色電磁輻射。本發(fā)明還提供一種柔性支持物，用于在金或其它適當(dāng)金屬或合金上支持抗體結(jié)合蛋白層。
本發(fā)明提供一種可批量生產(chǎn)的一次性廉價(jià)生物傳感器。該生物傳感器包括印有模式化抗體結(jié)合蛋白的表面。這些蛋白一般可通過(guò)抗體的恒定區(qū)(Fc)與抗體結(jié)合，這樣就使抗體的抗原結(jié)合區(qū)(Fab)處于游離狀態(tài)，從而獲得最佳的結(jié)合活性。模式化蛋白表面的制備還使傳感器的生產(chǎn)具有最大程度的靈活性。生產(chǎn)過(guò)程中的最終步驟，將所需抗體捕獲在模式化區(qū)域可根據(jù)特定分析物的需要來(lái)進(jìn)行(即在生產(chǎn)的時(shí)候)。
本發(fā)明的生物傳感器可制成用于單次分析物檢測(cè)的形式，也可定制成多重測(cè)試裝置。本發(fā)明的生物傳感器可用來(lái)檢測(cè)衣服，如尿布，中的污染物，也可用來(lái)檢測(cè)微生物污染物。
本發(fā)明還可用來(lái)檢測(cè)隱形眼鏡、眼鏡、窗玻璃、藥劑瓶、溶劑容器、水瓶、膠布繃帶等之上的污染物。
在審閱以下公開(kāi)實(shí)施方案的詳細(xì)描述之后，將會(huì)了解本發(fā)明的這些及其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。
圖2為抗體結(jié)合蛋白層的曬圖以及隨后的抗體模式化沉積的示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的特征是提供改進(jìn)型生物傳感裝置以及該生物傳感裝置的使用方法，用于對(duì)介質(zhì)中特定分析物的存在情況或數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)和定量?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明加以檢測(cè)的分析物包括，但不局限于，諸如細(xì)菌、酵母、真菌和病毒等微生物。與此前的裝置相比，本發(fā)明的裝置可通過(guò)持續(xù)時(shí)間僅數(shù)分鐘的快速測(cè)定來(lái)檢測(cè)介質(zhì)中極少量的分析物。此外，本發(fā)明的生物傳感裝置無(wú)需信號(hào)部件或相關(guān)電子部件。
本發(fā)明包括將抗體結(jié)合蛋白以微曬圖在一種聚合物薄膜上，該薄膜還可帶有金屬涂層。這是一種簡(jiǎn)易的模塊化生產(chǎn)方法，因?yàn)榇撕蟊┞队诳贵w可導(dǎo)致抗體的模式化結(jié)合。此外，這些蛋白可提高固定化抗體的活性。本發(fā)明產(chǎn)生可依據(jù)光衍射來(lái)表明分析物的存在情況的一次性專用傳感器。一旦目標(biāo)分析物與含有蛋白的塑料薄膜的特定區(qū)域接觸，即可通過(guò)該分析物的確定尺寸和特定精確位置產(chǎn)生透射光衍射和/或反射光衍射。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)酵母、真菌或細(xì)菌被在表面上有序模式化放置時(shí)，其大小均足以充當(dāng)可見(jiàn)光的衍射元件。此外，本發(fā)明還包括能提高生物傳感器衍射效率的衍射增強(qiáng)元件，由此可對(duì)任意數(shù)量的不同分析物進(jìn)行檢測(cè)。分析物除采用可產(chǎn)生簡(jiǎn)單衍射圖像的形式之外，也可采用產(chǎn)生全息傳感圖像和/或可見(jiàn)的顏色變化的形式。此時(shí)，全息圖象的出現(xiàn)或現(xiàn)有全息圖象的改變表明一種陽(yáng)性反應(yīng)。透射光的衍射模式可以是任何形式，其中包括，但不局限于，當(dāng)分析物與接受物結(jié)合時(shí)即由一種模式轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N模式。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，該衍射模式在分析物與本發(fā)明的生物傳感裝置接觸后不到1小時(shí)內(nèi)即可被辨別。
優(yōu)選而言，在與分析物相互作用后即可產(chǎn)生光衍射的衍射光柵具有最小的波長(zhǎng)頻率，并且折射率與周圍介質(zhì)不同。諸如病毒或分子等極小的分析物可通過(guò)使用對(duì)其有特異性的較大顆粒來(lái)間接檢測(cè)。檢測(cè)小分析物的實(shí)施方案包括用一種能夠與特定分析物特異性結(jié)合的蛋白物質(zhì)包被諸如乳膠粒等顆粒。可在本發(fā)明中使用的顆粒包括，但不局限于，玻璃、纖維素、合成聚合物或合成塑料、乳膠、聚苯乙烯、聚碳乙酸、蛋白、細(xì)菌或真菌細(xì)胞等。顆粒的優(yōu)選外形為球形，但該顆粒的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型對(duì)本發(fā)明而言并非決定性因素。舉例來(lái)說(shuō)，該顆?？梢允情L(zhǎng)條形、橢圓形、立方形等。合乎需要的顆粒大小為直徑約0.2μm-50.0μm，理想的則約為0.4μm-1μm。顆粒的成分對(duì)本發(fā)明而言并非決定性因素。
表面的固定化/模式化抗體將與分析物的一種表位特異性結(jié)合，該表位與結(jié)合衍射增強(qiáng)元件的表位不同。因此，在檢測(cè)含有小分析物，如病毒顆粒，的介質(zhì)時(shí)，可首先將該介質(zhì)暴露于結(jié)合有該病毒顆粒的衍射增強(qiáng)元件顆粒，如乳膠顆粒。然后選擇性地對(duì)衍射增強(qiáng)元件顆粒進(jìn)行沖洗，再將其暴露于具有含病毒特異性抗體的抗體結(jié)合蛋白層的聚合物膜。此時(shí)抗體可結(jié)合元件顆粒上的病毒顆粒，從而將元件顆粒以相同于抗體的模式固定在膜上。由于結(jié)合的元件顆?？梢鹂梢?jiàn)光衍射，所以可形成一種衍射圖像，以表明流體中存在該病毒顆粒。此外，該聚合物膜上可含有一層金屬涂層。此時(shí)抗體結(jié)合蛋白層應(yīng)位于薄膜的金屬化表面之上。
作為選擇，分析物的檢測(cè)方法也可以是，首先將基質(zhì)暴露于含有分析物的介質(zhì)，使分析物與含有分析物特異性抗體的抗體結(jié)合蛋白層物質(zhì)結(jié)合。其次將含有衍射增強(qiáng)元件顆粒的溶液與結(jié)合有分析物的基質(zhì)相接觸。從而使顆粒與分析物結(jié)合。由于結(jié)合的元件顆粒能夠?qū)е驴梢?jiàn)光衍射，因此會(huì)形成一種衍射圖像，以表明流體中存在該分析物。
最后，在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可將生物傳感器、衍射增強(qiáng)元件顆粒和含有分析物的介質(zhì)同時(shí)混合。這將導(dǎo)致上述結(jié)合過(guò)程一同發(fā)生。一些分析物將在與基質(zhì)結(jié)合前先與衍射增強(qiáng)元件顆粒結(jié)合。另一些分析物則是先與基質(zhì)結(jié)合，然后與元件顆粒結(jié)合。當(dāng)使用點(diǎn)光源透射(show through)該傳感器時(shí)，即可形成一種衍射圖像，以表明流體中存在該分析物。
可考慮使用本發(fā)明來(lái)加以檢測(cè)的分析物包括，但不局限于，細(xì)菌；酵母；真菌；病毒；類風(fēng)濕因子，抗體包括但不限于IgG，IgM，IgA，IgE抗體；癌胚抗原；鏈球菌A類抗原；病毒抗原；自身免疫疾病相關(guān)抗原；變應(yīng)原；腫瘤抗原；鏈球菌B類抗原；HIVI或HIVII抗原；或?qū)@些病毒及其它病毒的宿主應(yīng)答(抗體)；RSV特異性抗原或?qū)υ摬《镜乃拗鲬?yīng)答(抗體)；抗原；酶；激素；多糖；蛋白；脂類；糖類；藥物或核酸；沙門氏菌；念珠菌，其中包括，但不局限于，白色念珠菌和熱帶念珠菌；沙門氏菌；腦膜炎奈瑟菌A類、B類、C類、Y類和W類135亞類；肺炎鏈球菌、大腸桿菌K1、B型流感嗜血菌；來(lái)源于微生物的抗原；半抗原、濕用藥物；治療藥物；環(huán)境方劑；以及肝炎特異性抗原。
在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，可在抗體結(jié)合蛋白層內(nèi)加入一類特定微生物的營(yíng)養(yǎng)物。這樣就可以檢測(cè)極低濃度的微生物，方法是首先將本發(fā)明的生物傳感器與加入的營(yíng)養(yǎng)物相接觸，然后在適于所結(jié)合微生物生長(zhǎng)的條件下將該生物傳感器保溫。使微生物生長(zhǎng)，直至其數(shù)量足以形成衍射圖像。當(dāng)然在某些情況下，微生物可在模式化單層中不存在營(yíng)養(yǎng)物的條件下增殖至足以形成衍射圖像。
本發(fā)明還提供一種方法，用來(lái)將諸如抗體等受體模式化印制(pattern)在聚合物膜或金屬化聚合物膜上。該方法需要可結(jié)合抗體的微曬圖蛋白。這些蛋白包括，但不局限于，蛋白A、蛋白G、蛋白L，及其重組形式。商品形式的蛋白，如Zymed(San Francisco，CA)的KAPPALOCKTM，也同樣適用。因此，該蛋白物質(zhì)的定義為，用來(lái)與含有所需分析物特異性抗體的其它部分產(chǎn)生特異性配對(duì)結(jié)合的基底材料。
與模式化蛋白結(jié)合的受體物質(zhì)的特征在于，能夠與一種或多種目標(biāo)分析物特異性結(jié)合。無(wú)論選擇何種目標(biāo)分析物，都可通過(guò)設(shè)計(jì)使該蛋白物質(zhì)能夠與該目標(biāo)分析物特異性結(jié)合。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該生物傳感裝置的設(shè)定和編排方式能夠在目標(biāo)分析物被夾在抗體和衍射增強(qiáng)元件之間時(shí)對(duì)復(fù)色光(polychromatic light)透射發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生一種裸眼可辨的圖像。在分析物的大小足以使光發(fā)生衍射的另一項(xiàng)實(shí)施方案中，無(wú)需使用衍射增強(qiáng)元件。
在許多情況下需要一種“阻斷物”來(lái)避免非特異性結(jié)合。此處使用的術(shù)語(yǔ)“阻斷物”是指一種可附著于傳感器表面從而“阻斷”或避免非分析物與該表面(模式化區(qū)域或非模式化區(qū)域)非特異性結(jié)合的試劑。阻斷可作為后處理步驟在表面已被曬圖之后進(jìn)行(“后阻斷”)，這屬于用另一種巰基試劑來(lái)填補(bǔ)非曬圖區(qū)域的常規(guī)技術(shù)。但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，“前阻斷”技術(shù)要優(yōu)于后阻斷技術(shù)。前阻斷技術(shù)是用一種含非巰基的阻斷物對(duì)基質(zhì)表面進(jìn)行預(yù)處理，然后再曬圖。盡管不希望受任何理論的約束，但從理論上講，曬圖原料(通常含有硫)可取代物理吸附的阻斷物，從而使抗體結(jié)合蛋白原料可直接與基質(zhì)的表面結(jié)合。如果需要，也可隨后進(jìn)行后阻斷。阻斷物包括，但不局限于，β-酪蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白、非離子型表面活性劑(pluronic)或其它表面活性劑、聚乙二醇、聚乙烯醇，或上述化合物的硫衍生物，以及該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解的其它任何阻斷物。
含有目標(biāo)分析物的基體可以是固體、氣體、或一種體液，如組織液、粘液、唾液、尿、糞便物、組織、骨髓、腦脊液、血清、血漿、全血、滑膜液、痰、緩沖液、抽提液、精液、陰道分泌物、心包液、胃液、腹膜液、胸膜液、喉吸取液或其它清洗液等。目標(biāo)分析物可以是抗原、抗體、酶、毒素、環(huán)境藥劑(environmental agent)、細(xì)胞質(zhì)成分、傘毛或鞭毛成分、蛋白、多糖、藥物，或可被抗體識(shí)別的其它任何物質(zhì)。例如，細(xì)菌的受體物質(zhì)可特異性結(jié)合其表面膜成分、蛋白或脂類、多糖、核酸或酶。細(xì)菌的表明性分析物可以是糖類或多糖、酶、核酸、膜成分、神經(jīng)節(jié)苷脂或宿主對(duì)該細(xì)菌應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體。分析物的存在可表明一種感染性疾病(細(xì)菌性或病毒性)、癌癥、變態(tài)反應(yīng)或其它醫(yī)學(xué)病癥或病情。分析物的存在也可表明水污染或食物污染，或表明其它有害物質(zhì)的存在。該分析物可表明藥物濫用或用來(lái)監(jiān)控治療劑的水平。
在某些情況下，分析物可以不僅與受體物質(zhì)結(jié)合，還可導(dǎo)致該受體物質(zhì)發(fā)生可檢測(cè)的變化。這種相互作用可導(dǎo)致測(cè)試表面質(zhì)量的提高，也可導(dǎo)致測(cè)試表面受體物質(zhì)的量降低。后一情況的一個(gè)實(shí)例是降解酶或降解物質(zhì)與一種固定化特異底物發(fā)生相互作用。此時(shí)是在與目標(biāo)分析物發(fā)生相互作用之前可傳感到一種衍射圖像，而如果分析物存在，則該衍射圖像將消失。分析物與受體物質(zhì)結(jié)合、雜交或相互作用的具體機(jī)制對(duì)本發(fā)明而言并不重要，但它會(huì)影響最終測(cè)定方案所采用的反應(yīng)條件。
一般而言，抗體結(jié)合蛋白可被動(dòng)粘附于基質(zhì)層。如果需要，也可在抗體結(jié)合蛋白上連接功能基團(tuán)，以使其共價(jià)連接于測(cè)試表面。
有多種技術(shù)可用來(lái)將蛋白物質(zhì)涂布在基質(zhì)上。用抗體結(jié)合蛋白包被測(cè)試表面的方法可以是以離散點(diǎn)陣(discrete arrays)或模式涂覆溶液；噴灑、噴墨或其它印制方法；或曬圖方法。所選的技術(shù)應(yīng)能夠使包被大量測(cè)試表面所需的蛋白物質(zhì)量達(dá)到最小，并且能夠在應(yīng)用過(guò)程中保持蛋白物質(zhì)的穩(wěn)定性/功能性。該技術(shù)還須能夠?qū)⒌鞍孜镔|(zhì)以一種完全相同的和可重復(fù)的方式涂布或粘連在基質(zhì)上。
下一步包括將模式化表面暴露于對(duì)目標(biāo)分析物具有特異性的抗體。這一步的實(shí)現(xiàn)方法可以是在溶液中完全浸沒(méi)預(yù)定的時(shí)間、噴灑或旋涂。此外，將不同抗體進(jìn)行受控排布可獲得多重分析物系統(tǒng)。該方法的另一優(yōu)點(diǎn)在于模塊化生產(chǎn)方式。換句話說(shuō)，可將帶有模式化抗體結(jié)合蛋白的系統(tǒng)加以優(yōu)化，然后可根據(jù)所結(jié)合的抗體對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測(cè)。
分析物所處的介質(zhì)可以是固體、類凝膠、流體或氣體。對(duì)檢測(cè)體液中的分析物而言，該流體可選自，但不局限于，尿、血清、血漿、脊髓液、痰、全血、唾液、尿殖分泌物、糞便提取物、心包液、胃液、腹膜液、胸膜液、陰道分泌物，或喉吸取液；使用的方法可選擇性地包括使用一種分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量出現(xiàn)的折射圖像。本發(fā)明所述生物傳感裝置可考慮使用的最常見(jiàn)氣體為空氣。
本發(fā)明的生物傳感裝置采用在基質(zhì)上，理想的是在金屬化聚合物膜上，進(jìn)行模式化抗體結(jié)合蛋白的曬圖，隨后暴露于抗體以獲得模式化抗體的方法，同時(shí)涉及由此產(chǎn)生的組合物以及這些組合物的應(yīng)用。模式化抗體結(jié)合蛋白層可實(shí)現(xiàn)能與分析物結(jié)合的抗體的受控排布。此處使用的術(shù)語(yǔ)“模式化抗體結(jié)合蛋白層”是指包括固體形式的基質(zhì)上任何模式的，抗體結(jié)合蛋白加所需抗體層。
當(dāng)含有模式化抗體結(jié)合蛋白層的薄膜暴露于可與其抗體反應(yīng)的分析物時(shí)，該薄膜將根據(jù)抗體與目標(biāo)分析物間的反應(yīng)產(chǎn)生不同的光學(xué)衍射圖像。使用的流體可以是一種高表面張力流體，如水。使用的光可以是可見(jiàn)光，也可以是薄膜的反射光或是透射光，分析物可以是能夠與模式化抗體結(jié)合蛋白層反應(yīng)的任何化合物。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法涉及在可使基質(zhì)的折射率發(fā)生變化的條件下將基質(zhì)與一種可能含有分析物的測(cè)試樣品相接觸。當(dāng)光透射過(guò)帶有模式化抗體結(jié)合蛋白層的薄膜時(shí)可形成一種可見(jiàn)的衍射圖像，該衍射圖像的顯現(xiàn)方法可以是將光引至某一表面，或是直接透過(guò)基質(zhì)進(jìn)行觀察。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明采用將微曬圖薄膜裝在量尺(dipstick)末端的量尺方式來(lái)加以實(shí)施。在使用時(shí)，將量尺浸入可能含有待檢分析物的流體中并維持?jǐn)?shù)分鐘。然后取出量尺，并用光透射薄膜或是通過(guò)薄膜后的光對(duì)其進(jìn)行觀測(cè)。如果觀測(cè)到圖像，則該流體中存在分析物。
本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案是在同一支持物上建立多重分析物測(cè)試系統(tǒng)。如

圖1所示，條帶10上帶有若干微曬圖薄膜20、25、30和35，每種膜均印制有一種模式40。各微曬圖金屬化薄膜15、20、25和30含有對(duì)不同分析物具有特異性的不同抗體?？梢钥吹剑景l(fā)明可采用帶有多種微曬圖金屬化薄膜的任何陣列模式化，因而本發(fā)明所述生物傳感裝置的使用者可通過(guò)單次測(cè)試對(duì)介質(zhì)中多種分析物的存在情況進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明的又一項(xiàng)實(shí)施方案中，可將生物傳感器連接于帶背膠的膠粘物(Sticker)或貼紙(decal)，繼而可置于硬表面或容器壁上。該生物傳感器可置于諸如食品包裝或玻璃瓶等容器的內(nèi)表面。然后可通過(guò)該生物傳感器的顯象來(lái)確定分析物的存在情況。
典型的，涂鈦(titanium-primed)聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯薄膜、Si/SiO2晶片或玻璃片來(lái)支持5-2000nm厚的金膜。鈦可作為金與支持物的增粘劑?？贵w結(jié)合蛋白可在曬圖過(guò)程中連接在于金的表面。
圖2概述了微曬圖的方法。利用一種彈性印模(stamp)將抗體結(jié)合蛋白“印墨”經(jīng)接觸轉(zhuǎn)移到表面；如果印模被模式化，那么即可形成模式化的抗體結(jié)合蛋白層。印模的制作方法是將聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆注在具有所需模式的底版(master)上。底版的制備采用標(biāo)準(zhǔn)影印技術(shù)，也可利用具有微觀表面特性的現(xiàn)有材料構(gòu)造而成。
在一項(xiàng)優(yōu)選的典型實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施方案中，將通過(guò)影印法產(chǎn)生的底版置于玻璃或塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，并倒入比率為10∶1(w∶w)的SYLGARD硅酮彈性體184與SYLGARD硅酮彈性體184固化劑(curing agent)(Dow Corning Corporation)的混合物。在室溫下將彈性體靜置約30分鐘并減壓脫氣，然后在60℃下至少固化4小時(shí)，再溫和地由底版剝落。彈性印模的上墨方法是將印模暴露于0.1-10μM的抗體結(jié)合蛋白二硫化衍生物水溶液，其實(shí)現(xiàn)方法通常是將印模面朝下在該溶液中置10秒-10分鐘。在環(huán)境條件下或是一般通過(guò)暴露于空氣或氮?dú)饬魇褂∧８稍?。將上墨后的印模涂覆于金表面。施加輕微壓力以確保印模與該表面的完全接觸。在1秒-5分鐘后，溫和地使印模與該表面脫離。然后將表面漂洗并干燥。作為選擇，還可通過(guò)使用第二種印?；?qū)⒄麄€(gè)表面暴露于不同試劑來(lái)對(duì)未印制區(qū)域做進(jìn)一步的衍生化。隨后還可暴露于蛋白阻斷劑，如BSA或β-酪蛋白，或該領(lǐng)域所熟知的其它任何制劑。在模式被確定后，需要將該模式化表面暴露于對(duì)目標(biāo)分析物具有特異性的抗體，方法是浸沒(méi)在溶液中或是將溶液噴灑或旋涂在該模式化表面。
印模的彈性特性對(duì)該方法的成功實(shí)現(xiàn)非常重要。固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS)的彈性足以使印模與表面發(fā)生良好的共形接觸，甚至當(dāng)該表面具有明顯的起伏時(shí)也是如此；這種接觸是蛋白高效接觸轉(zhuǎn)移至金膜的基礎(chǔ)。當(dāng)印模由底版剝落時(shí)，PDMS的彈性特性也發(fā)揮了重要作用如果印模為剛性(象底版那樣)，那么當(dāng)固化完成后將很難在兩種基質(zhì)均不損壞的條件下將印模與底版分離。PDMS還具有充分的剛性來(lái)維持其形狀，甚至亞微米大小的部件也是如此。PDMS表面的界面自由能很低(y＝22.1 dynes/cm)，并且由其制作的印模不與金膜粘連。該印模十分耐用，同一印?？稍诔掷m(xù)數(shù)月的時(shí)間里使用多達(dá)100次而不出現(xiàn)性能的明顯降低。PDMS的聚合特性在上墨過(guò)程中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它能夠通過(guò)膨脹使印模吸收蛋白墨。
以下是本發(fā)明所述方法和組合物的更詳細(xì)描述。其中引用的所有出版物均全面引入作為參考。
任何塑料薄膜均適用于本發(fā)明。優(yōu)選而言，該塑料薄膜上還可沉積有一層金屬涂層。這些塑料薄膜包括，但不局限于，多種聚合物，如對(duì)苯二甲酸亞乙酯(MYLAR)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃紙，纖維素聚合物，如乙基纖維素、醋酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、丙酸纖維素、三醋酸纖維素、三醋酸纖維素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、離子交聯(lián)聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龍共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯和芳香聚砜。優(yōu)選而言，該塑料薄膜的光學(xué)透明度應(yīng)大于80％。其它適當(dāng)?shù)臒崴苄运芰霞肮?yīng)廠商可在，例如，Modern PlasticsEncyclodedia(McGraw-Hill Publishing Co.，New York 1923-1996)的參考部分中找到。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，聚合物薄膜上具有一層金屬涂層，并且光學(xué)透明度約為5％-95％。本發(fā)明使用的熱塑性塑料薄膜的更理想的光學(xué)透明度約為20％-80％。在本發(fā)明的一項(xiàng)理想實(shí)施方案中，聚合物薄膜的光學(xué)透明度至少約為80％，金屬涂層的厚度可使光學(xué)透明度維持在約20％以上，從而使折射光或透射光可以產(chǎn)生衍射圖像。這相當(dāng)于金屬涂層的厚度約為10nm。但是在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，金的厚度約為1nm-1000nm。
在薄膜上沉積的優(yōu)選金屬為金。但也可使用銀、鋁、鉻、銅、鐵、鋯、鉑和鎳，以及這些金屬的氧化物。
具有適當(dāng)大小的皺折的任何表面原則上都可作為底版。微曬圖方法首先需要一種適當(dāng)?shù)耐辜y(relief)表面結(jié)構(gòu)來(lái)澆注彈性印模。這種“底版”模板的產(chǎn)生可采用影印法或其它方法，如商品形式的衍射光柵。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，可利用聚二甲基硅氧烷來(lái)制備該印模。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了一種光學(xué)測(cè)定裝置，該裝置具有一種光學(xué)活性受體表面，其設(shè)定和編排方式可用來(lái)同時(shí)測(cè)定多個(gè)表面樣品的一種目標(biāo)分析物，另外還描述了一種自動(dòng)液體裝卸設(shè)備(如一種移液裝置)，其設(shè)定和編排方式可用來(lái)在表面施加樣品和試劑溶液。
以下提供一種說(shuō)明性方法，通過(guò)該方法可產(chǎn)生適于構(gòu)建本發(fā)明所述光學(xué)測(cè)試表面的最佳原料和方法。一般而言，本發(fā)明包括用于直接檢測(cè)分析物的新型光學(xué)活性測(cè)試表面。這些測(cè)試表面含有通過(guò)附著層——即抗體結(jié)合蛋白——與其相連接的分析物特異性抗體。因此，本發(fā)明提供一種檢測(cè)裝置，包括選擇一種光學(xué)基質(zhì)，用抗體結(jié)合蛋白對(duì)其進(jìn)行印制，然后將其暴露于抗目標(biāo)分析物的抗體。檢測(cè)方法涉及將該裝置與含有目標(biāo)分析物的流體樣品相接觸，然后通過(guò)觀查是否形成衍射圖像來(lái)檢測(cè)透射光衍射或折射光衍射的變化。
本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，并且可在多種特異性配對(duì)結(jié)合測(cè)定方法中使用。例如，本發(fā)明的裝置可在免疫測(cè)定法中用于抗原或抗體的檢測(cè)。該裝置經(jīng)過(guò)修改可在直接的、間接的或競(jìng)爭(zhēng)性的檢測(cè)方案中使用。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合蛋白層具有以下通式X-P-AbX是一種使化學(xué)吸附于金屬或金屬氧化物得以實(shí)現(xiàn)的可選媒介物。例如，X可以是不對(duì)稱的或?qū)ΨQ的二硫化物(-R’SSY’、-RSSY)、硫化物(-R’SY’、-RSY)、二硒化物(-R’Se-SeY’)、硒化物(-R’SeY’、-RSeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、異腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三價(jià)磷化合物、異硫氰乙酸、黃原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羥基酸和異羥肟酸。
P表示可與X衍生的抗體結(jié)合蛋白。Ab表示目標(biāo)分析物的特異性抗體。
印模涂敷可在空氣中或諸如水等流體內(nèi)進(jìn)行，以避免蛋白物質(zhì)的過(guò)度擴(kuò)散。對(duì)大規(guī)模或連續(xù)印制方法而言，最理想的是在空氣中印制，因?yàn)檫@些方法需要較短的接觸時(shí)間。
本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案是利用抗體結(jié)合蛋白層在金屬化熱塑性聚合物上形成模式。本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方案是利用抗體結(jié)合蛋白層形成模式凹紋。在模壓(stamping)過(guò)程完成后，可選擇性地利用，例如，酪蛋白等試劑將塑料上的金屬化區(qū)域鈍化或阻斷。優(yōu)選的是在暴露于抗體之前實(shí)施這一步驟。
本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例做進(jìn)一步的說(shuō)明，這些實(shí)施例決不是要對(duì)本發(fā)明的范圍加以限制。相反，應(yīng)清楚了解的是，可能有多種其它實(shí)施方案、修改方案及其等價(jià)方案，在閱讀本說(shuō)明書(shū)后會(huì)發(fā)現(xiàn)，這些方案對(duì)該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言并未脫離本發(fā)明的精神主旨。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)碳化二亞胺與乙基二甲氨基二碳化二亞胺(EDAC，Polysciences試劑盒3號(hào)瓶，目錄編號(hào)19539)的偶合產(chǎn)生抗體綴合的聚苯乙烯顆粒。該實(shí)施例是用EDAC水溶液將0.5微米直徑藍(lán)色羧乙酸顆粒(Bangs Laboratories；Fishers，Indiana；Cat#D0005070CB)的10％懸浮液共0.125mL活化1-4小時(shí)，漂洗，然后暴露于300微克的黃體生成素μ亞基單克隆抗體(FitzgeraldIndustries，Cat.No.10-L10，Clone No.M94136)。將顆粒再次漂洗，用牛血清白蛋白阻斷，并以2.5％的濃度保存在磷酸緩沖鹽溶液中。
將1.3mg Sulfo-LC-SPDP(Pierce Chemical Co.；Rockford，IL)溶于2.07mL去離子水，制備成10mM的Sulfo-LC-SPDP水性儲(chǔ)液。結(jié)合反應(yīng)是在含有20mM磷酸鈉緩沖液、150mM NaCl、1mM EDTA和0.02％疊氮化鈉的pH7.5的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中進(jìn)行。將1毫克凍干的蛋白A或蛋白G溶解于450微升PBS，并在該抗體溶液中加入50微升Sulfo-LC-SPDP儲(chǔ)液。將混合物在室溫反應(yīng)60分鐘。將該樣品加到此前已用5倍柱體積(25mL)PBS平衡的5mL聚丙烯酰胺脫鹽柱上。以PBS為洗脫緩沖液來(lái)洗脫組分，并用COOMASSIEPlusProtein Assay(Pierce Chemical Co.)監(jiān)測(cè)各組分中的蛋白。典型的是在微量滴定板中將50μL COOMASSIE試劑與50μL各組分相混合。COOMASSIE試劑與蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)顏色，顏色的強(qiáng)度取決于組分中的蛋白含量。產(chǎn)生的藍(lán)色最強(qiáng)的級(jí)分即為含有大部分洗脫蛋白的組分。將這些級(jí)分合并，作為二硫化物形式的最終衍生產(chǎn)物。曬圖通常即采用這種形式。
也可選擇性地通過(guò)還原反應(yīng)將二硫化物形式的硫醇化粘合劑中存在的二硫吡啶基還原成巰基。此時(shí)衍生蛋白的脫鹽不是在PBS平衡的柱上進(jìn)行，而是在醋酸緩沖液(100mM醋酸鈉緩沖液、100mM NaCl，pH4.5)平衡的柱上進(jìn)行。該醋酸緩沖液的酸性pH值可避免天然蛋白中存在的二硫鍵發(fā)生不必要的還原。該還原反應(yīng)是將12mg二硫蘇糖醇(DTT)溶于500mL醋酸緩沖液，并加入1mL經(jīng)SPDP衍生的蛋白。在室溫下將反應(yīng)混合物保溫30分鐘，然后在已用5倍柱體積(25mL)醋酸緩沖液平衡的5mL脫鹽柱上脫鹽。再次利用上述COOMASSIEProtein Assay試劑對(duì)洗脫組分的蛋白含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，將所含蛋白量最高的組分合并，用于隨后的曬圖。
二硫化物形式和還原形式的硫醇化粘合劑在曬圖前均以水溶液形式保存于4℃。
用5mg/mLβ-酪蛋白溶液將金/MYLAR膜預(yù)處理(或阻斷)10分鐘，然后將膜徹底清洗，并置于空氣流下干燥。用硫醇化抗體結(jié)合蛋白包被10微米大小的圓形PDMS印模，方法是將該印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化蛋白A(或蛋白G)溶液中，并浸泡10分鐘。利用強(qiáng)空氣流將印模表面徹底干燥。將包被的印模與金/MYLAR接觸5分鐘，然后移開(kāi)。將印制的所得金/MYLAR置蒸餾水中清洗并干燥。
然后將該傳感器暴露于抗體溶液(例如以2βg/mL濃度溶于PBS溶液的黃體生成素-β單克隆抗體，Catalog No.10-L15，Clone No.M94187，F(xiàn)itzgerald Industries International，Inc.；Concord，MA)，時(shí)間30分鐘，然后清洗并空氣干燥。
將傳感器樣品暴露于2□g/mL的羊抗鼠HRP(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的)水溶液(含有1％牛血清白蛋白)，方法是將一小滴該溶液滴加在傳感器表面，室溫下放置30-60分鐘。用0.02％吐溫20溶液清洗樣品，然后用蒸餾水清洗。隨后暴露于TMB膜增色溶液(如Kirkegaard與Perry Laboratories試劑的10∶1 v/v混合物，目錄編號(hào)50-76-18和50-77-01)，方法是將TMB溶液加在傳感器樣品上，放置10分鐘。這樣可在圓圈內(nèi)或部件內(nèi)顯現(xiàn)出藍(lán)色沉淀，并且用點(diǎn)光源照射時(shí)可產(chǎn)生衍射圖像。
也可選擇性地將分析物溶液(如該實(shí)施例使用的黃體生成素)與微顆粒相混合(通常是50-70微升分析物溶液與10-20微升的1.5-2.5％抗體結(jié)合顆粒形成懸浮液)，并加在傳感器上(通常使用1平方厘米的傳感器樣品)。5-10分鐘后，將中心鑿有小孔的硝化纖維素圓片(孔徑5或8微米，Sigma No.N3771或N4146)置于傳感器上。這樣做可以吸走過(guò)量的液體和未結(jié)合的微顆粒。此時(shí)用點(diǎn)光源透射傳感器樣品(通過(guò)硝化纖維素膜上的小孔)。如果分析物存在，則可在光束的另一側(cè)觀測(cè)到衍射圖像。
實(shí)施例2通過(guò)碳化二亞胺與乙基二甲氨基二碳化二亞胺(EDAC，Polysciences試劑盒3號(hào)瓶，目錄編號(hào)19539)的偶合產(chǎn)生結(jié)合有抗體的聚苯乙烯顆粒。該實(shí)施例是用EDAC水溶液將0.5微米直徑藍(lán)色羧乙酸顆粒(Bangs Laboratories；Fishers，Indiana；Cat#D0005070CB)的10％懸浮液0.125mL活化1-4小時(shí)，漂洗，然后暴露于300微克的IgE多克隆抗體(為了不與模式化蛋白A反應(yīng)，可使用例如雞抗IgE)。將顆粒再次漂洗，用牛血清白蛋白阻斷，并以2.5％的濃度保存在磷酸緩沖鹽溶液中。
將1.3mg Sulfo-LC-SPDP(Pierce Chemical Co.；Rockford，IL)溶于2.07mL去離子水，制備成10mM的Sulfo-LC-SPDP水性儲(chǔ)液。結(jié)合反應(yīng)是在含有20mM磷酸鈉緩沖液、150mM NaCl、1mM EDTA和0.02％疊氮化鈉的pH7.5的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中進(jìn)行。將1毫克凍干的蛋白A溶解于450微升PBS，并在該抗體溶液中加入50微升Sulfo-LC-SPDP儲(chǔ)液。將混合物在室溫反應(yīng)60分鐘。將該樣品加到此前已用5倍柱體積(25mL)PBS平衡的5mL聚丙烯酰胺脫鹽柱上。以PBS為洗脫緩沖液來(lái)洗脫組分，并用COOMASSIEPlus ProteinAssay(Pierce Chemical Co.)監(jiān)測(cè)各組分中的蛋白。典型的是在微量滴定板中將50μL COOMASSIE試劑與50μL各級(jí)分相混合。COOMASSIE試劑與蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)顏色，顏色的強(qiáng)度取決于級(jí)分中的蛋白含量。產(chǎn)生的藍(lán)色最強(qiáng)的級(jí)分即為含有大部分洗脫蛋白的級(jí)分。將這些級(jí)分合并，作為二硫化物形式的最終衍生產(chǎn)物。曬圖通常即采用這種形式。
也可選擇性地通過(guò)還原反應(yīng)將二硫化物形式的硫醇化粘合劑中存在的二硫吡啶基還原成巰基。此時(shí)衍生蛋白的脫鹽不是在PBS平衡的柱上進(jìn)行，而是在醋酸緩沖液(100mM醋酸鈉緩沖液、100mM NaCl，pH4.5)平衡的柱上進(jìn)行。該醋酸緩沖液的酸性pH值可避免天然蛋白中存在的二硫鍵發(fā)生不必要的還原。該還原反應(yīng)是將12mg二硫蘇糖醇(DTT)溶于500mL醋酸緩沖液，并加入1mL經(jīng)SPDP衍生的蛋白。在室溫下將反應(yīng)混合物保溫30分鐘，然后在已用5倍柱體積(25mL)醋酸緩沖液平衡的5mL脫鹽柱上脫鹽。再次利用上述COOMASSIEProtein Assay試劑對(duì)洗脫組分的蛋白含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，將所含蛋白量最高的組分合并，用于隨后的曬圖。
二硫化物形式和還原形式的硫醇化粘合劑在曬圖前均以水溶液形式保存于4℃。
用5mg/mLβ-酪蛋白溶液將金/MYLAR膜預(yù)處理(或阻斷)10分鐘，然后將膜徹底清洗，并置于空氣流下干燥。用硫醇化抗體結(jié)合蛋白包被10微米大小的圓形PDMS印模，方法是將該印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化蛋白A溶液中，并浸泡10分鐘。利用強(qiáng)空氣流將印模表面徹底干燥。將包被的印模與金/MYLAR接觸5分鐘，然后移開(kāi)。將印制的所得金/MYLAR置蒸餾水中清洗并干燥。
將分析物溶液(通常為50-70微升以2μg/mL濃度溶于PBS溶液的IgE(Catalog No.30-AI05，F(xiàn)itzgerald IndustriesInternational，Inc.；Concord，MA))加在傳感器上(通常為1平方厘米)，置0-20分鐘，然后加入10-20微升的1.5-2.5％抗體結(jié)合顆粒形成懸浮液，再置5-20分鐘。然后將中心鑿有小孔的硝化纖維素圓片(孔徑5或8微米，Sigma No.N3771或N4146)置于傳感器上。這樣做可以吸走過(guò)量的液體和未結(jié)合的微顆粒。此時(shí)用點(diǎn)光源透射傳感器樣品(通過(guò)硝化纖維素膜上的小孔)。如果分析物存在，則可如圖所示在光束的另一側(cè)觀測(cè)到衍射圖像。
權(quán)利要求
1.一種生物傳感器，包括一種聚合物膜；以及在該聚合物膜上模式印制的一種抗體結(jié)合蛋白層，其中該抗體結(jié)合蛋白層上帶有一種對(duì)分析物具有特異性的抗體。
2.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中抗體結(jié)合蛋白層的印制模式能夠使該生物傳感器在與分析物結(jié)合的情況下將透射光衍射而形成一種衍射圖像。
3.權(quán)利要求2的生物傳感器，其中的衍射圖像用裸眼可以看到。
4.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中聚合物膜進(jìn)一步含有一種金屬涂層。
5.權(quán)利要求4的生物傳感器，其中的金屬選自金、銀、鉻、鎳、鉑、鋁、鐵、銅、鋯，或其氧化物。
6.權(quán)利要求4的生物傳感器，其中的金屬為金。
7.權(quán)利要求6的生物傳感器，其中金涂層的厚度約為1納米-1000納米。
8.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中的聚合物膜選自對(duì)苯二甲酸亞乙酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃紙，纖維素聚合物如乙基纖維素、醋酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、丙酸纖維素、三醋酸纖維素、三醋酸纖維素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、離子交聯(lián)聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龍共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯或芳香聚砜。
9.權(quán)利要求8的生物傳感器，其中的聚合物膜為對(duì)苯二甲酸亞乙酯。
10.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中的聚合物膜為光學(xué)透明的。
11.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中的聚合物膜具有5％-95％的光學(xué)透明度。
12.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中的聚合物膜具有約20％-80％的光學(xué)透明度。
13.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中的抗體結(jié)合蛋白層由具有以下通式的化合物形成X-P-Ab其中X能夠與聚合物膜上的金屬或金屬氧化物反應(yīng)；P是一種抗體結(jié)合蛋白；并且Ab是一種目標(biāo)分析物特異性抗體。
14.權(quán)利要求13的生物傳感器，其中X為不對(duì)稱的或?qū)ΨQ的二硫化物(-SSY’、-SSY)、硫化物(-’SY’、-SY)、二硒化物(-’Se-SeY’)、硒化物(-SeY’、-SeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、異腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三價(jià)磷化合物、異硫氰乙酸、黃原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羥基酸和異羥肟酸。
15.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中分析物選自細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、類風(fēng)濕因子、IgG、IgM、IgA和IgE抗體、癌胚抗原、鏈球菌A類抗原、病毒抗原、自身免疫疾病相關(guān)抗原、變應(yīng)原、腫瘤抗原、鏈球菌B類抗原、HIVI或HIVII抗原、抗體、病毒、RSV特異性抗原、抗原、酶、激素、多糖、蛋白、脂類、糖類、藥物、核酸、腦膜炎奈瑟菌A類、B類、C類、Y類和W類135亞類、肺炎鏈球菌、大腸桿菌K1、B型流感嗜血菌、來(lái)源于微生物的抗原、半抗原、濫用藥物、治療藥物、環(huán)境藥劑或肝炎特異性抗原。
16.權(quán)利要求15的生物傳感器，其中的分析物為細(xì)菌、酵母、真菌或病毒。
17.權(quán)利要求16的生物傳感器，其中的真菌為念珠菌。
18.權(quán)利要求16的生物傳感器，其中的細(xì)菌為沙門氏菌。
19.權(quán)利要求1的生物傳感器，其中的蛋白物質(zhì)選自蛋白A、蛋白G、蛋白L，或其重組形式。
20.一種制備生物傳感器的方法，包括在聚合物膜上印制某種模式的抗體結(jié)合蛋白層并隨后加上抗體層。
21.權(quán)利要求20的方法，其中抗體結(jié)合蛋白層的印制模式能夠使該生物傳感器在與分析物結(jié)合的情況下將透射光衍射而形成一種衍射圖像。
22.權(quán)利要求20的方法，其中的聚合物膜進(jìn)一步含有一種金屬涂層。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的金屬選自金、銀、鉻、鎳、鉑、鋁、鐵、銅、鋯，或其氧化物。
24.權(quán)利要求22的方法，其中的金屬為金。
25.權(quán)利要求24的方法，其中金涂層的厚度約為1納米-1000納米。
26.權(quán)利要求20的方法，其中的聚合物膜選自對(duì)苯二甲酸亞乙酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃紙，纖維素聚合物如乙基纖維素、醋酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、丙酸纖維素、三醋酸纖維素、三醋酸纖維素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、離子交聯(lián)聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龍共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯或芳香聚砜。
27.權(quán)利要求26的方法，其中的聚合物膜為對(duì)苯二甲酸亞乙酯。
28.權(quán)利要求20的方法，其中的聚合物膜為光學(xué)透明的。
29.權(quán)利要求28的方法，其中的聚合物膜具有5％-95％的光學(xué)透明度。
30.權(quán)利要求28的方法，其中的聚合物膜具有約20％-80％的光學(xué)透明度。
31.權(quán)利要求20的方法，其中的抗體結(jié)合蛋白層由具有以下通式的化合物形成X-P-Ab其中X能夠與聚合物膜上的金屬或金屬氧化物反應(yīng)；P是一種抗體結(jié)合蛋白；并且Ab是一種目標(biāo)分析物特異性抗體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中X為不對(duì)稱的或?qū)ΨQ的二硫化物(-SSY’、-SSY)、硫化物(-’SY’、-SY)、二硒化物(-’Se-SeY’)、硒化物(-SeY’、-SeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、異腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三價(jià)磷化合物、異硫氰乙酸、黃原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羥基酸和異羥肟酸。
33.權(quán)利要求20的方法，其中分析物選自細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、類風(fēng)濕因子、IgG、IgM、IgA和IgE抗體、癌胚抗原、鏈球菌A類抗原、病毒抗原、自身免疫疾病相關(guān)抗原、變應(yīng)原、腫瘤抗原、鏈球菌B類抗原、HIVI或HIVII抗原、抗體、病毒、RSV特異性抗原、抗原、酶、激素、多糖、蛋白、脂類、糖類、藥物、核酸、腦膜炎奈瑟菌A類、B類、C類、Y類和W類135亞類、肺炎鏈球菌、大腸桿菌K1、B型流感嗜血菌、來(lái)源于微生物的抗原、半抗原、濫用藥物、治療藥物、環(huán)境劑或肝炎特異性抗原。
34.權(quán)利要求33的方法，其中的分析物為細(xì)菌、酵母、真菌或病毒。
35.權(quán)利要求20的方法，其中的蛋白物質(zhì)選自蛋白A、蛋白G、蛋白L，或其重組形式。
36.一種檢測(cè)介質(zhì)中的分析物的方法，包括將含有分析物的待測(cè)介質(zhì)與一種生物傳感裝置相接觸，該生物傳感裝置包括一種聚合物膜；以及在該聚合物膜上模式印制的一種抗體結(jié)合蛋白層，其中該抗體結(jié)合蛋白層上帶有一種對(duì)分析物具有特異性的蛋白物質(zhì)；以及用一種光透射該聚合物膜；并且通過(guò)檢測(cè)透射光的衍射圖像來(lái)檢測(cè)與蛋白物質(zhì)結(jié)合的分析物的存在情況。
37.權(quán)利要求36的方法，其中的衍射圖像用裸眼可以看到。
38.權(quán)利要求36的方法，其中聚合物膜進(jìn)一步含有一種金屬涂層。
39.權(quán)利要求38的方法，其中的金屬為金。
40.一種生物傳感器，包括一種聚合物膜；以及在該聚合物膜上模式印制的一種抗體結(jié)合蛋白層，其中該抗體結(jié)合蛋白層可作為分析物的一種受體。
41.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中抗體結(jié)合蛋白層的印制模式能夠使該生物傳感器在與分析物結(jié)合的情況下將透射光衍射而形成一種衍射圖像。
42.權(quán)利要求41的生物傳感器，其中的衍射圖像用裸眼可以看到。
43.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中聚合物膜進(jìn)一步含有一種金屬涂層。
44.權(quán)利要求43的生物傳感器，其中的金屬選自金、銀、鉻、鎳、鉑、鋁、鐵、銅、鋯，或其氧化物。
45.權(quán)利要求43的生物傳感器，其中的金屬為金。
46.權(quán)利要求45的生物傳感器，其中金涂層的厚度約為1納米-1000納米。
47.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中的聚合物膜選自對(duì)苯二甲酸亞乙酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃紙，纖維素聚合物如乙基纖維素、醋酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、丙酸纖維素、三醋酸纖維素、三醋酸纖維素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、離子交聯(lián)聚合物(乙烯聚合物)、聚乙烯-尼龍共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯或芳香聚砜。
48.權(quán)利要求47的生物傳感器，其中的聚合物膜為對(duì)苯二甲酸亞乙酯。
49.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中的聚合物膜為光學(xué)透明的。
50.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中的聚合物膜具有5％-95％的光學(xué)透明度。
51.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中的聚合物膜具有約20％-80％的光學(xué)透明度。
52.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中的抗體結(jié)合蛋白層由具有以下通式的化合物形成X-P其中X能夠與聚合物膜上的金屬或金屬氧化物反應(yīng)；P是一種抗體結(jié)合蛋白。
53.權(quán)利要求52的生物傳感器，其中X為不對(duì)稱的或?qū)ΨQ的二硫化物(-SSY’、-SSY)、硫化物(-’SY’、-SY)、二硒化物(-’Se-SeY’)、硒化物(-SeY’、-SeY)、硫醇(-SH)、腈(-CN)、異腈、硝基(-NO2)、硒醇(-SeH)、三價(jià)磷化合物、異硫氰乙酸、黃原乙酸、硫氨基甲乙酸、膦、硫羰酸或二硫羰酸、羧酸、羥基酸和異羥肟酸。
54.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中分析物選自諸如IgG、IgM、IgA和IgE等抗體。
55.權(quán)利要求40的生物傳感器，其中的蛋白物質(zhì)選自蛋白A、蛋白G、蛋白L，或其重組形式。
56.權(quán)利要求40的生物傳感器，該生物傳感器進(jìn)一步包含一種衍射增強(qiáng)元件，其中該衍射增強(qiáng)元件包括能夠與分析物結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種廉價(jià)而又靈敏的裝置以及用來(lái)對(duì)介質(zhì)中的分析物進(jìn)行檢測(cè)和定量的方法。該裝置含有一種金屬化薄膜,膜上印有預(yù)定模式的特定抗體結(jié)合蛋白。一旦目標(biāo)分析物附著于印有蛋白的塑料薄膜的特定區(qū)域,即可通過(guò)該分析物的確定尺寸和特定精確位置產(chǎn)生透射光衍射和/或反射光衍射。產(chǎn)生的衍射圖像可用眼睛方便地觀察,也可選擇性地使用一種傳感裝置。
文檔編號(hào)G01N21/47GK1338052SQ99814625
公開(kāi)日2002年2月27日 申請(qǐng)日期1999年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月17日
發(fā)明者K·麥格拉斯, R·M·凱洛, D·S·埃維爾哈特 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司