專利名稱：：慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動物實驗?zāi)Ｐ偷闹苽浞椒?，尤其是涉及一種慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型的制備方法。
背景技術(shù)：
：慢性肝損傷即慢性肝炎主要是指慢乙肝、慢丙肝，我國屬高發(fā)國家之一。因其具有傳染性、難治性、惡變性、家族遺傳性、經(jīng)常出現(xiàn)軀體不適等特點，使慢性肝炎患者長期或間斷地處于心、身雙重的折磨中。所以，慢性肝炎患者長期處于一種抑郁狀態(tài)，他們對生活悲觀失望，對生存失去信心。我們把這種由慢性肝炎引起的抑郁狀態(tài)稱為"慢性肝炎合并抑郁癥"。臨床除慢性肝病常見的癥狀體征外，還具有失眠、焦慮、抑郁、強迫、對疾病過渡關(guān)注等精神障礙癥，這種狀態(tài)存在于肝病發(fā)生發(fā)展的各個階段，并存在于每一個肝病個體，慢性肝病和抑郁癥二者互為因果，病情逐漸加重，治療難度也隨之加大，故對本病的研究越來越受到醫(yī)學(xué)界的重視。目前關(guān)于本病發(fā)生的流行病學(xué)大樣本、多種心的研究尚缺乏，但是隨著本病越來越受到關(guān)注，已經(jīng)有很多學(xué)者對慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌等慢性肝病患者的抑郁狀態(tài)進行了調(diào)查研究。有研究提示，一般肝病病人中有35%60%具有不同程度的抑郁。周愛紅對110例肝炎病人進行了調(diào)査，其中有67例(60.9%)存在不同程度的抑郁心理。肖瓊研究發(fā)現(xiàn)，212份肝硬化患者中，92例存在抑郁癥狀，占43.8%。張武等對82例慢性乙型肝炎患者進行測評，結(jié)果其中有抑郁者29例，患病率為35%(29/82)，抑郁自評量表標(biāo)準(zhǔn)分均值為43.16±10.05，高于正常組41.88士10.57(t=2.41，P〈0.05)。調(diào)查顯示慢性乙型肝炎癥狀嚴(yán)重、病毒復(fù)制明顯及肝功能損害嚴(yán)重患者其抑郁、焦慮情緒更明顯。慢性肝炎合并抑郁癥，祖國醫(yī)學(xué)并無此病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)"黃疸"、"脅痛"等合并"郁證"的范疇。許多古代醫(yī)籍中都有對"郁"的相關(guān)論述。對郁的認(rèn)識源于《內(nèi)經(jīng)》，提出外感致郁及情志致郁兩種觀點。宋代陳無擇，其在《三因極一病證方論》說"七情人之常性，動之則先自臟腑郁發(fā)，外形于肢體，為內(nèi)所因"。《景岳全書4卩證》"凡五氣之郁則諸病皆有，此因病而郁也。至若情志之郁，則總由乎心，此因郁而病也"。其病機是初起七情所傷，肝失條達，氣機不暢而成氣郁，病屬實為氣??；氣有余便是火可成火郁；由氣及血可成血郁；氣滯濕阻，聚而成痰可成痰郁；氣滯水氣不行，濕氣停留可成濕郁；氣滯痰濕不化則食積難消可成食郁；此六郁互為因果又相互兼夾。由此可見軀體疾病伴發(fā)抑郁癥與疾病本身有一定的關(guān)系。韓毳認(rèn)為抑郁癥與中醫(yī)肝臟有諸多聯(lián)系，其從中醫(yī)肝臟的生理病理特點，以及中醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對抑郁癥的認(rèn)識等方面進行分析闡述，得出如下推論肝郁可能是抑郁癥的重要發(fā)病環(huán)節(jié)；神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)是抑郁癥和肝失疏泄證共同的病理學(xué)基礎(chǔ)。導(dǎo)致心情壓抑長期不能緩解，引起腦腑氣機紊亂，腦神失調(diào)而致本病。慢性乙型肝炎的發(fā)病機制復(fù)雜，除與病毒感染有關(guān)外，還與機體的免疫應(yīng)答失調(diào)有關(guān)。研究表明心理反應(yīng)可導(dǎo)致一系列的生理反應(yīng)，影響機體的免疫功能，從而影響疾病的治療進程。對于肝炎合并抑郁的發(fā)生國內(nèi)外已有報道，但對其機理尚無較清晰的認(rèn)識。從抑郁的發(fā)病機理看，多認(rèn)為與生物-心理-社會因素有關(guān)。目前研究表明抑郁癥是腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)，如去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)等功能不足所致而成的。多種神經(jīng)肽，包括促皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促甲狀腺素釋放激素(TRH)、生長激素(GH)、生長激素釋放激素(GHRH)等參與抑郁癥的發(fā)病過程。此外，慢性應(yīng)激造成下丘腦一垂體一腎上腺軸亢進時產(chǎn)生的應(yīng)激激素對海馬神經(jīng)元的選擇性損傷是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的關(guān)鍵原因。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)屬于神經(jīng)營養(yǎng)素家族，是一類很重要的保護因子。研究發(fā)現(xiàn)慢性不可預(yù)知的應(yīng)激可致抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元明顯受損，BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。關(guān)于慢性肝炎合并抑郁癥的發(fā)病越來越受到重視，目前無有效的藥物治療，而對本病的實驗研究尚未見有報道，如果可以成功復(fù)制慢性肝損傷合并慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠模型，不但可以研究本病發(fā)生的機理，還可以為研制治療本病有效藥物提供動物實驗依據(jù)，且本發(fā)明的造模方法為復(fù)合式造模方法，研究的是一種疾病長期存在的狀態(tài)下，合并其他相關(guān)疾病的實驗，為其他疾病有合并癥提供實驗思路。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型的制備方法，用于研究本病發(fā)生的機理，為研制治療本病有效藥物提供動物實驗依據(jù)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型的制備方法，其特征在于包括下列步驟選用雄性Wistar大鼠，體重在180-220g之間，適應(yīng)環(huán)境1周后，進行敞箱實驗行為學(xué)篩選，選出積分相近的大鼠；第l-4周，5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周；第5-12周，5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，生理鹽水灌胃，l次/日；第13周，5只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，l次/日；第14-16周，首先進行敞箱實驗，1只/籠，正常飲食飲水，禁食禁水刺激時除外，生理鹽水灌胃，1次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每日隨機選用l種；第112天，稱體重、進行糖水消耗及敞箱實驗，實驗結(jié)束即得慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型。本發(fā)明采用皮下注射40%CCL4、孤養(yǎng)、給予慢性不可預(yù)知溫和刺激造模方法制備慢性肝損傷合并孤養(yǎng)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁大鼠模型，確立慢性肝損傷合并孤養(yǎng)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型評價指標(biāo)，不但可為今后研究本病造模提供參考依據(jù)，為臨床診治肝病合并抑郁癥提供有效的實驗依據(jù)，還可為今后研發(fā)治療本病的藥物提供實驗驗證手段。下面通過實驗例進一步說明本發(fā)明的效果選用雄性Wistar大鼠，體重在180-220g之間，適應(yīng)環(huán)境1周后，進行敞箱實驗(Open-field)行為學(xué)篩選，將積分相近的170只大鼠分為8組空白組、慢性肝損傷模型組(簡稱"肝炎模型組")、肝損傷合并慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(簡稱"抑郁模型組")、養(yǎng)肝解郁顆粒低劑量組(簡稱"低劑量組")、養(yǎng)肝解郁顆粒中劑量組(簡稱"中劑量組")、養(yǎng)肝解郁顆粒高劑量組(簡稱"高劑量組")、乙肝益氣解郁顆粒組(簡稱"對照1組")，鹽酸氟西汀膠囊組(簡稱"對照2組")，鹽酸氟西汀膠囊組30只，其余各組為20只，實驗周期為16周；l-4周空白組5只/籠，正常飲食飲水；肝炎模型組、抑郁模型組、對照1組、對照2組、高中低劑量組5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周；5-12周空白組5只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，1次/日；肝炎模型組、抑郁模型組:5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，生理鹽水灌胃，l次/日；對照l組5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，乙肝益氣解郁沖劑水溶液灌胃，l次/日；對照2組5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，鹽酸氟西汀膠囊水溶液灌胃，l次/日；高、中、低劑量組5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周，相應(yīng)濃度的養(yǎng)肝解郁顆粒水溶液灌胃，l次/日；13周空白組、肝炎模型組、抑郁模型組5只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，l次/日；對照l組5只/籠，正常飲食飲水，乙肝益氣解郁沖劑水溶液灌胃，l次/日；對照2組5只/籠，正常飲食飲水，鹽酸氟西汀膠囊水溶液灌胃，1次/日；高、中、低劑量組5只/籠，正常飲食飲水，相應(yīng)濃度的養(yǎng)肝解郁顆粒水溶液灌胃，l次/日；在實驗的第84天進糖水消耗實驗，稱量各組大鼠的體重；14-16周首先各組大鼠進行敞箱實驗；空白組、肝炎模型組5只/籠；正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，1次/日；抑郁模型組-1只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，l次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每天1種，具體詳見表l;對照l組l只/籠，正常飲食飲水，乙肝益氣解郁沖劑水溶液灌胃，l次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每天1種，具體詳見表l;對照2組l只/籠，正常飲食飲水，鹽酸氟西汀膠囊水溶液灌胃，1次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每天1種，具體詳見表1;高、中、低劑量組1只/籠，正常飲食飲水，相應(yīng)濃度的養(yǎng)肝解郁顆粒水溶液灌胃，l次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每天1種，具體詳見表l;實驗第112天各組大鼠稱體重、進行糖水消耗及敞箱實驗，實驗結(jié)束24小時后麻醉大鼠取實驗標(biāo)本。應(yīng)激刺激實驗日程表如下(表l):<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>每種刺激的操作方法如下:①禁食24h斷料，即早8:00至次日早8:00不喂食。②禁水24h斷水，即早8:00至次日早8:00不喂水。③晝夜顛倒于早7:OO將動物放入暗室中，不開燈使動物處于黑暗狀態(tài)；至晚19:OO將日光燈打開，使動物處于光照狀態(tài)，直至次曰早7:00。④冰水游泳游泳器具為一長方形硬塑料盒子，長50cm寬無限制，高度30cm以上，將動物放入盛有4。C冰水箱中，箱內(nèi)冰水的深度為15cm(大鼠的后足尖剛剛能觸及桶底)，5min后將動物取出放回籠中。⑤熱烘烘箱溫度調(diào)至45。C恒定，將動物放入烘箱中，5min后將動物取出。⑥夾尾將大鼠放入固定籠中，將鼠尾從籠蓋缺口中反向拉出，即大鼠的身體在籠內(nèi)，而尾巴通過籠蓋暴露在外，使用文件夾夾在距離大鼠尾根lcm處，(用力不要過大，使大鼠發(fā)出哀叫即可)持續(xù)1min后，將大鼠取出放回籠中。⑦電擊使用大鼠電擊箱操作，利用變壓線圈將電壓控制在36v，每隔lmin—次，每次通電10s，共進行30次。實驗過程中及實驗結(jié)束所獲得的結(jié)果1、結(jié)果表2各組大鼠體重的變化(；±s,g)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與空白組比較，？<0.05,"P<0.01;與肝炎模型組比較，*P<0.05**P<0.01;與抑郁模型組比較，AP<0.05,A。P<0.01。P值意義以下相同。表2結(jié)果表明造模前各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，隨著時間的推移各組大鼠逐漸消痩，體重明顯減輕。實驗84天與空白組比較，模型1組、模型2組體重減少有明顯的差異(P<0.01)。在第112天與空白組比較模型1、2組體重明顯減少(P<0.01)。表3各組大鼠糖水偏愛百分比比較(S±s,%)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3結(jié)果表明應(yīng)激刺激前，即第84天，與空白組比較，各組大鼠糖水偏愛百分比無明顯差異(P>0.05);實驗結(jié)東后，與空白組比較模型2組及對照1組糖水偏愛百分比明顯減少(P<0.01);與模型2組比較，模型1組大鼠對糖水偏愛百分比明顯增高(P<0.01)。表4各組大鼠Open-Field法行為測定水平運動比較(；±s，運動次數(shù)，次/3min)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5各組大鼠Open-Field法行為測定垂直運動比較(；±s,運動次數(shù)，次/3min)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表4分無差異(P〉0.05);實驗結(jié)束后與空白組比較，模型2組大鼠水平運動評分明顯下降(P<0.01)，與模型2組比較，模型1組大鼠水平運動評分明顯升高(P<0.01)。表5垂直運動結(jié)果表明實驗第1天及第92天，與空白組比較各組大鼠垂直運動評分無差異(P>0.05);實驗結(jié)東后與空白組比較，模型2組大鼠垂直運動評分明顯下降(P<0.01),與模型2組比較，模型l組大鼠垂直運動評分明顯升高(P<0.01)。表6各組慢性肝損傷合并孤養(yǎng)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型各組大鼠血清膽紅素及蛋白含量的比較(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>TBIL:與空白組比較模1組、模型2組大鼠血清TBIL含量明顯升高(P<0.01)。TP:與空白組比較模型1組、模型2組大鼠血清TP含量明顯下降(P復(fù)01)。ALB:與空白組比較模型1組、模型2組大鼠血清ALB含量明顯下降(P復(fù)01)。表7各組慢性肝損傷合并孤養(yǎng)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁模型各組大鼠血清酶含量的比較(X±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ALT:與空白比較模型1組、模型2組大鼠血清ALT含量明顯升高(P〈0.01);AST:與空白比較模型l組、模型2組大鼠血清ALT含量明顯升高(P<0.01)。表8各組大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化G土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>5-HT:與空白組比較，模型2組大鼠大腦下丘腦內(nèi)5-HT的含量均明顯降低(P<0.01);DA:與空白組比較，模型2組大鼠大腦下丘腦內(nèi)DA的含量均明顯降低(P<0.01);;NE:與空白組比較，模型2組大鼠大腦下丘腦內(nèi)NE的含量均明顯降低(P<0.01)。2、結(jié)論(1)通過對上述表格中正常對照組、肝炎模型組、肝炎合并抑郁模型組的數(shù)據(jù)統(tǒng)計的分析，可得出如下的結(jié)論在行為學(xué)上肝炎合并抑郁模型組在實驗結(jié)束時明顯出現(xiàn)抑郁的表現(xiàn)；在體重上三者間均有著差異性，且肝炎合并抑郁模型組大鼠的體重下降最明顯；在糖水消耗試驗上，在實驗到第13周末時，三組大鼠對糖水的偏愛沒有顯著性的差異，而在實驗第16周末時，正常對照組、肝炎模型組大鼠對糖水的偏愛沒有顯著差異，而肝炎合并抑郁模型組大鼠對糖水的偏愛明顯的降低，說明抑郁模型造模成功；在敞箱實驗上，實驗開始時三組大鼠均無明顯差異，試驗結(jié)束的時候，肝炎合并抑郁模型組的大鼠在水平運動和垂直運動與正常對照組和肝炎模型組有顯著性差異，說明抑郁模型造模成功；在肝功改變上，正常對照組與肝炎模型組、肝炎合并抑郁模型組大鼠肝功能的變化上有顯著性的差異，說明慢性肝損傷的模型復(fù)制成功；在神經(jīng)遞改變上，肝炎合并抑郁模型組均比正常對照組及肝炎模型組大鼠偏低，且有統(tǒng)計學(xué)意義，通過下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的變化，說明慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型照模成功。經(jīng)分析說明采用皮下注射40%CCL4、孤養(yǎng)、給予慢性不可預(yù)知溫和刺激造模方法可成功制備慢性肝損傷合并孤養(yǎng)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁大鼠模型。養(yǎng)肝解郁顆粒方來源于丹梔逍遙散，丹梔逍遙散出自明代醫(yī)家薛己《內(nèi)科摘要》，為古代經(jīng)典名方的中藥復(fù)方制劑，療效確切，今用于治療慢性肝病合并抑郁癥，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病與中醫(yī)證候相結(jié)合(病證結(jié)合)，體現(xiàn)中藥復(fù)方制劑的傳統(tǒng)繼承觀與現(xiàn)代應(yīng)用之發(fā)展觀，組成丹皮、梔子、白術(shù)、茯苓、甘草、柴胡、當(dāng)歸、白芍、生姜、薄荷。實施例選用雄性Wistar大鼠，體重在200g，適應(yīng)環(huán)境1周后，進行敞箱實驗行為學(xué)篩選，選出積分相近的大鼠；第l-4周，5只/籠，正常飲食飲水，40%CCL4lml/kg，皮下注射2次/周；第5-12周，5只/籠，正常飲食飲水，40%CCUlml/kg，皮下注射2次/周，生理鹽水灌胃，l次/日；第13周，5只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，l次/日；第14-16周，首先進行敞箱實驗，1只/籠，正常飲食飲水，禁食禁水刺激時除外，生理鹽水灌胃，1次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每日隨機選用l種；第112天，稱體重、進行糖水消耗及敞箱實驗，實驗結(jié)束24小時后麻醉大鼠即得慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型。權(quán)利要求1.一種慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型的制備方法，其特征在于包括下列步驟選用雄性Wistar大鼠，體重在180-220g之間，適應(yīng)環(huán)境1周后，進行敞箱實驗行為學(xué)篩選，選出積分相近的大鼠；第1-4周，5只/籠，正常飲食飲水，40％CCL41ml/kg，皮下注射2次/周；第5-12周，5只/籠，正常飲食飲水，40％CCL41ml/kg，皮下注射2次/周，生理鹽水灌胃，1次/日；第13周，5只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，1次/日；第14-16周，首先進行敞箱實驗，1只/籠，正常飲食飲水，禁食禁水刺激時除外，生理鹽水灌胃，1次/日，給予慢性應(yīng)激刺激，每日隨機選用1種；第112天，稱體重、進行糖水消耗及敞箱實驗，實驗結(jié)束即得慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型。全文摘要一種慢性肝損傷合并應(yīng)激抑郁大鼠模型的制備方法，選用雄性Wistar大鼠，體重在180-220g之間，適應(yīng)環(huán)境1周后，進行敞箱實驗行為學(xué)篩選，選出積分相近的大鼠；第1-4周，正常飲食飲水，40％CCL₄1ml/kg，皮下注射2次/周；5-12周，正常飲食飲水，40％CCL₄1ml/kg，皮下注射2次/周，生理鹽水灌胃，1次/日；第13周，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，1次/日；第14-16周，首先進行敞箱實驗，1只/籠，正常飲食飲水，生理鹽水灌胃，1次/日，給予慢性應(yīng)激刺激；第112天，稱體重、進行糖水消耗及敞箱實驗。本發(fā)明研究本病造模提供參考依據(jù)，為臨床診治肝病合并抑郁癥提供有效的實驗依據(jù)，還可為今后研發(fā)治療本病的藥物提供實驗驗證手段。文檔編號A61K49/00GK101284138SQ20081005078公開日2008年10月15日申請日期2008年6月4日優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日發(fā)明者劉鐵軍申請人:劉鐵軍