專利名稱:可用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的rna干擾靶點(diǎn)的制作方法
可用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的RNA干擾靶點(diǎn)
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明主要涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及可用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的5個(gè)RNA干擾(RNAi)靶點(diǎn)以及應(yīng)用這些靶點(diǎn)的重組表達(dá)載體和應(yīng)用這些靶點(diǎn)以各種方式獲得的可用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的藥物或組合物和方法。
發(fā)明背景
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全世界最重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。HBV感染引起的相關(guān)疾病包括急性或慢性乙型肝炎，及由慢性乙型肝炎進(jìn)一步發(fā)展引發(fā)的肝硬化(HC)、肝細(xì)胞癌(HCC)等。由于HBV是一種種屬特異性和組織特異性極強(qiáng)的DNA 病毒，其只感染人和高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，而不感染醫(yī)學(xué)中常用的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此需要建立一種有效、穩(wěn)定的HBV感染動(dòng)物模型以滿足目前研究的需要。構(gòu)建人鼠嵌合HBV感染小鼠模型是一個(gè)重要的研究方向。一般而言，構(gòu)建人鼠嵌合HBV感染小鼠模型的一個(gè)必要條件是人肝細(xì)胞移植入小鼠肝小葉及實(shí)質(zhì)細(xì)胞附近后，必須具備生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)以競(jìng)爭(zhēng)過(guò)復(fù)原能力強(qiáng)的鼠肝細(xì)胞，即需要對(duì)小鼠肝細(xì)胞造成特異性肝損傷。
RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是一種由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的序列特異性的抑制基因表達(dá)的機(jī)制，其于1998年在線蟲的基因表達(dá)抑制研究中被首次提出(Fire A等，自然，1998年，391卷806-811頁(yè))。在此之后，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi廣泛存在于高等哺乳動(dòng)物以及真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等幾乎所有的真核生物中，是一種普遍存在和保守的抑制基因表達(dá)的機(jī)制，可起到調(diào)控基因表達(dá)、抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)等作用(Dykxhoorn DM等，自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述，2003年，4卷457-467頁(yè))。目前RNAi的機(jī)制已基本被闡明內(nèi)源或外源產(chǎn)生的dsRNA 分子在細(xì)胞質(zhì)中被稱為Dicer的RNA酶III切割成小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)。典型的siRNA結(jié)構(gòu)特征為5'端被磷酸化，3'端對(duì)稱性突出2_3nt并帶羥基，長(zhǎng)度為19_23nt的dsRNA。siRNA分子與稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducing silencing complex, RISC)的蛋白復(fù)合體結(jié)合，RISC具有解螺旋酶和核酸內(nèi)切酶活性。siRNA分子在復(fù)合體中被解聚，其中反義鏈與可與之匹配的靶mRNA按堿基配對(duì)原則結(jié)合，并引導(dǎo)與之結(jié)合的RISC將靶mRNA在與反義鏈的結(jié)合區(qū)中部距5'端IOnt的位置處酶解，從而抑制靶基因的表達(dá)。目前獲得siRNA的方法主要有可表達(dá)小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA) 的質(zhì)粒和重組病毒載體、化學(xué)合成方法、體外轉(zhuǎn)錄等。
目前，RNAi技術(shù)已被廣泛用于特異性下調(diào)基因表達(dá)研究。研究顯示，延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)是細(xì)胞酪氨酸代謝途徑的重要水解酶(Grompe，al-Dhalimy et al. 1993)。肝細(xì)胞中FAH的缺乏會(huì)導(dǎo)致酪氨酸分解代謝受阻，無(wú)法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸鹽，引起酪氨酸在體內(nèi)的蓄積，導(dǎo)致肝臟損傷。因此，本發(fā)明人提出，通過(guò)RNA干擾的方法下調(diào)FAH的表達(dá)，從而獲得誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的效果。由于并非所有符合常規(guī)設(shè)計(jì)要求的RNAi靶點(diǎn)都能夠有效抑制靶基因的表達(dá)，不同靶點(diǎn)間的抑制效率各有差別，因此，選擇合適的具有高抑制效率的RNAi靶點(diǎn)是十分重要的。選擇合適的RNAi靶點(diǎn)需要從結(jié)構(gòu)特征、抑制效率、非人類基因同源性等方面進(jìn)行綜合考慮?？墒褂玫妮o助方法包括目前已提出的SiRNA輔助設(shè)計(jì)軟件、RNA分子結(jié)構(gòu)分析、核酸序列分析比對(duì)以及實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)等，并通過(guò)具體的抑制評(píng)估實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。
利用RNA干擾技術(shù)可建立有效的誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的方法，然而該方法需要提供可有效下調(diào)FAH的表達(dá)的RNA干擾靶點(diǎn)。本發(fā)明滿足了這一要求，提供了可用于該目的的RNA 干擾靶點(diǎn)、重組表達(dá)載體等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)，可表達(dá)靶向本發(fā)明所述的RNA干擾靶點(diǎn)的SiRNA的表達(dá)質(zhì)粒、重組病毒載體和細(xì)胞，以及包含靶向本發(fā)明所述的RNA干擾靶點(diǎn)的 siRNA的藥物或組合物。
本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)可用于靶向FAH，抑制FAH基因表達(dá)。本發(fā)明提供的 RNA干擾靶點(diǎn)是通過(guò)以下方法獲得的選擇和設(shè)計(jì)可靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)序列；通過(guò)設(shè)計(jì)合適的寡核苷酸構(gòu)建siRNA，并將其克隆入表達(dá)載體以獲得相應(yīng)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒；將該質(zhì)粒與帶有FAH基因的報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平來(lái)篩選獲得合適的RNA干擾靶點(diǎn)。
本發(fā)明提供靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)，其序列選自
(I)SEQ ID NO :1-5中任何一個(gè)所示的序列，或者
(2)在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件下能夠與(I)中序列雜交的核苷酸序列，或者
(3)與(I)中序列僅有I或2個(gè)核苷酸不同的序列；或者
(4)上述序列的片段或者互補(bǔ)序列。
本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)的序列可以是DNA或RNA序列。
本發(fā)明還提供包含該RNA干擾靶點(diǎn)序列的核酸構(gòu)建體或載體如表達(dá)載體。包含該 RNA干擾靶點(diǎn)序列的重組表達(dá)載體可用于表達(dá)本發(fā)明的靶向FAH的siRNA和/或miRNA。
本發(fā)明還提供依據(jù)上述的RNA干擾靶點(diǎn)序列獲得的、能夠抑制FAH基因的表達(dá)的 siRNA 或 miRNA。
本發(fā)明還提供了可表達(dá)本發(fā)明的靶向FAH的siRNA和/或miRNA的重組表達(dá)載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組表達(dá)載體具有以下特征包含靶向本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)的siRNA和/或miRNA的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，從而使得可在宿主細(xì)胞例如動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)中表達(dá)所述靶向FAH的siRNA和/或miRNA。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等。
本發(fā)明還涉及分離的細(xì)胞，其包含(I)本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)序列，或者⑵含有本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)序列的核酸構(gòu)建體或載體如表達(dá)載體。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了重組表達(dá)載體的分離的細(xì)胞，所述重組表達(dá)載體可表達(dá)本發(fā)明的靶向FAH的siRNA和/或miRNA。
本發(fā)明還涉及一種改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)，其可表達(dá)或包含本發(fā)明的siRNA和/或miRNA。[0023]本發(fā)明還涉及在基因組中或者基因組外攜帶本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列的細(xì)胞，包括原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞)和真核細(xì)胞(如真菌細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)，其包含有本發(fā)明涉及的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列，并且這些編碼核酸序列可與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在該細(xì)胞中表達(dá)所述的siRNA和/或miRNA。
本發(fā)明還涉及導(dǎo)入了根據(jù)本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或miRNA 的細(xì)胞，包括原核細(xì)胞(如細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞)和真核細(xì)胞(如真菌細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)，其被導(dǎo)入了或包含有根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或miRNA。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將含有本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列的 siRNA表達(dá)元件導(dǎo)入細(xì)胞，可使細(xì)胞獲得抑制FAH基因表達(dá)的能力。
本發(fā)明還涉及包含上述細(xì)胞的組織和生物，如動(dòng)物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的細(xì)胞的藥物或組合物。
另一方面，本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的改造的細(xì)胞的方法，其包括用本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(包括動(dòng)物細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括用本發(fā)明的重組病毒載體(例如慢病毒載體， 如慢病毒Lenti-siFAH8等)轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在上述方法中，所述細(xì)胞可以是分離的(或離體的)，例如從正常個(gè)體分離的，或者是在體內(nèi)的，或者是體外培養(yǎng)的細(xì)胞株。
本發(fā)明還涉及DNA序列(或者DNA)的組合，其包括或者由編碼正義RNA片段的第一 DNA序列和編碼反義RNA片段的第二 DNA序列組成，所述正義RNA片段包含本發(fā)明靶點(diǎn)序列所編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制 FAH基因的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及小干擾RNA(SiRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含本發(fā)明靶點(diǎn)序列編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能抑制FAH基因的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或miRNA在誘導(dǎo)肝損傷中的用途。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或miRNA在制備抑制FAH基因表達(dá)的藥物和/或組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)、或核酸構(gòu)建體或載體、或重組表達(dá)載體在誘導(dǎo)肝損傷或產(chǎn)生肝臟損傷的小鼠中的用途，或在制備用于誘導(dǎo)肝損傷或產(chǎn)生肝臟損傷的小鼠的藥物和/或組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的經(jīng)改造的細(xì)胞(包括動(dòng)物細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)在制備用于誘導(dǎo)肝損傷或產(chǎn)生肝臟損傷的小鼠的藥物和/或組合物中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的SiRNA在篩選治療肝損傷的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及抑制FAH基因表達(dá)的方法，其包括向有此需要的個(gè)體或細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)、核酸構(gòu)建體或載體、siRNA或miRNA、表達(dá)載體、細(xì)胞、或DNA 序列組合。
本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)、核酸構(gòu)建體或載體、siRNA或miRNA、表達(dá)載體、細(xì)胞、或DNA序列組合導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。
下面將結(jié)合
附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。
附圖概述
圖I為pSUPER-siRNA系列表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程的示意圖(該示意圖以實(shí)施例2 中所示的RNA干擾靶點(diǎn)序列siFAHS (SEQ ID NO :1)作為示例，但是也可以使用本發(fā)明提供的其他RNA干擾靶點(diǎn)序列)。
圖2顯示了獲得的5個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒在與FAH報(bào)告質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的抑制效果。結(jié)果顯示，針對(duì)這些RNA干擾靶點(diǎn)的siRNA具有良好的抑制效果。該圖中，siFAH8、siFAH10、siFAHl、siFAH12、siFAH6分別代表針對(duì)這些RNA干擾靶點(diǎn)的siRNA 表達(dá)質(zhì)粒，其中靶點(diǎn)序列及有關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程見實(shí)施例2。
圖3顯示，獲得的表達(dá)載體pDEST_siFAH8、pDEST-siFAHIO可有效表達(dá)所編碼的siRNA序列，且具有基因靶向特異性。當(dāng)FAH報(bào)告質(zhì)粒pGL3-FAH分別與表達(dá)載體 pDEST-siFAH8或pDEST-siFAHIO共轉(zhuǎn)染時(shí)，螢光素酶(Iuciferase)基因的表達(dá)受到了有效抑制，而當(dāng)對(duì)照?qǐng)?bào)告質(zhì)粒pGL3-control與表達(dá)載體pDEST_siFAH8或pDEST-siFAHIO共轉(zhuǎn)染時(shí)，螢光素酶基因的表達(dá)不會(huì)受到抑制。
圖4是攜帶有靶向FAH的siRNA表達(dá)序列的重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后細(xì)胞中的相對(duì)螢光素酶活性，結(jié)果顯示，在用攜帶有靶向FAH的siRNA表達(dá)序列的重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后，細(xì)胞可有效抑制FAH報(bào)告質(zhì)粒pGL3-FAH的表達(dá)。詳見實(shí)施例5。
圖5顯示了攜帶有靶向FAH的siRNA表達(dá)序列的載體表達(dá)的siRNA在小鼠體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用。其中圖A顯示注射siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-siFAH8的Balb/c小鼠出現(xiàn)整片的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損現(xiàn)象；圖B顯示注射siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-siFAH8的Balb/ c小鼠出現(xiàn)大片的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成的肝血竇不復(fù)存在，大量的血細(xì)胞匯集在肝細(xì)胞損傷處。圖C和D分別顯示了對(duì)照小鼠(即正常的Balb/c小鼠和注射對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-Nk的Balb/c小鼠)均未出現(xiàn)肝組織損傷。
具體實(shí)施方式
除非另有定義，否則本文中所使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。
本發(fā)明提供了可靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)，其包含如下序列SEQ ID NO :1_5的任何一個(gè)或幾個(gè)序列，或與其具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高) 一致性的序列。
—致性(identity)可以按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行計(jì)算。適合于確定序列一致性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法的一個(gè)優(yōu)選例子是BLAST和BLAST 2. O算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410中。采用例如本文所述的參數(shù)，BLAST和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分?jǐn)?shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó)立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。
在其它實(shí)施方案中，所述RNA干擾靶點(diǎn)具有在嚴(yán)緊條件下或者高度嚴(yán)緊條件與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的多核苷酸序列。在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，雜交技術(shù)是熟知的。為了舉例說(shuō)明的目的，所述雜交的條件是嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的DNA在6 X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，之后在O. 2XSSC/0. I % SDS中于約50-65°C下進(jìn)行一次或多次洗滌；高度嚴(yán)緊條件，例如與濾膜結(jié)合的核酸在6XSSC中約 45°C下雜交，之后在O. 1XSSC/0. 2% SDS中于約68°C下進(jìn)行一次或多次洗滌；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它嚴(yán)緊雜交條件(參見例如Ausubel,F. M.等編，1989,Current Protocols in Molecular Biology,第 I 卷，Green Publishing Associates, Inc.,和 John Wiley & Sons, Inc.，紐約，第 6. 3. 1-6. 3. 6 和 2· 10. 3 頁(yè))。
本發(fā)明還涉及在嚴(yán)緊條件或者高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1-5的任一序列、或其片段、或其互補(bǔ)序列能夠雜交的核苷酸序列。
在本發(fā)明中，siRNA和/或miRNA可被設(shè)計(jì)成靶向目的基因或者其調(diào)控序列，例如需要抑制其表達(dá)的基因或其調(diào)控序列，以便抑制或降低其表達(dá)。所針對(duì)的基因或其調(diào)控序列可以是需要抑制或降低其表達(dá)的任何基因或其調(diào)控序列，例如來(lái)自病原體的、或者參與癌癥形成和發(fā)展的那些。特別地，本發(fā)明的siRNA和/或miRNA靶向FAH。本發(fā)明的siRNA 和miRNA可按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)。
“根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA、miRNA”指的是通過(guò)重組表達(dá)或化學(xué)合成等方式得到的siRNA、miRNA,其所作用的靶序列(可以是DNA或RNA序列)為或包含有本發(fā)明涉及的RNA干擾靶點(diǎn)序列。
siRNA的常規(guī)設(shè)計(jì)方法可參考文獻(xiàn)(如Reynolds A等，自然生物技術(shù)，2004年， 22卷326-330)或AmhioruQiagen等公司網(wǎng)站的公開資料或?qū)嵤├齀中的描述。miRNA的常規(guī)設(shè)計(jì)方法可參考文獻(xiàn)(Lo HL等，基因治療，2007年，14卷1503-1512頁(yè))，選擇靶序列的方法與siRNA的設(shè)計(jì)方法相似，例如可將設(shè)計(jì)的含有靶序列的正義鏈及相應(yīng)的反義鏈替換到pri-microRNA上,使構(gòu)建的miRNA可阻止含有祀序列的mRNA的表達(dá)。
本發(fā)明使用的啟動(dòng)子可以是適于在細(xì)胞中表達(dá)目的基因的任何啟動(dòng)子，其可以是組成型的，也可以是誘導(dǎo)型的。本發(fā)明的啟動(dòng)子還可以是復(fù)合啟動(dòng)子，如雙啟動(dòng)子。
“可操作地連接”是指所連接的分子的連接方式使得能夠?qū)崿F(xiàn)預(yù)期的功能。例如， 表達(dá)控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實(shí)現(xiàn)表達(dá)控制序列對(duì)基因編碼序列的表達(dá)的控制作用。
“表達(dá)控制序列”是實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)所需要的控制序列，其是本領(lǐng)域熟知的。表達(dá)控制序列通常必須包括啟動(dòng)子，常常也包括轉(zhuǎn)錄終止序列，并且還可以包含其他序列，如增強(qiáng)子序列?；虮磉_(dá)對(duì)于siRNA、miRNA等而目是指轉(zhuǎn)錄,并且還可以包括轉(zhuǎn)錄后加工；對(duì)于蛋白質(zhì)編碼序列而言通常是指轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供可靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)以及根據(jù)該靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的siRNA、miRNA。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及小干擾RNA (siRNA)，其包括正義RNA片段和
7反義RNA片段，所述正義RNA片段包含本發(fā)明RNA干擾靶點(diǎn)編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能抑制FAH基因的表達(dá)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“小干擾RNA”或“ siRNA”可互換使用，它們都指能夠抑制FAH基因表達(dá)、包括正義RNA片段區(qū)域和反義RNA片段區(qū)域的核糖核酸(RNA)。
另外，本發(fā)明還提供DNA序列(或者DNA)的組合，其包括或者由編碼正義RNA片段的第一 DNA序列(或第一 DNA)和編碼反義RNA片段的第二 DNA序列(或第二 DNA)組成，所述正義RNA片段包含本發(fā)明RNA干擾靶點(diǎn)所編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能(通過(guò)RNA干擾)抑制FAH基因的表達(dá)。DNA或DNA序列的組合表不一種產(chǎn)品，例如可以是一段或兩段DNA,或者包含該DNA的載體如表達(dá)載體、 重組質(zhì)粒、重組病毒。例如，所述第一 DNA和第二 DNA可以存在于同一段DNA上，也可以分別存在于兩段不同的DNA上。
在本發(fā)明的這方面，所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在于兩條不同的RNA 鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如一個(gè)單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。
例如，本發(fā)明的siRNA可以為發(fā)夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA 片段之間的互補(bǔ)區(qū)域形成雙鏈RNA區(qū)域。
正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度優(yōu)選為8_50個(gè)核苷酸，優(yōu)選10_30 (更優(yōu)選 15-27，19-23，如19、20或者21)個(gè)核苷酸，但也可以更長(zhǎng)或者更短。
正義RNA片段和反義RNA片段所形成的雙鏈RNA的互補(bǔ)區(qū)域至少有10個(gè)(優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少18個(gè)，如19、20或者21個(gè))堿基對(duì)。優(yōu)選地，所述正義RNA片段與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)域含19、20、或21對(duì)互補(bǔ)堿基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在正義RNA片段和反義RNA片段之間允許有少量的錯(cuò)配，例如 1-5個(gè)，如I個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)堿基錯(cuò)配。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段完全互補(bǔ)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA為具有10-30(優(yōu)選，15-27，更優(yōu)選19-23)對(duì)堿基的雙鏈RNA分子，所述雙鏈中至少有10個(gè)(優(yōu)選至少15個(gè)，更優(yōu)選至少18個(gè))堿基互補(bǔ)配對(duì)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段的GC含量為35%-75%， 例如 40-60%、45-55%、48-52%，如約 50%。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段與已知的人類基因和基因表達(dá)片段無(wú)顯著的一致性。顯著的一致性是指至少60%，例如70，80、90%的一致性。
優(yōu)選的是，所述正義RNA片段自5'端開始的19個(gè)核苷酸中，堿基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數(shù)量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數(shù)量之和占除去3'端的TT以外的19個(gè)核苷酸數(shù)量的比例為35% -75% (即G/C比例)，所述反義RNA片段及其一個(gè)核苷酸的突變體與已知的人類基因和基因表達(dá)片段無(wú)顯著一致性。
在本發(fā)明的重組表達(dá)載體的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如肝細(xì)胞或干細(xì)胞)中表達(dá)所述靶向FAH的siRNA 和 / 或 miRNA。
類似地，在制備本發(fā)明的改造的細(xì)胞的方法中，可以通過(guò)用包含本發(fā)明涉及的RNA干擾祀點(diǎn)的編碼核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(包括動(dòng)物細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞和干細(xì)胞)來(lái)獲得本發(fā)明的改造的細(xì)胞，只要最終得到的細(xì)胞包含本發(fā)明涉及的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列即可。
也可以通過(guò)在所述細(xì)胞中導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或 miRNA來(lái)獲得本發(fā)明的改造的細(xì)胞，只要得到的細(xì)胞包含有根據(jù)本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或miRNA即可。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以是質(zhì)粒載體，或病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等)。
本發(fā)明的改造的細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選肝細(xì)胞，優(yōu)選干細(xì)胞。所述細(xì)胞在基因組中或基因組外攜帶本發(fā)明涉及的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在該細(xì)胞中表達(dá)所述靶向FAH的siRNA和/或 miRNA。
本發(fā)明的重組載體和改造細(xì)胞可以用于抑制FAH基因表達(dá)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，產(chǎn)生肝臟損傷的小鼠。
在具體的實(shí)施方案中，涉及以下內(nèi)容
I.靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)的序列(SEQID NO 1-5)[0078]siFAH8GCTTTGG aaccacaatctctt(SEQ ID NO. I)[0079]siFAHlOCCATCAGTGGATCAGACCCTT(SEQ ID NO. 2)[0080]siFAHlCCCAAAGCCACGGATTGGTTT(SEQ ID NO. 3)[0081]siFAHl2AGTGCTGCCTGCCCTTTCATT(SEQ ID NO. 4)[0082]siFAH6CTCAAAGCCTCCTGTGTATTT(SEQ ID NO. 5)
2.表達(dá)載體，優(yōu)選病毒載體，其可用于改造肝細(xì)胞或干細(xì)胞。
可表達(dá)單個(gè)或多個(gè)siRNA和/或miRNA的重組病毒載體。
該病毒載體在肝細(xì)胞和/或干細(xì)胞上的應(yīng)用，例如可用于穩(wěn)定表達(dá)抗FAH的分子， 如可在肝細(xì)胞和/或干細(xì)胞中特異性抑制FAH基因表達(dá)的siRNA。
3.改造的細(xì)胞，如肝細(xì)胞和干細(xì)胞，其包含有本發(fā)明涉及的RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列，可表達(dá)所述的siRNA和/或miRNA ;或被導(dǎo)入了根據(jù)本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或miRNA ;或被導(dǎo)入了本發(fā)明的重組載體。
實(shí)施例
實(shí)施例I.靶向FAH的siRNA表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)的選擇與設(shè)計(jì)將人和小鼠FAH參考序列進(jìn)行序列比對(duì)， 選擇在二者之間存在序列差異的序列(至少I個(gè)堿基的差別)的區(qū)域，步移設(shè)計(jì)靶向FAH 的siRNA的序列；將初選獲得的siRNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，選擇與非靶向序列具有3個(gè)或3個(gè)以上堿基相異的序列作為候選序列。
siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例中，以pSUPER載體(oligoengine公司Cat. No VEC-PBS-0001/0002)為例構(gòu)建SiRNA的表達(dá)質(zhì)粒。具體的構(gòu)建過(guò)程可參見該公司的pSUPER 載體實(shí)驗(yàn)指南(WWW. oligoengine. com),構(gòu)建簡(jiǎn)要流程可見示意圖I。簡(jiǎn)言之,分別合成帶有RNA干擾序列的寡核苷酸；將互補(bǔ)寡核苷酸退火處理，然后連接到經(jīng)Bgl II和Hind III 雙酶切的pSUPER載體；經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，獲得正確的siRNA表達(dá)質(zhì)粒。[0091]對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以特異靶向螢光素酶基因的siRNA序列(siRNA-螢光素酶， 具體序列是5' -GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3' (SEQ ID NO :6))以及不與小鼠FAH和小鼠基因相匹配的無(wú)關(guān) siRNA 序列(siRNA-Nk，具體序列是 5' -TGCATCGGAAAATAGATGT-3' (SEQ ID NO :7))作為對(duì)照。如上所述，合成寡核苷酸并連接入pSUPER載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，分別獲得相應(yīng)的對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-luc和pSUPER-Nk。
實(shí)施例2.共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)篩選獲得可抑制FAH的RNA干擾靶點(diǎn)
延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)的缺乏會(huì)導(dǎo)致酪氨酸分解代謝受阻，無(wú)法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸鹽，引起酪氨酸在體內(nèi)的蓄積，導(dǎo)致肝臟損傷(Grompe M.等，基因與發(fā)育，1993年，7卷2298-2307頁(yè))。通過(guò)RNA干擾的方法下調(diào)FAH的表達(dá)，以期獲得肝損傷的效果。
pGL-FAH質(zhì)粒(構(gòu)建方法通過(guò)在pGL3_control質(zhì)粒(購(gòu)自Promega公司，Cat. E1741)的螢光素酶基因的終止密碼子與PolyA之間插入合成的FAH基因序列(GenBank No.NM_010176. 3)，構(gòu)建了報(bào)告質(zhì)粒pGL3_FAH)為可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如293FT細(xì)胞)中轉(zhuǎn)錄包含螢光素酶-FAH序列的mRNA的質(zhì)粒。如果細(xì)胞中存在可有效靶向FAH并切斷螢光素酶-FAH mRNA的siRNA，那么可阻止螢光素酶-FAH mRNA的翻譯，從而可檢測(cè)到報(bào)告蛋白螢光素酶表達(dá)的降低。通過(guò)檢測(cè)螢光素酶活性的降低可計(jì)算siRNA的抑制效率。因此，將 siRNA表達(dá)質(zhì)粒與pGL-FAH質(zhì)粒在293FT細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以靶向螢光素酶的 siRNA-螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒和祀向無(wú)關(guān)序列的siRNA-Nk表達(dá)質(zhì)粒作為對(duì)照。通過(guò)檢測(cè)共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的螢光素酶蛋白的表達(dá)水平來(lái)檢驗(yàn)不同siRNA抑制FAH的效率。
將293FT細(xì)胞(Invitrogen，Catalog#R700_07)培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(添加10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，O. ImM MEM非必需氨基酸及I %青霉素-鏈霉素)，匯合率約為70%。12小時(shí)后，根據(jù)廠商的說(shuō)明書，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Cat. No 11668-027)，將每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染 5 μ g 的 siRNA 表達(dá)質(zhì)粒(siRNA 表達(dá)質(zhì)粒按照實(shí)施例I所述構(gòu)建)和I μ g pGL-FAH報(bào)告質(zhì)粒。在共轉(zhuǎn)染48小時(shí)后分別檢測(cè)細(xì)胞中螢光素酶蛋白的活性。以共轉(zhuǎn)染了對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒和pGL-FAH質(zhì)粒的293FT細(xì)胞中的螢光素酶蛋白活性為對(duì)照，計(jì)算各siRNA對(duì)FAH的抑制效率。由此，獲得了 5個(gè)根據(jù)其可構(gòu)建具有有效抑制能力的siRNA的RNA干擾靶點(diǎn)。圖2顯示了分別根據(jù)這5個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列構(gòu)建獲得的siRNA表達(dá)質(zhì)粒的抑制效率。
下面是我們獲得的RNA干擾靶點(diǎn)(根據(jù)其可構(gòu)建具有有效抑制FAH的能力的 siRNA)的序列
siFAH8GCTTTGGAACCACAATCTCTT(SEQIDNO. I)[0098]siFAHlOCCATCAGTGGATCAGACCCTT(SEQIDNO. 2)[0099]siFAHlCCCAAAGCCACGGATTGGTTT(SEQIDNO. 3)[0100]siFAHl2AGTGCTGCCTGCCCTTTCATT(SEQIDNO. 4)[0101]siFAH6CTCAAAGCCTCCTGTGTATTT(SEQIDNO. 5)
實(shí)施例3.表達(dá)siRNA的重組病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
在本實(shí)施例中，構(gòu)建了可表達(dá)siFAH8和siFAHlO的重組慢病毒表達(dá)載體。
表達(dá)載體在本實(shí)施例中，我們使用的慢病毒系統(tǒng)的表達(dá)載體pDEST_MR(專利申請(qǐng)?zhí)?200510112917. I ;公開號(hào)CN1948475)包含了由Hl啟動(dòng)子控制的可用于表達(dá)siRNA的表達(dá)框。
表達(dá)載體pDEST-siFAH8 和 pDEST-siFAHIO 的構(gòu)建
用XhoI 和 XbaI 雙酶切 pSUPER_siFAH8 和 pSUPER-siFAHIO (分別含有 siFAH8 和siFAHlO的pSUPER載體，其構(gòu)建方法見實(shí)施例I)，從而獲得攜帶在Hl啟動(dòng)子控制下的 siFAH8和siFAHlO的核酸片段；進(jìn)一步將獲得的片段連接至經(jīng)同樣酶切處理的pDEST_MR 載體，從而分別構(gòu)建表達(dá)載體pDEST-siFAH8和pDEST-siFAHIO。(這里示例性地使用了實(shí)施例2中所示的RNA干擾靶點(diǎn)siFAH8(SEQ ID NO :1)、siFAH10 (SEQ ID NO :2)，但是也可以使用本發(fā)明提供的其他RNA干擾靶點(diǎn))。
我們對(duì)構(gòu)建獲得的重組慢病毒表達(dá)載體pDEST-siFAH8和pDEST-siFAHIO的表達(dá)的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。以靶向螢光素酶的siRNA-luc表達(dá)質(zhì)粒和靶向無(wú)關(guān)序列的 siRNA-Nk表達(dá)質(zhì)粒作為對(duì)照，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)pGL3-FAH分別與表達(dá)載體pDEST-siFAH8、pDEST-siFAHIO共轉(zhuǎn)染時(shí)，螢光素酶基因的表達(dá)受到了有效抑制，而當(dāng) pGL3-control與表達(dá)載體pDEST_siFAH8、pDEST-siFAHIO共轉(zhuǎn)染時(shí)，螢光素酶基因的表達(dá)不會(huì)受到抑制(參見圖3)。這說(shuō)明構(gòu)建獲得的表達(dá)載體pDEST-siFAH8、pDEST-siFAH10可表達(dá)所編碼的siRNA序列，且具有基因靶向特異性。
實(shí)施例4.表達(dá)siRNA的重組病毒的構(gòu)建
在本實(shí)施例中，構(gòu)建了可表達(dá)靶向siFAH8或siFAHlO的siRNA的重組慢病毒。
除可表達(dá)靶向FAH的siRNA的表達(dá)載體外，構(gòu)建重組慢病毒所需的其它質(zhì)粒為 pLPl、pLP2、pVSVG,這些質(zhì)粒從 Invitrogen 公司購(gòu)買，商品名為pLenti4/V5_DEST Gateway Vector Kit，貨號(hào)V469_10。
重組慢病毒的制備方法
(I)用氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法大量提取四種質(zhì)粒pVSVG、pLPl、pLP2和表達(dá)載體(如本實(shí)施例中作為示例的pDEST-siFAHl質(zhì)粒)(提取方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學(xué)出版社，2002)；
(2) 293FT 細(xì)胞(Invitrogen，Catalog#R700_07)培養(yǎng)于 DMEM 培養(yǎng)基中(添加 10 % FBS, 2mM L-谷氨酰胺，0. ImM MEM非必需氨基酸及1%青霉素-鏈霉素)；
(3)將293FT細(xì)胞培養(yǎng)于直徑IOcm的細(xì)胞培養(yǎng)板上，匯合率約70%。12小時(shí)后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，用IOyg pLPlUOyg pLP2U0yg pVSVG、20 μ g表達(dá)載體進(jìn)行4種質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染(方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著，科學(xué)出版社， 2002)；
(4)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用0. 45 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾；用SW28轉(zhuǎn)頭(BECKMAN公司)以25，OOOrpm在4°C離心90分鐘；
(5)棄去上清，加500 μ L PBS溶解沉淀；
(6)分裝病毒收集液，貯存于_80°C備用。
由此獲得可表達(dá)靶向siFAHl或siFAHlO的siRNA的重組慢病毒，分別稱為 Lenti_siFAH8、Lenti_siFAH10o
實(shí)施例5.靶向FAH的siRNA通過(guò)重組病毒導(dǎo)入細(xì)胞對(duì)FAH的抑制作用
我們以可表達(dá)靶向FAH的siRNA的重組慢病毒為例(在本實(shí)施例中，我們使用可分別表達(dá)靶向siFAHl、siFAHlO的siRNA的重組慢病毒Lenti-siFAH8、Lenti_siFAH10作為示例，但是也可以使用其他可表達(dá)靶向本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)的siRNA的重組病毒)， 證明通過(guò)重組病毒將靶向FAH的siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞，使細(xì)胞獲得抑制FAH基因表達(dá)的能力。
實(shí)驗(yàn)方法以moi = 40 用慢病毒 Lenti_siFAH8、Lenti-siFAHlO 分別轉(zhuǎn)導(dǎo) 293FT 細(xì)胞，600g離心60min后換液；&moi = 40用帶有靶向螢光素酶基因的siRNA-luc表達(dá)元件的對(duì)照重組慢病毒Lenti-Iuc或帶有靶向無(wú)關(guān)序列的siRNA-Nk表達(dá)元件的對(duì)照重組慢病毒Lenti-Nk(靶向螢光素酶基因及無(wú)關(guān)序列的siRNA表達(dá)元件同實(shí)施例I ;按照實(shí)施例3 和4的方法制備對(duì)照重組慢病毒)轉(zhuǎn)導(dǎo)293FT細(xì)胞，600g離心60min后換液(作為對(duì)照)； 轉(zhuǎn)導(dǎo)后的293FT細(xì)胞在37°C培養(yǎng)，48小時(shí)后流式分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞。用pGL-FAH轉(zhuǎn)染分選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞，48小時(shí)后通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中螢光素酶蛋白的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)不同 siRNA抑制FAH的效率。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為未轉(zhuǎn)導(dǎo)的293FT細(xì)胞和對(duì)照重組慢病毒Lenti-luc、 Lenti-Nk轉(zhuǎn)導(dǎo)后的293FT細(xì)胞。
結(jié)果顯示，用重組慢病毒Lenti-siFAH8、Lenti-siFAH10轉(zhuǎn)導(dǎo)后的293FT細(xì)胞均顯示出抑制FAH表達(dá)的能力(參見圖4)。這表明在用攜帶有靶向FAH的siRNA表達(dá)元件的重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中，靶向FAH的siRNA在這些細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，從而抑制FAH的表達(dá)。
實(shí)施例6.靶向FAH的siRNA表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的siRNA在小鼠體內(nèi)對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Balb/c小鼠，7 8周齡，體重約為18 22g。每組6只，重復(fù)3 次。
在本實(shí)施例中，我們示例性地使用可表達(dá)靶向siFAH8的siRNA的表達(dá)質(zhì)粒 pSUPER-siFAH8(但是也可以使用其他可表達(dá)靶向本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)的siRNA的表達(dá)質(zhì)粒)，證實(shí)通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒將靶向FAH的siRNA導(dǎo)入活體小鼠后，可使小鼠肝臟產(chǎn)生損傷。
實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)小鼠尾靜脈高壓注射方法(hydrodynamictransfection)將siRNA 表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-siFAH8 (40 μ g/只)或?qū)φ召|(zhì)粒pSUPER-Nk (40 μ g/只)注射入小鼠，注射總體積為約2mL，在5秒內(nèi)注射完畢。在注射前及注射后每天采集小鼠肝臟，用免疫組化方法考察小鼠肝組織以及肝組織內(nèi)的FAH的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為正常的Balb/c小鼠和注射對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-Nk的Balb/c小鼠。
結(jié)果顯示，注射可表達(dá)靶向FAH的siRNA的表達(dá)質(zhì)粒的小鼠的肝組織產(chǎn)生了損傷 (參見圖5)。特別地，小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)整片的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞受損現(xiàn)象(圖 5A);并且大片的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死后，由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成的肝血竇不復(fù)存在，大量的血細(xì)胞匯集在肝細(xì)胞損傷處(圖5B)。相比之下，對(duì)照小鼠(即正常的Balb/c小鼠和注射對(duì)照表達(dá)質(zhì)粒pSUPER-Nk的Balb/c小鼠)均未出現(xiàn)肝組織損傷(圖5C和圖5D)。這表明，通過(guò)表達(dá)質(zhì)粒將靶向FAH的siRNA導(dǎo)入活體小鼠，可抑制肝細(xì)胞中FAH的表達(dá)并導(dǎo)致小鼠肝組織產(chǎn)生損傷。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，盡管為了舉例說(shuō)明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方案和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求
的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)，其序列選自(1)SEQID NO :1-5中任何一個(gè)所示的序列，或者(2)在嚴(yán)緊條件或者高度嚴(yán)緊條件下與(I)中序列能夠雜交的核苷酸序列，或者(3)與(I)中序列僅有I個(gè)核苷酸不同的序列；或者(4)上述序列的互補(bǔ)序列。
2.包含權(quán)利要求
I的RNA干擾靶點(diǎn)的核酸構(gòu)建體。
3.包含權(quán)利要求
I的RNA干擾靶點(diǎn)的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的、能夠抑制FAH基因的表達(dá)的siRNA。
5.—種重組表達(dá)載體,其可表達(dá)權(quán)利要求
4的siRNA。
6.權(quán)利要求
5的重組表達(dá)載體，其包含靶向FAH的siRNA的編碼核酸序列，所述編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在細(xì)胞中表達(dá)所述的siRNA。
7.權(quán)利要求
6的重組表達(dá)載體，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
8.權(quán)利要求
5的重組表達(dá)載體，其是質(zhì)粒載體或病毒載體。
9.權(quán)利要求
8的重組表達(dá)載體，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
10.權(quán)利要求
9的重組表達(dá)載體，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體。
11.轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了權(quán)利要求
5-10任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體的分離的細(xì)胞。
12.一種改造的分離的細(xì)胞，其可表達(dá)或包含有權(quán)利要求
4的siRNA。
13.權(quán)利要求
12的改造的細(xì)胞，其在基因組中或者基因組外攜帶權(quán)利要求
I所述的 RNA干擾靶點(diǎn)的編碼核酸序列，所述編碼核酸序列與表達(dá)控制序列可操作地連接，使得可在該細(xì)胞中表達(dá)所述siRNA。
14.權(quán)利要求
13的改造的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
15.制備權(quán)利要求
11-14任一項(xiàng)的細(xì)胞的方法,其包括用權(quán)利要求
5-12的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
16.DNA的組合，其包括編碼正義RNA片段的第一 DNA序列和編碼反義RNA片段的第二 DNA序列，或者由編碼正義RNA片段的第一 DNA序列和編碼反義RNA片段的第二 DNA序列組成，所述正義RNA片段的靶序列為權(quán)利要求
I的RNA干擾靶點(diǎn)所編碼的RNA序列，反義RNA 片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制FAH基因的表達(dá)。
17.小干擾RNA(siRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段的靶序列為權(quán)利要求
I的RNA干擾靶點(diǎn)編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能抑制FAH基因的表達(dá)。
18.權(quán)利要求
4的siRNA、或權(quán)利要求
5-10任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體、或權(quán)利要求
11_14 任一項(xiàng)的細(xì)胞、或權(quán)利要求
16的DNA的組合、或權(quán)利要求
17的siRNA在制備藥物或組合物中的用途，所述藥物或組合物可用于抑制FAH基因的表達(dá)、或誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷或產(chǎn)生肝臟損傷的小鼠。
19.誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求
4的siRNA或權(quán)利要求
5-10任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求
16的DNA的組合或權(quán)利要求
17的siRNA導(dǎo)入小鼠體內(nèi)。
20.抑制FAH基因的表達(dá)的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求
4的siRNA或權(quán)利要求
5-10 任一項(xiàng)的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求
16的DNA的組合或權(quán)利要求
17的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞。
專利摘要
本發(fā)明涉及可用于誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的5個(gè)不同的靶向FAH的RNA干擾靶點(diǎn)，其可用于制備可用于抑制FAH基因表達(dá)或者誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的藥物或組合物。本發(fā)明提供了可表達(dá)靶向FAH的siRNA的重組表達(dá)載體。本發(fā)明涉及具有抑制FAH基因表達(dá)的能力的可表達(dá)和/或被導(dǎo)入了根據(jù)本發(fā)明提供的RNA干擾靶點(diǎn)獲得的siRNA和/或藥物或組合物的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/113GKCN102604938SQ201210010355
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月13日
發(fā)明者夏寧邵, 張軍, 張雅麗, 王瑋, 王騰云, 程通 申請(qǐng)人:廈門萬(wàn)泰滄海生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan