本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)和新藥研究領(lǐng)域，具體涉及一種n-氨甲酰谷氨酸在緩解雞非酒精性脂肪肝病癥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

醫(yī)學(xué)上將由慢性應(yīng)激誘導(dǎo)發(fā)生的脂肪肝歸為非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)，屬于繼發(fā)性nafld。nafld是一種獲得性、代謝應(yīng)激性肝損傷，屬于代謝綜合征的范疇，以肝細(xì)胞內(nèi)的脂類堆積為特征，一般可以從相對良性和輕微的脂肪變性發(fā)展到更為嚴(yán)重的非酒精性脂肪性肝炎，繼而發(fā)展到肝硬化和肝癌，嚴(yán)重時可能會導(dǎo)致肝功能衰竭。nafld的發(fā)生誘因較為復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)制尚未明了，而脂肪在肝臟中的異位沉積是發(fā)生脂肪性肝炎的前提條件。脂肪肝發(fā)病呈全球化流行的趨勢。nafld已成為發(fā)達(dá)國家和中國富裕地區(qū)慢性肝病的首要病因，其發(fā)病率仍在增加且有低齡化發(fā)病趨勢。因此，nafld的發(fā)病危險因素和臨床特征引起學(xué)界關(guān)注。

目前，nafld的治療對策除了防治原發(fā)病或相關(guān)危險因素外，一是針對飲食結(jié)構(gòu)不良開展基礎(chǔ)治療，制定合理的能量攝人以及飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整、中等量有氧運(yùn)動、糾正不良生活方式和行為；一是針對伴隨病癥，如肥胖、胰島素抵抗和高血脂等，適當(dāng)藥物和手術(shù)減肥，施以胰島素增敏劑和降血脂藥物；二是針對nafld伴肝功能異常、代謝綜合征、經(jīng)基礎(chǔ)治療3-6個月仍無效，以及肝活體組織檢查證實(shí)為nash和病程呈慢性進(jìn)展性經(jīng)過者，可以進(jìn)行藥物輔助治療，以抗氧化、抗炎、抗纖維化，可依藥物性能以及疾病活動度和病期合理選用。但是，一方面慢性進(jìn)展性經(jīng)過者不宜同時應(yīng)用多種藥物，治療帶來體重急劇下降和濫用藥物及其他可能誘發(fā)肝病惡化的因素，可能加重肝臟損害；另一方面上述治療對nafld急性進(jìn)展性經(jīng)過者可能效果不顯著。

在慢性應(yīng)激狀態(tài)下，動物下丘腦-垂體-腎上腺軸被激活，大量的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，gcs)釋放到血液，作用于全身各處的靶細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡、物質(zhì)代謝與能量平衡、氧化應(yīng)激與免疫反應(yīng)，對應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持和應(yīng)變過程中起關(guān)鍵作用。故gcs是動物應(yīng)激發(fā)生的標(biāo)記物，同時也被稱為穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子。因此，糖皮質(zhì)激素，包括雞皮質(zhì)酮和人工合成的糖皮質(zhì)激素藥物地塞米松，被運(yùn)用于建立動物的慢性應(yīng)激模型，并用以對比研究目標(biāo)性狀形成的內(nèi)在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，提高嚙齒類和家禽外周循環(huán)中皮質(zhì)酮(corticosterone，cort)水平，會導(dǎo)致脂類在肝臟和外周組織的異常沉積。因此，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)建立的動物慢性應(yīng)激模型，可用以開發(fā)防治nafld藥物和篩選經(jīng)濟(jì)、安全、有效的抗慢性應(yīng)激調(diào)節(jié)劑。n-氨甲酰谷氨酸(n-carbamylglutamate，ncg)已在人類醫(yī)學(xué)丙二酸尿癥的治療和哺乳動物生長、繁殖上開展了一些應(yīng)用研究。但是，ncg作為nafld治療藥物、抗慢性應(yīng)激調(diào)節(jié)劑使用的相關(guān)研究尚未見報道，亦沒有在鳥類和家禽上應(yīng)用的相關(guān)研究報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明首次將n-氨甲酰谷氨酸應(yīng)用在緩解雞非酒精性脂肪肝行病癥。

本發(fā)明提供了一種n-氨甲酰谷氨酸在緩解雞非酒精性脂肪肝病癥中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，非酒精性脂肪肝病癥是由皮質(zhì)酮誘導(dǎo)形成的。

進(jìn)一步的，n-氨甲酰谷氨酸緩解雞非酒精性脂肪肝病癥呈現(xiàn)劑量依賴性。

進(jìn)一步的，將n-氨甲酰谷氨酸添加到雞飼料中用于緩解雞非酒精性脂肪肝病癥。

進(jìn)一步的，，n-氨甲酰谷氨酸在雞飼料中的添加的質(zhì)量比例為0.05-0.2％

進(jìn)一步的，n-氨甲酰谷氨酸在雞飼料中的添加量為0.05-0.2％。

進(jìn)一步的，雞飼料包含以下質(zhì)量百分含量的組分：玉米58.8-67.04％、豆粕20.14-30.5％、玉米蛋白粉0-5％、大豆油1.42-4.36％、石粉1.2-1.34％、磷酸氫鈣0.88-1.33％、蛋氨酸0.08-0.18％、賴氨酸硫酸鹽0.36-0.45％、蘇氨酸硫酸鹽0.01-0.05％、氯化鈉0-0.3％、氯化膽堿0-0.3％、金霉素0-0.1％、微量元素0-0.2％、維生素0-0.03％。

進(jìn)一步的，賴氨酸硫酸鹽中賴氨酸的質(zhì)量含量為65％。

進(jìn)一步的，蘇氨酸硫酸鹽中蘇氨酸的質(zhì)量含量為98％。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明是首次將n-氨甲酰谷氨酸應(yīng)用在緩解雞非酒精性脂肪肝病癥；n-氨甲酰谷氨酸可以極顯著地緩解cort誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性，具有劑量依賴效應(yīng)；并且，在緩解脂肪肝的同時，對動物體重的影響不顯著，符合nafld的用藥標(biāo)準(zhǔn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的肝臟的表型；

圖2為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的肝臟組織切片的oil-red染色情況；

圖3為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的體重情況；

圖4為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的腹部脂肪帶寬度；

圖5為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的肝臟指數(shù)；

圖6為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的血漿中的tg含量；

圖7為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的肝臟中的tg含量；

圖8為本發(fā)明對照組和試驗(yàn)組中試驗(yàn)雞的骨骼肌中的tg含量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地解釋說明。

本發(fā)明開發(fā)出的一種n-氨甲酰谷氨酸緩解非酒精脂肪肝的動物模型，僅選擇代表性的試驗(yàn)說明n-氨甲酰谷氨酸緩解非酒精脂肪肝的功效：

(1)構(gòu)建n-氨甲酰谷氨酸添加動物模型

1)配制n-氨甲酰谷氨酸添加日糧：①在對應(yīng)黃羽肉雞生長期的日糧的配制過程中，將n-氨甲酰谷氨酸和日糧核心料(如表1所示)充分混合；②將①與日糧原料(如表1所示)充分混合，然后制粒，得到含量為0.1％和0.2％的兩種n-氨甲酰谷氨酸添加日糧飼料，裝袋后保存于避光干燥處待用。

2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)：試驗(yàn)動物分為3組，1個對照組(c)從育雛期(0-21天)開始飼喂不含n-氨甲酰谷氨酸的基礎(chǔ)日糧，2個試驗(yàn)組，1個試驗(yàn)組(n1)從育雛期開始飼喂n-氨甲酰谷氨酸含量為0.1％的n-氨甲酰谷氨酸添加日糧，另1個試驗(yàn)組(n2)從育雛期開始分別飼喂n-氨甲酰谷氨酸含量為0.2％的n-氨甲酰谷氨酸添加日糧；飼喂至27日齡時，雞只平均體重為0.61kg。

表1黃羽肉雞飼料配方

(2)構(gòu)建動物非酒精性脂肪肝模型

1)配制皮質(zhì)酮溶液：

①確定待注射雞只數(shù)為52只，待注射雞平均體重為0.610kg，按照每只雞每天注射皮質(zhì)酮4mg/kg計(jì)算，每天共需要52只×0.610kg/只×4mg/kg＝126.88mg；用10ml滅菌帶蓋離心管將皮質(zhì)酮分裝7管，每管126.88mg×1.1＝139.57mg，保存于4℃待用；

②每天注射前，向盛有皮質(zhì)酮的離心管加入8ml乙醇，充分溶解，制成皮質(zhì)酮濃度為17.45mg/ml的純酒精母液；取上述液體4ml放入一個50ml滅菌帶蓋離心管，然后用生理鹽水稀釋到總體積25ml×1.1＝27.5ml，制備成乙醇溶液濃度為16％的工作液，其中皮質(zhì)酮濃度為2.536mg/ml，保存于4℃待用；間隔8-12h后，在當(dāng)天第二次注射前按上法將剩下的4ml母液配置成為工作液，保存于4℃待用。

現(xiàn)有的溶解皮質(zhì)酮的溶劑為玉米油，一般試驗(yàn)動物體重為0.5kg以上，故玉米油作為佐劑使用量達(dá)到0.4ml以上。而玉米油是一種營養(yǎng)復(fù)合型油劑，成分不穩(wěn)定，且這種溶劑對動物的發(fā)育有干涉作用，會給試驗(yàn)帶來不定因素，也會影響重復(fù)試驗(yàn)的穩(wěn)定性。一般用玉米油作為溶劑的試驗(yàn)，必須設(shè)置兩個對照組，即1個空白對照組和1個玉米油對照組；并且，動物注射部位局部吸收時間較長，也影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明選擇采用生理鹽水稀釋皮質(zhì)酮母液，試驗(yàn)只需設(shè)置一個生理鹽水對照組，節(jié)省了試驗(yàn)成本和工作量，且將試驗(yàn)動物因佐劑所受的影響降至最低。

本發(fā)明采用生理鹽水稀釋皮質(zhì)酮母液，因?yàn)槠べ|(zhì)酮在有機(jī)溶劑中才能溶解，而且溶解度很小，直接用生理鹽水或10-20％酒精溶液無法溶解。所以為了解決這個矛盾，本發(fā)明采用的梯度稀釋法，先將皮質(zhì)酮溶解于純酒精中制成母液，然后用生理鹽水稀釋，最終能將皮質(zhì)酮很好地溶解。

本發(fā)明采用的梯度稀釋法，先將皮質(zhì)酮溶解于純酒精中制成母液，然后用生理鹽水稀釋，由于皮質(zhì)酮在10-20％酒精溶液中長時間放置容易析出，故必須在注射前臨時小體積配制。

2)構(gòu)建模型：

①將(1)-2)中的3組試驗(yàn)動物(對照組c、試驗(yàn)組n1、試驗(yàn)組n2)，一分為二(c-con、c-cort、n1-con、n1-cort、n2-con、n2-cort)，對動物頸部局部消毒，消毒后將c-cort、n1-cort、n2-cort三組試驗(yàn)動物向皮下注射步驟1)中②的cort工作液，注射量為4mg/kg體重，每天分2次注射，間隔8-12h；c-con、n1-con、n2-con三組試驗(yàn)動物注射16％的酒精溶液，注射量為1.58ml/kg體重，每天分2次注射，間隔8-12h。

②按照1)中②的方法配制工作液，連續(xù)注射7天，至34日齡，對試驗(yàn)動物的脂肪肝表型進(jìn)行檢測。

(3)n-氨甲酰谷氨酸緩解非酒精脂肪肝的功效檢測

1)如附圖1-2所示，其中c-cort組肝色比其他組的肝色黃，肝臟組織切片通過oil-red染色后，可見c-cort組肝細(xì)胞中沉積有大量的脂質(zhì)顆粒，說明皮下注射cort成功構(gòu)建了肉雞脂肪肝模型；其中n1-con、n2-con組的肝色、組織切片與c-con組的相比差異不大，而n1-cort、n2-cort組與c-cort組的相比，肝色逐漸變淺，肝細(xì)胞中沉積的脂質(zhì)顆粒也逐漸減少，說明n-氨甲酰谷氨酸緩解cort誘導(dǎo)非酒精脂肪肝呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

2)c-cort試驗(yàn)組與對照組(c-con)相比，僅7天時間試驗(yàn)雞(c-cort)的體重就極顯著低于對照組(如附圖3所示)，皮下脂沉積顯著增加(如附圖4所示)；肝臟腫大、脂類沉積極顯著增加(如附圖5所示)，血液、肝臟和骨骼肌的甘油三酯tg含量均顯著增加(如附圖6、7、8所示)；n-氨甲酰谷氨酸能顯著緩解cort誘導(dǎo)的肉雞脂肪肝病癥(如附圖1、2所示)，在緩解肝臟指數(shù)、皮下脂沉積的情況下(如附圖4、5所示)，顯著降低血液、肝臟和骨骼肌的tg含量(如附圖6、7、8所示)。

以上僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。