專利名稱：可調(diào)控肝損傷動物模型的制作方法及其專用dna片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可調(diào)控肝損傷動物模型的制作方法及其專用DNA片段。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)嚴(yán)重威脅人類的健康，全球約有3. 6億乙肝患 者和1. 7億丙肝患者，每年約有150萬患者死亡。過去的十年里，在治療這些疾病方面已經(jīng) 取得了很大的進步，但是仍然沒有建立有效的治愈手段，且現(xiàn)有的治療方法通常伴有副作 用，發(fā)展更好的抗病毒藥物仍然是當(dāng)務(wù)之急。 目前，新的抗病毒藥物主要在細(xì)胞水平對進行測試和評價，用于臨床之前，必須在 動物模型上測試其活性和毒性?？笻BV和HCV的藥物只能用黑猩猩進行體內(nèi)研究，因為經(jīng) 濟和道德方面的原因，黑猩猩試驗具有一定局限性，所以人們試圖建立肝臟人源化的小鼠 模型用于HCV和HBV藥物和疫苗的開發(fā)，取得一些進展，如用人源肝臟細(xì)胞重建Alb-uPA轉(zhuǎn) 基因小鼠的肝臟，這樣的小鼠可以被HBV和HCV感染。 為了研究體內(nèi)的凝血溶血系統(tǒng)，Janice L. Hechei等人構(gòu)建了白蛋白啟動子驅(qū)動 uPA的轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠的肝細(xì)胞中過量表達(dá)uPA，血漿中的uPA上升，在新生小鼠 中容易引發(fā)內(nèi)出血致死。有兩個uPA表達(dá)水平較低的品系得以存活，但后代中大約一半轉(zhuǎn) 基因鼠出生后死亡。轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的uPA的表達(dá)本應(yīng)是穩(wěn)定的，但在兩個品系的小鼠的 血液內(nèi)的檢測到的uPA的活性是隨時間逐漸下降的，并且凝血能力也逐漸恢復(fù)，約1-2個月 以后，小鼠凝血能力完全恢復(fù)。 一周齡的轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟是全白的；到3-5周齡時，肝臟 里出現(xiàn)了一些散在的lmm-lcm的紅色區(qū)域；6-8周能觀察到連成片的紅色區(qū)域。兩個品系 都是這種情況，說明與轉(zhuǎn)基因的整合位點無關(guān)。這些現(xiàn)象表明白色的組織是原有的，紅色的 斑點是后來出現(xiàn)的。深入研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞通過同源重組刪去了外源基因，通過擴增最終 能夠重建整個肝臟，這說明肝臟細(xì)胞具有強大的增殖能力，為外源肝細(xì)胞重建小鼠肝臟提 供了依據(jù)。將Alb-uPA小鼠回交到免疫缺陷小鼠scid/bg背景上，把從肝切除病人分離的 無病毒感染的肝臟細(xì)胞被移植到Alb-uPA雜合和純合的小鼠肝臟，發(fā)現(xiàn)人源肝臟細(xì)胞能夠 在轉(zhuǎn)基因純合的小鼠體內(nèi)達(dá)到較高程度的重建，并且能被HBV和HCV感染，而在轉(zhuǎn)基因雜合 的小鼠肝臟內(nèi)幾乎看不到人源的肝臟細(xì)胞。 另一個用于移植研究的重要模型是Fah-/_小鼠，F(xiàn)ah缺陷的小鼠會發(fā)生酪 氨酸血癥，酪氨酸血癥是一種遺傳性氨基酸代謝疾病，患者體內(nèi)缺乏FAA水解酶，酪 氨酸在體內(nèi)代謝時，由于FAA不能水解而積累，從而引起肝臟細(xì)胞的損傷。NTBC是 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase抑制劑，可以阻止FAA的積累，因此服用NTBC可以 有效地改善酪氨酸血癥的癥狀。這種小鼠通過喂食NTBC可以正常生長繁殖。因為FAH缺 陷可以導(dǎo)致肝細(xì)胞的死亡，所以這個模型理論上可以作為肝細(xì)胞移植的模型。有報道說將 1000個正常的小鼠肝臟細(xì)胞移植到FAH小鼠，就可以重建？^-/-小鼠的肝臟。但是在很長 的一段時間里，都沒有使用Fah-/-模型進行肝臟人源化的報道。 雖然人源肝臟細(xì)胞在Alb-uPA小鼠能夠很好的重建，但是這種小鼠有幾個缺點阻礙了它的應(yīng)用1)繁殖困難轉(zhuǎn)基因雜合的小鼠出生后，約有半數(shù)致死，純合子小鼠在一個月內(nèi)全部死亡，只能通過雜合小鼠的交配來獲得純合的小鼠，根據(jù)遺傳規(guī)律，后代約有1/4的小鼠是純合子，除去新生致死的，很難得到純合小鼠。2)移植窗口??；純合子的小鼠在一
個月左右會死亡，所以必須盡早重建小鼠的肝臟，移植時間通常在出生后7-14天。3)手術(shù)不方便，7-14天的小鼠不易于手術(shù)操作。 大腸桿菌E. coli里，TetR(Tet r印ressor)是負(fù)調(diào)控四環(huán)素抗性操縱子。TetR在沒有四環(huán)素時，結(jié)合到Tet操縱子序列上阻斷基因的表達(dá)。在有四環(huán)素時，TetR從操縱子序列上釋放，基因開始表達(dá)，這就是Tet-off系統(tǒng)。與Tet-0ff系統(tǒng)不同，Tet-0n系統(tǒng)使用帶有兩個突變的反式Tet抑制子rTetRs (reverse Tetr印ressors) ， rTetRs的結(jié)合區(qū)和VP16的激活區(qū)融合，高級tet-on系統(tǒng)用的是最小的VP16激活區(qū)。在有強力霉素(Doxycycline四環(huán)素衍生物)或四環(huán)素時rTetRs的結(jié)合區(qū)與tet操縱子序列結(jié)合，啟動目的基因的表達(dá)。通過對tet-on系統(tǒng)的優(yōu)化得到的高級tet-0n系統(tǒng)提高了目的基因的表達(dá)，毒性降低，更容易獲得穩(wěn)定表達(dá)蛋白的細(xì)胞系。高級tet-On系統(tǒng)相具有如下優(yōu)點1)非常嚴(yán)緊的調(diào)控由于優(yōu)化的rtTA和TRE-Tight，目的基因的本底表達(dá)水平低。2)無副作用因為真核基因組里沒有對應(yīng)的序列，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)rtTA-Adavanced的結(jié)合區(qū)非常特異的作用于TRE-Tight的tet0序列。3)高效快速的誘導(dǎo)作用Dox能夠在30分鐘內(nèi)將目的基因的表達(dá)提高1000倍，而其他的誘導(dǎo)系統(tǒng)速度慢，不能完全誘導(dǎo)。4)絕對表達(dá)水平高Tet系統(tǒng)的最高表達(dá)水平甚至高于CMV啟動子的直接啟動，有報道說HeLa細(xì)胞里的Tet-0ff瞬時表達(dá)比CMV強35倍。5)誘導(dǎo)藥物Tc和Dox價格相對便宜，無毒，結(jié)果重復(fù)性高。基于以上優(yōu)點，我們使用高級tet-on系統(tǒng)來建立模型。 腺病毒載體是近年來發(fā)展的一種用于轉(zhuǎn)基因治療的載體，它具有毒性低，效率高和不整合的特點。研究發(fā)現(xiàn)，通過血液導(dǎo)入小鼠體內(nèi)的腺病毒，主要感染肝臟細(xì)胞。因此可以使用腺病毒載體將外源基因?qū)胄∈蟾闻K。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可調(diào)控肝損傷動物模型的制作方法及其專用DNA片段。
本發(fā)明提供的DNA片段I，自上游至下游依次包括肝臟特異啟動子、Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的反義四環(huán)素激活子編碼基因。 所述肝臟特異啟動子可采用多種啟動子，如小鼠白蛋白啟動子。 所述DNA片段I還包括位于小鼠白蛋白啟動子上游的增強子，所述增強子和所述
小鼠白蛋白啟動子形成如下1)或2)或3)或4)的融合DNA: 1)序列表中序列3自5'末端第29-2364位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；
4)與序列表中序列3限定的DNA序列具有90X以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。 所述反義四環(huán)素激活子是如下5)或6)的蛋白質(zhì)
5)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 6)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有反義四環(huán)素激活子功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。 所述DNA片段I還包括位位于反義四環(huán)素激活子編碼基因下游的polyA，所述連接polyA的反義四環(huán)素激活子編碼基因是如下7)或8)或9)的DNA分子
7)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子； 8)在嚴(yán)格條件下與7)限定的DNA序列雜交且編碼所述反義四環(huán)素激活子的DNA分子； 9)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼具有反義四環(huán)素激活子功能的蛋白質(zhì)的DNA分子； 含有所述DNA片段I的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。 本發(fā)明還保護由Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的四環(huán)素反應(yīng)因子(TRE)、啟動子
和尿激酶原激活劑編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成DNA片段II。 所述尿激酶原激活劑是如下10)或11)的蛋白質(zhì) 10)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 11)將序列5的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有尿激酶原激活劑功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。 所述尿激酶原激活劑的編碼基因是如下12)或13)或14)或15)的DNA分子
12)序列表中序列4自5'末端第44-1346位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
13)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子； 14)在嚴(yán)格條件下與12)或13)限定的DNA序列雜交且編碼所述尿激酶原激活劑的DNA分子； 15)與序列4限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有尿激酶原激活劑功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。 所述啟動子是如下16)或17)或18)的DNA分子
16)其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子； 17)在嚴(yán)格條件下與16)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；
18)與序列表中序列6限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。 所述四環(huán)素反應(yīng)因子(TRE)是如下19)或20)或21)的DNA分子
19)其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子； 20)在嚴(yán)格條件下與19)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；
21)與序列表中序列7限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。 含有所述DNA片段II的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述重組表達(dá)載體可將所述DNA片段II導(dǎo)入腺病毒表達(dá)載體得到。所述重組表達(dá)載體具體可為Adeno-TRE-uPA，所述Adeno-TRE-uPA是將所述DNA片
段II導(dǎo)入Adeno-X載體得到的。 在哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)所述重組表達(dá)載體得到的重組腺病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。 所述哺乳動物細(xì)胞具體可為HEK293細(xì)胞。
上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2 X SSC，0. 1 % SDS和1 X SSC， 0. 1 % SDS各洗膜一次。 本發(fā)明還保護一種肝損傷動物模型的制作方法，包括以下步驟 1)將所述的DNA片段I導(dǎo)入動物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動物； 2)將所述轉(zhuǎn)基因首建者動物與scid/bg動物回交，得到scid/bg背景的攜帶有
DNA片段I的動物； 3)用所述重組腺病毒注射scid/bg背景的攜帶有DNA片段I的動物，得到可調(diào)控
的肝損傷動物模型。 所述動物具體可為小鼠。 通常3次回交后，可得到免疫缺陷的背景的小鼠。實際操作中，可回交3-5次。
應(yīng)用本發(fā)明的方法得到的肝損傷模型小鼠，克服了 Alb-uPA小鼠的缺點，基因的表達(dá)由強力霉素(四環(huán)素的衍生物)激活，表達(dá)強度隨Dox的劑量變化而改變，最大表達(dá)強度與CMV啟動子直接啟動相當(dāng)。這個系統(tǒng)特異性非常高，幾乎沒有非特異性的作用。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為PCR擴增uPA基因的電泳圖。
圖2為pGEMT-uPA質(zhì)粒的酶切鑒定圖。
圖3為PTRE-uPA的酶切鑒定圖。
圖4為Adeno-TRE-uPA的酶切鑒定圖
圖5為Alb-rtTA片段的電泳結(jié)果。
圖6為轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定結(jié)果。
圖7為轉(zhuǎn)基因小鼠的RT-PCR鑒定。
圖8為模型小鼠的免疫組化分析結(jié)果。
圖9為模型小鼠的RT-PCR分析結(jié)果。
圖10為模型小鼠的HE染色結(jié)果。 圖11為本發(fā)明的肝損傷小鼠模型外源肝細(xì)胞重建的鑒定。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、pAlb-rtTA-polyA質(zhì)粒的構(gòu)建
—、 Psk-rtTA-polyA質(zhì)粒的構(gòu)建 1、用限制性內(nèi)切酶Ecorl和Hindi II 37 °C酶切pTet-On-Advanced載體(Clontech公司，Catalog No. :630930)過夜，酶切結(jié)束后，酶切產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用鼎國膠回收試劑盒回收約1. 2kb的rtTA-polyA片段?；厥盏腄NA片段溶于10ul超純水。將回收的DNA片段進行測序，見序列表中的序列l(wèi)，rtTA基因編碼的氨基酸序列見序列表中的序列2。 2、用限制性內(nèi)切酶Ecorl和HindIII 37。C酶切pBluscript載體(Fermentas公司)過夜，酶切結(jié)束后，酶切產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，用鼎國膠回收試劑盒回收約3kb的pSK載體骨架?；厥盏腄NA片段溶于10ul超純水。 3、將步驟1得到的rtTA-polyA片段和步驟2得到的pSK載體骨架16"C孵育2h，進行連接。 4、取1管(100ul) T0P10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司，CB104-03)，置冰上緩慢解凍，加入10ul步驟3的連接產(chǎn)物，混勻；冰水浴中繼續(xù)放置30min ;42。C水浴靜置熱激90sec ;迅速轉(zhuǎn)移至冰水浴中冷卻l-2min ;加入600ul不含抗生素的LB培養(yǎng)基，輕輕拍打混勻，置37t:搖床溫育45min。取兩個氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板(Amp， 125U/ml)，各涂100ul菌液；室溫靜置待菌液吸收后，37t:溫箱倒置培養(yǎng)10-15hr。 5、從轉(zhuǎn)化的瓊脂平板中挑單菌落接種到氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基(Amp， 125U/ml)中37"C培養(yǎng)。 提取在培養(yǎng)基上生長的菌落的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶HindIII和HEcorI進行酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠上顯示約1.2kb和約3kb的條帶。將酶切陽性的質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明獲得了目的質(zhì)粒，將其命名為Psk-rtTA-polyA。
二、 pAlb-rtTA-polyA質(zhì)粒的構(gòu)建
1、 Alb啟動子/增強子的獲得 將位于小鼠白蛋白基因5'上游10. 4-8. 5kb之間的1. 99kb的增強子片段和0. 33kb的啟動子片段在pAlb-hGH中融合成長度為2. 3kb的Alb啟動子/增強子，具體實驗方法參見文獻(xiàn)(Pinkert CA et al. An ALB enhancer located 10 kb upstreamfunctionsalong with its promoter to direct efficient, 1iverspecificexpression intransgenic mice. Genes Dev 1987 ;1 :268-276.)(北京大學(xué))。獲得的Alb啟動子/增強子序列見序列表中的序列3。 2、用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切pAlb-Hgh 3_4小時；然后加入T4 DNA聚合酶，平
滑末端；然后加入限制性內(nèi)切酶Sac I進行酶切，得到2. 3kb的Alb啟動子/增強子片段。 3、用限制性內(nèi)切酶Ecorl酶切Psk-rtTA-polyA 3-4小時；然后加入T4 DNA聚合
酶，平滑末端；然后加入限制性內(nèi)切酶Sac I進行酶切，得到4. 2kb的載體片段。 4、將步驟2制備的Alb啟動子/增強子片段和步驟3制備的載體片段混合孵育，
進行連接。 5、用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司，CB104-03)。取氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板(Amp， 125U/ml)，涂lOOul菌液；室溫靜置待菌液吸收后，37°C溫箱倒置培養(yǎng)10-15hr。 6、從轉(zhuǎn)化的瓊脂平板中挑單菌落接種到氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基(Amp， 125U/ml)中37"C培養(yǎng)。 提取在培養(yǎng)基上生長的菌落的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacI和KpnI進行酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。凝膠上顯示約3. 5kb和約3kb的條帶，表明獲得了目的質(zhì)粒，將其命名為pAlb_rtTA_polyA。 實施例2、制作TRE-PminCMV-uPA腺病毒
—、擴增尿激酶原激活劑(uPA)基因 根據(jù)Gene bank中小鼠的uPA mRNA序列(NM_008873)設(shè)計一對引物如下
上游引物(29bp) :5， -GGCGCTA ATGAAAGTCTGGCTGGCGAG-3，;
下游引物(29bp) :5' -TCTGGTACCGAGAGGACGGTCAGCATGGG-3'。 以上引物中，下劃線標(biāo)注的為酶切位點，斜粗體為Kozak序列用于增強表達(dá)。上游引物位于uPA mRNA起始ATG，含有Nhel酶切位點。下游引物位于終止密碼子下游76bp處，含有Kpn I酶切位點。 1 、提取CD-I小鼠(購自維通利華)腎臟RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用上述引物，使用TaKaRa的Pyrobest DNA Polymerase進行PCR反應(yīng)。
2、PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，應(yīng)用DNA快速純化/回收試劑盒(北京鼎國生物公司，cat. no A014-l)回收，紫外分光光度計測定A260/280 0D，估計PCR產(chǎn)物的濃度與純度，回收的DNA儲存于-2(TC備用。PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖1。 3、回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)體外加A反應(yīng)后，連入pGEM-T載體(購自Promega，產(chǎn)品目錄
號A3600)。 ①加A反應(yīng) 在200ul PCR管中加入以下溶液(總體積10ul): PCR產(chǎn)物 7. 2ul 10 X PCR buffer lul dNTP(2.5mM) 0. 8ul Taq DNA聚合酶(Takara貨號DRR001A)0. 2ul 70。C條件下反應(yīng)30分鐘。 2)將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體 ①連接反應(yīng)在1. 5ml離心管中加入以下溶液至終體積10ul : 2XT4DNA Ligase buffer 5ul ; pGEM-T(50g/ul) 0. 5ul ; 加A后的PCR產(chǎn)物 3. 5ul; T4 DNA連接酶(Promega M1801) lul ; 室溫孵育1小時后，用于轉(zhuǎn)化實驗。 ②轉(zhuǎn)化 取5ul連接產(chǎn)物加入到100ul Top 10感受態(tài)中，冰浴30分鐘，42。C孵育90秒，再冰浴2分鐘后，將其轉(zhuǎn)移至0. 5ml LB培養(yǎng)液中，37°C 、 100rpm條件下培養(yǎng)45分鐘，然后吸取50ul均勻涂布于經(jīng)過IPTG和X-gal處理的10cm LB平板上，37。C條件下培養(yǎng)18小時。
③重組陽性菌落的挑選和鑒定 挑選8 10個分散良好的白色單菌落分別入5ml液體LB培養(yǎng)基中，37t:、250rpm條件下培養(yǎng)12小時，待培養(yǎng)基變得混濁時，分取lul菌液用于PCR鑒定重組，其余菌液4t:條件下保存。 應(yīng)用Promega公司的Wizard Plus SV Minipr印s DNA Purification System試劑盒提取PCR鑒定陽性菌株的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶MluI和Nhel進行鑒定。出現(xiàn)3kb和1.3kb兩條DNA條帶的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒。結(jié)果見圖2。圖2中，M:marker;l :陽性菌株的質(zhì)粒；2 :pGEM-T載體(陰性對照)。將陽性質(zhì)粒命名為pGEMT-uPA。 將pGEMT-uPA質(zhì)粒送北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進行測序，測序結(jié)果表明得到了正確的uPA。
二 、制備Adeno-TRE-uPA腺病毒 所用系統(tǒng)為Clontech公司的Adeno-X Tet-on expression system,貨號631050。
1、構(gòu)建pTRE-uPA 用Nhel和Kpnl將uPA片段從pGEMT-uPA質(zhì)粒上切下來，連接到用Nhel和Kpnl消化過的pTRE-Shuttle2載體(Clontech，Adeno-X Tet-on expression system,貨號631050)的骨架上。轉(zhuǎn)化反應(yīng)同前。挑取卡那抗性的菌落培養(yǎng)，酶切篩選陽性克隆(見圖3)，即為pTRE-uPA。 2、構(gòu)建Adeno-TRE-uPA用限制性內(nèi)切酶PI-Sce I和I-Ceu I將3kb的TRE-PminCMV-uPA片段從pTRE-uPA上切下來，克隆到腺病毒載體Adeno-X(Adeno-X Tet-on expressionsystem，貨號631050)中，得到Adeno-TRE-uPA。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化之前，用swal消化連接產(chǎn)物消除背景。挑取Amp抗性的菌落培養(yǎng)，PCR篩選陽性克隆，陽性克隆用酶切確認(rèn)(見圖4)。
3 、包裝生產(chǎn)Adeno-TRE-uPA腺病毒 1)轉(zhuǎn)染之前12-24小時，在6cm培養(yǎng)皿里接種(1-2) X 106HEK293細(xì)胞(Adeno-XTet-on expression system,貨號631050)，為了提高效率，在細(xì)胞50%-70%時轉(zhuǎn)染。 2)細(xì)胞在37 °C 、 5 % C02條件培養(yǎng)。 3)每個6cm培養(yǎng)皿用磷酸鈣或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染10ug Pac I消化的Adeno-TRE-uPA。
4) —天后，每天檢測細(xì)胞病變反應(yīng)。 5) —個星期后，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到15ml離心管(切記不要使用胰酶消化)，貼得近的細(xì)
胞可以輕輕的刮下來轉(zhuǎn)移。 6)室溫1500gX5min離心富集細(xì)胞。 7)棄去上清，重懸沉淀于500ul無菌PBS中。 8)反復(fù)凍融三次裂解細(xì)胞在干冰/乙醇浴中凍，37t:水浴中溶，但不要達(dá)到37°C ，每次融化后渦旋震蕩細(xì)胞。 9)凍融三次后，凍存于-2(TC，或用于第10步。 10)在一個6cm的培養(yǎng)皿中加入250ul細(xì)胞裂解物，直接把裂解物加到培養(yǎng)基里，一個周以后應(yīng)該可以見到細(xì)胞病變反應(yīng)。 11)如果50%以上的細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落，-70°〇凍存前面的細(xì)胞裂解物，如果沒
有見到細(xì)胞病變反應(yīng)，說明病毒滴度太低。 4、擴增重組腺病毒 1)感染前24小時接種HEK 293細(xì)胞到T75培養(yǎng)瓶，細(xì)胞長到培養(yǎng)瓶的50_70%時感染。 2)細(xì)胞在37 °C 、 5 % C02條件培養(yǎng)。 3)第二天，用含有腺病毒的培養(yǎng)基換液，每個細(xì)胞對應(yīng)l-5pfu的病毒。 4)37°C、5% C02條件培養(yǎng)90分鐘。 5)換10ml新鮮的生長培養(yǎng)基。 6)37°C、5% 0)2條件培養(yǎng)3-4天。 7)檢測細(xì)胞病變反應(yīng)，當(dāng)50%細(xì)胞脫落，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液倒15ml離心管，切記不要使用胰酶消化，貼得近的細(xì)胞可以輕輕的刮下來轉(zhuǎn)移。
8)凍融法收獲病毒。9)用Adeno-X Rapid Titer Kit (Clontech， Cat. No. 631028)測定病毒滴度。 實施例3、肝損傷小鼠的制備 —、Alb-rtTA小鼠的制備 ( — )Alb-rtTA片段的酶切、回收和純化 1、用限制性內(nèi)切酶Sacl和Kpnl 37"酶切pAlb-rtTA-polyA質(zhì)粒過夜。 2、酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果見圖5。切下3.5kb大小的條帶，
用DNA膠回收試劑盒(鼎國)回收DNA。 3、用Promega Wizard DNA clear-up kit (Cat :A 7280)進一步純化DNA片段。
4、TE(7mM Tris-HC1，0. 15mM EDTA， pH 7. 5)溶解純化后的DNA。[OH9] ( 二 )制備供原核注射的DNA樣品測定DNA樣品的0D值，將DNA用TE稀釋至2-5ng/ul ; 12000gX lOmin (4°C )離心;將離心后的上1/3部分溶液小心吸出，分裝于若干離心管中，凍存于-2(TC冰箱。
(三)原核顯微注射法制作Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠 將按如上步驟純化好的pAlb-rtTA線性化DNA片段應(yīng)用原核顯微注射法制作pAlb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠，具體實驗步驟如下 1、選取4 5周齡雌性ICR小鼠(購自維通利華)，陰道口封閉，作為供體，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射IOIU孕馬血清(PMSG); 2、47 48小時后，每只小鼠腹腔注射10 IU的人促絨毛膜性腺激素HCG，并與正常公鼠合籠；另取數(shù)只適齡母鼠(2月齡以上)作為受體，選取陰道口潮紅的發(fā)情母鼠，與結(jié)扎公鼠合籠； 3、第二天上午9:00前觀察供體、受體，有精栓者拿出備用。受體籠拿出作好隔離措施； 4、10:30左右，斷頸處死供體，手術(shù)取出整個輸卵管，放入含有0.05%透明質(zhì)酸酶M2液中，顯微鏡下，用鑷子撕開輸卵管壺腹部，受精卵隨同顆粒細(xì)胞即一同流出；
5、仔細(xì)觀察放在透明質(zhì)酸酶M2液中的受精卵，當(dāng)受精卵周圍的顆粒細(xì)胞脫離時，將受精卵吸出，放入M2液中洗滌，最后放在M16液中放入5% C02，37t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
6、在顯微鏡下觀察，挑選細(xì)胞飽滿，透明帶清晰，雄原核清晰可見的受精卵待用；
7、安裝持卵針和注射針，使其末端平行于載物臺，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆蓋石蠟油，移入待注射的受精卵。DNA在注射針中的氣泡應(yīng)在先前全部彈走。
8、在高倍鏡下，將注射針輕觸持卵管，使DNA緩慢流出并控制其流量；反復(fù)吹吸受精卵，使其處于最佳位置，將注射針剌入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。將注射過的和未注射過的受精卵上下分開放置，不致于混攪，注射完畢后，放入5% (A，37t:培
養(yǎng)箱培養(yǎng)。 9、將受體麻醉，注射計量為1X戊巴比妥鈉0.01ml/g，腹腔注射。手術(shù)取出卵巢連
接輸卵管，用脂肪鑷固定，在顯微鏡下找到輸卵管開口。吸取注射后經(jīng)培養(yǎng)成活的受精卵，吸取方法是先吸一段較長的M2，吸一個氣泡，然后吸取受精卵，盡量緊密排列，再吸一段液體，吸一個氣泡，再吸一段液體，共四段液體三個氣泡。除較長的那段液體，其余的液體大致lcm左右，氣泡0. 2cm左右。將移植管口插入輸卵管口 ，輕輕將移植管內(nèi)的液體吹入，看到輸卵管壺腹部膨大并清晰地看到三個氣泡，即移植成功。將卵巢連同輸卵管放回腹腔，縫合肌肉和皮膚。 10、受體每隔一個星期稱體重一次，當(dāng)?shù)诙伪鹊谝淮畏Q重增加時，即可初步判斷懷孕。手術(shù)后19 21天仔鼠分娩，即為轉(zhuǎn)基因始建(Founder)小鼠。
(四)陽性的小鼠的鑒定
1、PCR鑒定 對陽性小鼠尾基因組DNA進行PCR分析，鑒定其是否為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。 采用Alb-rtTA跨基因引物進行PCR檢測。上游引物基于Alb啟動子序列(Alb/
P)，下游引物(primer II)基于rtTA基因序列，目標(biāo)片段為700bp。引物序列如下: 上游弓l物(primer I) :5， _tgg ctg aaa gtt act gtg gga-3，； 下游弓l物(primer II) :5， _aga tgg tgc get cct gga cgt_3，。 32只陽性小鼠中，共有4只PCR鑒定為陽性，為轉(zhuǎn)基因小鼠。4只轉(zhuǎn)基因小鼠的
PCR鑒定結(jié)果見圖6。圖6中，PC :質(zhì)粒pAlb-rtTA-polyA(陽性對照);l-5、2-9、2-10、4-6 :
4只轉(zhuǎn)基因小鼠；NC :ICR小鼠(陰性對照)。 2、 RT-PCR鑒定 原核注射轉(zhuǎn)基因的方法，目的片段是隨機整合的，有時會發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默和表達(dá)譜錯誤的情況，為了確認(rèn)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠的rtTA是否表達(dá)及表達(dá)譜是否正確，采用RT-PCR的方法在mRNA水平上對小鼠的心、肝、肺、腎和胰的組織進行檢測。 4只轉(zhuǎn)基因小鼠均表達(dá)rtTA，并且表達(dá)譜正確，強烈特異的在肝臟表達(dá)目的基因，除了肝臟，只有腎臟有微弱表達(dá)。其中一只轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果見圖7。
二、回交獲得免疫缺陷背景的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠 為了能夠接受外源肝臟細(xì)胞，需要將該模型轉(zhuǎn)換到免疫缺陷的小鼠背景，并且只有免疫缺陷的小鼠才能被腺病毒反復(fù)感染。Scid/bg是一種免疫缺陷小鼠，體內(nèi)無成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞，NK細(xì)胞缺失。這種小鼠能夠接受外源細(xì)胞和組織，因此我們將Alb-rtTA小鼠經(jīng)過多次回交，轉(zhuǎn)換為Scid/bg背景。( — )把普通環(huán)境下的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠通過剖腹產(chǎn)凈化轉(zhuǎn)移到SPF環(huán)境
1、選擇6 8week齡未交配過的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠作剖腹凈化對象。交配后第二天連續(xù)數(shù)天后觀察陰栓，并記錄陰栓出現(xiàn)日期，作為受孕日期，妊娠19士ld作為預(yù)產(chǎn)期，即剖腹產(chǎn)日期。 2、到預(yù)產(chǎn)期的孕鼠，斷頸椎處死后，立即用2X過氧乙酸浸泡2 3s，即在手術(shù)臺上固定、剖腹，用無菌止血鉗夾住近肛門處子宮頸，再用無菌剪子從止血鉗的肛門一側(cè)剪斷子宮，取出整子宮后，置2 %過氧乙酸液浸泡1 2s，迅速從手術(shù)隔離器的渡槽液(消毒液)內(nèi)將子宮轉(zhuǎn)移至無菌手術(shù)隔離器內(nèi)，切開子宮，取出幼仔，用無菌紗布將小仔全身擦干凈，再至小仔全身鮮紅，能自由呼吸為止。 3、把剖腹產(chǎn)所得的活幼仔，放入保姆鼠(維通利華實驗動物中心飼養(yǎng)的無菌ICR小鼠，交配比剖腹的Alb-rtTA小鼠提前3 4d)盒內(nèi)，每只保姆代乳8只左右，并與保姆所產(chǎn)小仔充分接觸后，處死保姆所產(chǎn)小仔。 4、從手術(shù)隔離器轉(zhuǎn)移至無菌隔離器飼養(yǎng)，21d離乳。經(jīng)各項微生物檢測合格后，轉(zhuǎn)
12移至SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。 5、已轉(zhuǎn)入SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)的Alb-rtTA小鼠，每季度送檢一次(5 10只)，作各項微生物檢測。 ( 二 )獲得scid/bg背景的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠 將凈化的轉(zhuǎn)基因小鼠與scid/bg小鼠(購自維通利華)在SPF環(huán)境下進行回交，每次回交后通過PCR的方法檢出轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠與scid/bg小鼠進行下一次回交。3次回交后，對小鼠的scid基因檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)攜帶純和的scid位點，對IgG檢測發(fā)現(xiàn)含量遠(yuǎn)低于正常小鼠，說明小鼠已經(jīng)獲得免疫缺陷的背景。為了進一步降低小鼠的免疫力，對小鼠繼續(xù)回交。5次回交后獲得的scid/bg背景的Alb-rtTA小鼠進行步驟三的試驗。 三、肝損傷模型小鼠的獲得 將10只免疫缺陷背景的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠分成兩組，每組5只(第一組和第二組)。將IO只ICR小鼠分成兩組，每組5只(第三組和第四組)。第一組和第三組小鼠在以下整個試驗階段用Dox水溶液(lmg/ml)作為飲用水。第二組和第四組小鼠在以下整個實驗階段用普通水作為飲用水。各組小鼠分別注射腺病毒Adeno-TRE-uPA 5X107只，三天后解剖小鼠取肝臟組織，進行RT-PCR及免疫組化分析。 對于注射腺病毒，DOX誘導(dǎo)的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠，在病毒注射后1天打開腹腔發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟外觀蒼白，這與報道的Alb-uPA小鼠的肝臟損傷特征一致。PCR分析結(jié)果表明各組小鼠均被腺病毒uPA感染。免疫組化分析結(jié)果見圖8。圖8中，A)野生型小鼠；B)Dox誘導(dǎo)的野生型小鼠；C)Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因陽性小鼠；D)Dox誘導(dǎo)的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠。只有DOX誘導(dǎo)的Alb-rtTA小鼠能夠檢測到uPA的表達(dá)，統(tǒng)計結(jié)果顯示80%以上的肝臟細(xì)胞都表達(dá)uPA。而在其余三種小鼠內(nèi)都沒有檢測uPA。 RT-PCR分析結(jié)果見圖9。圖9中，WT)野生型小鼠；WT+DOX)Dox誘導(dǎo)的野生型小鼠；Alb-rtTA)Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因陽性小鼠；Alb-rtTA+Dox)Dox誘導(dǎo)的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠。RT-PCR的結(jié)果與免疫組化結(jié)果相符，即只有兩個元件同時存在并且用DOX誘導(dǎo)的情況下uPA才會啟動表達(dá)。HE染色結(jié)果見圖10。圖10中，A)D0X誘導(dǎo)的野生型小鼠；B)DOX誘導(dǎo)的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠。野生型小鼠細(xì)胞形態(tài)正常，Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠的干細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣的損傷特征。
四、外源肝細(xì)胞的重建
1、外源肝臟細(xì)胞的獲得 用三溴乙醇將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠(購自維通利華)麻醉后，打開腹腔，分離門靜脈，將帶有軟管的頭皮針剌入門靜脈，動脈夾固定。軟管接注射器，依次灌注PBE50ml和PBC 50ml。然后剪下肝臟，WB沖洗肝臟。用鑷子撕破肝臟的包膜，用細(xì)胞篩過濾細(xì)胞。800rpmX lmin離心，小心吸掉上清，用WBD重懸細(xì)胞，離心；再用DF12 (GIBICO)洗滌兩次，臺盼藍(lán)染色檢測肝臟細(xì)胞存活率。 灌注緩沖液(PB)(PH7.4)的配方NaCl 27g、 KC1 1. 26g、 NaHC03 6. 3g、
Glucose2. 4g、H印es 14.34g、H20 3000ml 。PBE(PH7.4)的配方EDTA 0.37g、PB 500ml。PBC(PH7.4)的配方Collagenase 4. 2g、 CaCl2_2H20 0. 275g、 PB 500ml。WB(PH7. 4)的配方NaCl 17. 5g、 KC1 1. 15g、 CaCl2_2H20 0. 325g、 H印es 5. 95g、
13BSA 2. 5g、H20 2500ml 。 WBD(PH7.4)的配方MgCl2_6H20 0. 15g、 MgS04_7H20 0. 15g、 DNase 0. 15g、 WB1500ml。 2、外源肝細(xì)胞的重建 整個試驗階段用Dox水溶液(lmg/ml)作為飲用水，將10只免疫缺陷背景的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠分別注射腺病毒Adeno-TRE-uPA 5X 109/只，得到肝損傷小鼠模型。
在注射腺病毒的第二天(試驗第4天)移植肝臟細(xì)胞，每只小鼠移植5X10S個。移植后每7天每只小鼠注射5X 109腺病毒來促進外源細(xì)胞的增殖。每次注射腺病毒7天后檢測移植的效果。 肝細(xì)胞的移植方法如下用三溴乙醇將模型小鼠麻醉，側(cè)位置于實驗臺上。對左側(cè)脾臟部位皮膚剔毛，剪開皮膚和肌肉層，開口大小約lcm。用鑷子分離出脾臟，用注射器從脾臟末端將肝細(xì)胞緩慢的注入脾臟。注完后，用線結(jié)扎針孔部位以防出血。然后將脾臟放回原位，依次縫合肌肉層和皮膚層。移植后的小鼠放到保溫胎上保溫至蘇醒。
結(jié)果見圖11。圖11中，Pl-P5為移植后腺病毒Adeno-TRE-uPA促進一次到五次。對于注射腺病毒，并D0X誘導(dǎo)的Alb-rtTA轉(zhuǎn)基因小鼠，在病毒注射后4天時能夠觀測到肝臟有點狀再生，7天時肝臟出現(xiàn)節(jié)結(jié)狀的再生區(qū)域，10天后整個肝臟完全恢復(fù)。GFP肝臟細(xì)胞重建uPA損傷的小鼠肝臟。第一次促進后，小鼠的肝臟內(nèi)可以檢測到4-5個細(xì)胞的細(xì)胞團；第二次促進后，這些細(xì)胞團進一步增殖；三次促進后細(xì)胞團達(dá)到100多個細(xì)胞，重建程度達(dá)到20% ;四次促進后細(xì)胞團開始連結(jié)成片，重建率達(dá)到50% ;繼續(xù)用腺病毒uPA促進，外源細(xì)胞重建率接近80%。序列表〈no〉北京大學(xué)〈120〉可調(diào)控肝損傷動物模型的制作方法及其專用DNA片段〈130〉CGGNARY81956〈160>7〈210>1〈211>1228〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>1gaattcacca tgtctegactggac朋gagc 3朋gtcate3 acggcgctctggaattectc60aatggagtcg gtetcgaaggcctgacgac3 3gga朋ctcg ctc朋朋gctggg3gttg3g120cagccteccc tgtectggcacgtgaagaac aagcgggccc tgctcgatgccctgccaatc180gagatgctgg acaggcatcatecccacttc tgccccctgg aaggcgagtc3tggC朋g3C240tttctgcgga acaacgccaagtcattccgc tgtgctctcc tctcacatcgcgacggggct300aaagtgcatc tcggcacccgccc朋cagag 3朋cagtecg 3朋ccctggaaaatcagctc360gcgttcctgt gtcagcaaggcttctccctg gagaacgcac tgtecgctctgtccgccgtg420
ggccactttacactgggctg cgtettggag g朋caggagc atc朋gtegc朋朋gagg朋■cteccaccga ttctetgccc ccacttctga gacaagcaat tgagctgttc540gaccggcagggagccgaacc tgccttcctt ttcggcctgg aactaatcat atgtggcctg600g3g朋3C3gCtaaagtgcga aagcggcggg ccggccgacg cccttgacga ttttgactta660gacatgctcccagccgatgc ccttgacgac tttgaccttg atetgctgcc tgctgacgct720cttgacgattttgaccttga catgctcccc gggt朋ct朋gt朋ggatcc 3g3catgate780atgagtttgg 3C3朋cc3C3 acteg朋tgc 3gtg朋朋朋atgctttett840tgtgaaatttgtgatgctat tgctttettt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt■a a c a a c a a c aattgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt960te朋gc朋gtaaaacctcte caaatgtggt atggctgatt atgatcctgc aagcctcgtc1020gtctggccggaccacgctet ctgtgcaagg tccccggacg cgcgctccat gagcagagcg1080cccgccgccgaggcaagact cgggcggcgc cctgcccgtc ccaccaggtc aacaggcggt1140aaccggcctcttcatcggga atgcgcgcga ccttcagcat cgccggcatg tcccctggcg1200g3Cggg朋gtatcagctcga ccaagctt1228〈210>2〈211>248〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2MetSerAr,g LeuAspLysSerLys Val lie Asn Gly Ala Leu Glu Leu1510 15LeuAsnGly ValGlylieGluGly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gin2025 30LysLeuGly ValGluGinProThr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys3540 45ArgAlaLeu LeuAspAlaLeuPro lie Glu Met Leu Asp Arg His His505560ThrHisPhe CysProLeuGluGly Glu Ser Trp Gin Asp Phe Leu Arg657075 80AsnAsnAla LysSerPheArgCys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly8590 95AlaLysVal HisLeuGlyThrArg Pro Thr Glu Lys Gin Tyr Glu Thr100105 110LeuGluAsn GinLeuAlaPheLeu Cys Gin Gin Gly Phe Ser Leu Glu115120 125AsnAlaLeu TyrAlaLeuSerAla Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys130135140






































Val 145 Pro
Phe
lie
Ala
Leu 225 Phe
Leu Glu Glu Gin
Thr Thr Asp
Glu 150
Met
His Gin Val Pro Pro Leu
Asp
lie
Asp 210 Asp
Asp
Arg Gin 180 Cys Gly 195
Ala Leu Asp Phe Leu Asp
Ser 165
Gly Ala Glu Pro
Leu Glu Lys
Asp Asp Met
Asp
Leu 230 Leu
Phe 215 Asp
Gin 200
Asp
Met
Ala 185 Leu
Leu
Leu
Ala
Leu 170 Phe
Lys
Asp
Pro
Lys 155 Arg
Leu
Cys
Met
Ala 235
Glu
Gin
Phe
Glu
Leu 220 Asp
Glu
Ala
Gly
Ser 205 Pro
Arg
lie
Leu 190 Gly
Ala
Glu
Glu 175 Glu
Gly
Asp
Thr 160 Leu
Leu
Pro
Ala
Ala Leu Asp Asp 240
Pro Gly
245
〈210〉3
〈211〉2372
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉
〈400〉3
ctggagctccaccgcggtggcggccgctctagcttcctte
cte郷tggagcttecttctttgatttgatcttttgtgaa
ttccteagcttctgcttctctcagttttctgcttgctcat
tgcccccteccaacattgctCC3C皿gC3Caaattcatcc
tttetegttgtttggatcgcateggtegct腿g郷tgg
atgagcttgattttttttgatttegaaccttcccctctct
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■ 540 600 660 720 780 840
■ 960 1020 1080
agcttettetggatg朋tctatctctatetactctatetectcte皿皿3 g皿g皿3gac1140categac^tcatctetttgatetgtgteaagtttacatgtgagtegac3 tragatgctc1200catttctcactgteataccatttetegttecttgcaaaacteactggaat tcteggactt1260agttttagctgggtgactggtteggteagt 3ctg3皿cc31320agagattetettcteaagtttteg朋gtgatcataatcaa atetteccct1380tattccaaagttgagctecacateagatea ttttagctgt1440tttgttgtctattttcttttgagatecagttttttctgtc tegctttggc1500tgtcctggaccttgctctgtggtcttgaactcagagatct gcttgcctct1560gccttgcaagtgcteggattgccaccactgcctggcteca atctatgttt1620teteagagattateaagctctggctttgtgacattaatctttcagataat aagtcttttg1680gattgtgtctggag^categcagatgttcagaggtetet ttgctteggg1740tctgcagcaateattetgagcagaattectgacacttcca ttttatecat1800tctecttgctgatctetg皿acategateagcatgcaggc attcatcate gttttcttta1860ctttetteat acagtttega tgtgttttgc1920catctttteatttcttaaga朋tecteagctgatgcagag tg皿g3gtgt gtg皿皿gC31980gtggtgcagcttggcttgaactcgttctcc3gCttggg3tcgacctgcag gcatgcttcc2040atgcc皿ggcccacactgaaatgctcaaatggg3gac皿3 gagatteagc tcttetgt朋2100aatttgctgttttecateacggac朋agtcttgtgratgg gggtgggggt2160ggggtt卿gggg皿cagctCC3g3tggC3皿catecgc3 agggattteg tca朋c皿ct2220ttttggcaaagatggtetgattttgtaatggggtegg雄c皿tg皿atg cgaggteagt2280atggtt朋tgatctecagttg皿gtetett 3gagcgagtc tttctgcac32340cagatcacctttcctetcaaccccgggatc皿2372〈210〉4〈211〉1414〈212〉DNA
〈213>小鼠屬小鼠禾中(Mus musculus) 〈400>4gctgcagtcaccgaactgctgtctagagcccagcggcacttctggctggc60gagcctgttcctctgcgccttggtggtg^ggtggcagtgtacttggagc120tcctgatgaatcaaactgtgcgg郷tgtetgcgtgtcctacaagtactt180ctccagaattcgccgatgcagctgcccaaggggg解C3Ctgtg卿t卿240acctgctatctgactcttacccaacactga300cggccctgcctggCCtgg33tgcgcctgctgtccttcaga360tgcccacagacctgatgctattagcctaggCCtgggg333cacaattactgC3gg33CCC420tg3C^CC3gaagcgaccctggtgctetgtgc卿ttggccteaggcagtttgtccaaga4803tgC3tggtgcatgactgctctcttagcaaaaagccttcttcgtctgtag3CC皿C33gg540cttccagtgtggcc卿鄉(xiāng)ctctaaggccccgctttaagattgttgggggag皿ttcac600tg鄉(xiāng)tggagaaccagccctggttcgcagccatcteccag^g^c^ggg3gg33gtCC660tccctccttt皿atgtggtgggagtctcatcagtccttgctgggtggccagtgccgcaca720
17






































ctgcttcatt caactcccaa agaaggaaaa ctacgttgtc tacctgggtc agtcgaagga 780
gagctcctat aatcctggag agatgaagtt tgaggtggag cagctcatct tgcacgaate 840
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tatccaaaga acctgaaaat gtccgtcgte aagcttgttt ctcatgaaca 1080
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ggtctggcct tctgatggcc ctcaggtegc tgagggaaga aacagatggg 1380
ccatgctgac cgtcctctct gcaa 1414
tgactetctc gtgtetgcag cccagagtgg cgaaggccgc caagcccggt
tcacttgttc 〈210>5 〈211>433
〈212>PRT
〈213>小鼠屬小鼠禾中(Mus musculus) 〈400>5
Met Lys Val Trp Leu Ala Ser Leu Phe 1 5 Asn Ser Glu Gly Gly Ser Val Leu
Gly
lie
lie
65
Gly
Cys
Gly 20 Asn
Gly
Gin 35
Arg Cys Ser
Arg 50
Asp Ala Ser Lys
Lys Ala Asn
Ala Pro Ala Val 100 Gly
lie Ser Leu 115 Arg
Gin
Gin 145 Ser
Lys 130 Glu
Val
Cys Asp
Pro
Met
Gin
Thr
85
Leu
Leu
Trp
Val
Gin 165
Gly
Cys
Thr
70
Asp
Gin
Gly
Cys
His 150 Gly
Val
Pro
55
Cys
Thr
Lys
Lys
Tyr 135 Asp
Phe
Cys
40
Arg
Gly 25 Val
Leu
10
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Tyr His Gly Lys
Pro
His 120 Val
Gly
Tyr 105 Asn
Gin
Cys Ala Leu Val
Pro
Tyr Lys Phe Gin
Arg 90 Asn
Tyr
lie
Asn
75
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Asp
Lys
Gly
60
Gly
Glu
Tyr 45 Glu
Ser
30
Phe
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Val
15
Asn
Ser
Cys Asp Ser Tyr
Cys Leu Ala Trp 95 Asp
Ala His Arg
Cys Ser Leu Gin
Cys
Gly 170
Cys
Gly
Ser 155 Gin
Arg
Leu 140 Lys
Lys
Asn 125 Arg
Pro 110 Pro
Gin
Asp Phe
Lys Pro Ser Ala
Leu
Arg 175
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Cys
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Glu
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Asn
Val
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〈400>6teggcgtgtecggtggg郷ccteteteagctgg卿cgccatccacgctgttttgacctccgcggccc<210>7〈211〉312〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉7ttteccactccctetcagtgategag朋朋tgateg3g朋朋gtga朋gtcgagttteccgtcgagttteccactccctatcagtgatagtatcagtgatagagaaaagtgtga卿tcgagttteccactccctatcagacccgggtcg￡lg
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ccateg朋gacaccgggaccgatccagcct120
129
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tgatagag朋朋gtga朋gtcgagctcggt300
權(quán)利要求
DNA片段I，自上游至下游依次包括肝臟特異啟動子、Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的反義四環(huán)素激活子編碼基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的DNA片段I，其特征在于所述肝臟特異啟動子為小鼠白蛋白啟動子。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA片段I ，其特征在于所述DNA片段I還包括位于小鼠白蛋 白啟動子上游的增強子，所述增強子和小鼠白蛋白啟動子形成融合DNA，所述融合DNA是如 下1)或2)或3)或4)的DNA :1) 序列表中序列3自5'末端第29-2364位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；4) 與序列表中序列3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA分子。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的DNA片段I，其特征在于所述反義四環(huán)素激活子是 如下5)或6)的蛋白質(zhì)5) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；6) 將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且 具有反義四環(huán)素激活子功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
5. 如權(quán)利要求4所述的DNA片段I，其特征在于所述反義四環(huán)素激活子編碼基因下游 連接polyA，所述連接polyA的反義四環(huán)素激活子編碼基因是如下7)或8)或9)的DNA分 子7) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；8) 在嚴(yán)格條件下與7)限定的DNA序列雜交且編碼所述反義四環(huán)素激活子的DNA分子；9) 與序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼具有反義四環(huán)素激 活子功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。
6. 含有權(quán)利要求1至5中任一所述DNA片段I的重組表達(dá)載體。
7. 由Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的四環(huán)素反應(yīng)因子、啟動子和尿激酶原激活劑編 碼基因按上游至下游的順序依次連接而成DNA片段II。
8. 如權(quán)利要求7所述的DNA片段II，其特征在于所述尿激酶原激活劑是如下10)或 11)的蛋白質(zhì)10) 由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；11) 將序列5的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且具有尿激酶原激活劑功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求8所述的DNA片段II，其特征在于所述尿激酶原激活劑的編碼基因是 如下12)或13)或14)或15)的DNA分子12) 序列表中序列4自5'末端第44-1346位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；13) 其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；14) 在嚴(yán)格條件下與12)或13)限定的DNA序列雜交且編碼所述尿激酶原激活劑的DNA 分子；15) 與序列4限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼具有尿激酶原激活劑功能的蛋白質(zhì)的DNA分子。
10. 如權(quán)利要求7-9中任一所述的DNA片段II，其特征在于所述啟動子是如下16)或 17)或18)的DNA分子16) 其核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子；17) 在嚴(yán)格條件下與16)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；18) 與序列表中序列6限定的DNA序列具有90X以上同源性，且具有相同功能的DNA 分子。
11. 如權(quán)利要求7-10中任一所述的DNA片段II，其特征在于所述四環(huán)素反應(yīng)因子是 如下19)或20)或21)的DNA分子19) 其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；20) 在嚴(yán)格條件下與19)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；21) 與序列表中序列7限定的DNA序列具有90X以上同源性，且具有相同功能的DNA 分子。
12. 含有權(quán)利要求7至11中任一所述DNA片段II的重組表達(dá)載體。
13. 如權(quán)利要求12所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將權(quán)利要 求7至11中任一所述DNA片段II導(dǎo)入腺病毒表達(dá)載體得到的。
14. 如權(quán)利要求13所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是 Adeno-TRE-uPA ;所述Adeno-TRE-uPA是將權(quán)利要求7至11中任一所述DNA片段II導(dǎo)入Adeno-X載體 得到的。
15. 在哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)權(quán)利要求12至14中任一所述重組表達(dá)載體得到的重組腺 病毒。
16. 如權(quán)利要求15所述的重組腺病毒，其特征在于所述哺乳動物細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。
17. —種肝損傷動物模型的制作方法，包括以下步驟1) 將權(quán)利要求1-5中任一所述的DNA片段I導(dǎo)入動物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動物；2) 將所述轉(zhuǎn)基因首建者動物與scid/bg動物回交，得到scid/bg背景的攜帶DNA片段 I的動物；3) 用權(quán)利要求15或16所述的重組腺病毒注射scid/bg背景的攜帶DNA片段I的動 物，得到可調(diào)控的肝損傷動物模型。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述動物是小鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可調(diào)控肝損傷動物模型的制作方法及其專用DNA片段。DNA片段I由肝臟特異啟動子和Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的反義四環(huán)素激活子編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成；DNA片段II由Tet-off/Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)的四環(huán)素反應(yīng)因子、啟動子和尿激酶原激活劑編碼基因按上游至下游的順序依次連接而成。用攜帶DNA片段II的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞得到重組腺病毒。將DNA片段I導(dǎo)入動物中，得到轉(zhuǎn)基因首建者動物；將轉(zhuǎn)基因首建者動物與scid/bg動物回交，得到scid/bg背景的攜帶DNA片段I的動物；用重組腺病毒注射scid/bg背景的攜帶DNA片段I的動物，得到可調(diào)控的肝損傷動物模型。模型中尿激酶原激活劑的表達(dá)由強力霉素激活，表達(dá)強度隨劑量變化而改變，特異性非常高。
文檔編號C12N15/63GK101748123SQ200810227638
公開日2010年6月23日 申請日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者多曙光, 宋希軍, 鄧宏魁, 郭玉珊 申請人:北京大學(xué)