專利名稱：一種抗病玉米的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用基因工程培育轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法的領(lǐng)域，特別 涉及一種利用蛋白激酶培育抗病玉米的方法。
背景技術(shù)：
植物具有對環(huán)境變化快速感知和主動適應(yīng)的能力，而這種快速感知和 主動適應(yīng)的策略就是植物體內(nèi)胞間和胞內(nèi)的逆境信息傳遞。這一過程涉及 植物對逆境刺激的感受與識別、逆境信使的產(chǎn)生和傳輸以及反應(yīng)部位對逆
境信使的識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)等3個階段。在此過程中植物產(chǎn)生的鹽應(yīng)答相關(guān)分子
可以劃分為兩大類 一類是效應(yīng)分子，直接參與代謝變化等生化應(yīng)答過程， 產(chǎn)生耐鹽效應(yīng)。效應(yīng)分子包括前文所述的各種參與鹽脅迫下重建細(xì)胞離子 平衡、滲透壓平衡、水分?jǐn)z取的蛋白分子，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶類，各 種通道蛋白；另一類是調(diào)控分子，位于效應(yīng)分子的上游，介導(dǎo)信號傳遞， 包括轉(zhuǎn)錄因子和位于信號級聯(lián)系統(tǒng)中的各種蛋白激酶。
至今已研究的與高鹽應(yīng)答有關(guān)的植物蛋白激酶主要有與植物對干 旱、高鹽、低溫、激素(乙烯、脫落酸、赤霉素、生物素)等反應(yīng)的信號傳
遞有關(guān)的促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK); 鈣依賴而鈣調(diào)素不依賴的蛋白激酶(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase, CDPK);與感受發(fā)育和環(huán)境脅迫信號有關(guān)的受體蛋白激酶(Receptor protein kinase, RPK);通過增加某些特定蛋白的合成使植物對外界脅迫做 出反應(yīng)的核糖體蛋白激酶(Ribosomal-proteinkinase)，以及主要參與生物生 長、細(xì)胞周期、染色體正常結(jié)構(gòu)維持等多種生命活動相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控蛋白激酶(Transcription-regulation protein kinase, TRPK)(植物生理學(xué) 通訊，2001, 37(3): 185-191.)等。
蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化是生物體內(nèi)普遍存 在的一種調(diào)節(jié)機制，它在細(xì)胞的信號識別與轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。目前， 許多編碼植物蛋白激酶的基因已經(jīng)分離出來,然而人們對大多數(shù)植物蛋白 激酶的功能還不甚了解，它們對基因表達(dá)和代謝過程的調(diào)節(jié)機制、偶聯(lián)胞 外刺激和胞內(nèi)反應(yīng)的方式以及其所調(diào)節(jié)的功能蛋白等許多問題還有待進(jìn)一步的研究。蛋白激酶在感受外界刺激、調(diào)控離子通道、參與信號傳遞、 增加蛋白質(zhì)合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面起到重要作用。因此，分離與植物抗逆 相關(guān)的蛋白激酶基因，深入研究其作用機理，以及與其它信號物質(zhì)之間的 關(guān)系，對于揭示植物逆境信息傳遞的機制有重要意義。
蛋白激酶廣泛參與了植物對干旱、鹽脅迫、脫落酸(ABA)誘導(dǎo)、光 誘導(dǎo)等的應(yīng)答反應(yīng)(Current Opinion in Plant Biology, 2001， 4: 407-414; J Bio Chem， 2003, 278: 17328-17335; Acta Biochimica Polonica, 2004, 51: 635-647; Plant Cell, 2003, 15: 411-423; Plant physiol， 2005, 138: 1185-1194; Journal of Plant Physiology, 163 (2006) 1083-1093)。在參與 環(huán)境脅迫信號的傳遞方面，蛋白激酶可以通過多重復(fù)雜的信號傳遞途徑對 干旱、高鹽及低溫作出反應(yīng)，不同傳遞途徑之間存在交叉轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(Plant Mol.Biol, 1996， 30 (6): 1129; Plant J, 2003， 33 (4): 751-763; Plant Cell, 2003, 15 (3): 745-759.)。 Tanksley等從番茄中克隆了一個抗病基因尸to，將尸to 基因轉(zhuǎn)化番茄，轉(zhuǎn)基因植株可以抵抗病原菌Pseudomonas syringae的侵入 (Science, 1993,262: 1432-1436)。尸to是R基因的一種，其編碼的蛋白Pto 可以作為一個細(xì)胞內(nèi)受體與病原菌無毒基因的編碼的AvrPto相互作用，進(jìn) 而引發(fā)植物的抗病性反應(yīng)。尸W是一類編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基 因，屬于Pto下游的一個基因，兩者在序列上存在相似性，并且， 的相互作用可以引起植物的過敏性反應(yīng)(Cell, 1995， 83: 925-935; Arch Biochem Biophys, 2000, 383: 233-237; Science, 1988, 241: 42-52; Eur J Biochem, 2000, 267: 171-178)。過量表達(dá)A〃的轉(zhuǎn)基因煙草明顯提高了對 表達(dá)avrPto無毒基因的丁香假單胞桿菌(P. syringae tabaci)菌株的抵抗能 力(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1997, 48: 575-607.)。大豆中的 Ptil基因一Gwi^7的表達(dá)可以被抗病信號分子水楊酸(SA)和傷害所誘導(dǎo)(J Exp Bot. 2004, 396: 535-537)。以上研究表明可能參與了尸,o介導(dǎo)的抗 病信號傳導(dǎo)途徑。
玉米是世界主要農(nóng)作物之一，其用途已滲透到工農(nóng)業(yè)的許多方面，玉 米生產(chǎn)的好壞，對國民經(jīng)濟構(gòu)成了巨大影響。2004年，全世界玉米的種植 面積達(dá)3300萬公頃，產(chǎn)值超過230億美元。在我國，玉米是僅次于小麥 的主要糧食作物，其種植面積和產(chǎn)量居秋糧作物之首。據(jù)統(tǒng)計，我國現(xiàn)有 的0.93億公頃耕地中，玉米面積約為0.21億公頃，占總耕地面積的1/5。但是，在許多玉米產(chǎn)區(qū)，土壤的鹽堿化嚴(yán)重影響了玉米的生長及產(chǎn)量。因 此闡明植物耐鹽脅迫的信號途徑，提高植物的抗鹽性，是育種學(xué)家、生理 學(xué)家們面臨的 一個緊迫任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種抗病玉米的培育方法，該方法是利用植物正義表達(dá)載
體將玉米的蛋白激酶Zm尸W基因(Genbank中登陸號為AY708048)導(dǎo)入 玉米中，經(jīng)培育得到抗病玉米。
所述的植物正義表達(dá)載體帶有篩選標(biāo)記基因；所述的標(biāo)記基因為抗除 草劑的6ar基因。所述的植物正義表達(dá)載體帶有C/W《w'^啟動子和Zw/^7 基因的開放閱讀框。
所述的抗病玉米的培育方法為花粉管通道法。該方法包括去掉距離 玉米穗軸頂端1-2厘米的花絲和苞葉，在切口處滴注lOO)il濃度為500ng 1 的質(zhì)粒溶液，待玉米果穗成熟收獲；進(jìn)行所述的導(dǎo)入操作的時間優(yōu)選為上 午10點鐘，季節(jié)優(yōu)選為夏季。
本發(fā)明中，分別構(gòu)建了所述的了兩種植物表達(dá)載體植物正義表達(dá)載 體和植物RNAi表達(dá)載體，將所述的兩種植物表達(dá)載體通過花粉管通道法 導(dǎo)入玉米，對轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育進(jìn)行初步對比研究，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)基因 植株的抗病性存在差異。
本發(fā)明的有益效果為
1. 本發(fā)明中轉(zhuǎn)入玉米的Zm/^7基因，該基因是一個由鹽脅迫誘導(dǎo)的 蛋白激酶基因。研究該基因在玉米中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制以及在抗逆信號途徑 中的作用，有希望獲得玉米抗鹽的主效基因，將它直接應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因工程 中，改良作物抗鹽性狀，加快作物的育種進(jìn)程。
2. 本發(fā)明中轉(zhuǎn)入基因的方法采用花粉管通道轉(zhuǎn)入法。該方法中導(dǎo)入 的基因可以不帶篩選標(biāo)記，不會對環(huán)境和人類造成危害；采用該方法選系 穩(wěn)定、速度快；該方法無需要昂貴的設(shè)備，操作簡單，易于推廣。


圖1:植物正義表達(dá)載體pBPC-ZmPtil-bar的酶切圖譜；
圖2:植物正義表達(dá)載體pBPC-ZmPtil-bar的酶切鑒定結(jié)果；
圖3:植物RNAi表達(dá)載體pBPC-PtS-gfp-PtAS-bar的酶切圖譜；
圖4:植物RNAi表達(dá)載體pBPC-PtS-gfp-PtAS-bar的酶切鑒定結(jié)果；圖5:涂抹除草劑一周后的抗性植株篩選的情況； 圖6:草丁膦抗性植株的PCR檢測結(jié)果；
圖7:部分轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR-Southem檢測結(jié)果； 圖8:轉(zhuǎn)基因陽性植株溫室內(nèi)培150天的生長情況。
具體實施例方式
實施例l:植物表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
本實施例中的基礎(chǔ)材料為質(zhì)粒pBPC-p5cs-F129A，帶有f/Z^w'//"啟 動子、氨芐青霉素和bar基因篩選標(biāo)記；質(zhì)粒pGreen0029-ZmPtil-gfp，帶 有Zm尸"7基因(Genbank中登陸號為AY708048)和她基因。
所述的質(zhì)粒pBPC-p5cs-F129A的構(gòu)建方法參見文章《基因槍法向高羊 茅導(dǎo)入p5cs基因的研究》(李志亮等著，園藝學(xué)報，2005， 32: 653—657); 所述的質(zhì)粒pGreen0029-ZmPtil-gfp的構(gòu)建方法參見文章《玉米蛋白激酶 ZmSPKl在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的定位》(肖雪等著，華北農(nóng)學(xué)報，2006, 21(3 ): l一4)。
A:所述的植物正義表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
對質(zhì)粒pGreen0029-ZmPtil-gfp用BamHI和Kpnl雙酶切，得到約 1000bp大小的片段，即Zmi^7基因的cDNA全長，回收。用同樣的酶酶 切質(zhì)粒pBPC-p5cs-F129A，回收約6700bp的大片段。通過連接，把ZmPtil 基因連接到經(jīng)過BamHI和Kpnl酶切的pBPC-p5cs-F129A大片段上，得到 中間載體pBPC-ZmPtil。用Kpnl單酶切pBPC-p5cs-F129A載體，得到含 有一個L^々m/""啟動子和tor基因大小2800bp的片段，回收得到片段a。 再將中間載體pBPC-ZmPtil用Kpnl酶切回收得到片段b。然后將片段a 連接到片段b上，構(gòu)建成基因的植物正義表達(dá)載體 pBPC-ZmPtil-bar。植物正義表達(dá)載體pBPC-ZmPtil-bar的酶切圖譜如圖1 所示。
植物正義表達(dá)載體是一個雙價載體，鑒定時，分別用BamHI和Kpnl 雙酶切驗證，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖2所示，泳道1中為DL15000 DNA marker,泳道2-4中均為植物正義表達(dá)載體pBPC-ZmPtil-bar經(jīng)雙酶 切后得到的4個DNA片段分別是大小為1000bp的Zm尸"/基因片段，含 有和C/6^mY/"啟動子的大小為2250bp的片段，大小為550bp的bar 基因片段，大小為4700bp的載體骨架大片段。最后經(jīng)測序驗證載體構(gòu)建正確。
B.所述的植物RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
選取ZmP"7基因編碼區(qū)400bp的序列作為耙序列構(gòu)建RNA干擾載體。 根據(jù)Zm/^7基因序列設(shè)計正向的上下游引物，分別為P1和P2;反向的上 下游引物分別P5和P6，以質(zhì)粒pGreen0029-ZmPtil-gfp為模板，分別以 P1禾BP2， P5和P6為上下游引物，引入不同酶切位點，擴增出2個400bp 的片段；以pGreen0029-ZmPtil-gfp為模板，P3和P4為上下游引物，擴增 l個750bp的片段。
所述的引物的序列為
Pl (正向上游引物)5'-ATAGGATCCATGCGCCGGTGGTTTTG國3，
(含BamHI酶切位點)； P2 (正向下游引物)5'-GATAGGCCTGACGATTTCCTTCC-3，
(含StuI酶切位點)； P3 (上游引物)5'-ATAGGCCTATGGTGAGCAAGGGC-3，
(含StuI酶切位點)；
P4 (下游引物)5'-ATTCTGCAGCCGATTTACTTGTACAGCTCG-3，
(含PstI酶切位點)；
P5 (反向上游弓l物)5'-ATTCTGGACGCTGATTTCCTTCC-3， (含Pstl酶切位點)；
P6 (反向下游引物)5'-ATAGGTACCATGCGCCGGTGGTTTTG-3， (含KpnI酶切位點)；
再將所述的2個400bp的片段和1個750bp的片段分別連接到T載體 上，測序驗證后，按照相應(yīng)的酶切位點連接到pGreen0029上，得到中間載 體pGreen0029-ZmPtil 。用酶BamHI和Kpnl酶切質(zhì)粒pBPC-p5cs-F129A， 回收約6700bp的大片段c。再同時將中間載體pGreen0029-ZmPtil用酶 BamHI和Kpnl酶切，得到約1500bp的片段d。通過連接，把小片段d連 接到大片段c上，得到中間載體pBPC-ZmPtil-gfp。用Kpnl單酶切 pBPC-p5cs-F129A載體，得到一個含有176/^^'"啟動子和基因、大小 為2800bp的片段a。再將中間載體pBPC-ZmPtil-gfp用Kpnl酶切回收得 到片段e。然后將片段a連接到片段e上，構(gòu)成Zm尸//7基因的植物RNAi 表達(dá)載體 pBPC-PtS-gfp-PtAS-bar 。
植物 RNAi 表達(dá)載體pBPC-PtS-gfp-PtAS-bar的酶切圖譜如圖3所示。
所述的植物RNAi表達(dá)載體是一個雙價載體，鑒定時，用BamHI單酶 切驗證，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖4所示，泳道1中為DL15000 DNA marker,泳道2-4中均為植物RNAi表達(dá)載體pBPC-PtS-gfp-PtAS-bar 經(jīng)單酶切后得到的2個片段分別是含有l(wèi)-400、她、400-l、"o 和W^wY/" 啟動子大小為3800bp的小片段，及大小為5200bp的大片段。最后經(jīng)測序 驗證載體構(gòu)建正確。
本實施例中的酶切反應(yīng)體系為
A. 單酶切反應(yīng)體系10Xbuffer : 2iU;酶0.5 Ul; DNA : 4Ul; ddH20 : 13.5 ul;合計20lU。
B. 雙酶切反應(yīng)體系10Xbuffer : 2iU;酶1 : 0.5ul;酶2 : 0.5 Ul; DNA : 4tU; ddH20 : 13Ul;合計20lU。
本實施例中的連接反應(yīng)體系為10Xligase buffer : 1 y 1; PEG 4000 : 1Ul載體質(zhì)粒2iU;目的基因片段5M; T4DNAligase : 1 U 1;合計
10ul。
將以上得到的兩種載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a (￡.co//)，擴大培養(yǎng)后 提采用堿裂解法提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒溶液的濃度調(diào)整到500ng/ ul，用于實 施例2中的轉(zhuǎn)化。
本實施例中采用了 RNA干擾(RNAinterference, RNAi)技術(shù)。該技 術(shù)是將人工合成或載體表達(dá)的雙鏈RNA(siRNA)導(dǎo)入真核細(xì)胞，促使內(nèi)源 RNA降解，高效特異阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因 缺失表型，獲得功能喪失或降低的突變體(Plant Cell, 1990,4:279-289.)。 RNAi技術(shù)的關(guān)鍵是設(shè)計構(gòu)建載體，在構(gòu)建載體時，外顯子序列的dsRNA 能產(chǎn)生特異和高效的基因抑制作用(Nature, 2000, 407: 319-320)。關(guān)于 RNAi表達(dá)載體靶基因序列的選取，Elbashir等建議應(yīng)在基因轉(zhuǎn)錄起始位點 下游100個核苷酸以后，且該段DNA的GC含量在40%-70%的范圍內(nèi) (Genes Dev, 2001, 15 (2): 188-200)。本研究構(gòu)建的Zm尸 〃基因的RNA干 涉載體，選擇該基因的編碼區(qū)400bp的保守序列作為靶序列，并在目的基 因的正向和反向片段之間導(dǎo)入了一個大小為750bp的她基因，可以提高 正義和反義RNA形成雙連RNA的效率，有利于產(chǎn)生siRNA (The Plant Journal, 2001, 27: 581-590; Gene Dev, 2002, 16:948)。實施例2:花粉管通道法轉(zhuǎn)化
選擇玉米自交系178作為受體，在開花期從受體自交系群體中選擇發(fā) 育正常的植株進(jìn)行套袋自交，具體方法參照論文《大豆DNA直接導(dǎo)入玉 米自交系的研究》(祁永紅.玉米科學(xué)，2000, B(l): 34-36.)。在授粉后4-24 小時內(nèi)進(jìn)行導(dǎo)入，操作方法為先將雌穗上的紙袋摘下，用剪刀剪去大約 距離穗軸頂端1-2厘米的花絲和苞葉，保持花絲切面平齊，并使苞葉內(nèi)的 花絲略高于苞葉。然后用一次性針管在切口處滴注100pl濃度為500ng4il 的質(zhì)粒溶液，立即重新套上紙袋，記載導(dǎo)入時間及質(zhì)粒名稱。待玉米果穗 成熟時，將其分別收獲曬干脫粒，備用。
本實施例中，在花粉管通道法轉(zhuǎn)化實驗中，受體是玉米自交系178， 兩種載體共轉(zhuǎn)化了78株玉米，收獲56穗玉米。本實驗在夏季進(jìn)行，授粉 時間為上午10點鐘，其中有8株是在陰雨天進(jìn)行的授粉，均未收獲果穗。 由于花粉質(zhì)量和轉(zhuǎn)化效率都可能受天氣的影響，因此花粉管通道法進(jìn)行玉 米轉(zhuǎn)化時，最好選擇晴天進(jìn)行；若遇陰雨天，可再次授粉以降低天氣對轉(zhuǎn) 化產(chǎn)生的不良影響。導(dǎo)入時間對轉(zhuǎn)化效率有影響，授粉后4h導(dǎo)入外源基 因轉(zhuǎn)化效率較低，8h-20h轉(zhuǎn)化效率較高。
目前，花粉管通道法有很多優(yōu)點導(dǎo)入的基因可以不帶篩選標(biāo)記，不 會對環(huán)境和人類造成危害；采用該方法選系穩(wěn)定、速度快， 一般在導(dǎo)入后
的自交3代即可穩(wěn)定；該方法無需要昂貴的設(shè)備，操作簡單，易于推廣。 實施例3:轉(zhuǎn)化植株的抗性初步篩選
A. 檢測方法
將收獲的種子播種于人工氣候室的育苗盤中，培養(yǎng)基為蛭石。當(dāng)Io 代植株長出三葉一心時，用濃度為0.1%的除草劑涂抹心葉，所述的除草劑
可以為草丁膦。
B. 檢測結(jié)果
圖5中顯示了涂抹除草劑一周后，抗性植株篩選的情況圖5-A中為 無抗性植株，圖5-B中為無抗性植株葉片，圖5-C中為抗性植株，圖5-D 中為抗性植株葉片。由圖5所示大部分植株葉片涂抹除草劑地方呈黃斑， 黃斑的周邊呈干枯狀向葉片基部蔓延(圖5-A、 5-B);未轉(zhuǎn)基因的對照植
株與上述癥狀相似，兩周后大部分植株上部葉片干枯；植株生長緩慢。獲
得轉(zhuǎn)化所述的植物正義表達(dá)載體的20株抗性植株和所述的轉(zhuǎn)化植物RNAi表達(dá)載體的20株抗性植株生長發(fā)育正常，葉片顏色沒有黃化、干枯狀等 癥狀，表現(xiàn)為草丁膦抗性。
將上述的40株草丁膦抗性植株移栽到30cmX30cmX 30cm裝有營養(yǎng) 土的木箱中，每個木箱栽四株，進(jìn)行后續(xù)檢測和自交收獲種子。 本實施例所述的草丁膦購自sigma (45520)公司。 實施例4:轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測
A. 檢測方法
實施例3中所述的移栽7天后，將上述的40株草丁膦抗性的植株， 用CTAB法(CTAB:十六烷基三甲基溴化銨)提取葉片總DNA，利用PCR 對目的基因6ar基因進(jìn)行檢測。PCR擴增反應(yīng)體系為反應(yīng)總體積25pl; 引物為bar基因的上下游引物；擴增產(chǎn)物大小應(yīng)為550bp;
PCR反應(yīng)的程序為
94 °C 5min
94°C30s n
63 °C30s— 35個循環(huán)
72°C30s」
72 °C 7min。
上述PCR反應(yīng)完成后，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
B. 檢測結(jié)果
所述的40株草丁膦抗性植株的PCR檢測的結(jié)果如圖6所示。圖6中， 泳道1中為DL3000 DNAmarker，泳道2中為質(zhì)粒陽性對照，泳道3中為 未轉(zhuǎn)基因植株，泳道4中為無抗性植株，泳道5-8中為轉(zhuǎn)基因植株。
如圖6所示，以未轉(zhuǎn)基因的玉米自交系178 (泳道3中)和沒有草丁 膦抗性的轉(zhuǎn)化植株(泳道4中)的基因組DNA為模板進(jìn)行擴增，未擴增 出大小為550bp的特異性條帶；以上述的草丁膦抗性植株(泳道5-8中) 的基因組DNA為模板進(jìn)行擴增，擴增出大小為550bp的特異性條帶。
所述的40株草丁膦抗性植株中有33棵是轉(zhuǎn)基因植株。其中轉(zhuǎn)植物正 義表達(dá)載體的陽性植株15株，轉(zhuǎn)植物RNAi表達(dá)載體的陽性植株18株。
實施例5:轉(zhuǎn)化植株的PCR-Southern檢測
A:檢測方法
為進(jìn)一步驗證目的基因重組到玉米基因組中，對PCR鑒定為陽性的33個株系進(jìn)行PCR-Southem印跡分析。取實施例4中的經(jīng)PCR鑒定呈陽 性的33株植株進(jìn)行Southern檢測；同時以分別以實施例1中構(gòu)建的植物 正義表達(dá)載體和植物RNAi表達(dá)載體為模板在相同引物和條件下進(jìn)行 PCR，擴增產(chǎn)物作為陽性對照；以未轉(zhuǎn)基因的自交系178的基因組DNA 為模板，在相同弓I物和條件下進(jìn)行PCR，擴增產(chǎn)物作為陰性對照。上述PCR 反應(yīng)的體系和程序與實施例4中相同。
再分別取上述lO)ilPCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， Southern-blotting按《分子克隆實驗指南第三版》((美〕J.薩姆布魯克等著， 科學(xué)出版社，2002年出版)中所述的常規(guī)方法進(jìn)行。交探針為6"r基因， 探針標(biāo)記和雜交檢測按照Roche公司的地高辛試劑盒的方法進(jìn)行，雜交溫 度為65°C。
探針標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系為ddH20 : 19.5^1， PCR buffer: 2.5|il; PCR DIG Labeling Mix : 2pl;模板DNA: 0.5|ul; Taq酶:0.5^1;總體積: 25nl。
探針標(biāo)記的PCR反應(yīng)的程序為95 °C lmin
95 °C30s 「
63 °C 30s一35個循環(huán)
72°C35s —
72 °C 7min。
B.檢測結(jié)果
所述的33株中部分轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)Southern -PCR檢測的結(jié)果如圖7所示。圖7中，第l列為質(zhì)粒陽性對照，第2列為未轉(zhuǎn)基因植株，第3-7列 中為轉(zhuǎn)基因植株。
如圖7所示，Southern-blotting檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果一致，33個 株系全部為陽性(第3-7列中)；而對照植株沒有雜交信號(第2列中)。 證明該基因已經(jīng)整合到了受體基因組中。
實施例6:轉(zhuǎn)化植株抗病性初步鑒定
將實施例5中檢測到的轉(zhuǎn)基因陽性植株在溫室內(nèi)培養(yǎng)，150天的生長 情況如圖8所示。圖8中，圖8-A為轉(zhuǎn)植物正義表達(dá)載體的植株，圖8-B 為轉(zhuǎn)植物RNAi表達(dá)載體的植株，圖8-C為轉(zhuǎn)植物正義表達(dá)載體的植株的葉片，圖8-D中為轉(zhuǎn)植物RNAi表達(dá)載體的植株的葉片。
如圖8所示，轉(zhuǎn)植物正義表達(dá)載體的15株生長狀況良好(圖8-A)， 并且葉片未發(fā)現(xiàn)有明顯病斑(圖8-C);轉(zhuǎn)植物RNAi表達(dá)載體的18株生 長狀況與所述的轉(zhuǎn)植物正義表達(dá)載體的15株生長狀況無顯著差別，但是 其中有9株的葉片發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的病斑(圖8-D)。對轉(zhuǎn)基因植株的生長發(fā)育 進(jìn)行初步的研究，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)化植株的抗病性存在一定的差異。
這一結(jié)果提示，Zm尸"7基因在玉米中可能與抗病性有關(guān)。擬下一步對 轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行生物和非生物脅迫處理，檢測該基因的表達(dá)豐度，并檢測 植株在不同逆境下的生理指標(biāo)，進(jìn)一步明確蛋白激酶ZmPtil的基因在玉 米抗逆信號途徑中的作用。
實施例1至實施例6中，各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA 聚合酶均購自Takara公司；DL2000+15000Marker購自Takara公司；DNA 純化試劑盒、T-easy載體試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自Promega公司； CTAB等其他常規(guī)生化試劑購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)公司和北京欣經(jīng)科 生物技術(shù)公司。
實施例1至實施例6中，PCR引物合成和DNA測序工作均由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。
實施例1至實施例6中，所述的PCR反應(yīng)使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因擴增儀，購自MJ Research Inc公司；所述的瓊脂糖凝膠電泳使 用UVP Gel Documentation凝膠分析系統(tǒng)，購自基因公司；所述的瓊脂糖 凝膠電泳使用DYCP-31DN電泳儀，購自北京六一儀器公司。
實施例1至實施例6中，所采用的DNA提取、PCR、酶切、連接、 轉(zhuǎn)化等基因工程基本操作方法記載于《分子克隆實驗指南第三版》中((美〕 J.薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理 與技術(shù)》中(王關(guān)林，方宏筠著，科學(xué)出版社,1998)。
權(quán)利要求
1.一種抗病玉米的培育方法，其特征在于該方法是利用植物正義表達(dá)載體將玉米的蛋白激酶ZmPtil基因(Genbank中登陸號為AY708048)導(dǎo)入玉米中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗病玉米的培育方法，其特征在于所述的 植物正義表達(dá)載體帶有篩選標(biāo)記基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗病玉米的培育方法，其特征在于所述的 標(biāo)記基因為抗除草劑的6w基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的抗病玉米的培育方法，其特征在于， 所述的植物正義表達(dá)載體帶有t/6/《mY/"啟動子和Zwi^7基因的開放閱讀 框。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗病玉米的培育方法，其特征在于所述的 導(dǎo)入方法為花粉管通道法，該方法包括去掉距離玉米穗軸頂端1-2厘米 的花絲和苞葉，在切口處滴注100iil濃度為500ng l的質(zhì)粒溶液，待玉米果穗成熟收獲。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗病玉米的培育方法，其特征在于進(jìn)行所 述的導(dǎo)入操作的時間優(yōu)選為上午10點鐘，季節(jié)優(yōu)選為夏季。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗病玉米的培育方法，該方法是利用植物正義表達(dá)載體將玉米的蛋白激酶ZmPti1基因(Genbank中登陸號為AY708048)導(dǎo)入玉米中，經(jīng)培育得到抗病玉米；本發(fā)明中轉(zhuǎn)入玉米的ZmPti1基因，該基因是一個由鹽脅迫誘導(dǎo)的蛋白激酶基因。研究該基因在玉米中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制以及在抗逆信號途徑中的作用，有希望獲得玉米抗鹽的主效基因，將它直接應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因工程中，改良作物抗鹽性狀，加快作物的育種進(jìn)程。該方法中導(dǎo)入的基因可以不帶篩選標(biāo)記，不會對環(huán)境和人類造成危害；采用該方法選系穩(wěn)定、速度快；該方法無需要昂貴的設(shè)備，操作簡單，易于推廣。
文檔編號C12N15/82GK101407817SQ200810227598
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者吳忠義, 張秀海, 李春華, 梁宏霞, 王永勤, 黃叢林 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院