利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法及檢測(cè)方法，其制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法步驟是：步驟一：切開(kāi)小鼠股動(dòng)脈表面皮膚，分離此股動(dòng)脈和股動(dòng)脈分支；步驟二：將股動(dòng)脈分支剪一小口，利用螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支的此剪口處插入股動(dòng)脈主干內(nèi)；步驟三：停留1-3分鐘后抽出螺旋狀不銹鋼絲，結(jié)扎股動(dòng)脈分支并縫合皮膚；步驟四：3-5周后將損傷的股動(dòng)脈制作成動(dòng)脈斷面切片，制成標(biāo)本。本發(fā)明采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用于動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械性損傷，結(jié)合動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)過(guò)程，可達(dá)到研究動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷之反應(yīng)程度的目的。
【專利說(shuō)明】利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，特別是制作小鼠股動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械性損傷模型的方法及其檢測(cè)方法。本動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷方法用于動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及其相關(guān)疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制及治療效果等的研究。

【背景技術(shù)】
[0002]大或中型動(dòng)脈壁的解剖分為三層:動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜。其中動(dòng)脈內(nèi)膜位于血管腔內(nèi)側(cè)、直接接觸血液，由一層動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞組成，起到保護(hù)動(dòng)脈壁免受血液內(nèi)不良成分傷害的作用，另外分泌一些生物學(xué)物質(zhì)，以調(diào)節(jié)動(dòng)脈的收縮和舒張，從而維持心血管系統(tǒng)的正常功能。
[0003]動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)是動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受到血脂的侵害、特別是氧化型低密度脂蛋白的損傷。動(dòng)脈內(nèi)膜遭破壞后，血脂、血小板、吞噬細(xì)胞等繼而沉積在內(nèi)膜上形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，使血管的管腔變小、血管壁僵硬失去彈性、血液不能充分供應(yīng)至全身組織器官、致組織器官缺血缺氧、功能衰竭。因此動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的起始環(huán)節(jié)。
[0004]在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及其相關(guān)疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制及治療效果等研究中，經(jīng)常需要對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究，特別是動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的增殖反應(yīng)是多還是少進(jìn)行分析。分析的意義在于:在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷同時(shí)加用某種刺激(例如某種藥物)，一定時(shí)間后(一般4周達(dá)飽和)，與陽(yáng)性組和陰性組進(jìn)行比較，若實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)此種刺激反應(yīng)性增殖速度快、增殖量大，說(shuō)明這種刺激可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，應(yīng)該避免此種刺激。相反，若動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷加用另一種藥物4周后，動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不增殖，則說(shuō)明這種藥物具有保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞免受增殖之不良反應(yīng)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用，可以用于抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療。
[0005]因此，需要一種誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷以研究其增殖程度的方法。
[0006]由于人類疾病的發(fā)展十分復(fù)雜，探討疾病發(fā)生機(jī)制時(shí)以人本身為實(shí)驗(yàn)對(duì)象存在時(shí)間、空間、風(fēng)險(xiǎn)、倫理、方法、多種因素(年齡、性別、社會(huì)、文化、經(jīng)濟(jì)等)限制，故需借助于動(dòng)物模型，通過(guò)動(dòng)物生理、病理、毒理、藥理等間接研究，以揭示人類疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及防治手段。小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也越來(lái)越多的用于各種科研活動(dòng)。
[0007]小鼠價(jià)格低廉、易于操作，雖然其脂肪代謝過(guò)程不同于人類、血脂不高、所以不易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，但載脂蛋白E基因敲除(ApoE+)小鼠模型的成功制備，使此種小鼠易發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、且病理過(guò)程與人類相似。故動(dòng)脈粥樣硬化的研究多采用ApoE+小鼠作為載體進(jìn)行研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是，提供一種便于誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷以研究其增殖程度的制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法及其檢測(cè)方法。
[0009]本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，該方法步驟是:
[0011]步驟一:切開(kāi)小鼠股動(dòng)脈表面皮膚，分離此股動(dòng)脈和股動(dòng)脈分支；
[0012]步驟二:在股動(dòng)脈分支剪一小口，利用螺旋狀不銹鋼絲從此剪口插入股動(dòng)脈主干內(nèi)；
[0013]步驟三:停留1-3分鐘抽出螺旋狀不銹鋼絲，結(jié)扎股動(dòng)脈分支，并縫合皮膚切口 ；
[0014]步驟四:3_5周后將損傷的股動(dòng)脈制作成動(dòng)脈斷面切片，形成標(biāo)本。
[0015]本發(fā)明的目的還可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0016]進(jìn)一步的，所述的小鼠為8-11周齡。
[0017]進(jìn)一步的，步驟二中螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支插入股動(dòng)脈主干內(nèi)0.5-1.5厘米。
[0018]進(jìn)一步的，步驟三中利用螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支插入股動(dòng)脈主干內(nèi)停留時(shí)間為1分鐘。
[0019]進(jìn)一步的，所述的螺旋不銹鋼導(dǎo)管的直徑為0.2-0.5cm。
[0020]進(jìn)一步的，步驟四制成標(biāo)本方法包括:
[0021](1)標(biāo)本的提取:于手術(shù)3-5周后對(duì)小鼠實(shí)施全身麻醉，將小鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢用膠布固定，剪開(kāi)胸壁、暴露心臟，通過(guò)注射器從左心室抽出全部血液后，先后用生理鹽水和3-5%甲醛溶液沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)，切除損傷的動(dòng)脈段，形成標(biāo)本；
[0022](2)標(biāo)本的處理:用石蠟包埋標(biāo)本，用機(jī)器切出切片，用載玻片將切片組織置于其表面，切片厚度4-6um，動(dòng)脈段每隔1.5-3mm保留切片，平均每個(gè)動(dòng)脈分析3_4個(gè)截面；
[0023](3)標(biāo)本的染色:常規(guī)HE染色，之后脫水、透明、中性樹(shù)膠封固蓋玻片。
[0024]進(jìn)一步的，所述的沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)方法是:首先，將右心房剪一開(kāi)口，將生理鹽水從左心室抽血的針眼處緩慢注射入左心室，待右心房流出血液消失取代為生理鹽水時(shí)為止；其次，用3-5%甲醛溶液從左心室抽血的針眼處緩慢注射入左心室，進(jìn)行一次或多次沖洗；最后，切除損傷的股動(dòng)脈段浸泡于3-4%甲醛溶液6-24小時(shí)后形成標(biāo)本。
[0025]一種動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的檢測(cè)方法，其方法是:采用分析軟件，測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜面積⑴，動(dòng)脈中膜面積(M)及其比值(I/M)，與陰性對(duì)照組比較，若實(shí)驗(yàn)組I增大及/或1/Μ減小，說(shuō)明動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)嚴(yán)重，易于發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化；反之，不易發(fā)生。
[0026]本發(fā)明的有益效果:
[0027]1、本發(fā)明采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用于動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械性損傷，結(jié)合動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)過(guò)程，可達(dá)到研究動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷之反應(yīng)程度的目的。
[0028]2、本發(fā)明采用細(xì)的螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支插入股動(dòng)脈主干內(nèi)達(dá)到股動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，對(duì)檢測(cè)股動(dòng)脈皮細(xì)胞對(duì)損傷的增殖反應(yīng)、研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞增殖效果提供了一種有效的手段。
[0029]3、本發(fā)明適應(yīng)于小鼠股動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械性損傷，對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞及其相關(guān)的疾病例如動(dòng)脈粥樣硬化的研究具有實(shí)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為本發(fā)明具體實(shí)施方法的操作示意圖。
[0031]圖中標(biāo)記:1表示股動(dòng)脈主干、2表示股動(dòng)脈分支、3星號(hào)表示從此處剪一小開(kāi)口然后插入導(dǎo)管的部位、4箭頭表示導(dǎo)管插入的方向，插入深度為從分支算起向心性方向I厘米、5表示抽出導(dǎo)管后用絲線結(jié)扎的部位。

【具體實(shí)施方式】
[0032]參照?qǐng)D1所示的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其方法步驟是:
[0033](I)術(shù)前準(zhǔn)備:經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(120mg/kg)進(jìn)行小鼠全身麻醉后，將小鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢用膠布固定。
[0034](2)手術(shù)過(guò)程:
[0035]A、剃毛、消毒:一側(cè)(右手優(yōu)勢(shì)者取左側(cè))腹股溝區(qū)剃毛、碘酒消毒。另一側(cè)不動(dòng)，用做對(duì)照。
[0036]B、分離股動(dòng)脈及其分支:腹股溝正中縱向切開(kāi)皮膚、分離股動(dòng)脈主干(如圖中標(biāo)記I)。用兩根外科縫合線分別從股動(dòng)脈近端和遠(yuǎn)端的底下穿過(guò)并用膠布固定以臨時(shí)控制血流。分離位于主干中端的較粗動(dòng)脈分支-股動(dòng)脈肌支(如圖中標(biāo)記2)。
[0037]C、插管:在動(dòng)脈表面滴一滴1%利多卡因以防止動(dòng)脈痙攣。在股動(dòng)脈肌支近端剪一小口(如圖中標(biāo)記3)，將不銹鋼導(dǎo)管通過(guò)這一切口向心性延著股動(dòng)脈分支插入股動(dòng)脈主干內(nèi)方向(如圖中標(biāo)記4)內(nèi)I厘米，在其內(nèi)停留I分鐘，然后緩慢抽出。
[0038](3)關(guān)閉切口:用7.0號(hào)絲線5結(jié)扎股動(dòng)脈分支，結(jié)扎部位(見(jiàn)圖中標(biāo)記5)。放松股動(dòng)脈近端和遠(yuǎn)端用于控制血流的縫合線，恢復(fù)血流，皮膚用絲線縫合，手術(shù)后保溫，自然蘇醒。
[0039](4)標(biāo)本的提取:
[0040]A、標(biāo)本的提取過(guò)程:于手術(shù)4周后對(duì)小鼠實(shí)施全身麻醉，方法同前。之后將小鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢用膠布固定。剪開(kāi)胸壁、暴露心臟。通過(guò)注射器從左心室抽出全部血液后，先后用生理鹽水和4%甲醛溶液沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)。沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)方法:將右心房剪一開(kāi)口，將生理鹽水從剛才左心室抽血的針眼處緩慢注射入左心室，待右心房流出血液消失取代為生理鹽水時(shí)為止，約1ml ;用4%甲醛溶液重復(fù)上述步驟。沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)完畢后，切除損傷的股動(dòng)脈段浸泡于4%甲醛溶液6-24小時(shí)。
[0041]B、標(biāo)本的處理:用石蠟包埋標(biāo)本，用機(jī)器切出切片，用載玻片將切片組織置于其表面。切片厚度5um。動(dòng)脈段每隔2mm保留切片，平均每個(gè)動(dòng)脈分析3-4個(gè)截面。
[0042]C、標(biāo)本的染色:常規(guī)HE染色。之后脫水、透明、中性樹(shù)膠封固蓋玻片。
[0043](5)標(biāo)本的檢測(cè)分析:采用分析軟件，測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜面積(I)，動(dòng)脈中膜面積(M)及其比值(I/Μ)。與對(duì)照組比較，若實(shí)驗(yàn)組I增大及/或I/Μ減小，說(shuō)明動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)嚴(yán)重，易于發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化；反之，不易發(fā)生。
【權(quán)利要求】
1.利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征在于該方法的步驟是: 步驟一:切開(kāi)小鼠股動(dòng)脈表面皮膚，分離此股動(dòng)脈和股動(dòng)脈分支； 步驟二:將股動(dòng)脈分支剪一小口，利用螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支的此剪口處插入股動(dòng)脈主干內(nèi)； 步驟三:停留1-3分鐘后抽出螺旋狀不銹鋼絲，結(jié)扎股動(dòng)脈分支并縫合皮膚； 步驟四:3-5周后將損傷的股動(dòng)脈制作成動(dòng)脈斷面切片，制成標(biāo)本。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:所述的小鼠為8-11周齡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:步驟二中螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支插入股動(dòng)脈主干內(nèi)0.5-1.5厘米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:步驟三中利用螺旋狀不銹鋼絲從股動(dòng)脈分支插入股動(dòng)脈主干內(nèi)停留時(shí)間為1-3分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:所述的螺旋不銹鋼導(dǎo)管的直徑為0.2-0.5cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:步驟四制成標(biāo)本方法包括: (1)標(biāo)本的提取:于手術(shù)3-5周后對(duì)小鼠實(shí)施全身麻醉，將小鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢用膠布固定，剪開(kāi)胸壁、暴露心臟，通過(guò)注射器從左心室抽出全部血液后，先后用生理鹽水和3-5%甲醛溶液沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)，切取損傷的股動(dòng)脈切段，形成標(biāo)本； (2)標(biāo)本的處理:用石蠟包埋標(biāo)本，用機(jī)器切出切片，用載玻片將切片組織置于其表面，切片厚度4-6um，動(dòng)脈段每隔1.5-3mm保留切片，平均每個(gè)動(dòng)脈分析3-4個(gè)截面； (3)標(biāo)本的染色:常規(guī)HE染色，之后脫水、透明、中性樹(shù)膠封固蓋玻片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:所述的沖洗動(dòng)脈系統(tǒng)方法是:首先，將右心房剪一開(kāi)口，將生理鹽水從左心室抽血的針眼處緩慢注射入左心室，待右心房流出血液消失取代為生理鹽水時(shí)為止；其次，用3-5%甲醛溶液從左心室抽血的針眼處緩慢注射入左心室，進(jìn)行一次或多次沖洗；最后，切除損傷的股動(dòng)脈段浸泡于3-4%甲醒溶液6-24小時(shí)后形成標(biāo)本。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用小鼠制作動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，其特征是:該方法還包括動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的檢測(cè)方法，采用分析軟件，測(cè)量動(dòng)脈內(nèi)膜面積(I)，動(dòng)脈中膜面積(M)及其比值(I/M)，與陰性對(duì)照組比較，若實(shí)驗(yàn)組I增大及/或I/Μ減小，說(shuō)明動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)嚴(yán)重，易于發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化；反之，不易發(fā)生。
【文檔編號(hào)】A61D1/00GK104398313SQ201410692979
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】李君 , 沈粵春, 陸東風(fēng), 李新春 申請(qǐng)人:廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院