專利名稱：獼猴肝損傷動(dòng)物模型構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物模型的建立方法，具體涉及到一種獼猴酒精性肝損傷動(dòng)物模型構(gòu) 建方法。
背景技術(shù)：
飲酒對肝臟的影響已引起人們的重視。過量飲酒可造成肝臟不同程度的損害，據(jù) 統(tǒng)計(jì)，三分之二的酗酒者可發(fā)展為脂肪肝、肝纖維化，嚴(yán)重的可發(fā)展為肝硬變或肝細(xì)胞癌， 為深入研究酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制，特別是酒精性肝纖維化的病理機(jī)制，篩選有救預(yù)防和 治療本病的藥物，選擇有科學(xué)性、實(shí)用性、重現(xiàn)性的肝損傷動(dòng)物模型的意義十分重要。動(dòng)物 模型必須與人類酒精性肝病特征相似，病變有一定發(fā)展過程，即明顯分期，形成率高，死亡 率低，造模方法簡便易行，造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢，便于藥物干預(yù)研究。目前，人們通過構(gòu) 建動(dòng)物模型的方式，運(yùn)用科學(xué)方法，通過研究模型動(dòng)物從而找出疾病形成的原因，甚至評價(jià) 相關(guān)藥物對該種疾病的藥效評估，具有十分重要的意義。酒精性肝損傷可分為酒精性脂肪肝(AFL)、酒精性肝纖維化(AF)、酒精性肝炎 (alcoholic h印atitis，AH)、酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis. AC)。機(jī)體大量攝入乙 醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，使三羧循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂 肪代謝。乙醇可致η—磷酸甘油增多而促進(jìn)甘油三酯合成，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，同時(shí) 乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生氧自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗 竭。研究證實(shí)酒精中毒可以直接引起肝臟纖維化，并由纖維化直接進(jìn)入肝硬化。肝纖維化 的基本病理改變是結(jié)締組織在肝內(nèi)異常增生和沉積，肝纖維化發(fā)生機(jī)制及治療研究已成為 肝臟病學(xué)熱點(diǎn)，隨之建立起穩(wěn)定的、形成時(shí)間短、形成率高的肝纖維化動(dòng)物模型也成為I期 臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究的難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種造模時(shí)間短、造模成功率及造模效率高的酒精性肝損 傷(脂肪肝和肝纖維化)動(dòng)物模型的建立方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的的技術(shù)方案選取獼猴作為模型動(dòng)物，用純度99. 5%無水乙醇與純凈水按濃度百分比5% (V/ V)配制供獼猴自由飲用，濃度每周遞增5%，至20%后持續(xù)20 30周。所述方法是選取10歲雄性和雌性獼猴各10只作為模型動(dòng)物，雄性體重8 10公 斤，雌性體重5 7公斤，飲用純凈水的對照組模型動(dòng)物至少兩只。所述方法在造模期內(nèi)獼猴維持期飼料成分為粗蛋白質(zhì)> 19%、粗脂肪> 4%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明動(dòng)物模型的建立方法安全可靠，減少了動(dòng)物模型的造模時(shí)間，提高了造 模成功率和造模效率，具有良好的應(yīng)用前景。2、通過建立酒精性肝損傷動(dòng)物模型，可以用來研究肝病的發(fā)生機(jī)制，篩選保肝藥
3物，探索保肝作用原理，甚至評價(jià)相關(guān)藥物對該種疾病的藥效評估，具有十分重要的意義。


圖1是GE便攜式B超3. 5MHz電子凸陣探頭掃描正常獼猴肝組織超聲圖。圖2為脂肪肝組織超聲圖。圖3和圖4分別為肝纖維化組織超聲圖。圖5和圖6分別為masson染色正常肝切片(100X)、(200X)圖。圖7和圖8分別為masson染色彌漫性脂肪樣病變(100X) (200X)圖。圖9為HE染色彌漫性脂肪樣(200 X)病變圖。圖10為HE染色肝組織呈點(diǎn)狀壞死伴炎細(xì)胞浸潤(100 X)圖。圖11為光鏡下(200X)，masson染色肝纖維化肝細(xì)胞廣泛壞死變性，且肝小葉內(nèi) 原有網(wǎng)狀支架膠原化病變圖。圖12為光鏡下(200X) ,masson染色中央靜脈和匯管區(qū)互相連接出現(xiàn)壞死帶并向 肝小葉內(nèi)伸展圖。圖13為(200X)，masson染色肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的壞死，增生的膠原纖維向肝小葉 內(nèi)伸展圖。以下結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，本發(fā)明包括但不限于實(shí)施例列舉的內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式(一)本發(fā)明模型的建立實(shí)施例1選取10歲雄性和雌性獼猴各10只作為模型動(dòng)物，雄性體重8 10公斤，雌性體重 5 7公斤，飲用純凈水的對照組模型動(dòng)物至少兩只。模型動(dòng)物在造模期間以純度99. 5% 無水乙醇兌制純凈水，供獼猴飲用，飲用濃度開始一周以5 % (按體積比配制)，以每周增加 5%的濃度自由飲用，濃度達(dá)到20%后持續(xù)不變飲用。并飼喂獼猴商業(yè)維持期飼料。24周 后，獼猴表現(xiàn)明顯的脂肪肝癥狀，繼續(xù)維持至32周后，獼猴表現(xiàn)為中度纖維化癥狀。實(shí)施例2選取10歲雄性和雌性獼猴各10只作為模型動(dòng)物，雄性體重8 10公斤，雌性體重 5 7公斤，飲用純凈水的對照組模型動(dòng)物至少兩只。模型動(dòng)物在造模期間以純度99. 5% 無水乙醇兌制純凈水，供獼猴飲用，飲用濃度開始一周以5 % (按體積比配制)，以每周增加 5 %的濃度自由飲用，濃度達(dá)到20 %后持續(xù)不變飲用。造模期間，獼猴維持期飼料的營養(yǎng)成 分為粗蛋白質(zhì)19. 5%、粗灰分6. 88%、粗脂肪4. 28%、粗纖維3. 1%、水分8. 2%。20周 后，獼猴表現(xiàn)明顯的脂肪肝癥狀，繼續(xù)維持至30周后，獼猴表現(xiàn)為中度纖維化癥狀。( 二)獼猴肝損傷診斷模式評價(jià)方法及結(jié)果該方法包括血清生化標(biāo)志物、影像學(xué)、病理組織學(xué)診斷。1、血清生化標(biāo)志物主要包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)。造模在20周和30周后，實(shí)驗(yàn)獼猴禁食12小時(shí)，然后在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉 條件下，后肢靜脈采血5毫升，3000rpm離心15分鐘，分離血清，測試血清AST、ALT濃度，其AST指標(biāo)測試結(jié)果顯示脂肪肝病變模型猴與正常對照組差異顯著(P < 0. 05)；肝纖維化病變模型猴與正 常對照組差異顯著(P <0.05)；而脂肪肝病變模型猴與肝纖維化病變模型猴差異不顯著。 ALT指標(biāo)測試結(jié)果顯示，脂肪肝病變模型猴與正常對照組差異顯著(P <0.05)；肝纖維化病 變模型猴與正常對照組差異顯著(P < 0. 05)；脂肪肝病變模型猴與肝纖維化病變模型猴差 異顯著(P < 0. 05)。2、B 超檢查。在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉?xiàng)l件下，采用GE便攜式B超，采用3. 5MHz電子凸陣探 頭對肝臟病變部位掃描，保存圖片進(jìn)行分析。結(jié)果正常肝組織超聲圖(見圖1)。肝臟被膜整齊光滑，呈線狀纖細(xì)的強(qiáng)回聲，與腹膜 線狀回聲之間有微小的間隙。肝實(shí)質(zhì)光點(diǎn)微細(xì)、分布均勻；肝內(nèi)管道系統(tǒng)走行正常，紋理清 楚、透聲良好。脂肪肝組織超聲圖(見圖2)。肝被膜整齊平滑，邊緣處較圓鈍。肝內(nèi)回聲細(xì)密，前 場回聲增強(qiáng)，后場回聲衰減。肝內(nèi)血管明顯減少。結(jié)果呈現(xiàn)中度脂肪肝。肝纖維化組織超聲圖(見圖3和圖4)。肝臟表面不規(guī)則，崎嶇不平，肝臟實(shí)質(zhì)不均 勻，有1. 04cmX0. 61cm的壞死。3、病理組織學(xué)分析。在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉?xiàng)l件下，B超誘導(dǎo)行活檢肝組織，10%中性福爾馬林固 定，石蠟包埋、4um切片，制備肝臟組織學(xué)切片，用于HE和Masson染色，采用Leica顯微鏡觀 察肝細(xì)胞脂肪變性與膠原纖維增生情況。病理切片分析結(jié)果正常肝切片，肝細(xì)胞正常，明顯可見細(xì)胞核、胞質(zhì)和膜以及肝小葉。見圖5(100X) 和圖6 (200 X)，masson染色脂肪肝病理病變彌漫性脂肪樣病變。圖7 (100X)和圖8(200X)，maSSOn染色； 圖9 (200 X)，HE染色，肝組織呈點(diǎn)狀壞死伴炎細(xì)胞浸潤圖10 (100 X)，HE染色。肝纖維化病理病變光鏡下觀察，肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的壞死變性，且以脂肪樣病變細(xì) 胞為主，少量水樣變細(xì)胞，大量肝細(xì)胞壞死后，肝小葉內(nèi)原有網(wǎng)狀支架膠原化，而產(chǎn)生膠原 纖維，導(dǎo)致中度肝纖維化。圖11 (200X)，masson染色；中央靜脈和匯管區(qū)互相連接出現(xiàn) 壞死帶，并向肝小葉內(nèi)伸展。形成中度肝纖維化。圖12(200X)，maSSOn染色。光鏡下觀 察，肝細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的壞死變性，且以脂肪樣病變細(xì)胞為主，少量水樣變細(xì)胞，兩個(gè)中央靜 脈之間出現(xiàn)互相連接的壞死帶，增生的膠原纖維向肝小葉內(nèi)伸展，形成中度肝纖維化。圖 13(200X)，masson 染色。
權(quán)利要求
獼猴肝損傷動(dòng)物模型構(gòu)建方法，其特征是選取獼猴作為模型動(dòng)物，用純度99.5％無水乙醇與純凈水按濃度百分比5％(V/V)配制供獼猴自由飲用，濃度每周遞增5％，至20％后持續(xù)20～30周。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是選取10歲雄性和雌性獼猴各10只作為模型 動(dòng)物，雄性體重8 10公斤，雌性體重5 7公斤，飲用純凈水的對照組模型動(dòng)物至少有兩P
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是在造模期內(nèi)獼猴維持期飼料成分為粗 蛋白質(zhì)> 19%、粗脂肪>4%。
全文摘要
獼猴肝損傷動(dòng)物模型構(gòu)建方法，涉及動(dòng)物脂肪肝和肝纖維化模型的構(gòu)建。本發(fā)明用獼猴為模型動(dòng)物，以無水乙醇兌制純凈水，供獼猴飲用，濃度以5％/周遞增，至20％后持續(xù)20～30周，并飼喂維持期飼料。20周獼猴呈明顯脂肪肝癥狀，后期則呈中度纖維化癥狀。診斷分析結(jié)果證明，本發(fā)明造模時(shí)間短，成功率高，安全可靠，可用于治療酒精性肝損傷藥物研究與功效評價(jià)。
文檔編號A61P1/16GK101879149SQ20101020058
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日
發(fā)明者司維, 季維智, 牛昱宇, 王宏, 紀(jì)少琿, 趙博 申請人:昆明亞靈生物科技有限公司