包含抗微小rna反義寡核苷酸的藥物組合物的制作方法

專利名稱：：包含抗微小rna反義寡核苷酸的藥物組合物的制作方法包含抗微小RNA反義寡核苷酸的藥物組合物發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包含含LNA的單鏈寡核苷酸的藥物組合物，所述寡核苷酸能夠抑制誘導(dǎo)疾病的微小RNA，特別是人微小RMmiR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155和miR-375。
背景技術(shù)：
：微V、AW-差厲或這W新藝源f浙微小RNA(miRNA)是小內(nèi)源RNA的豐富類別，其通過與其乾mRNA堿基配對來充當(dāng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。成熟miRNA通過RNA酶III核糖核酸酶Drosha(Lee等人2003)和Dicer(Hutvagner等人2001，Ketting等人2001)由較長的發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行順次加工。根據(jù)2005年10月的miRBase孩i小RNA數(shù)據(jù)庫版本7.1(Griffith-Jones2004，Griffith-Jones等人2006),迄今為止超過3400種miRNA已在脊推動物、無脊推動物和植物中得到注釋，并且對應(yīng)假定基因的許多miRNA也已得到鑒定。大多數(shù)動物miRNA通過不完全的堿基配對來識別位于3，-UTRs中的其耙位點(diǎn)，導(dǎo)致把基因的反應(yīng)抑制(Bartel2004)。越來越多的大量研究顯示動物miRNA在下述方面起基本生物作用細(xì)胞生長和凋亡(Brennecke等人2003)、造血細(xì)胞鐠系分化(Chen等人2004)、壽命調(diào)節(jié)(Boehm和Slack2005)、光感受器分化(Li和Carthew2005)、同源框基因調(diào)節(jié)(Yekta等人2004、Hornstein等人2005)、神經(jīng)元不對稱(Johnston等人MO4)、胰島素分泌(Poy等人2004)、腦形態(tài)發(fā)生(Giraldez等人2005)、肌增殖和分化(Chen、Mandel等人2005、Kwon等人2005、Sokol和Ambros2005)、心臟發(fā)生(Zhao等人2005)和脊推動物中的晚期胚胎發(fā)育(Wienholds等人2005)。oiiRNA涉及廣泛多樣的人疾病。一種是脊髄性肌萎縮(SMA)，由的兒科神經(jīng)變性疾病(Paushkin等人2002)。人SLITRK1基因中的miR-189的靶位點(diǎn)中的突變近期已顯示與圖雷特氏綜合征相關(guān)(Abelson等人2005)，而另一項(xiàng)近期研究報道丙型肝炎病毒(HCV)RNA基因組與宿主細(xì)胞微小RNA——肝特異性miR-122a相互作用，以促進(jìn)其在宿主中的復(fù)制(Jopling等人2005)。其中已涉及miRNA或其加工機(jī)制的其他疾病包括由脆性X智力低下蛋白質(zhì)(FMRP)的不存在引起的脆性X智力低下(FXMR)(Nelson等人2003,Jin等人WO4)和迪格奧爾綜合征(Landthaler等人2004)此外，紊亂的miRM表達(dá)模式已在許多人癌癥中得到報道。例如，人miRNA基因miR15a和miR16-l在大多數(shù)B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)情況下是被刪除或下調(diào)的，其中13種miRNA基因的獨(dú)特標(biāo)記近期顯示與預(yù)后和進(jìn)展相關(guān)(Calin等人2002，Calin等人2005)。miRNA在癌癥中的作用進(jìn)一步得到下述事實(shí)的支持超過50%的人miRNA基因位于癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域中或脆性位點(diǎn)上(Calin等人2004)。近期，人癌癥的多樣性的系統(tǒng)表達(dá)分析揭示與正常組織比較，腫瘤中的miRNA的一般下調(diào)(Lu等人2005)。有趣的是，分化不良腫瘤的基于miRNA的分類是成功的，然而當(dāng)應(yīng)用于相同樣品時，mRNA譜是高度不準(zhǔn)確的。miRNA也已顯示在乳腺癌(Iorio等人2005)、肺癌(Johnson等人2005)和結(jié)腸癌(Michael等人2004)中是下調(diào)的，然而在人B細(xì)胞淋巴瘤中擴(kuò)增的miR-17-92簇，和在伯基特氏淋巴瘤中上調(diào)的miR-155已報道為第一種人miRNA癌基因(Eis等人2005，He等人2005)。因此，人miRNA將不僅作為生物標(biāo)記用于未來的癌癥診斷是高度有用的，而且快速出現(xiàn)為吸引人的靶用于通過寡核苷酸技術(shù)的疾病千預(yù)。炎y^卓遂差裙茅凝^浙凝'/、幾種寡核苷酸方法已報道用于抑制miRNA。W003/029459(Tuschl)要求保護(hù)編碼長度為18-25個核苷酸的微小RM及其互補(bǔ)物，其可以包含核苷酸類似物。LNA提議為可能的核苷酸類似物，盡管未公開包含寡核苷酸的LNA。Tuschl要求保護(hù)可以在治療中使用的miRNA寡核苷酸。US2005/0182005公開了與最長形式的miR21互補(bǔ)的24聚體2，OMeRNA寡核糖核普酸，發(fā)現(xiàn)其減少miR21誘導(dǎo)的抑制，然而包含寡核苷酸的等同DNA則不是。術(shù)語2，OMe-RNA指其中在第2'位上存在對甲基的取代的RNA類似物(2，O甲基)。US2005/0227934(Tuschl)涉及具有高達(dá)50%DNA殘基的antimir分子。還報道包含2，OMeRM的antimir針對胰腺微小RNA使用，但看起來未公開實(shí)際的寡核苷酸結(jié)構(gòu)。US20050261218(ISIS)要求保護(hù)包含第一個區(qū)域和第二個區(qū)域的寡聚化合物，其中至少一個區(qū)域包含修飾，和寡聚化合物的部分靶向小的非編碼RNA耙核酸，其中小的非編碼RNA靶核酸是miRNA。要求保護(hù)長度為17-25個核苷酸的寡聚化合物。實(shí)施例涉及完全地2'OMePS化合物，21聚體和20聚體，和靶向針對一系列前miRNA和成熟miRNA耙的2，OMegapmer寡核苷酸。Boutla等人2003(NucleicAcidsResearch31:4973-4980)描述了與果蠅中的ll種不同miRM互補(bǔ)的DNA反義寡核苷酸及其通過將DNA寡核脊酸注入蒼蠅胚胎內(nèi)滅活miRNA的用途。在11種DNA反義寡核苷酸中，只有4種構(gòu)建體顯示嚴(yán)重干擾正常發(fā)育，而剩余7種寡核苷酸不顯示任何表型，可能由于其不能抑制所述miRNA。這一方法的替代方法已由Hutvagner等人(2004)和Leaman等人(2005)報道，其中與成熟miRM互補(bǔ)的2，-0-甲基反義寡核苷酸可以在體外和體內(nèi)在果蠅屬("roso/7力2'/fl)和美麗線蟲(e/ega/2S)用作短干擾RNA(siRM)和miRNA功能的潛在和不可逆的抑制劑，從而誘導(dǎo)功能缺失表型。這種方法的缺點(diǎn)是在轉(zhuǎn)染和注射實(shí)驗(yàn)中需要高2，-O-甲基寡核苷酸濃度(100微摩爾)，這對動物可能是有毒的。這種方法近期應(yīng)用于小鼠研究，通過使與4種不同miRNA互補(bǔ)的2，-O-甲基反義寡核苷酸和膽固醇綴合用于在體內(nèi)沉默miRNA(Kriitzfedt等人2005)。這些所謂的antagomirs通過靜脈內(nèi)注射施用于小鼠。盡管這些實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致內(nèi)源性miRNA在體內(nèi)的有效沉默，這發(fā)現(xiàn)是特異性、有效的和長效的，主要缺點(diǎn)是需要高劑量(80mg/kg)2，-O-Meantagomir用于有效沉默。使用LNA修飾的寡核苷酸抑制miRNA先前已由Chan等人iesearc力2005，65(14)6029-6033，Lecellier等人Sc/e/2ce2005，308，557-560，Naguibneva等人jV"i/reCe/"/o/o^r20068(3)，278-84和0rum等人Ce"e2006，(Availableonline24February2006)進(jìn)行描述。在所有情況下，LNA修飾的抗-mir寡核苷酸與整個成熟的微小RNA互補(bǔ)，即長度為20-23個核苷酸，其阻遏分子的有效體內(nèi)攝取和廣泛的生物分布。Naguibneva(Naguibneva等人NatureCellBiology20068描述了mixmer寡核苷酸抗-mir在體外抑制微小RNAmiR-181功能的用途，其中8個LNA核苷酸的區(qū)塊位于側(cè)面分別為在5'末端上的6DNA核苷酸，和在3'末端上的9DNA核苷酸的分子中心。這種反義設(shè)計的主要缺點(diǎn)是由于側(cè)面DNA末端的低核酸酶抗性的低體內(nèi)穩(wěn)定性。盡管Chan等人(Chan等人Ca/icerWesearcA2005，65(14)6029-6033)，和0rum等人(0rum等人Ce/e2006，(2006年2月24曰在線可獲得)未公開在其研究中使用的LNA修飾的抗-mir分子的設(shè)計，Lecellier等人(Ucellier等人5W歸e2005，308，557-560)描述了gapmerLM-DNA-LNA反義寡核苷酸抗-mir抑制孩i小RNA功能的用途，其中4個LNA寡核苷酸的區(qū)塊分別位于5'末端和3'末端，其中13個DNA核普酸的窗口在分子的中心。由于抗-mir寡核苷酸中的13核苷酸DNA串，這種反義設(shè)計的主要缺點(diǎn)是低體內(nèi)攝取以及低體內(nèi)穩(wěn)定性。因此，本領(lǐng)域需要能夠抑制微小RNA的改進(jìn)的寡核苷酸。發(fā)明概述本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)設(shè)計為以高親和力與miRNA靶結(jié)合的短寡核苷酸的使用在體內(nèi)減輕由微小RNA造成的mRNA阻遏中是高度有效的。盡管不希望受任何特定理論束蜂，但本文公開的證據(jù)指出miRNA在體內(nèi)的高度有效靶向通過設(shè)計寡核苷酸來達(dá)到，目的是在體內(nèi)與miRNA靶形成高度穩(wěn)定的雙鏈體。這通過在短的例如10-17個或10—16個核普酸堿基寡核苷酸中使用高親和力核苷酸類似物例如至少一個LM單元和適當(dāng)?shù)剡M(jìn)一步的高親和力核苷酸類似物來達(dá)到，所述高親和力核苷酸類似物例如LM、2'-氟核苷酸類似物的2，-MOERNA，。在一個方面，目的是產(chǎn)生這樣長度的寡核苷酸，其不可能形成siRNA復(fù)合物(即短寡核苷酸)，并且具有高親和力核苷酸類似物的足夠負(fù)荷，使得寡核苷酸幾乎永久與其miRNA靶粘著，與miRNA靶有效形成穩(wěn)定和無功能的雙鏈體。已發(fā)現(xiàn)此類設(shè)計明顯比現(xiàn)有技術(shù)寡核苷酸更有效，特別是gapmer和blockmer設(shè)計以及具有長的長度例如20-30聚體的寡核苷酸。術(shù)語2'氟-DNA指其中在2'位置上存在氟取代的DNA類似物(2'F)。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長度為8-17個，例如10-17個，例如8-16個或10-16個核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述單鏈寡核苷酸的至少一個核苷酸堿基單元是高親和力核苷酸類似物，例如鎖定核酸(LNA)核苷酸堿基單元，和其中所述單鏈寡核苷酸與選自人微小RMmiR-19b、miR-21、miR-122A、miR-155和miR-375的人微小RM序列互補(bǔ)。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長度為10-26個核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3'末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列3，acgttt5，(SEQIDNO6，5，tttgca3，)，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DM單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA單元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長度為10-26個核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3'末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列3，ctcaca5，(SEQIDNO7，5，acactc3'),其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA單元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長度為10-26個核苷酸堿基單元的寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3'末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列3，ttacga5，(SEQIDNO8,5，agcatt3，)，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA單元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長度為10-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列3，acaagc5，(SEQIDNO9，5，cgaaca3，)，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA單元的區(qū)域。本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含長度為10-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、栽體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列3，cgaata5，(SEQIDNO10，5，ataagc3，)，其中所述序列中的至少一個，例如l個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和任選地其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA單元的區(qū)域。高親和力核苷酸類似物是導(dǎo)致這樣的寡核苷酸的核苷酸類似物，所述寡核苷酸與互補(bǔ)RNA核苷酸具有比等同DNA核苷酸的結(jié)合親和力更高的熱雙鏈體穩(wěn)定性。這一般通過測量L來測定。當(dāng)使用靶向針對特異性miRNA的這些短的、高親和力寡核苷酸時，我們未鑒定到任何顯著的脫靶效應(yīng)。事實(shí)上，本文提供的證據(jù)指出對mRNA表達(dá)的影響是由于在mRNA內(nèi)的針對乾miRNA(初級mRNA耙)的互補(bǔ)序列的存在，或?qū)τ沙跫塵RNA乾調(diào)節(jié)的mRNA(次級mRNA耙)的次級影響。未鑒定到毒性效應(yīng)，指出無顯著有害的脫靶效應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，例如可以形成藥物組合物的組成部分的那些，用于制備用于治療與微小RM的存在或過量表達(dá)(上調(diào))相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給需要治療的人施用組合物(例如藥物組合物)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于減少細(xì)胞或生物中的miRNA的有效量的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)本發(fā)明的組合物(例如藥物組合物)或單鏈寡核苷酸。在這種背景中減少有效量指存在于細(xì)胞或生物中的功能miRNA的減少。應(yīng)認(rèn)識到根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的寡核苷酸并非一直顯著減少細(xì)胞或生物中的miRNA的實(shí)際量，因?yàn)樗鼈円话闩c其miRNA乾形成非常穩(wěn)定的雙鏈體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用組合物(例如藥物組合物)或單鏈寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了長度為8-16個例如8-16個例如10-16個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸，用于制備用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給需要治療的人施用長度為8-16個例如8—16個例如10一16個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于減少細(xì)胞或生物中的miRNA靶的有效量(即，可用于阻遏靶mRNA的miRNA量)的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用包含8-16個例如10-16個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸的組合物(例如藥物組合物)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRM去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用包含8-16個例如10-16個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸(或包含所述寡核苷酸的組合物)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于合成針對選自人微小RNAmiR-19b，miR-21，miR-122A，miR-155和miR-375的人微小RNA的單鏈寡核苷酸例如本文描述的單鏈寡核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟a.任選選擇由3'末端計數(shù)的第1個核苷酸堿基，其為LNA核苷酸堿基。b.任選選擇由3'末端計數(shù)的第2個核苷酸堿基，其為核苷酸類似物，例如LNA核苷酸堿基。c.選擇對應(yīng)miRNA種區(qū)域的單鏈寡核香酸的區(qū)域，其中所述區(qū)域如本文定義的。d.任選選擇如本文定義的第7個和第8個核苷酸堿基。e.任選選擇1-10個進(jìn)一步的核苷酸堿基，其可以選自核苷酸(x)和核香酸類似物(X)例如LNA。f.任選選擇如本文定義的單鏈寡核苷酸的5'區(qū)域。g.任選選擇如本文定義的單鏈寡核苷酸的5'末端。其中所述合成通過步驟a-g中定義的區(qū)域的順次合成來進(jìn)行，其中所述合成可以以-5'(a至g)或5'-3'(g至a)方向來進(jìn)行，和其中所述單鏈寡核苷酸與miRNA靶的序列互補(bǔ)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，寡核苷酸設(shè)計為不受RISC募集或介導(dǎo)RISC指導(dǎo)的miRNA靶切割。已考慮到通過使用與miRNA靶互補(bǔ)的長寡核苷酸，例如21或22聚體，特別是RNA寡核苷酸，或RNA'類似物，寡核苷酸，寡核苷酸可以就RISC復(fù)合物結(jié)合而言竟?fàn)幇衜RNA，且由此經(jīng)由引入作為底物竟?fàn)巑iRNA的寡核苷酸來減輕miRM靶mRNA的miRNA阻遏。然而，本發(fā)明尋求通過提供與成熟微小RM能夠互補(bǔ)，且在某些情況下明顯幾乎不可逆結(jié)合的寡核苷酸來阻止此類不希望有的靶mRNA切割或翻譯抑制。這看起來導(dǎo)致針對降解或切割(例如通過RISC或RNA酶H或其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶)的保護(hù)形式，這可能不導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的miRNA的基本或甚至顯著減少(例如，如使用LNA探針通過RNA印跡檢測的)，但確保如通過去阻遏分析測量的miRNA的有效量顯著減少。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了這樣的寡核苷酸，其有目的地設(shè)計為不與RISC復(fù)合物相容，但通過寡核苷酸經(jīng)由滴定來去除miRNA。盡管不希望受本發(fā)明的寡核苷酸為何如此有效的具體理論的束縳，與基于RNA的寡核苷酸類似(或完全的2，OMe寡核苷酸)，用，因?yàn)樗鼈冇行コ齘細(xì)胞質(zhì)中可獲得的miRNA,其中作為現(xiàn)有技術(shù)寡核苷酸提供了備選miRNA底物，這可以充當(dāng)竟?fàn)幰种菩?，取決于細(xì)胞質(zhì)中的寡核苷酸濃度、以及靶mRNA和miRM的濃度，其有效性將相差很遠(yuǎn)。盡管不希望受任何具體理論的束縛，但使用與miRM粑(即miRM)幾乎相似長度的寡核苷酸可能存在的一個可能性是寡核苷酸可以與miRM靶形成siRNA樣雙鏈體，這是將減少寡核苷酸的有效性的情況。還可能寡核苷酸其自身可以用作RISC復(fù)合物內(nèi)的指導(dǎo)鏈，從而產(chǎn)生非特異性靶的RISC指導(dǎo)的降解的可能性，這僅碰巧與寡核苷酸指導(dǎo)具有足夠的互補(bǔ)性。通過選擇用于靶向miRNA序列的短寡核苷酸，避免了此類問題。摻入LNA的短寡核苷酸由試劑區(qū)域已知，例如LNA(參見例如WO2005/098029和WO2006/069584)。然而，設(shè)計用于診斷或試劑用途的分子在設(shè)計方面與用于藥學(xué)用途的那些非常不同。例如，試劑寡聚體的末端核苷酸堿基一般不是LNA，而是DM，并且核苷間鍵一般與用于在本發(fā)明的寡核苷酸中使用的優(yōu)選鍵硫代磷酸酯不同。本發(fā)明因此提供了寡核苷酸自身的新型類別。本發(fā)明進(jìn)一步提供了如在本發(fā)明的藥物組合物的背景中描述的(單鏈)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含i)至少一個硫代磷酸酯鍵和/或ii)至少一個3'末端LNA單元，和/或iii)至少一個5'末端LNA單元。對于大多數(shù)治療用途優(yōu)選的是寡核苷酸是完全硫代磷酸酯化的_用于在CNS中使用的治療寡核苷酸例外，例如在其中疏代磷酸酯化可以是毒性的腦或脊柱中，和由于不存在核酶，甚至在連續(xù)DNA單元之間也可以使用磷酸二酯鍵。如本文提及的，根據(jù)本發(fā)明的寡核普酸的其他優(yōu)選方面是第2個3'核苷酸堿基，和/或第9個和第IO個(由3'末端)也可以是LNA。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)其他方法來避免RNA切割(例如血清中的核酸外切酶降解，或根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的RISC相關(guān)切割是可能的，并且像這樣本發(fā)明還提供了包含下述的單鏈寡核苷酸a.在由3'末端計數(shù)的笫l和2位上的LNA單元和/或b.在同樣由3'末端計數(shù)的第9位和/或第10位上的LNA單元，和/或c.1個或2個LNA單元。盡管這些其他方面的利益可能由更長的寡核苷酸，例如長度高達(dá)26個核苷酸堿基單元的核苷酸可見，但考慮這些特征還可以與本文提及的較短寡核苷酸一起使用，例如本文描述的8-17個、8-16個、10-17個或10-16個核苷酸堿基的寡核苷酸。高度優(yōu)選的是寡核苷酸包含高親和力核苷酸類似物，例如本文提及的那些，最優(yōu)選LNA單元。本發(fā)明人因此已驚奇地發(fā)現(xiàn)包含以特定順序的鎖定核酸(LNA)單元的精心設(shè)計的單鏈寡核苷酸顯示對微小RM的顯著沉默，導(dǎo)致減少的微小RM水平。發(fā)現(xiàn)所述寡核苷酸與所謂的種子序列的緊密結(jié)合是重要的，所述種子序列是由靶微小RNA的5'末端計數(shù)的核苷酸2-8或2-7。靼微小RNA的核苷酸1是非配對堿基，并且最可能隱藏在Ago2蛋白質(zhì)的結(jié)合袋中。盡管不希望受具體理論束縛，但本發(fā)明人考慮通過選擇種區(qū)域的序列，特別是對于在與種區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域中包含LNA優(yōu)選LNA單元的寡核苷酸，miRNA和寡核苷酸之間的雙鏈體在靶向miRNA中特別有效，避免脫靶效應(yīng)，并且可能提供阻止RISI指導(dǎo)的miRNA功能的進(jìn)一步特征。本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)LNA修飾的單鏈寡核苷酸在3'末端上不包含對應(yīng)這種非配對的核苷酸1的核苷酸時，微小RNA沉默甚至更加增強(qiáng)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的3'末端中的2個LNA單元使得所述寡核苷酸是高度核酸酶抗性的，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在對應(yīng)從靶微小RM的5'末端計數(shù)的第11和12位的位置中具有至少一個核普酸類似物例如LM核苷酸的本發(fā)明的寡核苷酸可以預(yù)防本發(fā)明的寡核苷酸的切割。因此，在本發(fā)明的一個方面涉及長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，其中i)由3'末端計數(shù)的第l個核苷酸是鎖定核酸(LM)單元；ii)由3'末端計數(shù)的第2個核苷酸是LNA單元；和iii)由3'末端計數(shù)的第9個和/或第IO個核苷酸是LNA單元。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用作藥物的如本文定義的寡核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本文定義的寡核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。如上文提及的，微小RNA涉及眾多疾病。因此，本發(fā)明的第四個方面涉及如本文定義的寡核苷酸用于制備用于治療與微小RNA表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物的用途，所述疾病選自脊髄性肌萎縮、圖雷特氏綜合征、丙型肝炎、脆性X智力低下、迪格奧爾綜合征和癌癥，例如慢性淋巴細(xì)胞白血病、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌，特別是癌癥。本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是通過使靶微小RNA與如本文定義的寡核苷酸接觸來減少靶微小RNA的水平的方法，其中所述寡核苷酸1.與乾微小RM互補(bǔ)2.在3'末端上不包含對應(yīng)靶微小RNA的第l個5'末端核苷酸的核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO28、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO82、SEQIDNO83、SEQIDNO84、SEQIDNO85、SEQIDNO86、SEQIDNO87、SEQIDNO88和SEQIDNO89的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LM單元的含氮堿基；和其中LM胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO90、SEQIDNO91、SEQIDNO92、SEQIDNO93、SEQIDNO94、SEQIDNO95、SEQIDNO96、SEQIDNO97、SEQIDNO98、SEQIDNO99、SEQIDNO100和SEQIDNO101的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO31、SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34、SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO102、SEQIDNO103、SEQIDNO104和SEQIDNO105的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LM單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQIDNO47、SEQIDNO48、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51、SEQIDNO52、SEQIDNO53、SEQIDNO54、SEQIDNO55、SEQIDNO106、SEQIDNO107、SEQIDNO108和SEQIDNO109的核普酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被曱基化的，或其綴合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含選自SEQIDNO65、SEQIDNO66、SEQIDNO67、SEQIDNO68和SEQIDNO69、SEQIDNO38、SEQIDNO39、SEQIDNO40、SEQIDNO41、SEQIDNO42、SEQIDNO43、SEQIDNO44、SEQIDNO45和SEQIDNO46的核苷酸堿基序列的寡核苷酸；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LM單元的含氮堿基；和其中LM胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。在一個實(shí)施方案中，寡核苷酸可以具有l(wèi)-17個核苷酸堿基的核苷酸堿基序列，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個核苷酸堿基，和像這樣此類實(shí)施方案中的寡核苷酸可以是本文公開的寡核苷酸內(nèi)的連續(xù)子序列。本發(fā)明的本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)包含特定核心DM序列和在所述核心序列中的鎖定核酸(LNA)的特定長度的反義寡核苷酸顯示優(yōu)異的微小RNA抑制性質(zhì)。附圖簡述圖1.在表達(dá)miR-122a的細(xì)胞系Huh-7中用不同LNA抗-miR寡核苷酸處理對靶核酸表達(dá)的影響。顯示的是與未處理的細(xì)胞(模擬試驗(yàn))比較，衍生自miR-122a特異性qRT-PCR的miR-122a(任意單位)的量。LNA抗-miR寡核苷酸分別以2個濃度l和100nM使用。還包括的是對SPC3349(在本文中也稱為SPC3549)的錯配對照(SPC3350)。圖2.使用miR-122a實(shí)時RT-PCR，在體內(nèi)在小鼠肝中，與SPC3372比較，SPC3548和SPC3549的LNA抗-miR-122aknock-down劑量應(yīng)答的評估。圖2b.在用不同LNA-抗miR處理后在小鼠肝中的miR-122水平。LNA-抗miR分子SPC3372和SPC3649通過3次i.p.注射經(jīng)過6天時期每隔一日以指示劑量施用于正常小鼠內(nèi)，并在最后一次劑量后48小時處死。從小鼠肝中提取出總RNA，miR-122通過miR-122特異性qPCR進(jìn)行測量。圖3.與接受鹽水的對照小鼠比較，在LM-抗miR-122a處理的小鼠中的血漿膽固醇水平的評估。圖4a.使用實(shí)時定量RT-PCR，與鹽水對照小鼠比較，在LNA抗miR-122a處理的小鼠中的相對Bckdkm腿水平的評估。圖4b.使用實(shí)時定量RT-PCR，與鹽水對照小鼠比較，在LNA抗miR-122a處理的小鼠中的相對醛縮酶AmRNA水平的評估。圖4c.使用實(shí)時定量RT-PCR，與鹽水對照小鼠(動物l-3)比較，在LNA抗miR-122a處理的小鼠(動物3-40)中的GAPDHmRNA水平的評估。圖5.使用miR-122a實(shí)時RT-PCR，在體內(nèi)在小鼠肝中，LNA-抗miR-12,2aknock-down劑量應(yīng)答的評估。6組動物(5只小鼠/組)以下列方式進(jìn)行處理。組1動物通過i.v.用0.2ml鹽水注射連續(xù)3天，組2接受2.5mg/kgSPC3372，組3接受6.25mg/kg,組4接受12.5mg/kg和組5接受25mg/kg，而組6接受25mg/kgSPC3373(錯配LNA-抗miR^寡核苷酸)，全都以相同方式。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)(因此n-10)且顯示合并的結(jié)果。圖6.比較SPC3649與SPC3372的RNA印跡。對來自每個組中的1只小鼠的總RNA實(shí)施miR-122特異性RNA印跡。指出在LNA-抗miR和miR-122之間形成的成熟miR-122和雙鏈體(阻斷的微小RNA)。圖7.小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或鹽水處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后1、2或3周處死。還包括的是來自在最后一次劑量后24小時處死的動物的值(實(shí)施例11"舊設(shè)計")。miR-122水平通過qPCR進(jìn)行評估，且在每個單個時間點(diǎn)上相對于鹽水組的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。還包括的是來自在最后一次劑量后24小時處死的動物的值(顯示平均值和SD，n-7，24小時n-10)。處死日9、16或23對應(yīng)在最后一次劑量后l、2或3周處死。圖8.小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或鹽水處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后1、2或3周處死。還包括的是來自在最后一次劑量后24小時處死的動物的值(實(shí)施例11"舊設(shè)計，，)。測量血漿膽固醇且在每個時間點(diǎn)上相對于鹽水組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(顯示平均值和SD，n-7，24小時n=10)。圖9.通過miR-122a的SPC3372抑制的劑量依賴性miR-122a靶mRNA誘導(dǎo)。小鼠如上文描述的用不同SPC3372劑量處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后24小時處死。對由肝提取的總RNA實(shí)施qPCR。具有預(yù)測的miR-122把位點(diǎn)且觀察到由微陣列分析上調(diào)的基因使用qPCR通過增加的SPC3372劑量就劑量依賴性誘導(dǎo)進(jìn)行研究。對于指示基因?qū)碜宰詈笠淮蝿┝亢?4小時處死的2-3只小鼠/組的總肝RNA實(shí)施qPCR。圖9中顯示的是相對于鹽水組的mRNA水平，n-2-3(2.5-12.5mg/kg/天n=2，無SD)。還顯示的是錯配對照(mm,SPC3373)。圖10.SPC3372處理后的miR-122a乾mRNA的瞬時誘導(dǎo)。服RI雌性小鼠用25mg/kg/天SPC3372連同鹽水對照處理連續(xù)3天，且分別在最后一次劑量后1、2或3周處死。RNA由肝提取，并且經(jīng)由qPCR研究通過微陣列數(shù)據(jù)選擇的預(yù)測miR-122a靶mRNA的mRNA水平。分析來自每個組的3個動物。圖ll.通過SPC3372處理在肝中的Vldlr的誘導(dǎo)。與先前實(shí)施例(圖10)中相同的肝RNA樣品就Vldlr誘導(dǎo)進(jìn)行研究。圖12.小鼠血漿中的miR-122a/SPC3372雙鏈體的穩(wěn)定性。SPC3372和SPC3372/miR-122a雙鏈體的穩(wěn)定性在小鼠血漿中于37t:經(jīng)過96小時進(jìn)行測試。圖12中顯示的是SYBR-Gold染色的PAGE。圖13.經(jīng)由SPC3372隔離成熟miR-122a導(dǎo)致雙鏈體形成。圖13中顯示的是由miR-122a特異性探針探測的(上圖)和由Let-7特異性探針重新探測的(下圖)膜。使用miR-122探針，可以檢測到2個條帶，一個對應(yīng)成熟miR-122和一個對應(yīng)SPC3372和miR-122之間的雙鏈體。圖14.通過肝切片的原位雜交評估的經(jīng)由SPC3372的miR-122a隔離連同SPC3372分布。來自處理動物的肝冷凍切片圖15.在miR-122LNA-抗miR處理的小鼠中的肝基因表達(dá)。鹽水和LNA-抗miR處理小鼠通過基因組廣泛表達(dá)譜使用AffymetrixMouseGenome4302.0陣列進(jìn)行比較。(a，1)顯示的是在處理后24小時LNA-抗miR-122處理的和鹽水處理的小鼠肝樣品中顯示差異表達(dá)的探針數(shù)目。(b，2)在差異表達(dá)基因中的miR-122種子序列的存在。曲線圖顯示在其UTR中具有至少一個ffliR-122種子識別序列的轉(zhuǎn)錄物百分比。隨機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)序列且搜索miR-122種子識別序列。在LNA-抗miR處理小鼠中的瞬間肝基因表達(dá)鐠。小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR或鹽水處理連續(xù)3天，且在最后一次劑量后l、2或3周處死。還包括的是來自最后一次劑量后24小時處死的動物的值。(c，3)還對來自不同時間點(diǎn)的RNA樣品實(shí)施表達(dá)分析。在處理后24小時、l周或3周LNA-抗miR和鹽水處理小鼠之間鑒定為差異表達(dá)的基因的表達(dá)鐠的分層聚類分析。(d,4)隨著時間過去跟蹤在處理后24小時LNA-抗miR和鹽水處理小鼠之間鑒定為差異表達(dá)的基因的表達(dá)譜。在LNA-抗miR處理小鼠方法1中隨著時間-過程上調(diào)和下調(diào)的基因的表達(dá)比，指出LM-抗miR處理的可逆效應(yīng)。圖16.用SPC3372和3595處理對小鼠肝中的miR-122水平的影響。圖17.用SPC3372和3595處理對小鼠肝中的醛縮酶A水平的影響。圖18.用SPC3372和3595處理對小鼠肝中的Bckdk水平的影響。圖19.用SPC3372和3595處理對小鼠肝中的CD320水平的影響。圖20.用SPC3372和3595處理對小鼠肝中的Ndrg3水平的影響。圖21.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長期處理對血漿總膽固醇的影響。血漿的每周樣品每周一次得自SPC3649處理和鹽水對照小鼠，隨后為血漿總膽固醇的評估。小鼠用5mg/kgSPC3649、SPC3744或鹽水每周處理2次。給出的正常小鼠進(jìn)行平行處理。圖22.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長期處理對miR-122水平的影響。圖23.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長期處理對醛縮酶A水平的影響。圖24.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長期處理對Bckdk水平的影響。圖25.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長期處理對AST水平的影響。圖26.在高膽固醇血癥和正常小鼠中用SPC3649長期處理對ALT水平的影響。圖27.在Huh-7細(xì)胞^^莫型中SPC3649對HCV復(fù)制的調(diào)節(jié)。在用不同LNA-抗miR(SPC3648、SPC3649和SPC3550)和2，OMeantago-mir-122分子轉(zhuǎn)染后在Huh-7細(xì)胞中的HCVRNA的RNA印跡分析(上圖)。定量雜交信號強(qiáng)度且相對于在每個泳道中的血影蛋白mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(下圖)。圖28.在內(nèi)源性表達(dá)miR-19b的細(xì)胞系HeLa中經(jīng)由miR-19b阻斷寡核苷酸對具有miR-19b靶的花蟲螢光素酶的功能去阻遏。"miR-19b靶，，是具有miR-19b靶但不與寡聚體阻斷miR-19b共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，且因此表示完全miR-19b阻遏的花蟲螢光素酶表達(dá)。圖29.在內(nèi)源性表達(dá)miR-122的細(xì)胞系Huh-7中經(jīng)由miR-122阻斷寡核苷酸對具有miR-122靶的花蟲安光素酶的功能去阻遏。"miR-122耙"是具有miR-122靶但不與寡聚體阻斷miR-122共轉(zhuǎn)染的相應(yīng)質(zhì)粒，且因此表示完全miR-122阻遏的花蟲螢光素酶表達(dá)。圖30.舉例說明根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸和微小RNA靶的比對的圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的寡核苷酸典型地是單鏈的。因此應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的背景中，術(shù)語寡核苷酸可以與術(shù)語單鏈寡核苷酸互換使用。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含與人微小RNA互補(bǔ)的長度為8-17個核苷酸堿基，例如10-17個核苷酸堿基的短(單鏈)寡核苷酸。短寡核苷酸在體內(nèi)減輕miRNA阻遏方面特別有效。發(fā)現(xiàn)將高親和力核苷酸類似物摻入寡核苷酸內(nèi)導(dǎo)致高度有效的抗微小RNA分子，其表現(xiàn)出經(jīng)由與微小RNA耙形成幾乎不可逆的雙鏈體來起作用，而不是基于RM切割的機(jī)制，例如與RNA酶H或RISC相關(guān)的機(jī)制。高度優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸包含與人微小RNA種區(qū)域100%互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸堿基序列的區(qū)域。優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸與成熟的人微小RM序列互補(bǔ)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的寡核苷酸與選自has-miR19b、hsa-miR21、hsa-miR122、hsa-miR142a7b、hsa-miR155、hsa-miR375的miRNA序列互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在3'末端上不包含對應(yīng)靼微小RNA的第1個5'末端核苷酸的核苷酸堿基。在一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第1個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，由3'末端計數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第2個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，由3'末端計數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第9個和/或第IO個核苷酸是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第9個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第IO個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的第9個和第10個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過5個連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過6個連續(xù)DM核苷酸單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過8個連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過3個連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過2個連續(xù)DM核苷酸單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少由至少2個連續(xù)核苷酸類似物單元例如至少2個連續(xù)LNA單元組成的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少由至少3個連續(xù)核苷酸類似物單元例如至少3個連續(xù)LNA單元組成的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過6個連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過5個連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過4個連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過3個連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LM單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不包含超過2個連續(xù)DNA核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸的第l或2個3'核苷酸堿基對應(yīng)微小RNA序列的第2個5'核苷酸。在一個實(shí)施方案中，如由單鏈寡核苷酸的區(qū)域3'末端測量的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基單元1-6(包括端點(diǎn)在內(nèi))與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，如由單鏈寡核苷酸的區(qū)域3'末端測量的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基單元1-7(包括端點(diǎn)在內(nèi))與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，如由單鏈寡核苷酸的區(qū)域3'末端測量的單鏈寡核苦酸的核苷酸堿基單元2-7(包括端點(diǎn)在內(nèi))與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域內(nèi)的位置中包含至少一個核苷酸類似物單元，例如至少一個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苦酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域內(nèi)的位置中可以包含1-6個或1-7個核苷酸類似物單元，例如1-6個和1-7個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自以3'-5'方向讀取的(X)Xxxxxx，(X)xXxxxx(X)xxXxxx，(X)xxxXxx，(X)xxxxXx和(X)xxxxxX，其中"X"指核苷酸類似物，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少2個核苷酸類似物單元，例如至少2個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，與miRNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX和(X)xxxxXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少3個核苷酸類似物單元，例如至少3個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX和(X)XxXxXx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRM種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少4個核苷酸類似物單元，例如至少4個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx和(X)XXXXxx，其中"X"指核普酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RM核苷酸單元在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少5個核苷酸類似物單元，例如至少5個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX和(X)XXXXXx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸在與邁iRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含6個或7個核苷酸類似物單元，例如6個或7個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX和XXXXXXx,其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，由單鏈寡核苷酸的3'末端計數(shù)，在第7-8位的兩個核苷酸堿基基序選自xx、XX、xX和Xx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，由單鏈寡核苷酸的3'末端計數(shù)，在第7-8位的兩個核苷酸堿基基序選自XX、xX和Xx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少12個核苷酸堿基，和其中由單鏈寡核苷酸的3，末端計數(shù)，在第11-12位的兩個核苷酸堿基基序選自xx、XX、xX和Xx,其中"X"指核苷酸類似物例如LM單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少12個核苷酸堿基，和其中由單鏈寡核苷酸的3，末端計數(shù)，在第11—12位的兩個核苷酸堿基基序選自XX、xX和Xx，其中"X"指核苷酸類似物例如LM單元，例如LNA單元，和"x，，指DM或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少13個核苷酸堿基，和其中由3，末端計數(shù)，在第11-13位的三個核苷酸堿基基序選自xxx、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，由單鏈寡核普酸的3'末端計數(shù)，在第11-lS位的三個核苦酸堿基基序選自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX,其中"X"指核普酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少14個核苷酸堿基，和其中由3，末端計數(shù)，在第11一14位的四個核苷酸堿基基序選自xxxx、Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX和XXXX，其中"X"指核普酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，由3'末端計數(shù)，在單鏈寡核苷酸的第ll-14位的四個核苷酸堿基基序選自Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX和XXXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RM核普酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含15個核苷酸堿基，和其中由3，末端計數(shù)，在第11-15位的五個核苷酸堿基基序選自Xxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX、XXXxx、XXxxX、XxxXX、xXXXx、xxXXX、XXxXX、XxXxX、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXXX、xXXXX和XXXXX,其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含16個核苷酸堿基，和其中由單鏈寡核苷酸的3，末端計數(shù)，在第11-16位的六個核苷酸堿基基序選自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX、xxxXXX、XXXXxx、XXXxxX、XXxxXX、XxxXXX、xxXXXX、xXxXXX、XxXxXX、XXxXxX、XXXxXx、xXXxXX、XxXXxX、XXxXXx、xXXXxX、XxXXXx、xXXXXx、xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX、XXXXXx和XXXXXX,其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LM單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)，在單鏈寡核苷酸的第11-16位的六個核苷酸堿基基序是xxXxxX,其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核普酸單元。在一個實(shí)施方案中，3個最5，末端的核苷酸堿基選自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LM單元，例如LM單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。在一個實(shí)施方案中，"x，，指DNA單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核普酸在5'末端包含核苷酸類似物單元例如LNA單元。在一個實(shí)施方案中，核苷酸類似物單元例如X獨(dú)立地選自2，-O-烷基-RNA單元、2，-OMe-RNA單元、2，-氨基-DNA單元、2，-氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HNA單元、IM單元。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的所有核苷酸堿基都是核苷酸類似物單元。在一個實(shí)施方案中，核苷酸類似物單元例如X獨(dú)立地選自2，-OMe-RNA單元、2，-氨基-DNA單元和LNA單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含所述至少一個LNA類似物單元和至少一個除LNA以外的其它核苷酸類似物單元。在一個實(shí)施方案中，非LNA核苷酸類似物單元獨(dú)立地選自2，-OMe-RNA單元和2，-氟-DM單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸由至少一個序列XYX或YXY組成，其中X是LNA和Y是2，-OMe-RNA單元或2，-氟-DNA單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列由交替的X和Y單元組成。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含交替的LM和DNA單元(Xx)或(xX)。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含交替LNA后接2個DNA單元的基序(Xxx)、xXx或xxX。在一個實(shí)施方案中，至少一個DNA或非LNA核苷酸類似物單元在選自上文提及的任何一個實(shí)施方案中鑒定為LNA核苷酸單元的位置的位置中由LNA核苷酸堿基替換。在一個實(shí)施方案中，"X"指LNA單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少2個核苷酸類似物單元，例如至少3個核苷酸類似物單元，例如至少4個核苷酸類似物單元，例如至少5個核苷酸類似物單元，例如至少6個核苷酸類似物單元，例如至少7個核苷酸類似物單元，例如至少8個核苷酸類似物單元，例如至少9個核苷酸類似物單元，例如至少IO個核苷酸類似物單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少2個LNA單元，例如至少3個LNA單元，例如至少4個LNA單元，例如至少5個LNA單元，例如至少6個LNA單元，例如至少7個LM單元，例如至少8個LNA單元，例如至少9個LNA單元，例如至少10個LNA單元。在一個實(shí)施方案中，其中至少一個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤，例如1-10個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤，例如2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥噪呤。在一個實(shí)施方案中，至少2個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實(shí)施方案中，至少3個核苷酸類似物例如LM單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實(shí)施方案中，至少4個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實(shí)施方案中，至少5個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實(shí)施方案中，至少6個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實(shí)施方案中至少7個核苷酸類似物例如LNA單元是胞嘧啶或鳥嘌呤。在一個實(shí)施方案中，至少8個核苷酸類似物例如LM單元是胞嘧啶或鳥噪呤。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸類似物與互補(bǔ)RNA核苷酸的熱雙鏈體穩(wěn)定性高于等同DNA核苷酸與所述互補(bǔ)RNA核苷酸的結(jié)合親和力。在一個實(shí)施方案中，核苷酸類似物對單鏈寡核苷酸賦予增強(qiáng)的血清穩(wěn)定性。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈RNA分子形成A-螺旋構(gòu)象。2個RNA分子之間的雙鏈體一般以A型構(gòu)象存在，而2個DM分子的雙鏈體一般以B型構(gòu)象存在。DM和RNA分子之間的雙鏈體一般以中間體構(gòu)象(A/B型)存在。核苷酸類似物例如p-D-氧LNA的使用可以用于促進(jìn)更A型樣構(gòu)象。標(biāo)準(zhǔn)圓二色(CD)或NMR分析用于測定本發(fā)明的寡核苷酸和互補(bǔ)RNA分子之間的雙鏈體的形成。因?yàn)榻?jīng)由RISC復(fù)合物的募集被認(rèn)為依賴miRNA/mRM靶的特定結(jié)構(gòu)構(gòu)象，所以在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以與互補(bǔ)RNA分子形成A/B型雙鏈體。然而，我們已測定促進(jìn)A型結(jié)構(gòu)的核苷酸類似物的使用也是有效的，例如LNA的oc-L異構(gòu)體。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈RNA分子形成A/B型構(gòu)象。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸與互補(bǔ)單鏈RNA分子形成A型構(gòu)象o在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸不介導(dǎo)對互補(bǔ)單鏈RNA分子的基于RNA酶H的切割。一般地一段至少5個(一般在RNA酶H募集方面無效)、更優(yōu)選至少6個、更優(yōu)選至少7個或8個連續(xù)DNA核苷酸堿基(或可以募集RNA酶H的備選核苷酸堿基，例如ocL-氨基LNA)是需要的，以使寡核苷酸在RNA酶H的募集中有效。EP1222309提供了用于測定RNA酶H活性的體外方法，其可以用于測定募集RNA酶H的能力。如果當(dāng)與互補(bǔ)RNA靶一起提供時，使用由EP1222309的實(shí)施例91-95提供的方法，它具有如以pmo1/1/分鐘測量的，至少1%、例如至少5%、例如至少10%或小于20%的等同僅DM寡核苷酸(不含2'取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之間具有磷酸二酯連接基團(tuán))的起始速率，則認(rèn)為化合物能夠募集RNA酶H。如果當(dāng)與互補(bǔ)RNA靶和RNA酶H—起提供時，使用由EP1222309的實(shí)施例91-95提供的方法，如以pmol/l/分鐘測量的RNA酶H起始速率小于1%、例如小于5%、例如小于10%或小于20%的使用等同僅DNA寡核苷酸測定的起始速率，所述寡核苷酸不含2'取代，在寡核苷酸的所有核苷酸之間具有磷酸二酯連接基團(tuán)，則認(rèn)為化合物基本上不能募集RNA酶H,。在一個高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子(一般為所述單鏈寡核苷酸的約相同長度)形成雙鏈體，其中雙鏈體具有至少約60C的L，事實(shí)上優(yōu)選單鏈寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，其中雙鏈體具有約70X:-約95t:的Tra，例如約70°C-約90匸的Tm,例如約70°C-約85'C的Tra。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈DNA核酸分子形成雙鏈體，其中雙鏈體具有約50X:-約95。C的i;，例如約50'C-約90匸，例如至少約55匸，例如至少約60匸，或不超過約95*C。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸可以具有14-16個核苷酸堿基，包括15個核苷酸堿基的長度。在一個實(shí)施方案中，LNA單元獨(dú)立地選自以D-P和L-oc構(gòu)型或其組合的氧-LM、硫代-LNA和氨基-LNA。在一個具體實(shí)施方案中，LNA單元可以是ENA分子。在一個實(shí)施方案中，LM單元是pD氧-LNA。在一個實(shí)施方案中，LNA單元是ot-L氨基LNA。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含3-17個LM單元。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少一個不同于磷酸酯的核苷間連接基團(tuán)。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵。在一個實(shí)施方案中，所有核苷間鍵都是硫代磷酸酯鍵。在一個實(shí)施方案中，單鏈寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷間在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的所有核苷間鍵都是在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含栽體例如鹽水或緩沖鹽水。在一個實(shí)施方案中，用于合成靶向針對人微小RNA的單鏈寡核苷酸的方法以3'-5'方向a-f來進(jìn)行。用于合成根據(jù)本發(fā)明的單鏈寡核苷酸的方法可以使用標(biāo)準(zhǔn)固相寡核香酸合成來進(jìn)行。可以與上述實(shí)施方案組合的本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案如權(quán)利要求中顯示且在標(biāo)題'進(jìn)一步的實(shí)施方案，下。定義術(shù)語'核苷酸堿基，指核苷酸，例如DNA和RNA，和核苷酸類似物。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"寡核苷酸"(或簡單地"寡聚體")指由2個或更多核苷酸堿基的共價鍵形成的分子。當(dāng)在本發(fā)明的寡核苷酸(也稱為單鏈寡核苷酸)的背景中使用時，在一個實(shí)施方案中，術(shù)語"寡核苷酸，，可以具有例如8-26個核苷酸堿基，例如10-26個核苷酸堿基，例如12-26個核苷酸堿基。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，如本文詳述的，本發(fā)明的寡核普酸具有8-17個核普酸堿基，例如20-27個核苷酸堿基例如8-16個核苷酸堿基，例如12-15個核苷酸堿基的長度。在一個此類實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸可以具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個核苷酸堿基的長度。應(yīng)認(rèn)識到對于較短的寡核苷酸，可能必須增加(高親和力)核普酸類似物例如LNA的部分。因此，在一個實(shí)施方案中，至少約30%的核苷酸堿基是核苷酸類似物，例如至少約33%、例如至少約40%、或至少約50%或至少約60%、例如至少約66%、例如至少約70%、例如至少約80%、或至少約90%。還將顯而易見的是寡核苷酸可以包含僅由核苷酸類似物序列組成的核苷酸堿基序列。在本文中，術(shù)語"含氮堿基"意欲涵蓋噪呤和嘧啶，例如DM核苷酸堿基A、C、T和G，RNA核苷酸堿基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核苷酸堿基，例如5-甲基胞嘧啶(MeC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤，特別是，。應(yīng)當(dāng)理解非DNA/RNA核苷酸堿基的實(shí)際選擇將依賴寡核苷酸意欲粑向的微小RNA鏈中存在的相應(yīng)(或匹配)核苷酸。例如，在相應(yīng)的核苷酸是G的情況下，通常必須選擇能夠與G建立氫鍵的非DNA/RNA核苷酸堿基。在這種具體情況下，當(dāng)相應(yīng)的核苷酸是G時，優(yōu)選的非DNA/RNA核苷酸堿基的一般例子是^C。術(shù)語"核苷間連接基團(tuán)"意指能夠使2種核苷酸堿基共價偶聯(lián)在一起的基團(tuán)，例如在DNA單元之間，在DM單元和核苷酸類似物之間，在2個非LNA單元之間，在非LNA單元和LNA單元之間，和在2個LNA單元之間等。優(yōu)選例子包括磷酸酯、磷酸二酯基團(tuán)和硫代磷酸酯基團(tuán)。核苷間鍵可以選自-0-P(0)2-0-、-0-P(0，S)-0-、-0-P(S)2-0-、-S—P(0)廣O一、—S-P(O，S)—O-、-S-P(S)2-0—、-O一P(0)2-S-、-O-P(0，S)-S-、-S-P(0)2-S-、-0-PO(RH)-O-、0-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-0-、-0-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-0-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(0)2-NRH-、-NRH-P(0)2-0-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-，和/或核苷間鍵可以選自-O-CO-O-、-0-CO-NRH-、-NRh-CO-CH2-、-0-CH2-CO-NRH-，-0-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-CO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-0-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S02-CH2-、-CH2-C0-NRH-、-0-CH2-CH2-NRH-C0-、-CH2-NCH3-0-CH2-，其中RH選自氬和d-廣烷基。適當(dāng)?shù)?，在某些?shí)施方案中，如上文提供的含硫(S)核苷間鍵可以是優(yōu)選的。如在寡核苷酸的上下文中使用的，術(shù)語"對應(yīng)/相應(yīng)"指本發(fā)明的化合物的核苷酸堿基序列及其反向互補(bǔ)物之間的比較，或在一個實(shí)施方案中，在核苷酸堿基序列和等同(相同)核苷酸堿基序列之間，所基序列或其互補(bǔ)物。核苷酸類似物與其等同或相應(yīng)的天然核苷酸直接比較。形成序列的反向互補(bǔ)物的序列稱為序列的互補(bǔ)序列。當(dāng)提及如本文提及的核苷酸分子的長度時，該長度對應(yīng)單體單元即核苷酸堿基的數(shù)目，與那些單體單元是核苷酸還是核苷酸類似物無關(guān)。就核苷酸堿基而言，術(shù)語單體和單元在本文中可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)術(shù)語"約"在具體值或值范圍的背景中使用時，公開內(nèi)容應(yīng)包括提及的具體值或范圍。優(yōu)選的DNA類似物包括其中2'-H基團(tuán)由除-0H(RNA)外的取代進(jìn)行取代的DNA類似物，例如通過用-O-CH3、-0-CH2-CH2-0-CH3、-0-CH2-CH2-CH2-NH2、-0-CH2-CH2-CH2-OH或-F取代。優(yōu)選的RNA類似物包括已在其2'-0H基團(tuán)中進(jìn)行修飾的RNA類似物，例如通過用除-OH(RNA)外的基團(tuán)取代，例如-0-CH3、-0-CH2-CH2-0-CH3、-0-CH2-CH2-CH2-NH2、-0-CH2-CH2-CH2-OH或-F。在一個實(shí)施方案中，核苷酸類似物是"ENA"。當(dāng)在本文背景中使用時，術(shù)語"LNA單元"、"LNA單體，，、"LNA殘基"、"鎖定核酸單元"、"鎖定核酸單體"或"鎖定核酸殘基"指二環(huán)核普類似物。LNA單元特別在WO99/14226、WO00/56746、WO00/56748、W001/25248、W002/28875、W003/006475和W003/095467中得到描述。LNA單元還可以就其化學(xué)式而言進(jìn)行定義。因此，如本文所使用的，"LNA單元"具有下文方案1中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu):方案1其中X選自O(shè)、S和NRH，其中RH是H或d—4-烷基；Y是(-ClUr，其中r是l-4的整數(shù)；和B是含氮堿基。當(dāng)在本發(fā)明的背景中提及由其相應(yīng)的LNA取代DNA單元時，術(shù)語"相應(yīng)的LNA單元"意指DNA單元已由包含與其已替換的DNA單元相同的含氮堿基的LNA單元進(jìn)行替換，例如包含含氮堿基A的DNA單元的相應(yīng)LNA單元也包含含氮堿基A。例外是當(dāng)DNA單元包含堿基C時，相應(yīng)的LNA單元可以包含堿基C或堿基MeC，優(yōu)選MeC。在本文中，術(shù)語"非LNA單元"指不同于LNA單元的核苷，即，術(shù)語"非LM單元"包括DNA單元以及RNA單元。優(yōu)選的非LNA單元是DNA單元。術(shù)語"單元，，、"殘基，，和"單體"在本文中可互換使用。在本文背景中，術(shù)語"綴合物"意指通過使如本文描述的寡核普酸與一個或多個非核苷酸或非多核苷酸部分的共價連接而形成的異質(zhì)分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的例子包括大分子試劑例如蛋白質(zhì)、脂肪酸鏈、糖殘基、糖蛋白、聚合物、或其組合。一般地蛋白質(zhì)可以是對于靶蛋白的抗體。典型的聚合物可以是聚乙二醇。術(shù)語"至少一個"包含大于或等于l的整數(shù)，例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。術(shù)語"一"如關(guān)于核苷酸、試劑、LNA單元等使用時，意指一個或多個。特別地，表達(dá)"選自……的組分(例如核苷酸、試劑、LNA單元等)"意指可以選擇一個或多個所述組分。因此，表達(dá)如"選自A、B和C的組分"意欲包括A、B和C的所有組合，即，A、B、C、A+B、A+C、B+C和A+B+C。術(shù)語"硫代-LNA單元"指其中方案1中的X是S的LNA單元。硫代LNA單元可以是P-D型和ot-L型。一般地，硫代-LM單元的P-D型是優(yōu)選的。硫代-LNA單元的D型和oc-L型在方案3中分別顯示為化合物3A和3B。術(shù)語"氨基-LNA單元，，指其中方案1中的X是NH或NRH的LNA單元，其中RH是氫或d-廣烷基。氨基-LNA單元可以是P-D型和ct-L型。一般地，氨基-LNA單元的p-D型是優(yōu)選的。氨基-LNA單元的D型和a-L型在方案4中分別顯示為化合物4A和4B。術(shù)語"氧-LNA單元，，指其中方案1中的X是O的LNA單元。氧-LNA單元可以是P-D型和ct-L型。一般地，氧-LM單元的^-D型是優(yōu)選的。氧-LNA單元的P-D型和ot-L型在方案5中分別顯示為化合物5A和5B。在本文背景中，術(shù)語"d—6-烷基"意指線性或分支飽和烴鏈，其中最長的鏈具有1-6個碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基和己基。分支烴鏈意指在任何碳上由烴鏈取代的CH-烷基。在本文背景中，術(shù)語"Cw-烷基"意指線性或分支飽和烴鏈，其中最長的鏈具有1-4個碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。分支烴鏈意指在任何碳上由烴鏈取代的Ch-坑基。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語"C卜6-烷氧基"意指Ch-烷基-氧，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、異戊氧基、新戊氧基和己氧基。在本文背景中，術(shù)語"Ch-彿基"意指具有2-6個碳原子且包含一個或多個雙鍵的線性或分支烴基團(tuán)。Cw-烯基的舉例說明性例子包括烯丙基、高-烯丙基、乙烯基、巴豆基、丁烯基、丁二烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基和己二烯基。不飽和(雙鍵)的位置可以在沿著碳鏈的任何位置上。在本文背景中，術(shù)語"C2-6-炔基"意指具有2-6個碳原子且包含一個或多個三鍵的線性或分支烴基團(tuán)。CH-炔基的舉例說明性例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。不飽和(三鍵)的位置可以在沿著碳鏈的任何位置上。超過一個鍵可以是這樣不飽和的，使得"Cw-炔基"是如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的二炔或烯二炔(enedi-yne)。如本文所使用的，"雜交"意指在互補(bǔ)的核苷或核苷酸堿基之間的氬鍵合，其可以是沃森-克里克、Hoogsteen、可逆的Hoogsteen氫鍵合等。通常在DNA中發(fā)現(xiàn)的4個核苷酸堿基是G、A、T和C,其中G與C配對，和A與T配對。在RM中，T由尿嘧咬(U)替換，這隨后與A配對。參與標(biāo)準(zhǔn)雙鏈體形成的核苷酸堿基中的化學(xué)基團(tuán)構(gòu)成沃森-克里克面。Hoogsteen在2年后顯示嘌呤核苷酸堿基(G和A)除其沃森-克里克面外還具有Hoogsteen面，其可以由雙鏈體的外面識別，并且用于經(jīng)由氫鍵合結(jié)合嘧啶寡核苷酸，由此形成三螺旋結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的背景中，"互補(bǔ)性"指2個核苷酸序列彼此之間用于精確配對的能力。例如，如果在寡核苷酸的某一位置上的核苷酸能夠與在DNA或RNA分子的相應(yīng)位置上的核苷酸氫鍵合，那么寡核苷酸和DNA或RNA被認(rèn)為在那個位置上彼此互補(bǔ)。當(dāng)寡核苷酸中足夠數(shù)目的核苷酸可以與靶DNA或RNA中的相應(yīng)核苷酸形成氫鍵合以使得能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物時，DNA或RM鏈被認(rèn)為彼此互補(bǔ)。為了在體外或體內(nèi)穩(wěn)定，寡核苷酸的序列無需與靶微小RNA100%互補(bǔ)。術(shù)語"互補(bǔ)性"和"可特異性雜交"因此暗示寡核苷酸與靶分子足夠強(qiáng)烈和特異的結(jié)合，以提供對于靶的正常功能的所需干擾，同時使得非靶RNA的功能不受影響。在一個優(yōu)選例子中，本發(fā)明的寡核苷酸與人微小RNA序列，例如本文提及的微小RNA序列之一100%互補(bǔ)。在一個優(yōu)選例子中，本發(fā)明的寡核苷酸包含與人微小RNA序列的種區(qū)域100%互補(bǔ)的連續(xù)序列。微小RM是衍生自內(nèi)源基因的短的、非編碼RNA，所述內(nèi)源基因充當(dāng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。它們通過RNA酶III酶Dicer由稱為前miRNA的更長的(約70-80nt)發(fā)夾樣前體進(jìn)行加工。微小RNA在稱為miRNPs的核糖核蛋白復(fù)合物中裝配且通過反義互補(bǔ)性識別其耙位點(diǎn)，由此介導(dǎo)其把基因的下調(diào)。在miRNA及其把位點(diǎn)之間接近完全或完全的互補(bǔ)性導(dǎo)致靶mRNA切割，而微小RNA和靶位點(diǎn)之間有限的互補(bǔ)性導(dǎo)致靶基因的翻譯抑制。在本發(fā)明的背景中的術(shù)語"微小RNA，，或"miRNA"意指由18-25個核苷酸組成的RNA寡核苷酸。在功能術(shù)語中，miRNA—般是調(diào)節(jié)性內(nèi)源RM分子。術(shù)語"耙微小RNA"或"耙miRNA"或"miRNA乾，，指在人疾病中具有生物作用的微小RNA，例如在癌癥中上調(diào)的、致癌miRNA或肺瘤抑制miRNA，從而是用于所述疾病的治療干預(yù)的耙。術(shù)語"靶基因"或"靶mRNA"指微小RNA的調(diào)節(jié)mRNA耙，其中基于miRNA及其靼位點(diǎn)之間接近完全或完全的互補(bǔ)性，所述"乾基因"或"靶mRNA"由微小RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，導(dǎo)致靶mRNA切割；或有限的互補(bǔ)性，通常賦予所謂的種子序列(miRNA的核苷酸2-7)和耙位點(diǎn)之間的互補(bǔ)性，導(dǎo)致耙mRNA的翻譯抑制。在本發(fā)明的背景中，寡核苷酸是單鏈的，這指其中寡核苷酸在不存在互補(bǔ)寡核苷酸的情況，即它不是雙鏈寡核苷酸復(fù)合物，例如siRNA。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物不包含進(jìn)一步的寡核苷酸，其與5個或更多連續(xù)核苷酸堿基的單鏈寡核苦酸具有互補(bǔ)性的區(qū)域，例如8個或更多，或12個或更多連續(xù)核苷酸堿基。認(rèn)為進(jìn)一步的寡核苷酸不與單鏈寡核苷酸共價連接。本發(fā)'銀慕裙茅凝盡管LNA單元和非LNA單元可以以眾多方式進(jìn)行組合以形成寡核香酸，但本發(fā)明的發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，特定核心DNA序列和所述DNA序列中LNA單元的特定存在導(dǎo)致對微小RNA的特別高的抑制。在本發(fā)明的寡核苷酸的所述核心序列中LM單元的這種存在使得所述寡核苷酸高度抵抗核酸酶。核心序列外的核苷酸可以是LNA單元和/或非LM單元。在一個實(shí)施方案中，核心序列外的非LNA單元是DNA單元。核心序列為了使本發(fā)明的反義寡核苷酸盡可能有效地抑制其靶微小RNA,在本發(fā)明的反義寡核苷酸和相應(yīng)的靶微小RNA之間需要存在一定程度的互補(bǔ)性。對于本發(fā)明的寡核苷酸特別重要的是與相應(yīng)的靶微小RNA由5'末端計數(shù)的第3-8位互補(bǔ)。在某些靶微小RNA中由5'末端計數(shù)的核苷酸l是非配對堿基，并且最可能隱藏在Ago2蛋白質(zhì)的結(jié)合袋中。因此，本發(fā)明的寡核苷酸在由3'末端計數(shù)的第l位中可以具有或不具有核苷酸，其對應(yīng)相應(yīng)的靶微小RNA由5'末端計數(shù)的核苷酸1。在某些情況下，相應(yīng)的靶微小RNA由5'末端計數(shù)的前2個核苷酸可以是不匹配的。本發(fā)明的寡核苷酸的核心序列因此是由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位的DNA序列，對應(yīng)相應(yīng)的靶^U、RNA由5,末端計數(shù)的第3-8位。miR-19b一種特定靶微小RNA稱為miR-19b。由5'末端計數(shù)的第3-8位的miR-19b的序列是ugcaaa(參見GenBank基因座AJ421740和AJ421739)。相應(yīng)的DNA序列是acgttt。本發(fā)明的發(fā)明人已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)為了使對靶微小RNA的抑制達(dá)到最大，本發(fā)明的寡核苷酸在其核心序列中必須包含至少一個LNA單元。因此，本發(fā)明的第一個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，例如長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，具有由3，末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位，優(yōu)選第2-7位或第3-8位的DNA序列acgttt(SEQIDNO6)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。與靼微小RNA進(jìn)一步的核苷酸的互補(bǔ)性可以增強(qiáng)對所述靶微小RNA的抑制。因此，一個實(shí)施方案是如上所述的寡核苷酸，具有包含由3,末端計數(shù)第1-7位、笫2-8位或第3-9位，優(yōu)選第2-8位或第3-9位的DNA序列acgttta，(SEQIDNO70)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DM單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3'末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或笫3-10位，優(yōu)選第2-9位或第3-10位的DNA序列acgtttag，(SEQIDNO71)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另外一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位，優(yōu)選第2-10位或第3-11位的DNA序列:acgtttagg，(SEQIDNO72)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。miR-122a另一種有利的乾微小RNA是miR-122a。由5'末端計數(shù)第3-8位的miR-122a的序列是gagugu(參見miRBase條目HGNC:MIRN122A)。相應(yīng)的DNA序列是ctcaca。因此，本發(fā)明的第二個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，例如長度為12—26個核苷酸的寡核苷酸，具有由3，末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位，優(yōu)選第2-7位或第3-8位的DM序列ctcaca，(SEQIDNO7)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。一個實(shí)施方案涉及如上所述的miR-122aantagomir寡核苷酸，具有由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位，優(yōu)選第2-8位或第3-9位的DNA序列ctcacac，(SEQIDNO73)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位，優(yōu)選第2-9位或第3-10位的DNA序列:ctcacact，(SEQIDNO74)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另外一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位，優(yōu)選第2-10位或第3-11位的DNA序列ctcacactg，(SEQIDNO75)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。miR-155另一種有利的靶微小RNA是miR-155。由5'末端計數(shù)第3-8位的miR-155的序列是aaugcu(參見miRBase條目HGNC:MIRN155)。相應(yīng)的DNA序歹iJ是ttacga。因此，本發(fā)明的第三個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，例如長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，具有由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位，優(yōu)選第2-7位或第3-8位的DNA序列ttacga，(SEQIDNO8)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。在一個實(shí)施方案中，如上所述的miR-155antagomir寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位，優(yōu)選第2-8位或第3-9位的DNA序列ttacgat，(SEQIDNO76)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)笫1-8位、第2-9位或第3-10位，優(yōu)選第2-9位或第3-10位的DNA序列ttacgatt，(SEQIDNO77)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另外一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3'末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位，優(yōu)選第2-10位或第3-11位的DNA序列ttacgatta，(SEQIDNO78)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。miR-375另外一種有利的靶微小RNA是miR-375。由5'末端計數(shù)第3-8位的miR-375的序列是uguucg(參見miRBase條目HGNC:MIRN375)。相應(yīng)的DNA序列是acaagc。因此，本發(fā)明的第四個方面涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，例如長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，具有由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位，優(yōu)選第2-7位或第3-8位的DNA序列acaagc，(SEQIDNO9)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。在一個實(shí)施方案中，如上所述的miR-375antagomir寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位，優(yōu)選第2-8位或第3-9位的DNA序列acaagca，(SEQIDNO79)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位，優(yōu)選第2-9位或第3-10位的DNA序列:acaagcaa，(SEQIDNO80)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DM單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。在另外一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位，優(yōu)選第2-10位或第3-11位的DNA序列acaagcaag，(SEQIDNO81)其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。核心序列中的核苷酸的修飾如上所述，在本發(fā)明的寡核苷酸的核心序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。本發(fā)明人已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)對靶微小RM的抑制可以通過確保所述核心序列中的2個LNA單元由至少一個DNA單元分隔開得到進(jìn)一步增加。因此，本發(fā)明的一個實(shí)施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位，優(yōu)選第2-7位或第3-8位的至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。本發(fā)明人也已發(fā)現(xiàn)對靼微小RNA的抑制可以通過確保核心序列中的2個LNA單元由至多2個DNA單元分隔開得到再進(jìn)一步增加。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位，優(yōu)選第2-7位或第3-8位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。所述發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于核心序列其本身，即該發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于對應(yīng)核心序列的本發(fā)明的寡核苷酸的位置。因此，另一個實(shí)施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位，優(yōu)選第2-8位或第3-9位的至少2個，例如2個、3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位，優(yōu)選第2-8位或第3-9位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。另外一個實(shí)施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位，優(yōu)選第2-9位或第3-10位的至少2個，例如2個、3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第l-8位、第2-9位或第3-10位，優(yōu)選第2-9位或第3-10位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。另外一個實(shí)施方案涉及如上所述的寡核普酸，其中由3'末端計數(shù)第1-9位、第2-IO位或第3-ll位，優(yōu)選第2-IO位或第3-11位的至少2個，例如2個、3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DM單元分隔開。再進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及如上所述的寡核苷酸，其中由3，末端計數(shù)第l-9位、第2-10位或第3-11位，優(yōu)選第2-10位或第3-11位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。核心序列外的核苷酸的修飾如上所述，核心序列外的核苷酸可以是LNA單元和/或非LNA單元。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的寡核苷酸，其中核心序列外的LNA單元的數(shù)目為至少一個，例如1個、2個、3個和4個，和其中所述LNA單元由至少一個非LNA單元分隔開。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核心序列外的置換方式是這樣的，使得核心序列外的連續(xù)非LNA單元的數(shù)目為至多2個。由3'末端計數(shù)，在第3-8位中的核苷酸的修飾。在涉及由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的修飾的下述實(shí)施方案中，LNA單元可以由其他核苷酸類似物，例如本文提及的那些進(jìn)行替換。因此，"X"可以選自2，-0-烷基-RNA單元、2，-0Me-RNA單元、2，-氨基-DNA單元、2，-氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HNA單元、INA單元。"x"優(yōu)選是DNA或RNA，最優(yōu)選DNA。在本發(fā)明的一個有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸在由3'末端計數(shù)第3-8位中進(jìn)行修飾。這種序列的設(shè)計可以由存在的非LNA單元的數(shù)目或由存在的LNA單元的數(shù)目進(jìn)行定義。在前者的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第3-8位中的至少一個，例如l個核苷酸是非LNA單元。在另一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第3-8位中的至少2個，例如2個核苷酸是非LNA單元。在另外一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第3-8位中的至少3個，例如3個核苷酸是非LNA單元。在另外一個實(shí)施方案中，由3'末端計數(shù)第3-8位中的至少4個，例如4個核苷酸是非LNA單元。在另一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第3-8位中的至少5個，例如5個核苷酸是非LNA單元。在另一個實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第3-8位中的所有6個核苷酸都是非LNA單元。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述非LNA單元是DNA單元。備選定義的，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含至少一個LM單元。在其一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含1個LNA單元。在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx和xxxxxX,其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含至少2個LNA單元。在其一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3'末端計數(shù)第3-8位中包含2個LNA單元。在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX和xxxxXX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX和xxxXxX，其中"X"指LM單元，和"x"指非LNA單元。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX和xxxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自xXxXxx、xXxxXx和xxXxXx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式是xXxXxx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在另外一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含至少3個LNA單元。在其一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含3個LNA單元。在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自XXXxxx、xXXXxx、xxXXXx、xxxXXX、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中"X"指LM單元，和"x"指非LNA單元。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選白XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX和xXxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式是xXxXxX或XxXxXx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LM單元。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在由3'末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式是xXxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含至少4個LM單元。在其一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含4個LM單元。在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自xxXXXX、xXxXXX、xXXxXX、xXXXxX、xXXXXx、XxxXXX、XxXxXX、XxXXxX、XxXXXx、XXxxXX、XXxXxX、XXxXXx、XXXxxX、XXXxXx和XXXXxx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在一個再進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3'末端計數(shù)第3-8位中包含至少5個LNA單元。在其一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3'末端計數(shù)第3-8位中包含5個LNA單元。在由3，末端計數(shù)第3-8位中的核苷酸的置換方式可以選自xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX和XXXXXx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由3，末端計數(shù)第3-8位中包含1個或2個LNA單元。這對于由寡聚體微小RM雙鏈體(在結(jié)構(gòu)上類似RNA:RNA雙鏈體的雙鏈體)形成的A螺旋的穩(wěn)定性被認(rèn)為是有利的。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述非LNA單元是DNA單元。寡核苷酸長度的變化本發(fā)明的寡核苷酸的長度無需確切匹配靶微小RNA的長度。事實(shí)上具有短寡核苷酸，例如10—17個或10—16個核苷酸堿基被認(rèn)為是有利的。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有8-24個核苷酸的長度，例如10-24個，12-24個核苷酸，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸的長度，優(yōu)選10-22個，例如12-22個核苷酸的長度，例如IO、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個核苷酸的長度，更優(yōu)選10-20個，例如12-20個核苷酸的長度，例如IO、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸的長度，更加優(yōu)選10-19個，例如12-19個核苷酸的長度，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個核苷酸的長度，例如10-18個，例如12-18個核苷酸的長度，例如IO、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸的長度，更優(yōu)選10-17個，例如12-17個核苷酸的長度，例如IO、11、12、13、14、15、16或17個核苷酸的長度，更優(yōu)選10-16個，例如12-16個核苷酸的長度，例如IO、11、12、13、14、15或16個核苷酸的長度。由3'末端向5'末端計數(shù)，從第ll位開始的核苷酸的修飾由3'末端向5'末端計數(shù)，從第ll位開始的核苷酸的置換方式可以包括核苷酸類似物單元(例如LNA)或可以不包括。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含由3'末端向5'末端計數(shù)，從第11位開始的至少一個核苷酸類似物單元(例如LNA)，例如l個核苷酸類似物單元。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含由3'末端向5'末端計數(shù)，從第11位開始的至少2個核苷酸類似物單元(例如LNA)，例如2個核苷酸類似物單元。在涉及從寡核苷酸的第11位到5，末端的核苷酸堿基中的核苷酸的修飾的下述實(shí)施方案中，LNA單元可以由其他核苷酸類似物，例如本文提及的那些進(jìn)行替換。因此，"X"可以選自2，-O-烷基-RM單元、2，-OMe-RNA單元、2，-氨基-DNA單元、2，-氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HNA單元、IM單元。"x，，優(yōu)選是DNA或RNA，最優(yōu)選醒。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有下述置換方式，其由從3'末端向5'末端計數(shù)的核苷酸11開始重復(fù)xXxX或XxXx，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LM單元。在另一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有下述置換方式，其由從3'末端向5'末端計數(shù)的核苷酸11開始重復(fù)XxxXxx、xXxxXx或xxXxxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在另外一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有下述置換方式，其由從3'末端向5'末端計數(shù)的核苷酸ll開士會重復(fù)XxxxXxxx、xXxxxXxx、xxXxxxXx或xxxXxxxX,其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。由3'末端向5'末端計數(shù)，從第ll位開始的核苷酸的具體置換方式取決于根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸中的核苷酸的數(shù)目。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含12個核苷酸，和由3，末端計數(shù)第11-12位的置換方式選自xX和Xx，其中"X"指LM單元，和"x"指非LNA單元。在其一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-12位的置換方式是xX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。備選地，無LNA單元存在于由3'末端計數(shù)第11-12位中，即置換方式是xx。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含13個核苷酸，和由3，末端計數(shù)第11-13位的置換方式選自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-13位的置換方式選自xXx、xxX和xXX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在其一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-13位的置換方式是xxX,其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。備選地，無LNA單元存在于由3，末端計數(shù)第11-13位中，即置換方式是XXXo在另外一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含14個核苷酸，和由3，末端計數(shù)第11-14位的置換方式選自Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX和xxXX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LM單元。在其一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3'末端計數(shù)第11-14位的置換方式是xXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。備選地，無LNA單元存在于由3，末端計數(shù)第11-14位中，即置換方式是xxxx。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含15個核苷酸，和由3'末端計數(shù)第11-15位的置換方式選自Xxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX和XxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個優(yōu)選實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-15位的置換方式選自xxXxx、XxXxx、XxxXx、xXxXx、xXxxX和xxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-15位的置換方式選自xxXxx、xXxXx、xXxxX和xxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-15位的置換方式選自xXxxX和xxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-15位的置換方式是xxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。備選地，無LNA單元存在于由3，末端計數(shù)第11-15位中，即置換方式是xxxxx。在一個再進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含16個核苷酸，和由3，末端計數(shù)第11-16位的置換方式選自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX和xxxXXX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個優(yōu)選實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-16位的置換方式選自XxxXxx、xXxXxx、xXxxXx、xxXxXx、xxXxxX、XxXxXx、XxXxxX、XxxXxX、xXxXxX、xXxxXX和xxXxXX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。在其一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-16位的置換方式選自xXxXxx、xXxxXx、xxXxXx、xxXxxX、xXxXxX、xXxxXX和xxXxXX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在其一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-16位的置換方式選自xxXxxX、xXxXxX、xXxxXX和xxXxXX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在其一個更加優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-16位的置換方式選自xxXxxX和xXxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。在其一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，由3，末端計數(shù)第11-16位的置換方式是xxXxxX,其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。備選地，無LNA單元存在于由3，末端計數(shù)第11-16位中，即置換方式是xxxxxx。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在5'末端包含LNA單元。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸在由5'末端計數(shù)的前2個位置上包含LNA單元。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含13個核苷酸，和從3'末端開始的置換方式是XXxXxXxxXXxxX，其中"X"指LNA單元，和"x，，指非LNA單元。關(guān)于這個實(shí)施方案從3'末端開始的優(yōu)選序列是CCtCaCacTGttA，其中大寫字母指LNA單元中的含氮堿基，和小寫字母指非LNA單元中的含氮堿基。在另一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含15個核苷酸，和從3'末端開始的置換方式是XXxXxXxxXXxxXxX，其中"X"指LNA單元，和"x"指非LNA單元。關(guān)于這個實(shí)施方案從3'末端開始的優(yōu)選序列是CCtCaCacTGUAcC，其中大寫字母指LNA單元中的含氮堿基，和小寫字母指非LNA單元中的含氮堿基。核苷間連接基團(tuán)的修飾寡核苷酸中的典型核苷間連接基團(tuán)是磷酸基，但這些可以由不同于磷酸酯的核苷間連接基團(tuán)替換。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步有利的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸在其核苷間連接基團(tuán)結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾，即經(jīng)修飾的寡核苷酸包含不同于磷酸酯的核苷間連接基團(tuán)。因此，在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸包含至少一個不同于磷酸酯的核苦間連接基團(tuán)的具體例子(-0-P(0)2-0-)包括-O-P(O，S)-0-、-0-P(S)2-0-、-S-P(0)廣0-、-S-P(O，S)-0-、-S-P(S)2-0-、-O-P(0)2-S-、-O-P(0，S)-S-、-S-P(0)廣S-、-0-P0(RH)-0-、O-PO(OCH3)-0-、-O-PO(nrh)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-0-、-O-PO(BH3)-0-、-O-PO(NHRH)-o-、-o-p(o)-nrh-、-nrh-p(o)2-0-、-nrh-co-o-、-nrh-co-nrh-、-O-CO-O-、-O-CO-nrh-、-nrh-CO-CH廣、-0-CH2-C0-NRH-、-O-CH廣CH廣NRH-、-C0-NRH-CH2-、-CH2-NRH-C0-、-0-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-0-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S02-CH2-、-CH2-C0-NRH-、-0-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-0-CH廠，其中rh是氫或d-4-烷基。當(dāng)核苷間連接基團(tuán)被修飾時，核苷間連接基團(tuán)優(yōu)選是硫代磷酸酯基團(tuán)(-0-P(O，S)-0-)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的所有核苷間連接基團(tuán)都是硫代磷酸酯。關(guān)于具體微小RM的設(shè)計下表提供了如與現(xiàn)有技術(shù)類型的分子比較根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的例子，例如用于藥物組合物中的那些。輩巴hsa-miR-122aMIMAT0000421SEQIDuggagugugacaaugguguuuguSEQIDNO1在表達(dá)miR-122的HUH-7細(xì)胞系中篩選寡聚體#,靶微小RNA，寡聚體序列3962:miR-1225'-ACAAacaccattgtcacacTCCA-3'3965:miR-1225'-acaaacACCATTGTcacactcca-3'3972:miR-1225'-acAaaCacCatTgtCacActCca-3'3549(3649):miR-1225'-CcA"GTcaCaCtCC-3'3975:miR-122-CcAtTGTcaCACtCC-3'3975':miR-1225'-ATTGTcACACtCC-3'ED-13聚體3975'':miR-122-TGTcACACtCC-3'ED_11聚體3549，(3649):miR-1225'CCMATTGTCMAMCAMCTMCC-3'3549，'(3649):miR-1225'CCFATFTFGTCFAFCAFCTFCC-3'設(shè)計完全互補(bǔ)物，缺口SEQIDNO11完全互補(bǔ)物，阻斷SEQIDNO12SEQIDNO13SE(JIDNO14SEQIDNO15SEQIDNO16SEQIDNO17SEQIDNO18SEQIDNO19完全互補(bǔ)物，LNA一3新設(shè)計增強(qiáng)的新設(shè)計新設(shè)計-2，MOE新設(shè)計-2'氟乾hsa-miR-19bMIMAT0000074ugugcaaauccaugcaaaacuga在表達(dá)miR-19b的HeLa細(xì)胞系中篩選寡聚體#，靶微小RNA,寡聚體序列3963:miR-19b5'-TCAGttttgcatggatttgCACA-3'3967:miR-19b5'-tcagttTTGCATGGatttgcaca-3'SEQIDNO2設(shè)計完全互補(bǔ)物，缺口SEQIDNO20完全互補(bǔ)物，阻斷SEQIDNO213973:miR-19b完全互補(bǔ)物，SEQ5'-tcAgtTttGcaTggAttTgcAca-3'LNA—3223560:miR-19b新設(shè)計SEQ5'-TgCatGGatTtGcAC-3'233976:miR-19b增強(qiáng)的新設(shè)計SEQ5'-TgCaTGGatTTGcAC-3'243976，miR-19bED-13聚體SEQ5'-CaTGGaTTTGcAC-3'253976，，miR-19bED—11聚體SEQ5'-TGGaTTTGcAC-3'263560，miR-19b5'新i殳計-2，MOESEQTGMCATGGAMTMTTMGCMAC-3'273560，，miR-19b新設(shè)計-2，MOESEQ5'-TGFCAFfGGAFTFTTFGCFAC-3'28耙:hsa-miR-155MIMAT0000646uuaaugcuaaucgugauaggggSEQ在表達(dá)miR-155的518A2細(xì)胞系中篩選寡聚體#,靶微小RNA，寡聚體序列設(shè)計3964:miR-155完全互補(bǔ)物，缺口SEQ5'-CCCCtatcacgattagcaTTAA-3'293968:miR-155完全互補(bǔ)物，阻斷SEQ5'-cccctaTCACGATTagcattaa-3'303974:miR-155完全互補(bǔ)物，SEQ5'-cCccTatCacGatTagCatTaa-3'LNA—3313758:miR-155新設(shè)計SEQ5'-TcAcgATtaGcAtTA-3'323818:miR-155增強(qiáng)的新設(shè)計SEQ5'-TcAcGATtaGCAtTA-3'33IDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNO3IDNOIDNOIDNOIDNOIDNO3818':miR-1555'-ACGATtAGCAtTA-3'3818'':miR-155ED-13聚體5'-GATtAGCaTTA-3'ED-11聚體3758':miR-1555,-tcmacmgmattamgcmat<ta_3,3758，'miR-1555'-TCFACFGFATTpAFGCFATFTA-3'SEQIDNO34SEQIDNO35新設(shè)計-2，MOESEQIDNO36新設(shè)計-2，氟SEQIDNO37靼hsa-raiR-21MIMAT0000076uagcuuaucagacugauguugamiR—215'—TCAAcatcagtctgataaGCTA—3'完全互補(bǔ)物，缺口miR-215'-tcaacaTCAGTCTGataagcta-3'完全互補(bǔ)物，阻斷SEQIDNOmiR—215'-tcAtcAtcAgtCtgAtaAGcTt—3'miR-215'-TcAgtCTgaTaAgCT—3'miR—215'—TcAgTCTgaTAAgCT-3'-miR-215'-miR-215'-AGTCTgATAAgCT-3'-TCTgAtAAGCT-3'-miR-215'—TCMAGMTMCTGMAMTAMAG"CT一3，miR—215'-TCFAGFTFCTGFAFTAFAGFCT—3'完全互補(bǔ)物，LNA_3新設(shè)計增強(qiáng)的新設(shè)計ED-13聚體ED-11聚體新設(shè)計-2'MOE新設(shè)計-2'氟SEQSEQ38SEQ39SEQ40SEQ41SEQ42SEQ43SEQ44SEQ45SEQ46IDNO4IDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNOIDNO把hsa-miR-375MIMAT0000728uuuguucguucggcucgcgugaSEQIDNO5miR-3755'-TCTCgcgtgccgttcgttCTTT-3'完全互補(bǔ)物，缺口SEQIDNO47miR-3755'-tctcgcGTGCCGTTcgttcttt-3'完全互補(bǔ)物，阻斷SEQIDNO48SEQIDNO49SEQIDNO50SEQIDNO51SEQIDNO52SEQIDNO53SEQIDNO54SEQIDNO55miR-3755'-tcTcgCgtGccGttCgtTctTt-3'miR-3755'-GtGccGTtcGtTcTT3'miR-3755'-GtGcCGTtcGTTcTT3'miR-3755'-GCCGTtCgTTCTT3'miR—"55'-CGTTcGTTCTT3'miR—3755'—GTMGCMCMGTTMCMGTMTCMTT3'miR-3755'-GTFGCFCFGTTFCFGTFTCFTT3'完全互補(bǔ)物，LNA—3新設(shè)計增強(qiáng)的新設(shè)計ED-13聚體ED-11聚體新設(shè)計-2，MOE新設(shè)計-2，氟不含上標(biāo)M或F的大寫字母指LNA單元。小寫字母-DNA,除了粗體小寫字母-RNA。LNA胞嘧啶可以任選是甲基化的。后有上標(biāo)M的大寫字母指2，OMERNA單元，后有上標(biāo)F的大寫字母指2，氟DM單元，小寫字母指DNA。在一個實(shí)施方案中，上述寡聚體可以完全是硫代磷酸酯，但可以使用如本文所描述的其他核苷酸堿基連接鍵。在一個實(shí)施方案中，核苷酸堿基連接鍵都是磷酸二酯。認(rèn)為對于在腦/脊髓內(nèi)的應(yīng)用優(yōu)選使用磷酸二酯鍵，例如對于使用靶向miR21的抗miR。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以具有選自下述的—3'核苷酸堿基序列LdLddLLddLdLdLL(新設(shè)計)LdLdLLLddLLLdLL(增強(qiáng)的新設(shè)計)LML腿LL腿LMLMLL(新設(shè)計-2，MOE)LMLMLLL醒LLLMLL(增強(qiáng)的新設(shè)計-2，MOE)LFLFFLLFFLFLFLL(新設(shè)計-2，氟)水:水:LFLFLLLFFLLLFLL(增強(qiáng)的新設(shè)計-2，氟)LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)匿匿LMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)MLMML腿LMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)MM匿固LM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)LdLdLdLdL(d)(L)(d)(:L)(d)1〔"(d)MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)LMLMLMLML(M)(L)(M)(:L)(M)<〔"(M)FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)LFLFLFLFL(F)(L)(F)(:L)(F)1(F)'每第2其中L=LNA單元，d-DNA單元，M-2，MOERNA，F(xiàn)=2，氟，和括號中的殘基是可選存在的。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的具體例子可以選自tgCatGgaTUGcaCa個個個個個個個個個個3333333332第第第第第第第第第第每每每每每每每每每每(SEQIDNO82)，tgCatGgaTttGcaC(SEQIDNO83)，CatGgaTttGcaC(SEQIDNO84)，tGcAtGgAtTtGcAc(SEQIDNO85)，cAtGgAtTtGcAc(SEQIDNO86)，CatGGatTtGcAC(SEQIDNO87)，TgCatGGatTtGcAC(SEQIDNO88)，TgCaTgGaTTtGcACa(SEQIDNO89)，cCatTgtCacActCca(SEQIDNO90)，cCatTgtAacTctCca(SEQIDNO91)，ccAttGtcAcaCtcCa(SEQIDNO92)，cCatTgtCacActCc(SEQIDNO93)，atTgtCacActCc(SEQIDN094)，ccAttGtcAcaCtcC(SEQIDNO95)，AttGtcAcaCtcC(SEQIDNO96)，aTtGtCaCaCtCc(SEQIDNO97)，AttGTcaCaCtCC(SEQIDN098)，CcAttGTcaCaCtCC(SEQIDNO99)，CcaTtgTcacActcCa(SEQIDNO100)，CCAttgtcacacTCCa(SEQIDNO101)，tCacGatTagCatTaa(SEQIDNO102)，aTcaCgaTtaGcaTta(SEQIDNO103)，TcAcGaTtAgCaTtAa(SEQIDNO104),AtcAcGaTtAgCaTta(SEQIDNO105)，gAgcCgaAcgAacAa(SEQIDNO106)，gcCgaAcgAacAa(SEQIDNO107)，GaGcCgAaCgAaCaA(SEQIDNO108)和GcCgAaCgAaCaA(SEQIDNO109);其中小寫字母標(biāo)示DM單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基，其中大寫C指MsC。應(yīng)認(rèn)識到上述具體例子中的LNA/DNA核苷酸堿基的設(shè)計可以應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的其他寡核苷酸。綴合物本發(fā)明還提供了包含根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的綴合物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，寡聚化合物與配體/綴合物連接，這可以例如用于增加反義寡核苷酸的細(xì)胞攝取。這種綴合可以在末端位置5，/3，-OH上發(fā)生，但配體還可以在糖和/或堿基上發(fā)生。特別地，反義寡核苷酸可以與之綴合的生長因子可以包含轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸。轉(zhuǎn)鐵蛋白-聚賴氨酸-寡核苷酸復(fù)合物或葉酸-聚賴氨酸-寡核苷酸復(fù)合物可以制備用于被表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)鐵蛋白或葉酸受體的細(xì)胞攝取。綴合物/配體的其他例子是膽固醇部分，雙鏈體嵌入劑例如吖啶，聚L-賴氨酸，用一個或多個核酸酶抗性連接基團(tuán)例如單硫代磷酸酯的"封端"等。本發(fā)明還提供了綴合物，其包含如本文所描述的根據(jù)本發(fā)明的化合物，和與所述化合物共價附著的至少一個非核普酸或非多核苷酸部分。因此，在其中本發(fā)明的化合物由指定核酸組成的一個實(shí)施方案中，如本文公開的，化合物還可以包含與所述化合物共價附著的至少一個非核苷酸或非多核苷酸部分(例如，不包含一個或多個核苷酸或核苷酸類似物)。非核苷酸堿基部分可以例如是或包含齒醇例如膽固醇。因此，應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明的寡核苷酸，例如在藥物(治療)制劑中使用的寡核苷酸可以包含進(jìn)一步的非核苷酸堿基組分，例如本文定義的綴合物。LNA單元在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，LNA單元具有下文方案1中所示的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)方案11A1B其中X選自O(shè)、S和NRH，其中RH是H或d—4-烷基；Y是(-CH2)r，其中r是l-4的整數(shù)；和B是含氮堿基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，r是l或2，特別是l,即優(yōu)選LNA單元具有下文方案2中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)方案2或2A2B其中X和B如上定義。在一個有利的實(shí)施方案中，摻入本發(fā)明的寡核苷酸中的LNA單元獨(dú)立地選自硫代-LNA單元、氨基-LNA單元和氧-LNA單元。因此，硫代-LNA單元可以具有下文方案3中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)方案3構(gòu)或3A3B其中B如上定義。優(yōu)選地，硫代-LNA單元是其P-D型，即具有上文3A中所示的結(jié)同樣地，氨基-LNA單元可以具有下文方案4中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)方案4NRH巳或4A4B其中B和RH如上定義。優(yōu)選地，氨基-LNA單元是其p-D型，即具有上文4A中所示的結(jié)構(gòu)。氧-LNA單元可以具有下文方案5中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)方案5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>5A5B其中B如上定義。優(yōu)選地，氧-LNA單元是其0-D型，即具有上文5A中所示的結(jié)構(gòu)。如上所述，B是可以是天然或非天然來源的含氮堿基。含氮堿基的具體例子包括腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(MSC)、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤、7-丙炔-7-去氮鳥嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。末端基團(tuán)末端基團(tuán)的具體例子包括選自下述的末端基團(tuán)氫、疊氮基、卣素、氰基、硝基、羥基、Prot-0-、Act-0-、巰基、Prot-S-、Act-S-、d—「烷硫基、氨基、Prot-N(JO-、Act-N(RH)-、單或二(CH-烷基)氨基、任選取代的d-6-烷氧基、任選取代的CH-烷基、任選取代的C2-6-烯基、任選取代的Cw-烯氧基、任選取代的C2-6-炔基、任選取代的Cw-炔氧基、單磷酸包括保護(hù)的單磷酸、單硫代磷酸酯包括保護(hù)的單硫代磷酸酯、二磷酸酯包括保護(hù)的二磷酸酯、二硫代磷酸酯包括保護(hù)的二硫代磷酸酯、三磷酸酯包括保護(hù)的三磷酸酯、三硫代磷酸酯包括保護(hù)的三疏代磷酸酯，其中Prot是用于-0H、-SH和-匪(RH)的保護(hù)基團(tuán)，和Act是用于-0H、-SH和-NH(RH)的活化基團(tuán)，和R"是氫或d—6-烷基。指保護(hù)基團(tuán)的例子包括S-乙酰硫代乙基(acetylthioethyl)(SATE)和S-特戊酰硫代乙基(叔丁基-SATE)。末端基團(tuán)的再進(jìn)一步的例子包括DNA嵌入劑、光化學(xué)活性基團(tuán)、熱化學(xué)活性基團(tuán)、螯合基團(tuán)、報道基團(tuán)、配體、羧基、sulphono、羥甲基、Prot-0-CH2-、Act-0-CH「、氨甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH廣、羧甲基、sulphonomethyl，其中Prot是用于-0H、-SH和-NH(RH)的保護(hù)基團(tuán)，和Act是用于-OH、-SH和-NH(RH)的活化基團(tuán)，和RH是氫或d-6-烷基。用于-OH和-SH基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)的例子包括取代的三苯甲基，例如4，4'-二甲氧基三苯曱氧基(DMT)，4-單甲氧基三苯甲氧基(醒T);三苯曱氧基，任選取代的9-(9-苯基)占噸氧基(pixyl)，任選取代的甲氧基四氫吡喃氧基(mthp);硅烷氧基，例如三甲硅烷氧基(TMS)，三異丙基硅烷氧基(TIPS)，叔丁基二甲基硅烷氧基(TBDMS)，三乙基硅烷氧基，苯基二甲基硅烷氧基；叔丁基醚；縮醛(包括2個羥基)；酰氧基，例如乙酰基或卣素取代的乙?；缏却阴Ｑ趸蚍阴Ｑ趸?，異丁酰氧基，特戊酰氧基，苯甲酰氧基和取代的苯甲?；?，曱氧基甲基氧基(MOM)，節(jié)醚或取代的節(jié)醚例如2，6-二氯節(jié)氧基(2，6-Cl2Bzl)。此外，當(dāng)Z或Z承是鞋基時，它們可以通過與固體栽體附著進(jìn)行保護(hù)，任選經(jīng)由接頭。胺保護(hù)基團(tuán)的例子包括芴曱氧羰基氨基(Fmoc),叔丁氧基羰基氨基(B0C)，三氟乙酰氨基，烯丙氧基羰基氨基(alloc,A0C)，Z-苯甲氧基羰基氨基(Cbz)，取代的苯甲氧基羰基氨基，例如2-氯苯甲氧基羰基氨基(2-C1Z)，單曱氧基三苯甲基氨基(MMT)，二甲氧基三苯甲基氨基(DMT)，鄰苯二甲酰氨基，和9-(9-苯基)占噸基氨基(pixyl)?；罨鶊F(tuán)優(yōu)選介導(dǎo)與其他殘基和/或核苷酸單體的偶聯(lián)，并且在偶聯(lián)已完成后，活化基團(tuán)一般轉(zhuǎn)變成核苷間鍵。此類活化基團(tuán)的例子包括任選取代的0-亞磷酰胺，任選取代的0-磷酸三酯，任選取代的磷酸二酯，任選取代的H-膦酸酯，和任選取代的0-膦酸酯。在本文背景中，術(shù)語"亞磷酰胺"意指式-P(0RX)-N(Ry)2的基團(tuán)，其中IT指任選取代的烷基，例如曱基、2-氰乙基或苯甲基，和每個Ry指任選取代的烷基，例如乙基或異丙基，或-N(Ry)2基團(tuán)形成嗎啉代基團(tuán)(-N(CH2CH2)20)。r優(yōu)選指2-氰乙基，和2個r優(yōu)選是相同的且指異丙基。因此，特別優(yōu)選的亞磷酰胺是N，N-二異丙基-^(2-氰乙基)-亞磷酰胺。最優(yōu)選的末端基團(tuán)是羥基、巰基和氨基，特別是羥基。治#和秀#逸合#如最初解釋的，本發(fā)明的寡核苷酸將構(gòu)成具有改善性質(zhì)的合適藥物。有效和安全藥物的設(shè)計要求各種參數(shù)如親和性/特異性、生物流體中的穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取、作用方式、藥代動力學(xué)性質(zhì)和毒性的細(xì)調(diào)。因此，在一個進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑。優(yōu)選地所述載體是鹽水或緩沖鹽水。在一個再進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸。如應(yīng)當(dāng)理解的，劑量取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，從數(shù)天持續(xù)至數(shù)月的療程，或直至實(shí)現(xiàn)治愈或達(dá)到疾病狀態(tài)的減少。最佳的給藥方案可以由患者體內(nèi)的藥物積聚的測量進(jìn)行計算。最佳劑量可以依個別寡核苷酸的相對功效而變。一般地，它可以基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動物模型中有效的EC50進(jìn)行估計。一般而言，劑量為0.01Pg-lg/kg體重，并且可以每天、每周、每月或每年給予一次，或甚至每2—10年給予1次或通過連續(xù)輸注給予數(shù)小時直至數(shù)月。關(guān)于給藥的重復(fù)率可以基于測量的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度進(jìn)行估計。成功治療后，可能希望使患者經(jīng)歷維持療法以防止疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)。藥物組合物如上所述，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的至少一種寡核苷酸作為活性成分。應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物任選包含藥物載體，并且藥物組合物任選包含進(jìn)一步的化合物，例如化學(xué)療法化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物和/或免疫調(diào)節(jié)化合物。本發(fā)明的寡核苷酸可以"就這樣"使用，或以各種藥學(xué)上可接受的鹽的形式使用。如本文所使用的，術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"指保留本文鑒定的寡核苷酸的所需生物活性和顯示最低限度的不希望有的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽。此類鹽的非限制性例子可以與有機(jī)氨基酸形成，和與金屬陽離子或與由銨、iV，舲二千基乙二胺、/"葡糖胺、四乙銨或乙二胺形成的陽離子形成的堿加成鹽，所述金屬陽離子例如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、鈉、鉀等。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，寡核苷酸可以是前藥的形式。寡核苷酸在性質(zhì)上是帶負(fù)電荷的離子。由于細(xì)胞膜的親脂性質(zhì)，與中性或親脂等同物比較，寡核苷酸的細(xì)胞攝取是減少的。這種極性'阻礙，可以通過使用前藥法得到避免(參見例如Crooke，R.M.(1998)inCrooke，S.T.爿/zf/se/7^eresearc力a/df/o".Springer—Verlag，Berlin,Germany,第131巻，第103-140頁)。藥學(xué)上可接受的結(jié)合劑和輔劑可以構(gòu)成所配制藥物的組成部分。用于遞送本文描述的治療劑的遞送方法的例子以及藥物制劑的細(xì)節(jié)、鹽可以在其他地方得到詳細(xì)描述，例如通過引用合并入本文的美國臨時申請60/838，710和60/788，995，和同樣通過引用合并入本文的丹麥申請PA200600615。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液、乳劑或含脂質(zhì)體的制劑。這些組合物可以由多種組分產(chǎn)生，所述組分包括但不限于預(yù)先形成的液體、自身乳化的固體和自身乳化的半固體。藥物至腫瘤組織的遞送可以通過載體介導(dǎo)的遞送得到增強(qiáng)，所述載體包括但不限于陽離子脂質(zhì)體、環(huán)糊精、卟啉衍生物、支鏈樹枝狀聚合物、聚乙烯亞胺聚合物、納米顆粒和孩i球體(DassCR.JPharmPharmacol2002;54(1):3_27)?？梢苑奖愕匾詥挝粍┬痛嬖诘谋景l(fā)明的藥物制劑可以根據(jù)醫(yī)藥工業(yè)眾所周知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備。此類技術(shù)包括使活性成分與藥學(xué)栽體或賦形劑接觸的步驟。一般而言，制劑通過下述進(jìn)行制備使觸，和隨后必要時使產(chǎn)物成型。本發(fā)明的組合物可以配制成許多可能的劑型中的任何一種，例如但不限于片劑、膠嚢、凝膠膠嚢、液體糖漿劑、軟凝膠和栓劑。本發(fā)明的組合物還可以在水性、非水性或混合介質(zhì)中配制為懸浮液。水性懸浮液可以進(jìn)一步包含增加懸浮液的粘性的物質(zhì)，所述物質(zhì)包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的化合物還可以與活性藥物物質(zhì)例如阿司匹林、布洛芬、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗細(xì)菌藥或抗生素綴合。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含靶向第一微小RNA的一種或多種寡核苷酸化合物，和乾向第二微小RNA靶的一種或多種另外的寡核苷酸化合物。兩種或更多組合化合物可以一起或順次使用。本文公開的化合物對于如上所述的許多治療應(yīng)用有用。一般而言，本發(fā)明的治療方法包括給哺乳動物特別是人施用治療有效量的寡核苷酸。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含U)—種或多種本發(fā)明的化合物，和(b)—種或多種化學(xué)治療劑的藥物組合物。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時，此類化學(xué)治療劑可以單獨(dú)、順次或與一種或多種其他此類化學(xué)治療劑組合或與放射療法組合使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有化學(xué)治療劑作為與根據(jù)本發(fā)明的化合物的組合療法引入本文。其他活性劑例如抗炎藥包括但不限于非甾體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇，抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)藥物也可以在本發(fā)明的組合物中進(jìn)行組合。兩種或更多組合化合物可以一起或順次4吏用?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的藥物組合物治療的治療適應(yīng)癥的例子微小RM可能的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥miR-21成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，乳腺癌miR-122高膽固醇血癥，丙型肝炎，血色素沉著病miR-19b淋巴瘤和其他腫瘤類型miR-155淋巴瘤、乳腺癌和肺癌miR-375糖尿病、代謝紊亂miR-181成肌細(xì)胞分化、自身免疫病癥腫瘤抑制基因原肌球蛋白1(TPM1)mRNA已指示為miR-21的靶。Myotrophin(mtpn)mRNA已指示為miR-375的靼。在一個再進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸用于制備用于治療選自下述的疾病的藥物的用途動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥；癌癥，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，乳腺癌，淋巴瘤，肺癌；糖尿病，代謝紊亂；成肌細(xì)胞分化；免疫病癥。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸用于在治療選自下述的疾病中的用途動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥；癌癥，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，乳腺癌，淋巴瘤，肺癌；糖尿病，代謝紊亂；成肌細(xì)胞分化；免疫病癥。本發(fā)明提供了用于治療患有選自下述的疾病或病狀的受試者的方法動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥；癌癥，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，乳腺癌，淋巴瘤，肺癌；糖尿病，代謝紊亂；成肌細(xì)胞分化；免疫病癥，所述方法包括給有此需要的受試者施用本發(fā)明的寡核苷酸或藥物組合物的步驟。癌癥在一個再進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于治療癌癥或針對癌癥預(yù)防的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物，或本發(fā)明的藥物組合物。此類癌癥可以包括淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞瘤形成、成淋巴細(xì)胞性白血病、腦腫瘤、胃腫瘤、漿細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髄瘤、白血病、結(jié)締組織腫瘤、淋巴瘤和實(shí)體瘤。在本發(fā)明的化合物或其綴合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途中，所述癌癥可以適當(dāng)?shù)厥菍?shí)體瘤的形式。有利地，在用于治療本文公開的癌癥的方法中，所述癌癥可以適當(dāng)?shù)厥菍?shí)體瘤的形式。此外，所述癌癥也適當(dāng)?shù)厥前?。癌一般選自惡性黑素瘤、基底細(xì)胞癌、卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、復(fù)發(fā)性表淺膀胱癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌、宮頸發(fā)育不良、喉乳頭狀瘤病、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌和類癌瘤。更一般地，所述癌選自惡性黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和腎細(xì)胞癌。惡性黑素瘤一般選自淺表擴(kuò)散性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、惡性雀斑樣黑素瘤、肢端黑素瘤、無黑素性黑素瘤和結(jié)締組織增生性黑素瘤。備選地，癌癥可以適當(dāng)?shù)厥侨饬?。肉瘤一般是選自骨肉瘤、尤文氏肉瘤、軟骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和卡波濟(jì)氏肉瘤的形式。備選地，癌癥可以適當(dāng)?shù)厥巧窠?jīng)膠質(zhì)瘤。一個進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途，其中所述藥物進(jìn)一步包含選自下述的化學(xué)治療劑腎上腺皮質(zhì)類固醇例如潑尼松，氟美松或地塞米松；六曱蜜胺(六甲蜜胺、六甲三聚氰胺(HMM));氨磷汀(阿密磷定)；氨格魯米特(氨魯米特)；安吖啶(M-AMSA);阿那曲唑(瑞寧得)；雄激素，例如睪酮；天冬酰胺酶(優(yōu)適寶)；卡介苗；比卡魯胺(康士得)；爭光霉素(博來霉素)；白消安(馬利蘭)；卡鉑(伯爾定)；卡莫司汀(BCNU，BiCNU);苯丁酸氮芥(瘤可寧)；2-氯脫氧腺苷(2-CDA，克拉屈濱，克拉立平)；順鉑(順氯氨鉑)；胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷)；達(dá)卡巴溱(DTIC);更生霉素(放線菌素-D,更生霉素)；道諾霉素(柔紅霉素)；多西他賽(泰索帝)；多柔比星(阿霉素)；表柔比星；雌氮芥(emcyt);雌激素，例如己烯雌酚(DES);依托泊苷(VP-16，VePesid，凡畢復(fù))；氟達(dá)拉濱(福達(dá)華)；氟他米特(氟他胺)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU);吉西他濱(健擇)；戈舍瑞林(zodalex);赫賽汀(曲妥珠單抗)；羥基尿素(羥基脲)；依達(dá)比星(伊達(dá)比星)；異環(huán)磷酰胺；IL-2(阿地白介素，阿地白介素)；干擾素oc(甘樂能，羅擾素)；依立替康(camptosar);亮丙瑞林(乙酸亮丙瑞林)；左旋咪唑(左旋咪唑片)；羅莫司汀(CCNU);mechlorathamine(氮芥，氮芥)；美法侖(愛克蘭)；巰嘌呤(巰基嘌呤，6-MP);氨甲蝶呤(氨甲蝶呤鈉)；絲裂霉素-C(mutamucin);米托蒽醌(諾消靈)；奧曲肽(善得定)；噴司他丁(2-脫氧助間型霉素，噴司他丁)；普利霉素(光輝霉素，普卡霉素)；丙卡巴肼(甲苯肼)；鏈佐星；三苯氧胺(諾瓦得士)；泰素(紫杉醇)；替尼泊苷(威猛；VM-26);噢替派；托泊替康(和美新)；維曱酸(vesanoid，全反式維甲酸)；長春堿(valban);長春新堿(安可平)和長春瑞濱(諾維本)。適當(dāng)?shù)?，進(jìn)一步的化學(xué)治療劑選自紫杉烷類例如泰素、紫杉醇或多西他賽。類似地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途，其中所述治療進(jìn)一步包含施用選自下述的進(jìn)一步的化學(xué)治療劑腎上腺皮質(zhì)類固醇，例如潑尼^，氟美松或地塞米松；六曱蜜胺(六甲蜜胺、六甲三聚氰胺(H腿))；氨磷汀(阿密磷定)；氨格魯米特(氨魯米特)；安吖啶(M-AMSA);阿那曲唑(瑞寧得)；雄激素，例如睪酮；天冬酰胺酶(優(yōu)適寶)；卡介苗；比卡魯胺(康士得)；爭光霉素(博來霉素)；白消安(馬利蘭)；卡鉑(伯爾定)；卡莫司汀(BCNU，BiCNU);苯丁酸氮芥(瘤可寧)；2-氯脫氧腺苷(2-CDA,克拉屈濱，克拉立平)；順鉑(順氯氨鉑)；胞嘧啶阿糖核苷(阿糖胞苷)；達(dá)卡巴嚷(DTIC);更生霉素(放線菌素-D,更生霉素)；道諾霉素(柔紅審素)；多西他賽(泰索帝)；多柔比星(阿霉素)；表柔比星；雌氮芥(emcyt);雌激f，例如己烯雌酚(DES);依托泊苷(VP-16，VePesid，凡畢復(fù))；氟達(dá)拉濱(福達(dá)華)；氟他米特(氟他胺)；5-FUDR(氟尿苷)；5-氟尿嘧啶(5-FU);吉西他濱(健擇)；戈舍瑞林(zodalex);赫賽汀(曲妥珠單抗)；羥基尿素(羥基脲)；依達(dá)比星(伊達(dá)比星)；異環(huán)磷酰胺；IL-2(阿地白介素，阿地白介素)；干擾素oc(甘樂能，羅擾素)；依立替康(camptosar);亮丙瑞林(乙酸亮丙瑞林)；左旋咪唑(左旋咪唑片)；羅莫司汀(CCNU);mechlorathamine(氮芥，氮芥)；美法侖(愛克蘭)；巰嘌呤(巰基嘌呤，6-MP);氨甲蝶呤(氨曱蝶呤鈉)；絲裂霉素-C(mutamucin);米托蒽醌(諾消靈)；奧曲肽(善得定)；噴司他丁(2-脫氧助間型霉素，噴司他丁)；普利霉素(光輝霉素，普卡霉素)；丙卡巴肼(甲苯肼)；鏈佐星；三苯氧胺(諾瓦得士)；泰素(紫杉醇)；替尼泊苷(威猛；VM-26);噻替派；托泊替康(和美新)；維曱酸(vesanoid，全反式維甲酸)；長春堿(valban);長春新堿(安可平)和長春瑞濱(諾維本)。適當(dāng)?shù)?，所述治療進(jìn)一步包含選自紫杉烷類例如泰素、紫杉醇或多西他賽的進(jìn)一步的化學(xué)治療劑的施用。備選說明的，本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物，或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，且進(jìn)一步包括施用進(jìn)一步的化學(xué)治療劑。所述進(jìn)一步的施用可以是這樣的，使得進(jìn)一步的化學(xué)治療劑與本發(fā)明的化合物綴合，存在于藥物組合物中，或在分開制劑中施用。感染性疾病考慮本發(fā)明的化合物可廣泛地應(yīng)用于廣泛范圍的感染性疾病，例如白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰質(zhì)炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感嗜血桿菌、麻療、腮腺炎和風(fēng)滲。Hsa-miR122在丙型肝炎感染中指示，并且像這樣靶向miR-122的根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以用于治療丙型肝炎感染。因此，在另外一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療感染性疾病的藥物的用途，以及用于治療感染性疾病的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物，或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。炎性疾病炎癥應(yīng)答是生物針對感染原攻擊的基本防御機(jī)制，并且它也牽涉許多急性或慢性疾病包括自身免疫病癥的發(fā)病機(jī)理。盡管是對抗病原體所需的，但炎癥性爆發(fā)的效應(yīng)可以是破壞性的。因此通常必須使用抗炎藥來限制炎癥的癥狀學(xué)。炎癥是通常由組織損害觸發(fā)的復(fù)雜過程，其包括大批酶的激活，血管通透性和血流體外滲的增加，細(xì)胞遷移和化學(xué)介質(zhì)的釋放，全都指向破壞和修復(fù)損害組織。在另外一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療炎性疾病的藥物的用途，以及用于治療炎性疾病的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物，或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，炎性疾病是風(fēng)濕病和/或結(jié)締組織疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或狼瘡、硬皮病、多肌炎、炎性腸病、皮肌炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、脈管炎、牛皮褲關(guān)節(jié)炎、銀屑病性剝脫性皮炎、尋常天皰瘡和干燥綜合征，特別是炎性腸病和克羅恩氏病。備選地，炎性疾病可以是非風(fēng)濕性炎癥，如滑囊炎、滑膜炎、囊炎、腱炎和/或創(chuàng)傷性和/或運(yùn)動性起源的其他炎性病損。代謝疾病代謝疾病是由體內(nèi)天然產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)的積聚引起的病癥。這些疾病通常是嚴(yán)重的，某些甚至是威脅生命的。其他可以減慢身體發(fā)育或引起智力低下。具有這些病癥的大多數(shù)嬰兒起初不顯示明顯的病征。出生時的正確篩選通常可以發(fā)現(xiàn)這些問題。使用早期診斷和治療，代謝疾病通常可以進(jìn)行有效處理。在另外一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療代謝疾病的藥物的用途，以及用于治療代謝疾病的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物，或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，代謝疾病選自淀粉樣變性病、生物素酰胺酶、OMIM(在線人類孟德爾遺傳)、克-納二氏綜合征、糖尿病、FabrySupport&InformationGroup、月旨肪酸氧化障礙、半乳糖血癥、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺乏癥、戊二酸尿癥、戊二酸血癥的國際組織、戊二酸血癥I型、戊二酸血癥II型、戊二酸血癥I型、戊二酸血癥II型、F-HYPDRR-家族性低磷酸鹽血癥、抗維生素D佝僂病、克拉伯病、長鏈3羥酰CoA脫氫酶缺乏癥(LCHAD)、甘露糖苷病群、楓糖尿病、線粒體病癥、粘多糖病綜合征尼曼皮克病、有機(jī)酸血癥、PKU、龐貝氏病、葉啉癥、代謝綜合征、高脂血癥和遺傳性脂代謝紊亂、三曱基胺尿癥臭魚癥和尿素循環(huán)病癥。肝病在另外一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物用于制備用于治療肝病的藥物的用途，以及用于治療肝病的方法，所述方法包括給有此需要的患者施用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或其綴合物，或根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，肝病選自膽道閉鎖、Alagille綜合征、ot-l抗胰蛋白酶、酪氨酸血癥、新生兒肝炎和威爾遜氏病。其他用途本發(fā)明的寡核苷酸可以作為研究試劑用于診斷、治療和預(yù)防。在研究中，寡核苷酸可以用于特異性抑制細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物中的靶基因的合成，從而促進(jìn)靶的功能分析或其作為用于治療干預(yù)的靶的有效性的評估。在診斷中，寡核苷酸可以通過RNA印跡、原位雜交或類似技術(shù)用于檢測和定量細(xì)胞和組織中的耙表達(dá)。對于治療，懷疑具有可以通過調(diào)節(jié)靼的表達(dá)進(jìn)行治療的疾病或病癥的動物或人通過施用依照本發(fā)明的寡核苷酸化合物進(jìn)行治療。進(jìn)一步提供的是通過施用治療或預(yù)防有效量的一種或多種本發(fā)明的寡核苷酸化合物或組合物，治療懷疑患有或傾向于患與乾的表達(dá)相關(guān)的疾病或病狀的動物特別是小鼠和大鼠和治療人的方法。耙向miR-122a的寡核苷酸的治療用途在實(shí)施例部分，證實(shí)乾向miR-l"a的LNA-抗miR頂例如SP。372減少血漿膽固醇水平。因此，本發(fā)明的另一個方面是上文描述的靶向miR-122a的寡核苷酸作為藥物的用途。本發(fā)明的另外一個方面是上文描述的靶向miR-122a的寡核苷酸用于制備用于治療增加的血漿膽固醇水平的藥物的用途。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解增加的血漿膽固醇水平是不希望有的，因?yàn)樗黾痈鞣N病狀例如動脈粥樣硬化的危險。本發(fā)明的另外一個方面是上文描述的靶向miR-122a的寡核苷酸用于上調(diào)Nrdg3、AldoA、Bckdk或CD320的mRNA水平的用途。進(jìn)一步的實(shí)施方案下述實(shí)施方案可以與如本文所描述的本發(fā)明的其他實(shí)施方案進(jìn)行組合1.長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，其具有由3'末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列acgttt，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換；或其綴合物。2.長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，其具有由3'末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DM序列ctcaca，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換；或其綴合物。3.長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，其具有由3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列ttacga，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換；或其綴合物。4.長度為12-26個核苷酸的寡核苷酸，其具有由3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位的核心DNA序列acaagc;其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換；或其綴合物。5.根據(jù)實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位的至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。6.根據(jù)實(shí)施方案5的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第l-6位、第2-7位或第3-8位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。7.根據(jù)實(shí)施方案6的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位的每笫2個核苷酸是LNA單元。8.根據(jù)實(shí)施方案6的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位的每第3個核苷酸是LNA單元。9.根據(jù)實(shí)施方案6的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位的核苷酸的置換方式選自xxXxxX、xxXxXx、xXxxXx、xXxXxx、XxxXxx、xXxXxX、XxXxXx、XxxXxX和XxXxxX;其中"X"指LNA單元，和"x，，指DNA單元。10.根據(jù)實(shí)施方案9的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-6位、第2-7位或第3-8位的核苷酸的置換方式選自xxXxxX、xXxxXx、XxxXxx、xXxXxX和XxXxXx;其中"X"指LNA單元，和"x"指DNA單元。11.根據(jù)實(shí)施方案1的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3'末端計數(shù)第l-7位、第2-8位或第3-9位的DNA序列acgttta，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。12.根據(jù)實(shí)施方案2的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第l-7位、第2-8位或第3-9位的DM序列ctcacac，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。13.根據(jù)實(shí)施方案3的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第l-7位、第2-8位或第3-9位的DNA序列ttacgat，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。14.根據(jù)實(shí)施方案4的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3'末端計數(shù)第l-7位、第2-8位或第3-9位的DNA序列acaagca，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。15.根據(jù)實(shí)施方案11-14中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位的至少2個，例如2個、3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。16.根據(jù)實(shí)施方案15的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第l-7位、第2-8位或第3-9位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。17.根據(jù)實(shí)施方案16的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位的每第2個核苷酸是LM單元。18.根據(jù)實(shí)施方案16的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位的每第3個核苷酸是LM單元。19.根據(jù)實(shí)施方案16的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位的核苷酸的置換方式選自xxXxxXx、xxXxXxx、xXxxXxx、xxXxXxX、xXxxXxX、xXxXxxX、xXxXxXx、XxxXxxX、XxxXxXx、XxXxxXx、XxXxXxx和XxXxXxX;其中"X"指LNA單元，和"x"指DNA單元。20.根據(jù)實(shí)施方案19的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-7位、第2-8位或第3-9位的核苷酸的置換方式選自xxXxxXx、xXxxXxx、XxxXxxX、xXxXxXx、XxXxXxX和XxXxXxx;其中"X"指LNA單元，和"x，，指DNA單元。21.根據(jù)實(shí)施方案11的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第l-8位、第2-9位或第3-10位的DNA序列acgtttag，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。22.根據(jù)實(shí)施方案12的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第l-8位、第2-9位或第3-10位的DNA序列ctcacact，其中所述序列中的至少一個，例如l個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。23.根據(jù)實(shí)施方案13的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位的DNA序列ttacgatt，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。24.根據(jù)實(shí)施方案14的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第l-8位、第2-9位或第3-10位的DM序列acaagcaa，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。25.根據(jù)實(shí)施方案21-24中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物，其中由3,末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位的至少2個，例如2個、3個或4個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。26.根據(jù)實(shí)施方案25的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。27.根據(jù)實(shí)施方案26的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第l-8位、第2-9位或第3-10位的每第2個核苷酸是LNA單元。28.根據(jù)實(shí)施方案26的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位的每第3個核苷酸是LNA單元。29.根據(jù)實(shí)施方案26的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位的核香酸的置換方式選自xxXxxXxx、xxXxxXxX、xxXxXxxX、xxXxXxXx、xXxxXxxX、xXxxXxXx、xXxXxxXx、xXxXxXxx、XxxXxxXx、XxxXxXxx、XxXxxXxx、xXxXxXxX、XxXxXxxX、XxXxxXxX、XxxXxXxX和XxXxXxXx;其中"X"指LNA單元，和"x"指DNA單元。30.根據(jù)實(shí)施方案29的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-8位、第2-9位或第3-10位的核苷酸的置換方式選自xxXxxXxx、xXxxXxxX、XxxXxxXx、xXxXxXxX、XxXxXxXx和XxXxXxxXj其中"X"指LNA單元，和"x"指DNA單元。31.根據(jù)實(shí)施方案21的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-IO位或第3-ll位的DNA序列acgtttagg，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。32.根據(jù)實(shí)施方案22的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第l-9位、第2-10位或第3-11位的DNA序列ctcacactg,其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。33.根據(jù)實(shí)施方案23的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位的DNA序列ttacgatta，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。34.根據(jù)實(shí)施方案24的寡核苷酸或其綴合物，其具有由3'末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位的DNA序列acaagcaag，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個，更優(yōu)選至少3個，例如3個，更加優(yōu)選至少4個，例如4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。35.根據(jù)實(shí)施方案21-24中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位的至少2個，例如2個、3個、4個或5個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。36.根據(jù)實(shí)施方案35的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-9位、第2-IO位或第3-ll位的連續(xù)DNA單元的數(shù)目為至多2個。37.根據(jù)實(shí)施方案36的寡核苷酸或其綴合物，其中由3'末端計數(shù)第1-9位、第2-IO位或第3-ll位的每第2個核苷酸是LNA單元。38.根據(jù)實(shí)施方案36的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第l-9位、第2-10位或第3-ll位的每第3個核苷酸是LNA單元。39.根據(jù)實(shí)施方案36的寡核苷酸或其綴合物，其中由3，末端計數(shù)第1-9位、第2-10位或第3-11位的核苷酸的置換方式選自xxXxxXxxX、xxXxxXxXx、xxXxXxxXx、xxXxXxXxx、xXxxXxxXx、xXxxXxXxx、xXxXxxXxx、XxxXxxXxx、xxXxXxXxX、xXxxXxXxX、xXxXxxXxX、xXxXxXxxX、XxxXxxXxX、XxxXxXxxX、XxXxxXxxX、XxxXxXxXx、XxXxxXxXx、XxXxXxxXx、XxXxXxXxx和XxXxXxXxX;其中"X"指LM單元，和"x，，指DNA單元。40.根據(jù)任何前述實(shí)施方案的寡核苷酸或其綴合物，其中所述核苷酸具有12-24個核苷酸的長度，例如12-22個核苷酸的長度，優(yōu)選12-20個核苷酸的長度，例如12-19個核普酸的長度，更優(yōu)選12-18個核苷酸的長度，例如12-17個核苷酸的長度，更加優(yōu)選12-16個核苷酸的長度。41.根據(jù)實(shí)施方案1的寡核苷酸，其具有選自tgMeCatGgaTttGcaMeCa、tgMeCatGgaTttGcaMeC、MeCatGgaTttGcaMeC、tGcAtGgAtTtGcAc、cAtGgAtTtGcAc、MeCatGGatTtGcAMeC、TgMeCatGGatTtGcAMeC和TgMeCaTgGaTTtGcACa的序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；或其綴合物。(SEQIDNO82-89)42.根據(jù)實(shí)施方案2的寡核苷酸，其具有選自cMeCatTgtCacActMeCca、cMeCatTgtAacTctMeCca、ccAttGtcAcaMeCtcMeCa、cMeCatTgtMeCacActMeCc、atTgtMeCacActMeCc、ccAttGtcAcaMeCtcMeC、AttGtcAcaMeCtcMeC、aTtGtMeCaCaMeCtMeCc、AttGTcaMeCaMeCtMeCMeC、MeCcAttGTcaMeCaMeCtMeCMeC、MeCcaTtgTcacActcMeCa和MscMsCAttgtcacacTM6CMeCa的序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；或其綴合物。(SEQIDNO90-101)43.根據(jù)實(shí)施方案3的寡核苷酸，其具有選自tMeCacGatTagMeCatTaa、aTcaMeCgaTtaGcaTta、TcAcGaTtAgMeCaTtAa、AtcAcGaTtAgMeCaTta的序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；或其綴合物。(SEQIDNO102-105)。44.根據(jù)實(shí)施方案4的寡核苷酸，其具有選自gAgcMeCgaAcgAacAa、gcMeCgaAcgAacAa、GaGcMeCgAaMeCgAaMeCaA和GcMeCgAaMeCgAaMeCaA的序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；或其級合物。(SEQIDNO106-109)。45.根據(jù)任何前述實(shí)施方案的寡核苷酸或其綴合物，其中寡核苷酸包含至少一個不同于砩酸二酯的核苷間連接基團(tuán)。46.根據(jù)實(shí)施方案45的寡核苷酸或其綴合物，其中所述不同于磷酸二酯的核苷間連接基團(tuán)是硫代磷酸酯。47.根據(jù)實(shí)施方案46的寡核苷酸或其綴合物，其中所有核苷間連接基團(tuán)都是硫代磷酸酯。48.根據(jù)任何前述實(shí)施方案的寡核苷酸或其綴合物，其中所述LNA單元獨(dú)立地選自硫代-LM單元、氨基-LNA單元和氧-LNA單元。49.根據(jù)實(shí)施方案48的寡核苷酸或其綴合物，其中所述LNA單元是P-D-型。50.根據(jù)實(shí)施方案48的寡核苷酸或其綴合物，其中所述LNA單元是P-D-型的氧-LNA單元。51.根據(jù)任何前述實(shí)施方案的寡核苷酸或其綴合物用作為藥物。52.藥物組合物，其包含根據(jù)實(shí)施方案1-50中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物和藥學(xué)上可接受的載體。53.根據(jù)實(shí)施方案5.2的組合物，其中所述載體是鹽水或緩沖,鹽水。54.根據(jù)實(shí)施方案1一50中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物或根據(jù)實(shí)施方案52的組合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。55.用于治療癌癥的方法，其包括施用根據(jù)實(shí)施方案1-50中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物或根據(jù)實(shí)施方案52的組合物的步驟。56.根據(jù)實(shí)施方案1—50中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物或根據(jù)實(shí)施方案52的組合物用于制備用于治療增加的血漿膽固醇水平的藥物的用途。57.根據(jù)實(shí)施方案1—50中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物或根據(jù)實(shí)施方案52的組合物用于上調(diào)Nrdg3、AldoA、Bckdk或CD320的mRNA水平的用途。實(shí)驗(yàn)LNA單體構(gòu)件及其衍生物根據(jù)公開的操作和本文引用的參考文獻(xiàn)進(jìn)行制備，參見，例如W003/095467Al和D.S.Pedersen，C.Rosenbohm,T.Koch(2002)PreparationofLNAPhosphoramidites,Synthesis6，802-808.寡核苷酸使用亞磷酰胺法在Expedite8900/MOSS合成儀(多重寡核脊酸合成系統(tǒng)(MultipleOligonucleotideSynthesis旦ystem))以1Mmol或15Mmol規(guī)模進(jìn)行合成。對于更大規(guī)模的合成，使用AktaOligoPilot(GEHealthcare)。在合成結(jié)束時(帶DMT),寡核苷酸在室溫下使用氨水1-2小時從固體載體上切下，且在65"C進(jìn)一步脫保護(hù)4小時。寡核苷酸通過反相HPLC(RT-HPLC)進(jìn)行純化。在DMT-基團(tuán)去除后，寡核苷酸通過AE-HPLC、RP-HPLC和CGE進(jìn)行表征，分子量由ESI-MS進(jìn)一步證實(shí)。關(guān)于更多細(xì)節(jié)參見下文。LNA-固體載體的制備LM琥珀酰半酯的制備將5，-0-Dmt-3，-羥基-LNA單體(500mg)、琥珀酸酐(12eq.)和DMAP(1.2eq.)溶解于DCM(35mL)中。使反應(yīng)在室溫下攪拌過夜。用NaH2P040.1MpH5.5(2x)和鹽水(lx)萃取后，有才幾層用無水Na2S04進(jìn)行進(jìn)一步干燥、過濾且蒸發(fā)。半酯衍生物以95%產(chǎn)率獲得并且無需任何進(jìn)一步純化即可使用。LNA-載體的制備將上文制備的半酯衍生物(90|umol)溶解于最小量的DMF中，且加入DIEA和pyBOP(90nmol)，并一起混合1分鐘。使這種預(yù)活化的混合物與LCAA-CPG(500A，80-120篩目，300mg)在手動合成器中組合且攪拌。在室溫下1.5小時后，載體被濾掉且用DMF、DCM和MeOH進(jìn)行洗滌。干燥后，載量測定為57jamo1/g(參見TomBrown,DorcasJ.S.Brown.Modernmachine-aidedmethodsofoligodeoxyribonucleotidesynthesis.In:F.Eckstein,editor.OligonucleotidesandAnaloguesAPracticalApproach.Oxford:IRLPress,1991:13-14)。寡核苷酸的延伸亞磷酰胺(A(bz)，G(ibu)，5-甲基-C(bz))或T-p-氛乙基亞磷酰胺)的偶聯(lián)通過使用溶于乙腈的5，-O-DMT-保護(hù)的amidite溶液和溶于乙腈(0.25M)的DCI(4，5-二氰基咪唑)作為活化劑來進(jìn)行。硫醇化通過使用蒼耳烷氯化物(0.01M于乙膪吡啶10%中)來進(jìn)行。剩余試劑是一般用于寡核苷酸合成的那些。經(jīng)由RP-HPLC的純化柱XterraRP18流速3mL/分鐘緩沖液0.1M乙酸銨pH8和乙腈縮寫DMT:二曱氧三苯曱基DCI:4，5-二氰基咪唑DMAP:4-二曱氨基吡咬DCM:二氯甲烷DMF:二甲基甲酰胺THF:四氫呋喃DIEA:乂^"二異丙基乙胺PyB0P:苯并三唑-l-基-氧-三-吡咯烷-磷錄六氟砩酸鹽Bz:苯曱?；鵌bu:異丁?；?滋辨J;戎-/7/^差裙茅^^沒#;^岸鏈溫^乾微小RNA:miR-122a:5,-uggagugugacaaugguguuugu-3/SEQIDNO:1miR-122a3,至5,:3,-uguuugugguaacagugugaggu-5,(SEQIDNO:1反向)表lLNA抗-miR寡核苷酸序列和L:SEQIDNO:寡聚體IDSEDID序列Tm(x:)2SPC3370XxxX設(shè)計SEQID565，-cCatTgtCacActCca-3'PS主鏈753SPC3372XxxX設(shè)計SEQID575，一ccAttGtcAcaCtcCa-3'PS主鏈694SPC3375GapmerSEQID585，-CCAttgtcacacTCCa-3'PS主鏈695SPC354915-聚體SEQID595'-CcAttGTcaCaCtCC-3'PS主鏈786SPC3550錯配對照SEQID605'-CcAttgTgaCgCt^C-3'PS主鏈327SPC3373錯配對照SEQID615'-ccAttGtcIca^tcCa-3'PS主鏈468SPC354813-聚體SEQID625，-AttGTcaCaCtCC-3'PS主鏈小寫字母DNA，大寫字母LM(所有LMC都是甲基化的)，有下劃線的錯配解鏈溫度針對成熟的miR-122a序列進(jìn)行評估，使用硫代磷酸酯連接的的合成miR-122aRNA寡核苷酸。LNA抗-miR/miR-122a寡聚體雙鏈體在500W無RM酶H20中稀釋至3MM,這隨后與500W2x二聚化緩沖液進(jìn)行混合(最終的寡聚體/雙鏈體濃度1.5MM，2xTm緩沖液200mMNaCl，0，2mMEDTA，20mMNaP，pH7,0，DEPC處理以去除RNA酶)?；旌衔锸紫燃訜嶂?5T3分鐘，隨后允許冷卻至室溫(RT)30分鐘。RT溫育后，L使用PETemplab軟件(PerkinElmer)在Lambda40UV/VIS分光光度計與peltier溫度編程器(progammer)PTP6上進(jìn)4亍測量。溫度從20C上升至95。C且隨著再次降至2QTC，連續(xù)記錄在260nm處的吸收。解鏈和退火的一階導(dǎo)數(shù)和局部最大值用于評估解鏈/退火點(diǎn)(Tm)，兩者應(yīng)給出相似/相同L值。對于一階導(dǎo)數(shù)，91個點(diǎn)用于計算斜度。通過置換抗mir寡核苷酸和互補(bǔ)RNA分子，上述測定法可以用于測定其他寡核苷酸例如根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的L。然而，在一個實(shí)施方案中，L可以對互補(bǔ)DNA(硫代磷酸酯鍵)分子制得。一般地，針對DM互補(bǔ)分子測量的L比關(guān)于等同RM互補(bǔ)物的L低約10X:。使用DNA互補(bǔ)物測量的L因此可以在其中雙鏈體具有極高L的情況下使用。<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>應(yīng)認(rèn)識到關(guān)于具有極高L的寡核苷酸，上述TV測定法可能不足以測定L。在此類情況下，硫代磷酸酯DNA互補(bǔ)分子的使用可以進(jìn)一步降低Tm。甲酰胺的使用在寡核苷酸雜交分析中是常規(guī)的(參見Hutton1977，NAR4(10)3537-3555)。在上文測定法中，15%甲酰胺的包括一般使L降低約9C，和50%甲酰胺的包括一般使L降低約30匸。使用這些比，因此可以測定寡核苷酸針對其互補(bǔ)RM(磷酸二酯)分子的比較L，甚至當(dāng)雙鏈體的L例如高于95C時(在不存在甲酰胺的情況下)。對于具有極高L的寡核普酸，測定L的備選方法是進(jìn)行滴定且使其在凝膠上運(yùn)行以察看單鏈對雙鏈體，并且通過那些濃度和比測定涉及AG的Kd(解離常數(shù))以及乙,滋辨《.ZAC4^裙茅^4乂-戈義處^《哞W^定'勝LNA寡核苷酸穩(wěn)定性在來自人或大鼠的血漿(它還可以是小鼠、猴或狗血清)中進(jìn)行測試。在45|il血漿中，加入5plLNA寡核苷酸(以20juM的終濃度)。LNA寡核苷酸在血漿中于37n溫育0-96小時(血漿就核酸酶活性測試高達(dá)96小時且在核酸酶切割模式中未顯示出差異)。在指定時間時，樣品在液氮中進(jìn)行速凍。在血漿中的2pL(等于40pmol)LNA寡核苷酸通過添加15|iL水和3jiL6x載量染料(Invitrogen)進(jìn)行稀釋。使用10bp梯(Invitrogen，USA10821-015)作為標(biāo)記。向1n1梯中，加入1p16x載量和4p1水。樣品進(jìn)行混合，加熱至65X:i0分鐘且裝載至預(yù)運(yùn)行凝膠(16%丙烯酰胺，7MUREA，lxTBE,在50Watt下預(yù)運(yùn)行1小時)，且在50-60Watt下運(yùn)行2小時。隨后，染色用在lxTBE中的lxSyBRGold(分子探針)染色15分鐘。條帶使用來自BioRad的phosphoimager進(jìn)行顯現(xiàn)。LNA寡核苷酸對靶核酸表達(dá)(量)的影響可以在各種細(xì)胞類型中的任何一種中進(jìn)行測試，條件是耙核酸以可測量水平存在。靶可^.通過編碼所述核酸的核酸的瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)行內(nèi)源表達(dá)。乾核酸的表達(dá)水平使用例如RM印跡分析(包括微小RNARNA)、定量PCR(包括微小RNAqPCR)、核糖核酸酶保護(hù)測定法進(jìn)行常規(guī)測定。提供下述細(xì)胞類型用于舉例說明性目的，但其他細(xì)胞類型可以常規(guī)使用，條件是靶在所選擇的細(xì)胞類型中表達(dá)。細(xì)胞如下所述在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，且于37。C在95-98%濕度和5%0)2下進(jìn)行維持。細(xì)胞每周常規(guī)傳代2-3次。15PC3:人前列腺癌細(xì)胞15PC3由Dr.F.Baas，NeurozintuigenLaboratory,AMC，TheNetherlands友'清捐贈，且在DMEM(Sigma)+10%胎牛血清(FBS)+GlutamaxI+慶大霉素中進(jìn)行培養(yǎng)。PC3:人前列腺癌細(xì)胞系PC3購自ATCC,且在含谷氨酰胺的F12Coon，s(Gibco)+10%FBS+慶大霉素中進(jìn)行培養(yǎng)。518A2:人黑素瘤癌細(xì)胞系518A2由Dr.B.Jansen，SectionofexperimentalOncology,MolecularPharmacology,DepartmentofClinicalPharmacology,UniversityofVienna友十青捐贈，且在DMEM(Sigma)+10%胎牛血清(FBS)+GlutamaxI+慶大霉素中進(jìn)行培養(yǎng)。HeLa:宮頸癌細(xì)胞系HeLa在包含10%胎牛血清慶大霉素的MEM(Sigma)中在37C、95%濕度和5%C02下進(jìn)行培養(yǎng)。MPC-11:鼠類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系MPC-ll購自ATCC，且在含4mM。11^&歸乂+10%馬血清的DMEM中進(jìn)行維持。DU-145:人前列腺癌細(xì)胞系DU-145購自ATCC，且在含Glutamax+10%FBS的RPMI中進(jìn)行維持。RCC-4+/-VHL:用表達(dá)VHL的質(zhì)粒或空質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人腎癌細(xì)胞系RCC4購自ECACC，且根據(jù)制造商說明書進(jìn)行維持。786-0:人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系786-0購自ATCC，且根據(jù)制造商說明書進(jìn)行維持。HUVEC:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC購自Camcrex，且在EGM-2培養(yǎng)基中進(jìn)行維持。K562:人慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系K562購自ECACC，且在含Glutamax+10%FBS的RPMI中進(jìn)行維持。U87MG:人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG購自ATCC，且根據(jù)制造商說明書進(jìn)行維持。B16:鼠類黑素瘤細(xì)胞系B16購自ATCC，且根據(jù)制造商說明書進(jìn)行維持。LNCap:人前列腺癌細(xì)胞系LNCap購自ATCC，且在含Glutamax+10%FBS的RPMI中進(jìn)行維持。Huh-7:人肝、上皮樣在含IO%FBS、2mMGlutamaxI、lx非必需氨基酸、慶大霉素25Pg/ml的EaglesMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。M28:(DeutscheSammlungfiirMikroorganismen(DSM，B訓(xùn)nschwieg，Germany)):人B細(xì)胞淋巴瘤在補(bǔ)充有10%FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640中進(jìn)行維持。L1236:(DeutscheSammlungftirMikroorganismen(DSM，Braunschwieg,Germany)):人B細(xì)胞淋巴瘤在補(bǔ)充有10%FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640中進(jìn)行維持。^滋斧/七##模型；戎-邊2^義#核茅^^理表達(dá)miR-122a的細(xì)胞系Huh-7根據(jù)優(yōu)化的1ipofectamine2000(LF2000,Invitrogen)方案(如下)用LNA抗-miR以1和100nM濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Huh-7細(xì)胞在含10%FBS、2mMGlutamaxI、lx非必需氨基酸、慶大霉素25Pg/ml的EaglesMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天以2.5ml的總體積在6孔平板中進(jìn)行種植(300000細(xì)胞/孔)。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，制備在Optimem(Invitrogen)中稀釋的包含LF2000的溶液(1.2mloptimem+3.75WLF2000/孔，最終2,5PgLF2000/ml，最終總體積1.5ml)。LNA寡核苷酸(LNA抗-miR)也在optimem中進(jìn)行稀釋。285Woptiraem+15WLNA寡核苷酸(關(guān)于終濃度100nM10MM寡核苷酸原液和關(guān)于終濃度1nM0.1MM)。細(xì)胞在optimem中洗滌1次，然后將1.2mloptimem/LF2000混合物加入每個孔中。細(xì)胞在室溫下在LF2000混合物中溫育7分鐘，其中在300|a1寡核苷酸optimem溶液加入后。細(xì)胞與寡核苷酸和lipofectamine2000—起進(jìn)一步溫育4小時(在37X:，5。/。C02下在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中)。這4小時后，去除培養(yǎng)基/混合物且加入常規(guī)完全培養(yǎng)基。允許細(xì)胞生長另外20小時。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時收獲在Trizol(Invitrogen)中。RNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Trizol方案根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen)進(jìn)行提取，特別是在總RNA提取中保留微小RNA。多滋辦7;脊#和#^模型；^由凝V、MJ#^'勝定量尸(^#浙l裙茅鑀對邁/i^t這^抻賴RNA樣品中的miR-122a水平在ABI7500Fast實(shí)時PCR儀器(AppliedBiosystems，USA)上進(jìn)行評估，4吏用miR-122a特異性qRT—PCR試劑盒、mirVana(Ambion，USA)和miR—122a引物(A邁bion，USA)。操作根據(jù)制造商方案來進(jìn)行。結(jié)果與100nM的先前設(shè)計模型包括"每第3個"和"gap-mer"(SPC3370，SPC3372,SPC3375)基序比較，miR-122a特異性新LNA抗-miR寡核苷酸設(shè)計(即SPC3349(也稱為SPC3549))在1nM時在抑制miR-122a中更有效。未發(fā)現(xiàn)錯配對照抑制miR-122a(SPC3350)。結(jié)果顯示于圖1中。^滋辨炎y^邊/^VJ凝萍/^^這為、^f^估fl/7"w邊/ri7ocir-^jra橫dA)用于miRNA#:陣列分析的RNA標(biāo)記總RNA^f吏用Trizol試劑(Invitrogen)進(jìn)行提取，和3'末端j吏用T4RNA連接酶和Cy3-或Cy5-標(biāo)記的RNA接頭(5-P04-rUrUrU-Cy3/dT-3或5-P04-rUrUrU-Cy5/dT-3)進(jìn)4亍標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)包含2-5Pg總RNA、15MMRNA接頭、50mMTris-HCl(pH7.8)、10mMMgC12、10mMDTT、1mMATP、16%聚乙二醇和5單位T4RNA連接酶(Ambion，USA)，且于30X:溫育2小時，隨后為T4RM連接酶于80X:5分鐘的熱滅活。B)微陣列雜交和雜交后洗滌包含在miRBase微小RNA數(shù)據(jù)庫版本7.1中所有的來自小鼠(小家鼠(Musmusculus))和人(智人(Homosapiens))的注釋miRM的探針的LNA修飾的寡核苷酸捕獲探針(包括一組陽性和陽性對照探針)購自Exiqon(Exiqon，Denmark),且用于印制微陣列用于miRNA分析。捕獲探針包含5'末端C6-氨基修飾的接頭，且通過調(diào)整LNA含量和捕獲探針的長度設(shè)計為具有針對互補(bǔ)靶miRNA72X:的Tm。捕獲探針在150mM磷酸鈉緩沖液(pH8.5)中稀釋至10MM的終濃度，且使用來自BioRobotics的MicroGridIIP車歹'J器(arrayer)在45o/0濕度和室溫下一式四份地印跡到Codelink載玻片(AmershamBiosciences)上。印跡的載玻片如由制造商推薦的進(jìn)行后處理。標(biāo)記的RNA在包含4xSSC、0.1%SDS、1Pg/WHerringSpermDNA和38%甲酰胺的雜交混合物中于651C與LNA微陣列雜交過夜。雜交栽玻片在2xSSC、0.025%SDS中于65t:洗滌3次，隨后在0.08xSSC中洗滌3次，和最后在0.4xSSC中在室溫下洗滌3次。C)陣列掃描、圖像分析和數(shù)據(jù)處理微陣列使用ArrayWorx掃描儀(AppliedPrecision,USA)根據(jù)制造商的建議進(jìn)行掃描。將掃描的圖像輸入到TIGRSpotfinder版本3.1(Saeed等人，2003)內(nèi)用于提取平均斑點(diǎn)強(qiáng)度和中間局部本底強(qiáng)度，排除具有在中間局部本底+4x標(biāo)準(zhǔn)差下的強(qiáng)度的斑點(diǎn)。本底相關(guān)的強(qiáng)度使用變異穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)化包版本1.8.0(Huber等人，2002)就R(www."project,org)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。重復(fù)斑點(diǎn)的強(qiáng)度使用MicrosoftExcel求平均值。顯示>100%的變異系數(shù)的探針從進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析中排除。實(shí)施例9:經(jīng)由原位雜交檢測微小RNA，經(jīng)由原位雜交檢測在福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片中的微小RNAA)用于原位雜交的福爾馬林固定、石蠟包埋的切片的制備重新找到記錄的石蠟包埋的樣品且以5-10mm切片進(jìn)行切片，并且使用浮選技術(shù)固定在帶正電的載玻片中。載玻片貯存于4C直至進(jìn)行原位實(shí)驗(yàn)。B)原位雜交載玻片上的切片在二甲苯中進(jìn)行脫石蠟化，然后通過乙醇稀釋系列(從100%-25%)進(jìn)行再水化。將栽玻片浸入DEPC處理的水中且實(shí)施HC1和0.2%甘氨酸處理，在4%多聚甲醛中進(jìn)行再固定，且用乙酸酐/三乙醇胺進(jìn)行處理；載玻片在2次處理之間以IXPBS的幾次洗滌進(jìn)行漂洗。栽玻片于50"在hyb溶液(50%甲酰胺、5XSSC、500mg/mL酵母tRNA、lXDenhardt)中進(jìn)行預(yù)雜交30分鐘。隨后，將與每種選擇的miRNA互補(bǔ)的3pmolFITC-標(biāo)記的LNA探針(Exiqon，Denmark)加入hyb溶液中，且在比探針預(yù)期的Tm低20-25X:的溫度下(一般為45-55C取決于miRNA序列)雜交1小時。于65匸在0.IX和0.5XSCC中洗滌后，根據(jù)廠商的建議使用GenpointFluorescein(FITC)試劑盒(DakoCytomation，Denmark)進(jìn)行酪胺信號擴(kuò)增反應(yīng)。最后，載玻片用ProlongGold溶液進(jìn)行固定。在使用落射熒光顯微鏡證明所選擇的miRNA的表達(dá)前允許熒光反應(yīng)顯色16-24小時。經(jīng)由斑馬魚、爪蟾屬和小鼠胚胎的全包埋原位雜交檢測微小RNA所有洗滌和溫育步驟在2mleppendorf管中進(jìn)行。胚胎于41C在溶于PBS的4%多聚甲醛中固定過夜，且隨后通過等級系列(溶于PBST(包含0.l%Tween-20的PBS)的25%MeOH、溶于PBST的50%MeOH、溶于PBST的75%MeOH)轉(zhuǎn)移至100%甲醇且貯存于-20X:長達(dá)數(shù)月。在原位雜交的第一天時，胚胎通過在溶于PBST的75。/。MeOH、溶于PBST的50。/。MeOH、溶于PBST的25%Me0H和100%PBST(4x5分鐘)中順次溫育5分鐘進(jìn)行再水化。魚、小鼠和爪蟾屬胚胎用蛋白酶K(溶于PBST的10lug/ml)于37C處理45分鐘，在溶于PBS的4%多聚甲醛中再固定20分鐘，且用PBST洗滌3x5分鐘。在水中短暫洗滌后，內(nèi)源性堿性磷酸酶活性通過使胚胎在O.1M三乙醇胺和2.5%乙酸酐中溫育10分鐘進(jìn)行封閉，隨后為在水中的短暫洗滌和在PBST中的5x5分鐘洗滌。隨后將胚胎轉(zhuǎn)移至雜交緩沖液(50%甲酰胺、5xSSC、0.1%Tween、9.2mM檸檬酸、50ug/ml肝素、500ug/ml酵母RNA)中在雜交溫度下2-3小時。雜交在包含與每種選擇的miRNA互補(bǔ)的10nM3，DIG-標(biāo)記的LNA探針(RocheDiagnostics)的新鮮預(yù)熱的雜交緩沖液中進(jìn)行。雜交后洗滌在雜交溫度下通過在HM-(不含肝素和酵母RNA的雜交緩沖液)、75%HM-/25%2xSSCT(包含0.1%Tween-20的SSC)、50%HM-/50%2xSSCT、25%HM-/75%2xSSCT、100%2xSSCT中順次溫育15分鐘，和在O.2xSSCT中溫育2x30分鐘來進(jìn)行。然后，通過在75%0.2xSSCT/25%PBST、50%0.2xSSCT/50%PBST、25%0.2xSSCT/75%PBST和100%PBST中順次溫育10分鐘將胚胎轉(zhuǎn)移至PBST。在封閉緩沖液(溶于PBST的2%綿羊血清/2mg:mlBSA)中封閉1小時后，胚胎在包含anti-DIG-APFAB片段(Roche,1/2000)的封閉緩沖液中于4X:溫育過夜。第二天，斑馬魚胚胎在PBST中洗滌6x15分鐘，小鼠和熱帶爪蟾(X.tropicalis)胚胎在包含2mM左旋咪唑的TBST中洗滌6x1小時，隨后于4TC2天，伴隨洗滌緩沖液的常規(guī)更新?？贵w后的洗滌之后，胚胎在染色緩沖液(100mMtrisHC1pH9.5、50mMMgC12、100mMNaCl、0.1%tween20)中洗滌3x5分鐘。染色在補(bǔ)充有4.5p1/mlNBT(Roche，50mg/ml原液)和3.5jn1/mlBCIP(Roche，50mg/ml原液)的緩沖液中完成。反應(yīng)用溶于PBST的lmMEDTA進(jìn)行終止，且將胚胎貯存于4X:。在成像前，胚胎經(jīng)由增加的甲醇系列(溶于PBST的25%MeOH、溶于PBST的50%MeOH、溶于PBST的75%MeOH、100%MeOH)在Murray's溶液(2:1苯甲酸千酯苯曱醇)中進(jìn)行封固。體,A^費(fèi)；為、岸希^浙^^^這f^fiZ7ii^為V^fW,g細(xì)為、庠和c細(xì)合4總RNA^f吏用RNeasyminikit(Qiagen)或4吏用Trizol試劑(Invitrogen)進(jìn)行分離。對于使用RNeasyminikit(Qiagen)的總RNA分離，細(xì)胞用PBS進(jìn)行洗滌，且向孔中直接加入補(bǔ)充有1%巰基乙醇的CellLysisBuffer(RTL，Qiagen)。數(shù)分鐘后，樣品根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行加工。對于mRNA表達(dá)的體內(nèi)分析，組織樣品使用Retsch300MM勻漿器進(jìn)行第一次均質(zhì)化，并且總RNA如由制造商所描述的使用Trizol試劑或RNeasymini試劑盒進(jìn)行分離。第一鏈合成(來自mRNA的cDNA)根據(jù)制造商的說明書(Qiagen)使用OmniScriptReverseTranscriptase試劑盒或M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(基本上如制造商(Ambion)所描述的)來進(jìn)行。當(dāng)使用OmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶時，0.5總RNA每種樣品調(diào)整至12Hi,且與0.2W聚UT)12—18(0.5Pg/m)(LifeTechnologies)、2mdNTP混合物(各5mM)、2|il10xRT緩沖液、0.5WRNAguardRNA酶抑制劑(33單位/ml，Amersham)和1WOmniScript逆轉(zhuǎn)錄酶混合，隨后于37匸溫育60分鐘，且于93C熱滅活5分鐘。當(dāng)?shù)谝绘満铣墒褂秒S機(jī)十倍體和M-MLV-逆轉(zhuǎn)錄酶(基本上如制造商(Ambion)所描述的)來進(jìn)行時，每種樣品的0.25Pg總RNA在H20中調(diào)整至10.8W。加入2W十倍體和2WdNTP混合物(各2.5mM)。將樣品加熱至70C3分鐘，且立即在冰水中冷卻，且加入3.25m1包含(2W10xRT緩沖液；1mM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；0.25WRNA酶抑制劑)的混合物。cDNA于42iC合成60分鐘，隨后為于95*C10分鐘的熱滅活步驟，且最后冷卻至4X:。cDNA可以通過例如實(shí)時定量PCR進(jìn)一步用于mRNA定量。mRNA表達(dá)可以以本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)4于測定。例如，mRNA水平可以通過例如RNA印跡分析、竟?fàn)幘酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、核糖核酸酶保護(hù)測定法(RPA)或?qū)崟rPCR進(jìn)行定量。實(shí)時定量PCR是目前優(yōu)選的。RNA分析可以對總細(xì)胞RNA或mRNA來進(jìn)行。RNA分離和RNA分析的方法例如RNA印跡分析是本領(lǐng)域常規(guī)的，且在例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons中教導(dǎo)。實(shí)施定量(PCR)可以使用可從BioRAD獲得的商購可得的iQMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystem便利地完成。實(shí)時定量PCR是本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，且在例如Heid等人RealtimequantitativePCR,GenomeResearch(1996)，6:986-994中教導(dǎo)?！蹲谈?u;zw^裙茅^^傳^凝承;^甜炎體內(nèi)研究6組動物(5只小鼠/組)以下述方式進(jìn)行處理。組l動物通過i.v.用0,2ml鹽水注射連續(xù)3天，組2接受2.5mg/kgSPC3372,組接受6.25mg/kg，組4接受12.5mg/kg和組5接受25mg/kg，而組6接受25mg/kgSPC3373(錯配LM-抗miR^寡核苷酸)，全都以相同方式。所有劑量由每個動物的第0天體重進(jìn)行計算。在給藥前(第0天)和最后1次劑量后24小時(第3天)，將眶后血液收獲在包含EDTA的管中，并且收獲血漿部分且冷凍貯存于-80X:用于膽固醇分析。在處死時，解剖肝，并且將一部分切成5mm立方體且浸入5體積水冷的RNAlater中。第二部分在液氮中進(jìn)行速凍且貯存用于冷凍切片。如上所述從肝樣品中提取總RM，且通過微小RM特異性QPCR就miR-122a水平進(jìn)行分析。圖5證實(shí)用SPC3372獲得的明確的劑量應(yīng)答，其中IC50在約3一5mg/kg,而使用miR-122a的錯配LMantago-mirSPC3373未檢測到miR-122a抑制?！蹲剔k^Ci7/見//雄'勝小處哞4琳力^邊/y-"^體內(nèi)研究IO組動物(雌性C57/BL6;3只小鼠/組)以下述方式進(jìn)行處理。組1動物在第0天、第2天和第4天時通過i.p.用0.2ml鹽水進(jìn)行注射。組2-10通過i.p.用3種不同濃度(25nig/kg、5mg/kg和lmg/kg)的LNA抗miR-122a/SPC3372(組2-4)，LNA抗mir-122a/SPC3548(組5-7)或LNA抗mir-122a/SPC3549(組8-10)進(jìn)行給藥；LNA抗mir-122a序列在表1中給出。所有3種LNA抗miR-122a寡核苷酸都靶向肝特異性miR-122a。劑量由每個動物的第0天體重進(jìn)行計算。動物在最后1次劑量后48小時(第6天)處死，將眶后血液收獲在包含EDTA的管中，并且收獲血漿部分且冷凍貯存于-80X:用于膽固醇分析。在處死時，解剖肝，并且將一部分切成5mm立方體且浸入5體積冰冷的RMlater中。第二部分在液氮中進(jìn)行速凍且貯存用于冷凍切片?？俁NA根據(jù)制造商的建議(Invitrogen，USA)使用Trizol試劑從肝樣品中進(jìn)行提取，且根據(jù)制造商的建議(Ambion，USA)通過微小RM特異性QPCR就miR-122a水平進(jìn)行分析。圖2證實(shí)用所有3種LNA抗mir-122a分子(SPC3372、SPC3548、SPC3549)獲得的明確的劑量應(yīng)答。與SPC3372比較，SPC3548和SPC3549在體內(nèi)顯示出在miR-122a沉默方面顯著改善的功效(如由減少的miR-122a水平可見的)，其中SPC3549是最有效的(ICs。約lmg/kg)。上述實(shí)施例使用SPC3372和SPC3649使用5只小鼠/組進(jìn)行重復(fù)，并且組合的數(shù)據(jù)(每組總共8只小鼠)顯示于圖2b中。實(shí)施例12a:RNA印跡。在LNA-抗miR處理的小鼠肝中，與SPC3372比較，微小RNA特異性RNA印跡顯示出SPC3649所致的增強(qiáng)的miR-122阻斷。在這個實(shí)施例中使用的寡聚體SPC3649:5'-CcAttGTcaCaCtCC-3'(SEQID59)新設(shè)計SPC3372:5'-CcAUGtcAcaCtcCa-3'(SEQID57)舊設(shè)計決定評估SPC3649對SPC3649處理小鼠的肝中的miR-122miRNA水平的影響。LNA-抗miRSPC3649和SPC3372通過3次i.p.注射經(jīng)過6天時期每隔一日以指示劑量施用于小鼠，隨后在最后1次劑量后48小時處死動物?？俁NA從小鼠肝中取出。miR-122水平通過微小RNA特異性RNA印跡進(jìn)行評估(圖6)。正常小鼠用SPC3649處理導(dǎo)致顯著改善的、劑量依賴性miR-l22減少。進(jìn)行使SPC3649與SPC3372比較的微小RNA特異性RNA印跡(圖6)。如由成熟的單鏈miR-122的不存在以及僅存在LNA-抗miR和miR-122之間的雙鏈體條帶可見的，SPC3649在5和25mg/kg時完全阻斷miR-122。比較在RNA印跡上的雙鏈體相對于成熟條帶，SPC3649看起來在1mg/kg時與SPC3372在25mg/kg時一樣有效。^滋辨W;在ZW戎-邁/WW處理的小處j&^中^^e萄殍;^"f#^估總膽固醇水平使用來自ABXPentra的比色測定法CholesterolCP在血漿中進(jìn)行測量。膽固醇在酶促水解和氧化(2，3)后進(jìn)行測量。將21.5y1水加入1.5ja1血漿中。加入250n1試劑且在5分鐘內(nèi)膽固醇含量在540nM波長處進(jìn)行測量。對每個動物的測量一式兩份地進(jìn)行。敏感性和線性用2倍稀釋的對照化合物(ABXPentraN對照)進(jìn)行測試。膽固醇水平通過扣除本底進(jìn)行測定，且相對于鹽水處理小鼠的血漿中的膽固醇水平呈現(xiàn)。圖3證實(shí)在第6天時與鹽水對照比較，在接受SPC3548和SPC3549的小鼠中明顯降低的血漿膽固醇水平。^滋辨"；在ZW戎/Z7/-7"a^理^小葳#邊/i-"^乾鹽水對照和不同LNA-抗miR-122a處理的動物在最后1次劑量后48小時(第6天)處死，并且總RM根據(jù)制造商的建議(Invitrogen，USA)使用Trizol試劑從肝樣品中提取。mRNA水平通過實(shí)時定量RT-PCR分別就2種miR-122a靶基因-Bckdk(支鏈酮酸脫氫酶激酶，ENSMUSG00000030802)和醛縮酶A(aldoA，ENSMUSG00000030695)以及對于作為對照的GAPDH進(jìn)行評估，根據(jù)制造商的說明書(Appliedbiosystems，USA)使用Taqman測定法。圖4a和4b證實(shí)作為對使用所有3種LNA抗miR-122a分子(SPC3372、SPC3548、SPC3549)處理的應(yīng)答，2種miR-122a靼基因Bckdk和AldoA分別明確的劑量依賴性上調(diào)。相比之下，與鹽水對照動物比較，對于GAPDH對照的qPCR測定法未揭示LNA-抗miR-122a處理小鼠中的GAPDmRNA水平的任何差異(圖4c)。與SPC3372處理的小鼠比較，Bckdk和AldoAmRNA水平在SPC3548和SPC3549處理的小鼠中明顯更高(圖4a和4b)，從而證實(shí)其改善的體內(nèi)功效?！蹲蘔7J.'ZW慕祐茅磁在伴W作V^掙鍵^7《。體內(nèi)研究2組動物(21只小鼠/組)以下述方式進(jìn)行處理。組l動物通過i.v.用0.2ml鹽水注射連續(xù)3天，組2以相同方式接受25mg/kgSPC3372。所有劑量由每個動物的第0天體重進(jìn)行計算。最后l次劑量(第3天)后，來自每組的7個動物分別在第9天、第16天和第23天時處死。在這之前，在每天時，將眶后血液收獲在包含EDTA的管中，并且收獲來自每天的血漿部分且冷凍貯存于-80X:用于膽固醇分析。在處死時，解剖肝，并且將一部分切成5mm立方體且浸入5體積冰冷的RNAlater中。第二部分在液氮中進(jìn)行速凍且貯存用于冷凍切片?？俁NA如上所述由肝樣品中進(jìn)行提取，且通過微小RNA特異性QPCR就miR-122a水平進(jìn)行分析。圖7(處死日9、16或23對應(yīng)在最后1次劑量后1、2或3周處死)證實(shí)與鹽水對照比較，在接受SPC3372的小鼠中的2倍抑制，并且這種抑制在第16天時仍可以檢測到，而到第23天時，mil22a水平接近鹽水組的水平。其滋辦W;ZW慕裙茅^在琳體內(nèi)研究2組動物(21只小鼠/組)以下述方式進(jìn)行處理。組l動物通過i.v.用0.2ml鹽水注射連續(xù)3天，組2以相同方式接受25mg/kgSPC3372。所有劑量由每個動物的第0天體重進(jìn)行計算。最后1次劑量(第3天)后，來自每組的7個動物分別在第9天、第16天和第23天時處死。在這之前，在每天時，將眶后血液收獲在包含EDTA的管中，并且收獲來自每天的血漿部分且冷凍貯存于-80匸用于膽固醇分析。在處死時，解剖肝，并且將一部分切成5mm立方體且浸入5體積水冷的RNAlater中。第二部分在液氮中進(jìn)行速凍且貯存用于冷凍切片?？俁NA如上所述由肝樣品中進(jìn)行提取，且通過微小RM特異性QPCR就miR-122a水平進(jìn)行分析。圖8證實(shí)與鹽水對照比較，在接受SPC3372的小鼠中的2倍抑制，并且這種抑制在第16天時仍可以檢測到，而到第23天時，mil-22a水平接近鹽水組的水平。#于《滋辦〃-^，^^T迷橫斧；NMRI小鼠使用2.5-25mg/kg的日劑量用SPC3372靜脈內(nèi)施用連續(xù)3天。動物在最后1次劑量后24小時、1、2或3周處死。收獲肝，分成片且浸入RNAlater(Ambion)中或進(jìn)行速凍。RNA根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen)用Trizol試劑從RNAlater組織中進(jìn)行提取，除了沉淀的RNA在80%乙醇中進(jìn)行洗滌且不渦旋。RNA根據(jù)制造商(Appliedbiosystems)用于mRNATaqManqPCR或RNA印跡(參見下文)。速凍片進(jìn)行冷凍切片用于原位雜交。此外，對于圖9-14，SPC3372命名為LNA-抗miR和SPC3373(錯配對照)命名為"mm"而不是使用SPC編號。^滋辨經(jīng)由邊/i-"^卑浙S戶C"72^浙量諒潛'勝邁/W-"^乾/Z7iW謬尋小鼠如上所述用不同SPC3372劑量處理連續(xù)3天，且在最后l次劑量后24小時處死。對從肝中提取的總RNA實(shí)施qPCR。具有預(yù)測的miR-122乾位點(diǎn)且通過微陣列分析觀察到上調(diào)的基因使用qPCR就經(jīng)由增加SPC3372劑量的劑量依賴性誘導(dǎo)進(jìn)行研究。來自在最后1次劑量后24小時處死的2-3只小鼠/組的總肝RNA就指示的基因?qū)嵤﹒PCR。圖9中顯示的是相對于鹽水組的mRNA水平，n-2-3(2.5-12.5mg/kg/天n=2,無SD)。還顯示的是錯配對照(mm,SPC3373)。測定的基因:具有預(yù)測的miR-122靶位點(diǎn)的Nrdg3AldoA，Bckdk，CD320。AldoB和Gapdh不具有預(yù)測的miR-122耙位點(diǎn)。在用不同劑量的SPC3372處理后可見miR-122靶基因明確的劑量依賴性誘導(dǎo)?！蹲剔k4^V"〃邁L-"2a乾MW^辨^謬尋NMRI雌性小鼠用25mg/kg/天SPC3372連同鹽水對照處理連續(xù)3天，且分別在最后1次劑量后1、2或3周處死。RNA由肝中提取且通過孩史陣列數(shù)據(jù)選擇的，預(yù)測的miR-122a靼mRNA的mRNA水平通過qPCR進(jìn)行研究。分析來自每組的3個動物。測定的基因具有預(yù)測的miR-122靶位點(diǎn)的Nrdg3AldoA，Bckdk，CD320。Gapdh不具有預(yù)測的miR-122乾位點(diǎn)?？梢娝矔r誘導(dǎo)隨后恢復(fù)為正常表達(dá)水平，類似于正常miR-122a水平的恢復(fù)(圖10)。在每個單個時間點(diǎn)上，mRNA水平相對于個體GAPDH水平和鹽水處理組的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。還包括的是來自在最后1次劑量后24小時處死的動物的值。顯示的是平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，n=3(24小時11=3)?！蹲瘫鍶義'經(jīng)由#P7Wr#謬尋與先前實(shí)施例一樣的肝RNA樣品就Vldlr誘導(dǎo)進(jìn)行研究。在SPC3372處理后可見瞬時上調(diào)，如同其他預(yù)測的miR-122a靶mRNA—樣(圖11)?！蹲滩縒,在哞#邊/i-"2a/5^C"72雙鏈謬^^l定^SPC3372和SPC3372/miR-122a雙鏈體的穩(wěn)定性在小鼠血漿中于37。C經(jīng)過96小時進(jìn)行測試。圖12中顯示的是SYBR-Gold染色的PAGE。SPC3372經(jīng)過96小時是完全穩(wěn)定的。SPC3372/miR-122a雙鏈體立即被截短(未由SPC3372涵蓋的單鏈miR-122a區(qū)域的降解)但其后經(jīng)過96小時幾乎完全穩(wěn)定。預(yù)先形成的SPC3372/miR-122雙鏈體顯示出在血清中經(jīng)過96小時的穩(wěn)定性連同SPC3372分子的高熱雙鏈體穩(wěn)定性的事實(shí)支持我們的想法SPC3372對miR-122a的抑制是由于2種分子之間穩(wěn)定雙鏈體的形成，這也在細(xì)胞培養(yǎng)中得到報道(Naguibneva等人2006)。姿滋辨"；4',務(wù)邊^(qū)-"2fl^由^^^72^腐岸爭放歡鏈脊多^還對肝RNA實(shí)施微小RMRNA印跡。圖13中顯示的是用miR-122a特異性探針探測(上圖)且用Let-7特異性探針再次探測(下圖)的膜。使用miR-122a探針，可以檢測到2個條帶，1個對應(yīng)成熟的miR-122和1個對應(yīng)SPC3372和miR-122之間的雙鏈體。為了證實(shí)miR-122的沉默，對肝RNA樣品實(shí)施小RNARNA印跡分析，這顯示出顯著減少水平的可檢測的成熟miR-122，與我們的實(shí)時RT-PCR結(jié)果一致。相反，let-7a對照的水平未改變。有趣的是，觀察到改變的miR-122/SPC3372異源雙鏈體條帶的劑量依賴性積聚，暗示SPC3372不耙向miR-122進(jìn)行降解，而是與微小RNA結(jié)合，從而立體阻礙其功能。RNA印跡分析如下進(jìn)行RNA膜的制備如Sempere等人2002中所述來完成，除了下述改變外在曱酰胺加樣緩沖液(47.5%曱酰胺、9mMEDTA、0.0125%溴酴藍(lán)、0.0125%二甲苯藍(lán)、0.0125D/。SDS)中的總RNA，10ng/泳道，裝載到15。/。變性NovexTBE-尿素聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上，而不使RM預(yù)熱。在200mA時將RNA電泳轉(zhuǎn)移至GeneScreen加雜交轉(zhuǎn)移膜(PerkinElmer)35分鐘。膜用與成熟微小RNA互補(bǔ)的32P-標(biāo)記的LNA修飾的寡核苷酸進(jìn)行探測*。LNA寡核苷酸如(V《16czi等人20Q4)中所述進(jìn)行標(biāo)記且與膜雜交，除了下述變化外預(yù)雜交和雜交溶液包含50%曱酰胺、0.5%SDS、5xSSC、5xDenhardts溶液和20Pg/ml剪切變性緋精DNA。雜交在45X:下進(jìn)行。印跡通過在Storm860掃描儀中掃描進(jìn)行顯現(xiàn)。本底膜的信號從源于miRNA條帶的放射性信號中扣除。miR-122信號的值基于let-7a信號就裝載差異進(jìn)行校正。為了測定放射性信號的尺寸，依照供應(yīng)商的建議使用DecadeMarkerSystem(Ambion)。《滋辨"；遞過，勿^付j祖殺it^估^57^"〃^邊/^-2"fl^條庫遂對來自處理動物的肝冷凍切片實(shí)施原位雜交用于miR-122和SPC3372的檢測和定位(圖14)。與miR-122互補(bǔ)的探針可以檢測miR-122a。第2種探針與SPC3372互補(bǔ)。圖14中顯示的是在10x放大倍數(shù)下的覆蓋，綠色是miR-122a和SPC3372的分布和表觀量，和藍(lán)色是DAPI核染色。100x放大倍數(shù)揭示miR-122a和SPC3372在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)分布。來自鹽水對照動物的肝切片顯示在整個肝切片上的強(qiáng)miR-122染色模式，而來自SPC3372處理小鼠的切片顯示顯著減少的片狀染色模式。相比之下，SPC3372分子在SPC3372處理的肝中而不是在未處理的鹽水對照肝中容易地檢測到。更高的放大倍數(shù)將miR-122a定位于肝細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)，在其中原位才莫式的miR-122明顯區(qū)室化，而SPC3372分子在整個細(xì)胞質(zhì)中均勻分布。實(shí)施例23:微陣列分析我々:H吏用AffymetrixMouseGenome4302.0卩車歹'J進(jìn)行來自最后1次劑量后24小時的鹽水、LNA-抗miR-122處理和LNA錯配對照處理的小鼠肝的總RNA樣品的全基因組表達(dá)分析。陣列數(shù)據(jù)的分析揭示與鹽水和LNA錯配對照比較，在LM-抗miR處理的小鼠肝中上調(diào)的455種轉(zhuǎn)錄物，而54種轉(zhuǎn)錄物是下調(diào)的(圖15a)。在Ensembl數(shù)據(jù)庫中總共可以鑒定415種上調(diào)和53種下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物。隨后就6nt序列CACTCC的存在檢查差異表達(dá)的mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)，所述序列對應(yīng)成熟miR-122中的核苷酸2-7種區(qū)域的反向互補(bǔ)物。具有至少一個miR-122識別序列的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目在上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物中是213(51%)，在下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物內(nèi)是10(19%)，而在隨機(jī)序列群體中的頻率是25%，暗示上調(diào)的mRNA的顯著庫表示肝中直接的miR-122靶(圖15b)。LNA-抗miR處理顯示miR-122水平在24小時時最大的減少，在1周時50%的減少和在最后1次LNA劑量后3周時匹配鹽水對照(實(shí)施例12"舊設(shè)計，，)。這與在隨后時間點(diǎn)時2個小鼠組之間顯著減少數(shù)目的差異表達(dá)基因一致。在最后1次LNA劑量后24小時的509種mRNA比較，在l周后鑒定了251種差異表達(dá)的基因，但在處理后3周后僅18種基因(圖15c和15d)。一般而言，在LNA-抗miR處理后24小時上調(diào)的基因隨后在接下來的2周朝向?qū)φ账交謴?fù)(圖15d)?？傊蟛糠衷贚NA-抗miR處理后上調(diào)/去阻遏的基因是miR-122靶，表明阻斷miR-122的非常特異的效應(yīng)。此外，上調(diào)/去阻遏的基因在處理結(jié)束后3周接近正常水平，暗示相對長的療效，然而不引起永久改變，即效應(yīng)是可逆的。方法LM-抗iniR處理小鼠的基因表達(dá)分析。將鹽水和LNA-抗miR處理小鼠的肝的表達(dá)譜進(jìn)行比較。NMRI雌性小鼠用25mg/kg/天LNA-抗miR連同鹽水對照處理連續(xù)3天，且在最后1次劑量后24小時、1、2或3周處死。此外，獲得在最后1次劑量后24小時用錯配LNA對照寡核苷酸處理的小鼠肝的表達(dá)語。分析來自每組的3只小鼠，產(chǎn)生總共21個表達(dá)譜。RNA質(zhì)量和濃度分別使用Agilent2100Bioanalyzer和NanodropND-1000進(jìn)行測量。總RNA根據(jù)GeneChipExpression3'-AmplificationReagentsOne-cyclecDNA試劑盒說明書(AffymetrixInc，SantaClara,CA，USA)進(jìn)行加工，以產(chǎn)生雙鏈cDNA。這根據(jù)制造商的說明書用作模板以產(chǎn)生生物素標(biāo)記的cRNA。使15微克生物素標(biāo)記的cRNA斷裂成長度為35-200個堿基的鏈，其中10微克在AffymetrixMouseGenome4302.0陣列上在GeneChip雜交爐6400中使用標(biāo)準(zhǔn)操作雜交過夜。陣列進(jìn)行洗滌且在GeneChipFluidicsStation450中進(jìn)行染色。掃描4吏用GeneChipScanner3000來進(jìn)行，并且圖像分析使用GeneChipOperatingSoftware來進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計分析使用用于R編程環(huán)境7的LI固A軟件包來完成。在所有雜交中由GC0S軟件報道為不存在的探針從數(shù)據(jù)集中去除。此外，將強(qiáng)度濾器應(yīng)用于數(shù)據(jù)集以去除顯示低于16的本底校正的強(qiáng)度的探針。數(shù)據(jù)使用分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化28進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。差異表達(dá)使用線性模型方法進(jìn)行評估。P值使用Benjamini和Hochberg就多重檢驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。如果經(jīng)調(diào)整的p值是p〈0.05，那么檢驗(yàn)被視為顯著的。Affymetrix陣列數(shù)據(jù)的聚類和可視化使用MultiExperimentViewer軟件29來完成。乾位點(diǎn)預(yù)領(lǐng)，J具有注釋的3，UTR的轉(zhuǎn)錄物使用EnsMart數(shù)據(jù)采掘工具30從Ensembl數(shù)據(jù)庫(版本41)中提取，且尋找CACTCC序列的存在，所述CACTCC序列是成熟的miR-122序列中的核苷酸2-7種子的反向互補(bǔ)物。作為本底對照，對應(yīng)在最后1次LNA-抗miR劑量后24小時時上調(diào)和下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物的平均3'UTR長度，對一組長度為1200nt的1000個序列尋找6核苷酸miR-122種子匹配。這進(jìn)行500次且平均計數(shù)用于比較。實(shí)施例24.與antagomir抑制miR-122比較，在小鼠肝中LNA-抗miR對miR-122的劑量依賴性抑制得到增強(qiáng)。NMRI雌性小鼠用指示劑量的LM-抗miR(SPC3372)連同錯配對照(mm，SPC3373)、鹽水和antagomir(SPC3595)處理連續(xù)3天，且在最后1次劑量后24小時處死(如實(shí)施例11"舊設(shè)計"中，n=5)。miR-122水平通過qPCR進(jìn)行分析且相對于鹽水處理組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。具有預(yù)測的miR-122靶位點(diǎn)且在表達(dá)分析中上調(diào)的基因(AldoA、Nrdg3、Bckdk和CD320)顯示出通過qPCR測量的增加LNA-抗miR劑量所致的劑量依賴性去阻遏。與antagomir處理的小鼠比較，在LNA-抗miR處理的小鼠中去阻遏對所有測試的miR-122靼mRNA(AldoA、Bckdk、CD320和Nrdg3，圖17、18、19、20)都一致地更高。當(dāng)通過miR-122特異性qPCR分析miR-122抑制時，這也得到表明(圖16)。因此LNA-抗miR產(chǎn)生比相應(yīng)劑量的antagomir更有效的對miR-122的功能抑制。實(shí)施例25.在高膽固醇血癥小鼠中LNA-抗miR對miR-122的抑制連同膽固醇減少和miR-122靶mRNA去阻遏。C57BL/6J雌性小鼠在SPC3649處理開始前喂養(yǎng)高脂飲食13周。當(dāng)在LNA-抗miR處理開始時稱重時，與僅在20g下的正常小鼠的重量比較，這導(dǎo)致增加至30-35g的重量。高脂飲食小鼠導(dǎo)致約130mg/dl顯著增加的血漿總膽固醇水平，因此使得與約70mg/dl的正常水平比較小鼠為高膽固醇血癥。高膽固醇血癥和正常小鼠都用5mg/kgSPC3649和相應(yīng)的錯配對照SPC3744每周i.p.處理2次，共51/2周的研究時期。血液樣品每周進(jìn)行收獲且血漿總膽固醇在研究的整個過程期間進(jìn)行測量。在小鼠處死后，肝和血液樣品制備用于總RNA提取、miRNA和mRNA定量、血清轉(zhuǎn)氨酶水平的測量和肝組織學(xué)。與鹽水對照小鼠比較，10天后高膽固醇血癥小鼠用SPC3649處理已導(dǎo)致血漿總膽固醇減少約30%,且在整個研究期間維持在這個水平上(圖21)。該效應(yīng)在正常飲食小鼠中沒有這么顯著。相反，錯配對照SPC3744在高膽固醇血癥和正常小鼠中都不影響血漿膽固醇水平。在用SPC3649長期處理后，miR-122抑制和miR-122耙基因mRNA去阻遏(AldoA和Bckdk)的定量揭示在高膽固醇血癥和正常小鼠中可比較的鐠(圖22、23、24)，從而證實(shí)SPC3649在這2個動物組中在miR-122拮抗方面的功效。miR-122qPCR測定法指出錯配對照SPC3744也對處理的小鼠肝中的miR-122水平具有影響，雖然與SPC3649比較程度較小。這可能是與莖-環(huán)qPCR相關(guān)的減少。與這個發(fā)現(xiàn)一致，用錯配對照SPC3744處理小鼠不導(dǎo)致直接的miR-122靶基因的任何功能去阻遏(圖23和24)，也不導(dǎo)致血漿膽固醇的減少(圖21)，暗示SPC3649介導(dǎo)的對miR-122的拮抗在體內(nèi)是高度特異性的。在高膽固醇血癥和正常小鼠肝中的肝酶在長期SPC3649處理后進(jìn)行評估。與鹽水對照小鼠比較，在SPC3649處理的高膽固醇血癥小鼠中未檢測到丙氨酸和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT和AST)水平的變化(圖25和26)。在用SPC3649長期處理后，在正常小鼠中觀察到可能升高的ALT水平(圖26)。實(shí)施例26用于執(zhí)行LNA-抗miR/高膽固醇血癥實(shí)驗(yàn)和分析的方法小鼠和給藥。使用C57BL/6J雌性小鼠(TaconicM&BLaboratoryAnimals,Ejby，Denmark)。所有物質(zhì)在生理鹽水(0.9%NaCl)中配制至終濃度，允許小鼠接受IOml/kg的腹膜內(nèi)注射體積。在飲食誘導(dǎo)的肥胖研究中，在給藥開始前小鼠接受高脂(60EN。/0)飲食(D12492，研究飲食)13周以增加其血液膽固醇水平。劑量方案延伸至5mg/kgLNA-抗miR加每周2次的51/2周。血漿在整個給藥期間每周收獲l次。實(shí)驗(yàn)完成后，處死小鼠且從肝中提取RNA用于進(jìn)一步的分析。還收荻血清用于肝酶的分析?？俁NA提取。將來自處死小鼠切開的肝立即貯存于RNAlater(Ambion)中?？俁NA根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen)用Trizol試劑進(jìn)行提取，除了沉淀的RNA團(tuán)塊在80%乙醇中進(jìn)行洗滌且不渦旋外。微小RNA特異性定量RT-PCR。miR-122和let-7a微小RM水平根據(jù)制造商的i兌明書用TaqManmicroRNAAssay(AppliedBiosystems)進(jìn)行定量。RT反應(yīng)在7JC中稀釋10倍，且隨后根據(jù)制造商的說明書用于實(shí)時PCR擴(kuò)增。來自鹽水處理的動物的肝總RNA的2倍cDNA稀釋系列或模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞cDNA反應(yīng)(使用比樣品中多2.5倍的總RNA)充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)以確保擴(kuò)增的線性范圍(Ct對相對拷貝數(shù))。AppliedBiosystems7500或7900實(shí)時PCR儀器用于擴(kuò)增。定量RT-PCR所選擇的基因的mRNA定量使用標(biāo)準(zhǔn)TaqMan測定法(AppliedBiosystems)來完成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用隨才幾十聚體、0.5Pg總RNA和來自Ambion的M-MLVRT酶根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案來進(jìn)行。在加入RT-PCR反應(yīng)混合物中之前，第一鏈cDM隨后在無核酸酶的水中稀釋10次。來自鹽水處理的動物的肝總RM的2倍cDNA稀釋系列或模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞cDNA反應(yīng)(使用比樣品中多2.5倍的總RNA)充當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)以確保擴(kuò)增的線性范圍(Ct對相對拷貝數(shù))。AppliedBiosystems7500或7900實(shí)時PCR儀器用于擴(kuò)增。代謝測量在處死前即刻將眶竇后血液收獲在EDTA包被的管中，隨后分離血漿部分。血漿總膽固醇根據(jù)制造商的說明書使用ABXPentraCholesterolCP(HoribaGroup,HoribaABXDiagnostics)進(jìn)行分析。肝酶(ALT和AST)測量來自每只單個小鼠的血清如下制備血液樣品在離心(IO分鐘，在室溫下3000rpm)前貯存于室溫2小時。在離心后，收獲血清且冷凍于-20r。ALT和AST測量根據(jù)制造商的說明書在96孔平板中使用來自ABXPentra的ALT和AST試劑來進(jìn)行。簡言之，血清樣品用H20稀釋2.5倍并且每種樣品一式兩份地進(jìn)行測定。向每個孔中加入50W稀釋的樣品或標(biāo)準(zhǔn)(來自ABXPentra的multical)后，將200WAST或ALT試劑混合物加入每個孔中。動態(tài)測量使用分光光度計以30秒的間隔在340nm和37。C下進(jìn)行5分鐘。實(shí)施例27LNA-抗miR(SPC3649)對丙型肝炎復(fù)制的調(diào)節(jié)在這個實(shí)施例中使用的寡聚體(大寫字母LNA，小寫字母DNA，LNAC是甲基，和LNA優(yōu)選是B-D-氧(在LNA殘基后的o腳注)SPC3649(把向miR-122的LM-抗miR在絲小M^^成中命名為SPC3549)5,_cscsAststsGsTscsasCsascs"CsC一3,SPC3648(把向miR-122的LNA—抗miR在妙小^L^成中命名為SPC3548)5'-A°ttG°T°camC0a血C。tmCQ血C。-3'〕AstsWs丄scsasLsasLs44ljSPC3550(SPC3649的4nt錯酉Wf照)SEQID635'-VCsAs0tstsVTSVsmCsVcs0tsAs0mC0-3'2'0me抗-122:與miR-122互補(bǔ)的全長(23nt)2'0Me修飾的寡聚體2'(MeCtrl:混雜的2'0Me修飾的對照丙型肝炎(HCV)復(fù)制已顯示由miR-122促進(jìn)，因此拮抗miR-122已證實(shí)在體外在肝細(xì)胞瘤細(xì)胞模型中影響HCV復(fù)制。在基于Huh-7的細(xì)胞模型中評估了SPC3649減少HCV復(fù)制的功效。將不同的LNA-抗miR分子連同2，OMe反義和混雜寡核普酸轉(zhuǎn)染到Huh-7細(xì)胞內(nèi)，允許HCV復(fù)制48小時。對從Huh-7細(xì)胞中提取的總RNA樣品實(shí)施RNA印跡分析。實(shí)施例28增強(qiáng)的乾向miR-21的LNA-抗miR，反義寡核苷酸來自SangerInstitutemiRBase的成熟miR—21序歹'J:>hsa-miR-21MIMAT0000076UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQIDNO4)>mmu-miR-21MIMAT0000530UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQIDNO64)化合物的序列SPC3521miR-215'-FAMTCAgtctgataaGCTa-3'(gap-mer設(shè)計)-(SEQIDNO65)SPC3870miR-21(mm)5'-FAMTCCgtcttagaaGATa-3'-(SEQIDNO66)SPC3825miR-215'-FAMTcTgtCAgaTaCgAT-3'(新i殳計)(SEQIDNO67)SPC3826miR-21(mm)5'-FAMTcAgtCTgaTaAgCT-3,-(SEQIDNO68)SPC3827miR-215'-FAMTcAGtCTGaTaAgCT-3'(新的，增強(qiáng)的設(shè)計)-(SEQIDNO69)所有化合物具有完全或幾乎完全硫醇化的主鏈且在此在5'末端還具有FAM標(biāo)記。miR-21已顯示在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Chan等人CancerResearch2005,65(14)，p6029)和乳腺癌(Iorio等人CancerResearch2005，65(16)，p7065)中是上調(diào)的，且因此已被視為潛在的'致癌，微小RNA。Chan等人也顯示通過用0Me或LM修飾的反義寡核苷酸拮抗miR-21在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。因此，拮抗miR-21的試劑具有成為用于治療成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和其他實(shí)體瘤例如乳腺癌的療法的可能性。呈現(xiàn)了耙向邁iR-21的增強(qiáng)的LNA修飾的寡核苷酸，LNA-抗miRTM，具有適合于上述治療用途的抑制miR-21的驚人好的性質(zhì)。合適的治療施用途徑是例如在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的顱內(nèi)注射、在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和乳腺癌中的瘤內(nèi)注射、以及在乳腺癌中的全身遞送。在"J7J4'應(yīng)^勿應(yīng)膚勿應(yīng)^和^^-7^,^勿應(yīng)^^孝/目前的LNA-anitmiR^的功效通過以不同濃度連同對照寡核苷酸轉(zhuǎn)染到已知表達(dá)miR-21的U373和MCF-7細(xì)胞系(或以及其他表達(dá)miR-21的細(xì)胞系)內(nèi)進(jìn)行評估。轉(zhuǎn)染4吏用標(biāo)準(zhǔn)的Lipofectamine2000方案(Invitrogen)來進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24小時，收獲細(xì)胞且使用Trizol方案(Invitrogen)提取總RNA。依賴使用的治療和濃度的miR-21水平的評估通過miR-21特異性、莖-環(huán)實(shí)時RT-PCR(AppliedBiosystems)來完成，或備選地通過miR-21特異性非放射性RNA印跡分析來完成。與媒介物對照比較，檢測的miR-21水平反映LNA-抗miR^的抑制潛力。miR-21拮抗的效應(yīng)通過將完全匹配的miR-21靶序列克隆在標(biāo)準(zhǔn)的花蟲螢光素酶報道系統(tǒng)(在編碼序列和3'UTR之間，psiCHECK-2，Promega)后進(jìn)行研究-參見實(shí)施例29。報道構(gòu)建體和LNA-抗miR將共轉(zhuǎn)染到表達(dá)miR-21的細(xì)胞系(例如U373，MCF-7)內(nèi)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時收獲到被動裂解緩沖液中，并且螢光素酶活性根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(Promega，DualLuciferaseReporterAssaySystem)進(jìn)行測量。螢光素酶活性的誘導(dǎo)用于證實(shí)拮抗miR-21的LNA-抗miRTM的功能效應(yīng)。實(shí)施例29:用于評估LNA-抗miR和其他微小RNA耙向寡聚體對微小RNA的功能抑制的螢光素酶報道測定法新的和增強(qiáng)的新設(shè)計作為優(yōu)選設(shè)計用于阻斷微小RNA功能的總結(jié)在這個實(shí)施例中用于評估通過阻斷各自的微小RNA克隆對具有微小RNA耙序列的螢光素酶報道分子的LNA-抗miR去阻遏影響的寡聚體(大寫字母LNA，小寫字母DNA):乾hsa-miR-122aMIMAT0000421uggagugugacaaugguguuugu在表達(dá)miR-22的HUH-7細(xì)胞系中篩選寡聚體#，靶微小RNA,寡聚體序列3962:miR-1225'-ACAAacaccattgtcacacTCCA-3'3965:miR-1225'-acaaacACCATTGTcacactcca-3'3972:miR-1225'-acAaaCacCatTgtCacActCca-3'3549(3649):miR-1225'-CcAttGTcaCaCtCC-3'3975:miR—1225'-CcAtTGTcaCACtCC-3'設(shè)計完全互補(bǔ)物，缺口完全互補(bǔ)物，阻斷完全互補(bǔ)物，LM_3新設(shè)計增強(qiáng)的新設(shè)計把hsa-miR-19bMIMAT0000074ugugcaaauccaugcaaaacuga在表達(dá)miR-19b的HeLa細(xì)胞系中篩選寡聚體#,靶微小RNA,寡聚體序列設(shè)計3963:miR--19b5'-TCAGmtgcatggatttgCACA--3'完全互補(bǔ)物，缺口3967:miR--19b5'-tcagttTTGCATGGatttgcaca--3'完全互補(bǔ)物，阻斷3973:miR--19b5'-tcAgtTUGcaTggAttTgcAca--3'完全互補(bǔ)物，LNA—33560:miR--19b5'-TgCatGGatTtGcAC-3'新設(shè)計3976:miR--19b5'-TgCaTGGatTTGcAC-3'增強(qiáng)的新設(shè)計把hsa-miR-155MIMAT0000646uuaaugcuaaucgugauagggg在表達(dá)miR-155的518A2細(xì)胞系中篩選寡聚體#,靶微小RM，寡聚體序列396439683974miR-1555'-CCCCtatcacgattagcaTTAA-3'miR-1555'-cccctaTCACGATTagcattaa-3'miR-1555'-cCccTatCacGatTagCatTaa-3'設(shè)計完全互補(bǔ)物，缺口完全互補(bǔ)物，阻斷完全互補(bǔ)物，LNA-33758:miR-1555'-TcAcgATtaGcAtTA-3'新設(shè)計3818:miR-1555'-TcAcGATtaGCAtTA-3'增強(qiáng)的新設(shè)計SEQIDNO如前。編碼螢光素酶的花蟲和螢火蟲變體的報道質(zhì)粒(psiCheck-2Promega)這樣進(jìn)行改造，使得花蟲螢光素酶的3'UTR包括與所研究的miRNA完全互補(bǔ)的序列的單拷貝。內(nèi)源表達(dá)所研究的miRNA的細(xì)胞(HuH-7用于miR-122a，HeLa用于miR-19b，518A2用于miR-155)用LNA-抗miR或其他miR結(jié)合寡核苷酸(完全互補(bǔ)即全長)和相應(yīng)的微小RM靶報道質(zhì)粒使用Lipofectamine2000(Invitrogen)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染和螢光素酶活性的測量根據(jù)制造商的說明書(InvitorgenLipofectamine2000/PromegaDual-luciferasekit)來進(jìn)行，在6孔平板中使用150000-300000細(xì)胞/孔。為了補(bǔ)償不同的細(xì)胞密度和轉(zhuǎn)染率，花蟲螢光素酶信號用螢火蟲螢光素酶信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行。令人驚訝地，新設(shè)計和新增強(qiáng)設(shè)計是對于所有3種微小RNA把miR-155、miR-19b和miR-122的最佳功能抑制劑(圖27、28、29)。結(jié)果概括于下表3中。結(jié)果概括:<table>tableseeoriginaldocumentpage117</column></row><table>表3.各種設(shè)計的LNA-抗miR對內(nèi)源性miR-155、miR-19b和miR-122a功能的去阻遏程度。參考文獻(xiàn)Abelson,J.F.等人2005.Science310:317-20.Bartel，D.P.2004.Cell116:281-297.Boehm，M.，Slack,F.2005.Science.310:1954-7.Brennecke，J.等人2003Cell113:25-36,Calin,G.A.等人2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:15524-15529.Calin，G.A.等人2004.Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.101:2999-3004.Calin，G.A.等人2005'N.Engl.J.Med.353:1793—801Chan,J.A.等人2005.CancerRes.65:6029-33.Chen,C.Z.等人2004.Science303:83-86.Chen，J.F.等人2005.NatGenet.Dec25，預(yù)先的在線公開。Eis,P.S.等人2005.ProcNatlAcadSciUSA.102:3627-32.Giraldez，A.J.等人2005.Science308:833—838.Griffiths-Jones,S.等人2004.NucleicAcidsRes.32:D109-D111.Griffiths-Jones,S.等人2006.NucleicAcidsRes.34:D140-4He，L.等人2005.Nature435:828-833.Hornstein,E.等人2005.Nature438:671-4.Hutvagner，G.等人2001.Science293:834-838，Hutvdgner，G.等人2004.PLoSBiology2:1-11.Iorio，M.V.等人2005.CancerRes.65:7065-70.Jin，P.等人2004.NatCellBiol.6:1048-53.Johnson,S.M.等人2005.Cell120:635-647.Jopling，C丄等人2005.Science309:1577-81.Ketting，R.F.等人2001.GenesDev.15:2654-2659.Kwon，C.等人2005.ProcNatlAcadSciUSA.102:18986-91.Landthaler,M.等人2004.Curr.Biol.14:2162-2167.Leaman，D.等人2005'Cell121:1097-108.Lee，Y.等人2003.Nature425:415-419.Li，X.和Carthew，R.W.2005.Cell123:1267-77.Lu.J.等人2005.Nature435:834-838.Michael,M.Z.等人2003.Mol,CancerRes.1:882-891.Nelson,P.等人2003.TIBS28:534-540.Paushkin,S.等人2002,Curr.Opin.Cel1Biol.14:305-312.Poy，M.N.等人2004.Nature432:226—230.Wienholds,E.等人2005.Science309:310-311.Yekta，S.等人2004.Science304:594-596.Zhao，Y.等人2005.Nature436:214-220.權(quán)利要求1.藥物組合物，其包含長度為8-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，或其綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3’末端計數(shù)第2-7位或第3-8位3’acgttt5’(SEQIDNO6)的核心DNA序列，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。2.藥物組合物，其包含長度為8-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，或其綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位3，ctcaca5，(SEQIDN07)的核心DNA序列，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。3.藥物組合物，其包含長度為8-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，或其綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位3，Uacga5，(SEQIDN08)的核心DNA序列，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換。4.藥物組合物，其包含長度為8-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，或其綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位3，acaagc5，(SEQIDN09)的核心DNA序列，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換。5.藥物組合物，其包含長度為8-26個核苷酸堿基單元的單鏈寡核普酸，或其綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述寡核苷酸包含從3，末端計數(shù)第2-7位或第3-8位3，cgaata5，(SEQIDNO10)的核心DM序列，其中所述序列中的至少一個，例如1個，優(yōu)選至少2個，例如2個或3個DNA單元已由其相應(yīng)的LNA單元置換，和其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)DM單元的區(qū)域。6.根據(jù)權(quán)利要求l-5中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列與選自下述的人微小RNA序列中存在的核苷酸序列互補(bǔ)(miR19b)UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA(SEQID1)(miR122a)UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU(SEQID2)(miR155)UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG(SEQID3)(miR375)UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA(SEQID4)(miR21)UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQID5)7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸具有10-17個核苷酸堿基的長度。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸具有10-16個核苷酸堿基的長度。9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸具有12-26個核苷酸堿基的長度。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-6位、第2-7位或第3-8位的至少2個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換，和其中所述LNA單元由至少一個DNA單元分隔開。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-6位、第2-7位或第3-8位的至少3個DNA單元已由其相應(yīng)的LM單元置換，和其中所述LM單元由至少一個DNA單元分隔開。12.根據(jù)權(quán)利要求IO或11的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第l-6位、第2-7位或第3-8位的連續(xù)DNA單元數(shù)目為至多2個。13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-6位、笫2-7位或第3-8位的每第2個核苷酸是LNA單元。14.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物組合物，其中由3'末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-6位、第2-7位或笫3-8位的每第3個核苷酸是LNA單元。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3'末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-6位、第2-7位或第3-8位的LNA單元總數(shù)目是2-6個LNA單元。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。17.根據(jù)權(quán)利要求l-16中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3'末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第2個核苷酸堿基是核苷酸類似物例如LNA單元。18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-6位、第2-7位或第3-8位的核苷酸堿基的置換才莫式選自xxXxxX、xxXxXx、xXxxXx，xXxXxx、XxxXxx、xXxXxX、XxXxXx、XxxXxX和XxXxxX;xxXxxX、xXxxXx、XxxXxx、xXxXxX和XxXxXx;其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA單元。19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-7位、第2-8位或第3-9位的核苷酸械基的置換模式選自xxXxxXx、xxXxXxx、xXxxXxx、xxXxXxX，、xXxxXxX、xXxXxxX、xXxXxXx、XxxXxxX、XxxXxXx、XxXxxXx、XxXxXxx、XxXxXxX、xxXxxXx、xXxxXxx、XxxXxxX、xXxXxXx、XxXxXxX和XxXxXxx;其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA單元。20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第l-8位、第2-9位或第3-10位的核苷酸堿基的置換模式選自xxXxxXxx、xxXxxXxX、xxXxXxxX、xxXxXxXx、xXxxXxxX、xXxxXxXx、xXxXxxXx、xXxXxXxx、XxxXxxXx、XxxXxXxx、XxXxxXxx、xXxXxXxX、XxXxXxxX、XxXxxXxX、XxxXxXxX、XxXxXxXx;xxXxxXxx、xXxxXxxX、XxxXxxXx、xXxXxXxX、XxXxXxXx和XxXxXxxX;其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA單元。21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第1-9位、第2-10位或第3-11位的核苷酸堿基的置換模式選自xxXxxXxxX、xxXxxXxXx、xxXxXxxXx、xxXxXxXxx、xXxxXxxXx、xXxxXxXxx、xXxXxxXxx、XxxXxxXxx、xxXxXxXxX、xXxxXxXxX、xXxXxxXxX、xXxXxXxxX、XxxXxxXxX、XxxXxXxxX、XxXxxXxxX、XxxXxXxXx、XxXxxXxXx、XxXxXxxXx、XxXxXxXxx和XxXxXxXxX;其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA單元。22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含連續(xù)核苷酸堿基序列的區(qū)域，其與人微小RNA種區(qū)域100%互補(bǔ)。23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由3，末端計數(shù)，所述寡核苷酸的第9個和/或第IO個核苷酸是核苷酸類似物例如LNA單元。24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸不包含超過5個連續(xù)DNA核苷酸單元的區(qū)域。25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少一個由至少2個連續(xù)核苷酸類似物單元，例如至少2個連續(xù)LNA單元組成的區(qū)域。26.根據(jù)權(quán)利要求l-25中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸不包含超過7個連續(xù)核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。27.根據(jù)權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述寡核苷酸不包含超過3個連續(xù)核苷酸類似物單元例如LNA單元的區(qū)域。28.根據(jù)權(quán)利要求1-27的藥物組合物，其中與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自以3'-5'方向讀取的(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx和(X)xxxxxX，其中"X"指核苷酸類似物，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。29.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少2個核苷酸類似物單元，例如至少2個LNA單元。30.根據(jù)權(quán)利要求29的藥物組合物，其中與miRNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX和(X)xxxxXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。31.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少3個核苷酸類似物單元，例如至少3個LNA單元。32.根據(jù)權(quán)利要求31的藥物組合物，其中與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX和(X)XxXxXx，其中"X"指核苷酸類似物例如UA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。33.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核脊酸在與miRM種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少4個核苷酸類似物單元，例如至少4個LM單元。34.根據(jù)權(quán)利要求33的藥物組合物，其中與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx和(X)XXXXxx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。35.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含至少5個核苷酸類似物單元，例如至少5個LNA單元。36.根據(jù)權(quán)利要求35的藥物組合物，其中與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX和(X)XXXXXx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，(X)指可選存在的核苷酸類似物例如LNA單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。37.根椐權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸在與miRNA種區(qū)域互補(bǔ)的位置中包含6個或7個核苷酸類似物單元，例如6個或7個LNA單元。38.根據(jù)權(quán)利要求37的藥物組合物，其中與微小RNA種區(qū)域的序列互補(bǔ)的所述寡核苷酸的核苷酸堿基序列選自XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX和XXXXXXx，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。39.根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中由所述單鏈寡核苷酸的3，末端計數(shù)，在第7-8位的兩個核苷酸堿基基序選自xx、XX、xX和Xx，其中"X"指核普酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。40.根據(jù)權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少12個核苷酸堿基，和其中由所述單鏈寡核苷酸的3，末端計數(shù)，在第11-12位的兩個核苷酸堿基基序選自xx、XX、xX和Xx,其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。41，根據(jù)權(quán)利要求1-40中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少13個核苷酸堿基，和其中由3，末端計數(shù)，在第11-13位的三個核苷酸堿基基序選自xxx、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中"X"指核普酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。42.根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少14個核苷酸堿基，和其中由3，末端計數(shù)，在第11—14位的四個核脊酸堿基基序選自xxxx、Xxxx、xXxx、xxXx、xxxX、XXxx、XxXx、XxxX、xXXx、xXxX、xxXX、XXXx、XxXX、xXXX、XXxX和XXXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x，，指DNA或RNA核普酸單元。43.根據(jù)權(quán)利要求1-42中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含15個核苷酸堿基，和其中由3'末端計數(shù)，在第11-15位的五個核普酸堿基基序選自Xxxxx、xXxxx、xxXxx、xxxXx、xxxxX、XXxxx、XxXxx、XxxXx、XxxxX、xXXxx、xXxXx、xXxxX、xxXXx、xxXxX、xxxXX、XXXxx、XXxxX、XxxXX、xXXXx、xxXXX、XXxXX、XxXxX、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXXX、xXXXX和XXXXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LM單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。44.根據(jù)權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含16個核苷酸堿基，和其中由3，末端計數(shù)，在第ll-16位的六個核香酸堿基基序選自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx、xxxxxX、XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX、xxxxXX、XXXxxx、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、XxXXxx、XxXxXx、XxXxxX、XxxXXx、XxxXxX、XxxxXX、xXXXxx、xXXxXx、xXXxxX、xXxXXx、xXxXxX、xXxxXX、xxXXXx、xxXXxX、xxXxXX、xxxXXX、XXXXxx、XXXxxX、XXxxXX、XxxXXX、xxXXXX、xXxXXX、XxXxXX、XXxXxX、XXXxXx、xXXxXX、XxXXxX、XXxXXx、xXXXxX、XxXXXx、xXXXXx、xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX、XXXXXx和XXXXXX，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。45.根據(jù)權(quán)利要求44的藥物組合物，其中所述寡核苷酸由17-26個核苷酸堿基組成，其中由3'末端計數(shù)的核苷酸堿基17-26各自獨(dú)立地選自X和x，其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x，，指DNA或RNA核苷酸單元。46.根據(jù)權(quán)利要求1-45中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸的3個最5'末端的核普酸堿基的核苷酸堿基基序選自Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX,其中"X"指核苷酸類似物例如LNA單元，例如LNA單元，和"x"指DNA或RNA核苷酸單元。47.根據(jù)權(quán)利要求18-46中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中"x"指DNA單元。48.根據(jù)權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸在5'末端包含核苷酸類似物單元例如LNA單元。49.根據(jù)權(quán)利要求16-48中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述核苷酸類似物單元例如X獨(dú)立地選自2，-O-烷基-RNA單元、2，-0Me-RNA單元、2，-氨基-DNA單元、2，-氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HM單元、INA單元。50.根據(jù)權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所有核苷酸堿基都是核苷酸類似物單元。51.根據(jù)權(quán)利要求49或50的藥物組合物，其中所述核苷酸類似物單元例如X獨(dú)立地選自2，-OMe-RNA單元、2，-氟-DNA單元和LM單元。52.根據(jù)權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核普酸包含所述至少一個LNA類似物單元和至少一個除LNA以外的其它核苷酸類似物單元。53.根據(jù)權(quán)利要求52的藥物組合物，其中非LNA核苷酸類似物單元獨(dú)立地選自2，-OMe-RNA單元和2，-氟-DNA單元。54.根據(jù)權(quán)利要求53的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸由至少一個序列XYX或YXY組成，其中X是LNA和Y是2，-OMe-RNA單元或2，-氟-DNA單元。55.根據(jù)權(quán)利要求54的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸的核苷酸堿基序列由交替的X和Y單元組成。56.根據(jù)權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸包含交替的LNA和DNA單元(Xx)或(xX)。57.根據(jù)權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸包含交替LNA后接2個DNA單元的基序(Xxx)、xXx或xxX。58.根據(jù)權(quán)利要求54-57中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中至少一個所述DNA或非LNA核苷酸類似物單元在選自前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)中鑒定為LNA核苷酸單元的位置的位置中由LNA核苷酸堿基替換。59.根據(jù)權(quán)利要求18-58中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中"X"指LM單元。60.根據(jù)權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸包含至少5個LNA單元。61.根據(jù)權(quán)利要求60的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸包含至少7個LNA單元。62.根據(jù)權(quán)利要求l-61中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中至少一個所述LNA核苷酸堿基是胞嗜啶或鳥噤呤。63.根據(jù)權(quán)利要求62的藥物組合物，其中至少3個所迷LNA核苷酸堿基獨(dú)立地選自胞嘧啶或鳥嘌呤。64.根據(jù)權(quán)利要求16-63中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述核苷酸類似物與互補(bǔ)RNA核普酸的熱雙鏈體穩(wěn)定性高于等同DM核苷酸與所述互補(bǔ)RNA核苷酸的熱雙鏈體穩(wěn)定性。65.根據(jù)權(quán)利要求16-64中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述核苷酸類似物對所述寡核苷酸賦予增強(qiáng)的血清穩(wěn)定性。66.根據(jù)權(quán)利要求1-65中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸不介導(dǎo)對互補(bǔ)單鏈RNA分子的基于RNA酶H的切割。67.根據(jù)權(quán)利要求1-66中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，其中所述雙鏈體具有至少約60X:的Tra。68.根據(jù)權(quán)利要求67的藥物組合物，其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，其中所述雙鏈體具有至少約70TC-約95t!的Tm。69.根據(jù)權(quán)利要求68的藥物組合物，其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈RNA核酸分子形成雙鏈體，其中所述雙鏈體具有至少約-約90n,例如約70"C-約85t:的Tn。70.根據(jù)權(quán)利要求1-69中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸能夠與具有磷酸二酯核苷間鍵的互補(bǔ)單鏈DM核酸分子形成雙鏈體，其中所述雙鏈體具有約50^C-約90^C的Tm。71.根據(jù)權(quán)利要求1-70中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸具有10-16個核苷酸堿基的長度，例如IO、11、12、13、14、15或16個核苷酸堿基的長度。72.根據(jù)權(quán)利要求71的藥物組合物，其中所迷單鏈寡核苷酸具有15或16個核苷酸堿基的長度。73.根據(jù)權(quán)利要求1-72中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述LNA單元獨(dú)立地選自以D-P和L-ot構(gòu)型中任一種或其組合的氧-LNA、石克代-LM和氨基-LNA。74.根據(jù)權(quán)利要求73的藥物組合物，其中所述LNA單元是PD氧-LNA。75.根據(jù)權(quán)利要求73的藥物組合物，其中所述LM單元是a-L氨基LNA。76.根據(jù)權(quán)利要求1-75中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述單鏈寡核苷酸包含3-17個LNA單元。77.根據(jù)權(quán)利要求1-76中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少一個不同于磷酸酯的核苷間連接基團(tuán)。78.根據(jù)權(quán)利要求77的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯核苷間鍵。79.根據(jù)權(quán)利要求78的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含磷酸二酯和硫代磷酸酯鍵。80.根據(jù)權(quán)利要求77的藥物組合物，其中所有核苷間鍵都是硫代磷酸酯鍵。81.根據(jù)權(quán)利要求1-79中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯核苷間鍵。82.根據(jù)權(quán)利要求81的藥物組合物，其中所有核苷間鍵都是磷酸二酯鍵。83.根據(jù)權(quán)利要求1-82中任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述栽體是鹽水或緩沖鹽水。84.如權(quán)利要求1-75中任一項(xiàng)定義的寡核苷酸，其中所述單鏈寡核苷酸包含至少一個硫代磷酸酯鍵和/或其中至少第l個5'和/或最后1個3'核苷酸堿基是LNA核苷酸堿基。85.寡核苷酸，其包含選自SEQIDN020、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25、SEQIDNO28、SEQIDNO26、SEQIDNO27、SEQIDNO82、SEQIDNO83、SEQIDNO84、SEQIDNO85、SEQIDNO86、SEQIDNO87、SEQIDNO88和SEQIDNO89的核苷酸堿基序列；其中小寫字母標(biāo)示DM單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。86.寡核苷酸，其包含選自SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO90、SEQIDNO91、SEQIDNO92、SEQIDNO93、SEQIDNO94、SEQIDNO95、SEQIDNO96、SEQIDNO97、SEQIDNO98、SEQIDNO99、SEQIDNO100和SEQIDNO101的核苷酸堿基序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。87.寡核苷酸，其包含選自SEQIDNO29、SBQIDNO30、SEQIDNO31、SEQIDNO32、SEQIDNO33、SEQIDNO34、SEQIDNO35、SEQIDNO36、SEQIDNO37、SEQIDNO102、SEQIDNO103、SEQIDNO104和SEQIDNO105的核苷酸堿基序列；其中小寫字母標(biāo)示DM單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。88.寡核苷酸，其包含選自SEQIDNO47、SEQIDNO48、SEQIDNO49、SEQIDNO50、SEQIDNO51、SEQIDNO52、SEQIDNO53、SEQIDNO54、SEQIDNO55、SEQIDNO106、SEQIDNO107、SEQIDNO108和SEQIDNO109的核苷酸堿基序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LM單元的含氮堿基；和其中LNA胞嗜啶是任選被甲基化的，或其綴合物。89.寡核苷酸，其包含選自SEQIDNO65、SEQIDNO66、SEQIDNO67、SEQIDNO68和SEQIDNO69、SEQIDNO38、SEQIDNO39、SEQIDNO40、SEQIDNO41、SEQIDNO42、SEQIDNO43、SEQIDNO44、SEQIDNO45和SEQIDNO46的核苷酸堿基序列；其中小寫字母標(biāo)示DNA單元的含氮堿基，和大寫字母標(biāo)示LNA單元的含氮堿基；和其中LNA胞嘧啶是任選被甲基化的，或其綴合物。90.根據(jù)權(quán)利要求84-89中任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中核苷間鍵如根據(jù)權(quán)利要求77-82中任一項(xiàng)所述。91.根據(jù)權(quán)利要求84-90中任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸核苷酸堿基序列由所述核苷酸堿基序列組成。92.綴合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求84-91中任一項(xiàng)的寡核苷酸，和與之共價附著的至少一個非核苷酸堿基實(shí)體。93.根據(jù)權(quán)利要求92的綴合物，其中所述非核苷酸堿基實(shí)體由甾醇例如膽固醇組成，或包含齒醇例如膽固醇。94.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求84-93中任一項(xiàng)的寡核苷酸或綴合物，和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑。95.如權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)中定義的單鏈寡核苷酸或綴合物用于制備用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物的用途，例如選自增加的血漿膽固醇水平，動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥，丙型肝炎，癌癥和代謝紊亂例如糖尿病的疾病。96.用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的方法，其包括給需要治療的人施用根據(jù)權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)的組合物的步驟，例如患有選自下述的疾病的人增加的血漿膽固醇水平，動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥，丙型肝炎，癌癥和代謝紊亂例如糖尿病。97.用于減少細(xì)胞或生物中的miRNA靶的有效量的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)權(quán)利要求1一93中任一項(xiàng)的組合物或單鏈寡核苷酸。98.根據(jù)權(quán)利要求97的方法，其中所述miRNA乾的有效量的減少經(jīng)由體內(nèi)拮抗而發(fā)生。99.用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)的組合物或單鏈寡核苷酸。100.用于合成根據(jù)權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)的單鏈寡核苷酸的方法，所述方法包括下述步驟a.選擇由3'末端計數(shù)的第1個核苷酸堿基，其為LNA核苷酸堿基，b.任選選擇由3'末端計數(shù)的第2個核苷酸堿基，其為LNA核苷酸堿基，c.選擇所述單鏈寡核苷酸的區(qū)域，其對應(yīng)權(quán)利要求1-5中鑒定的區(qū)域中的任何l個，或miRNA種區(qū)域，d.任選選擇如根據(jù)權(quán)利要求的2個進(jìn)一步的核苷酸堿基，如根據(jù)權(quán)利要求39的第7個和第8個核苷酸堿基，e.任選選擇根據(jù)權(quán)利要求40-45中任一項(xiàng)的單鏈寡核苷酸的5'區(qū)域，f.任選選擇1-10個進(jìn)一步的核苷酸堿基，其可以選自核苷酸和核苷酸類似物例如LNA，g.任選選擇根據(jù)權(quán)利要求46的所述單鏈寡核苷酸的5'末端，其中所述合成通過步驟a-f中定義的區(qū)域的順次合成來進(jìn)行，其中所述合成可以以3'-5'(a至f)或5'-3'(f至a)方向來進(jìn)行，和其中所述單鏈寡核苷酸與選自下述的序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)的序列互補(bǔ)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。101.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中所述合成以卩-5'方向a-f來進(jìn)行。102.長度為8-16個核苷酸堿基的寡核苷酸在制備用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物中的用途，其中所述寡核苷酸與選自下述的序列內(nèi)存在的相應(yīng)序列互補(bǔ)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。103.根據(jù)權(quán)利要求102的用途，其中所述疾病選自增加的血漿膽固醇水平，動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥，丙型肝炎，癌癥和代謝紊亂例如糖尿病。104.用于治療與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的藥物的方法，其包括給需要治療的人施用根據(jù)權(quán)利要求1-100中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物的步驟。105.根據(jù)權(quán)利要求104的方法，其中所述人患有選自下述的疾病增加的血漿膽固醇水平，動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥，丙型肝炎，癌癥和代謝紊亂例如糖尿病。106.根據(jù)權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)的寡核苷酸或其綴合物用于上調(diào)Nrdg3、AldoA、Bckdk或CD320的mRNA水平的用途。107.用于減少細(xì)胞或生物中的miRNA靶的有效量的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)的組合物或寡核苷酸或其綴合物。108.用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用根據(jù)權(quán)利要求1-93中任一項(xiàng)的組合物或寡核苷酸或其綴合物。109.與微小RNA的存在或過量表達(dá)相關(guān)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的治療，其包括給需要治療的人施用組合物(例如藥物組合物)的步驟，所述組合物包含長度為8-16個核普酸堿基的單鏈寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與選自下述的序列內(nèi)存在的相應(yīng)序列互補(bǔ)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。110.用于減少細(xì)胞或生物中的miRM靶的有效量的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用組合物(例如藥物組合物)的步驟，所述組合物包含長度為8-16個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與選自下述的序列內(nèi)存在的相應(yīng)序列互補(bǔ)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。111.用于細(xì)胞或生物中的miRNA的靶mRNA去阻遏的方法，其包括給所述細(xì)胞或生物施用長度為8-16個核苷酸堿基的單鏈寡核苷酸(或包含所述寡核苷酸的組合物)的步驟，其中所述寡核苷酸與選自下述的序列內(nèi)存在的相應(yīng)序列互補(bǔ)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。112.藥物組合物，其包含長度為8-16個核苷酸堿基單元的單鏈寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或輔劑，其中所述單鏈寡核苷酸的至少一個核苷酸堿基單元是核苷酸類似物，和其中所述單鏈寡核苷酸與人微小RNA序列互補(bǔ)，其中所述寡核苷酸與選自下述的序列內(nèi)存在的相應(yīng)序列互補(bǔ)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO5。113.根據(jù)權(quán)利要求112的藥物組合物，其中所述組合物用于治療選自下述的疾病增加的血漿膽固醇水平，動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥或高脂血癥，丙型肝炎，癌癥和代謝紊亂例如糖尿病。全文摘要本發(fā)明提供了包含長度為8-26個核苷酸堿基的短單鏈寡核苷酸的藥物組合物，所述短單鏈寡核苷酸與選自miR19b、miR21、miR122a、miR155和miR375的人微小RNA互補(bǔ)。所述短寡核苷酸在體內(nèi)在減輕miRNA阻遏中特別有效。發(fā)現(xiàn)將高親和力核苷酸類似物摻入寡核苷酸內(nèi)導(dǎo)致產(chǎn)生高度有效的抗微小RNA分子，其表現(xiàn)出經(jīng)由與微小RNA靶形成幾乎不可逆的雙鏈體來起作用，而不是基于RNA切割的機(jī)制，例如與RNA酶H或RISC相關(guān)的機(jī)制。文檔編號A61P3/10GK101437942SQ200780015880公開日2009年5月20日申請日期2007年3月30日優(yōu)先權(quán)日2006年4月3日發(fā)明者J·埃爾門,P·卡尼,S·考皮寧申請人:桑塔里斯制藥公司