專利名稱：Ubf反義核苷酸及其衍生物和它的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及UBF反義核苷酸及其衍生物和它的制備及在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
由于rRNA的轉(zhuǎn)錄活性與細胞增殖的活性，所以，UBF的表達情況直接影響細胞增殖的活性。
1)Northern blot實驗分別提取腫瘤組織樣品與正常組織樣品的總RNA，用UBF的DNA作為探針分子，進行Northern雜交。結(jié)果顯示，腫瘤組織樣品中對應(yīng)于UBF的雜交信號遠大于正常組織樣品中對應(yīng)于UBF的雜交信號。這說明，腫瘤組織中的UBF在RNA水平的含量遠大于正常組織。
2)cDNA array實驗分別提取腫瘤組織樣品與正常組織樣品的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，分別與cDNA array(中科院生化細胞研究所提供，含有14000個人類基因的cDNA序列)進行分子雜交。結(jié)果顯示，腫瘤組織樣品中對應(yīng)于UBF的雜交信號遠大于正常組織樣品中對應(yīng)于UBF的雜交信號。這說明，腫瘤組織中的UBF在mRNA水平的含量遠大于正常組織。
3)Western實驗分別提取腫瘤組織和正常組織中的總蛋白，用UBF的特異性單克隆抗體作為探針進行Western雜交。結(jié)果顯示，腫瘤組織樣品中對應(yīng)于UBF的雜交信號遠大于正常組織樣品中對應(yīng)于UBF的雜交信號。這說明，腫瘤組織中的UBF在蛋白質(zhì)水平的含量遠大于正常組織。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是基于上述研究結(jié)果，提供一種能特異性地與UBF結(jié)合，導(dǎo)致UBF的表達受到抑制，從而抑制腫瘤細胞生長達到抗腫瘤目的的物質(zhì)。
本發(fā)明公開的能特異性地與UBF結(jié)合的物質(zhì)是指UBF的反義核苷酸，或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物。
本發(fā)明所述的以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物可以是UBF反義核苷酸與化學(xué)毒素、放射性核素或藥物形成的偶聯(lián)物。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是公開上述UBF反義核苷酸的設(shè)計方法。
要獲得本發(fā)明UBF反義核苷酸所采用的技術(shù)方案為首先找出UBF序列中編碼蛋白質(zhì)的核酸片段，將此片段為模板在整個人類基因序列的數(shù)據(jù)庫中進行掃描(在NCBI(National Center forBiotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中被稱為BLAST)，找出具有UBF特異性的數(shù)個核酸片段，選取其中的15至30bp的核苷酸序列，其反向互補序列可作為UBF的反義核苷酸。
用本發(fā)明設(shè)計方法可獲得多種UBF反義核苷酸，如5′-CTTCTCCGTTCATCCTCC-3′；5′-CGGGCCAGGTTT CGCTCGAA-3′等，但不僅限于此。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題是公開上述UBF反義核苷酸及以其為模板制備的衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明首次提出UBF在腫瘤細胞中的含量遠高于正常細胞，通過抑制UBF的表達，使腫瘤細胞的生長受到抑制，但不影響正常細胞的生長，達到抗腫瘤的目的。
本發(fā)明公開的UBF反義核苷酸及以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物即為特異性地與UBF結(jié)合的物質(zhì)，可以此為活性成份制備抗腫瘤藥物。
本發(fā)明將用UBF反義核苷酸處理過和未用UBF反義核苷酸處理過的腫瘤細胞進行比較(1)設(shè)計UBF的反義核苷酸，長度約為20bp，進行合成后標記熒光素。分別加入到表達UBF和不表達UBF的細胞的培養(yǎng)液中，待其進入細胞內(nèi)與UBF結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況。結(jié)果顯示，表達UBF的細胞中，細胞的生長受到一定程度的抑制，最終細胞死亡；而在不表達UBF的細胞中，反義核苷酸的加入對細胞的生長無影響。
(2)提取同一種細胞(經(jīng)過UBF反義核苷酸處理、未經(jīng)過UBF反義核苷酸處理)的兩瓶細胞的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，然后進行cDNAarray實(cDNA array由中科院生化細胞研究所提供，含有14000個人類基因的cDNA序列)。結(jié)果顯示，經(jīng)過UBF反義核苷酸處理的細胞中UBF的mRNA含量較未經(jīng)UBF反義核苷酸處理的細胞中為低。
(3)對同一種細胞(經(jīng)過UBF反義核苷酸處理、未經(jīng)過UBF反義核苷酸處理)的兩瓶細胞的總蛋白進行Western實驗(以UBF的特異性單克隆抗體作為探針)。結(jié)果顯示，經(jīng)過UBF反義核苷酸處理的細胞中UBF的蛋白含量較未經(jīng)UBF反義核苷酸處理的細胞中為低。
上述試驗證明UBF反義核苷酸具有抗腫瘤的效果。
圖1肝癌組織(S2，T)和正常肝組織(S2，N)中的UBF基因的Northern實驗結(jié)果圖2肝癌組織(S2，T)和正常肝組織(S2，N)中UBF蛋白的Western實驗結(jié)果圖3食道癌組織(S3，T)和正常食道組織(S3，N)中的UBF基因的Northern實驗結(jié)果圖4食道癌組織(S3，T)和正常食道組織(S3，N)中的UBF蛋白的Western實驗結(jié)果圖5UBF反義核苷酸對腫瘤細胞(SMMC-7721)生長形態(tài)的影響圖6UBF反義核苷酸對腫瘤細胞(SMMC-7721)和正常細胞(HLF)存活率的影響圖7UBF反義核苷酸對腫瘤細胞(SMMC-7721)蛋白的Western結(jié)果影響本發(fā)明首次提出了抑制腫瘤細胞中的UBF達到治療腫瘤的目的的理論，并公開了特異性與UBF結(jié)合的UBF反義核苷酸及以其為模板制備的衍生物，為人類戰(zhàn)勝癌癥提供了一種新思路。
具體實施例方式
實施例1、肝癌組織中UBF含量肝癌組織和相應(yīng)的正常肝組織由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院提供；具有14000個基因的cDNA array的膜由中科院生化細胞研究所提供。
1)Northern實驗用TRIZOL(GIBCO BRL)提取肝癌組織(S2，T)和相應(yīng)的正常肝組織(S2，N)總RNA各30μg，用常規(guī)的Northern方法進行實驗用1％的瓊脂糖凝膠走RNA電泳后，將膠轉(zhuǎn)到Hybond-XL尼龍膜(Amersham Pharmacia，Buckinghamshire，England)上，80℃烘烤2小時。用預(yù)雜交液(配方6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt，100μg/ml變性的鮭精DNA)對尼龍膜在65℃預(yù)雜交3小時。用含有32P標記的UBF cDNA的雜交液(配方6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml鮭精DNA)過夜雜交后，在65℃洗脫(洗脫液配方0.1×SSC，0.5％SDS)1小時。使尼龍膜在磷屏(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)中放射自顯影后，用FLA-3000A Plate/Fluorescent Image Analyzer(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)掃描結(jié)果，并分析數(shù)據(jù)。用18S的rRNA作為對照。實驗結(jié)果見圖1。
實驗結(jié)果說明，UBF基因在肝癌組織的總RNA中的含量遠高于其在正常肝組織中的含量。
2)cDNA array實驗用QIAGEN公司的KIT提取肝癌組織和相應(yīng)的正常肝組織的mRNA各2μg，進行反轉(zhuǎn)錄后標記33P同位素、預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影、數(shù)據(jù)讀取和分析[3]。cDNA array的數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表1。
表1
實驗結(jié)果說明，UBF基因在肝癌組織的mRNA中的含量遠高于其在正常肝組織中的含量。
3)Western實驗提取肝癌組織和相應(yīng)的正常肝組織總蛋白各100μg，用常規(guī)的Western方法進行實驗用10％SDS-PAGE膠走蛋白電泳，將膠轉(zhuǎn)到尼龍膜(Scheleicher&Schuell，Dassel，Germany)上，并點上UBF的單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，使抗體結(jié)合到相應(yīng)的抗原部位，再將標有HRP(辣根過氧化物酶)的抗小鼠IgG抗體結(jié)合到膜上。通過免疫印跡化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)((AmershamPharmacia)產(chǎn)生的光信號觀察Western實驗結(jié)果。用Actin作為對照。實驗結(jié)果見圖2。
實驗結(jié)果說明UBF蛋白在肝癌組織中的含量遠高于其在正常肝組織中的含量。
實施例2、食道癌組織中UBF含量食道癌組織和相應(yīng)的正常食道組織由中國醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供；具有14000個基因的cDNA array的膜由中科院生化細胞研究所提供。
1)Northern實驗用TRIZOL(GIBCO BRL)提取食道癌組織(S3，T)和相應(yīng)的正常食道組織(S3，N)總RNA各30μg，用常規(guī)的Northern方法進行實驗用1％的瓊脂糖凝膠走RNA電泳后，將膠轉(zhuǎn)到Hybond-XL尼龍膜(Amersham Pharmacia，Buckinghamshire，England)上，80C烘烤2小時。用預(yù)雜交液(配方6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt，100μg/ml變性的鮭精DNA)對尼龍膜在65℃預(yù)雜交3小時。用含有32P標記的UBF cDNA的雜交液(配方6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml鮭精DNA)過夜雜交后，在65℃洗脫(洗脫液配方0.1×SSC，0.5％SDS)1小時。使尼龍膜在磷屏(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)中放射自顯影后，用FLA-3000A Plate/Fluorescent Image Analyzer(Fuji Photo Film，Tokyo，Japan)掃描結(jié)果，并分析數(shù)據(jù)。用18S的rRNA作為對照。實驗結(jié)果見圖3。
實驗結(jié)果說明，UBF基因在食道癌組織的總RNA中的含量遠高于其在正常食道組織中的含量。
2)cDNA array實驗用QIAGEN公司的KIT提取食道癌組織和相應(yīng)的正常食道組織的mRNA各2μg，進行反轉(zhuǎn)錄后標記33P同位素、預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影、數(shù)據(jù)讀取和分析[3]。cDNA array的數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表2。
表2
實驗結(jié)果說明，實驗結(jié)果說明，UBF基因在食道癌組織的mRNA中的含量遠高于其在正常食道組織中的含量。
3)Western實驗提取食道癌組織和相應(yīng)的正常食道組織總蛋白各100μg，用常規(guī)的Western方法進行實驗用10％SDS-PAGE膠走蛋白電泳，將膠轉(zhuǎn)到尼龍膜(Scheleicher&Schuell，Dassel，Germany)上，并點上UBF的單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)，使抗體結(jié)合到相應(yīng)的抗原部位，再將標有HRP(辣根過氧化物酶)的抗小鼠IgG抗體結(jié)合到膜上。通過免疫印跡化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)((AmershamPharmacia)產(chǎn)生的光信號觀察Western實驗結(jié)果。用Actin作為對照。實驗結(jié)果見圖4。
實驗結(jié)果說明，UBF蛋白在食道癌組織中的含量遠高于其在正常食道組織中的含量。
實施例3、UBF基因的反義核苷酸對肝癌細胞株的抑制作用肝癌細胞株SMMC-7721和肺成纖維細胞株HLF由中科院上海細胞庫提供；各個核苷酸片段由上海Sangon公司合成。
設(shè)計的UBF反義核苷酸序列為5′-CTTCTCCGTTCATCCTCC-3′(AS)，另外設(shè)計了三段序列作為對照1)5′-CCT CCT ACT TGC CTC TTC-3′(SH)；2)5′GGA GGA TGA ACG GAG AAG-3′(SE)；3)5′-GGT GTC CGT TCA TCG ACG-3′(MI)。
其中SH與AS的各堿基數(shù)目一致，但堿基排布不同；SE是AS的反向互補序列；MI與AS相比，出現(xiàn)幾個堿基的隨機錯配。使用前將各個核苷酸序列標記熒光素，并溶解在1M PBS中，制備出0.5μM、2μM、5μM等濃度。將各溶液按如表3的濃度加入各細胞的上清液中。
a)48小時后，通過共聚焦顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài)，結(jié)果如圖5所示；b)48小時后對活細胞計數(shù)，并與空白對照(C)的活細胞計數(shù)結(jié)果比較，計算細胞的存活率(Percentage)，結(jié)果列表如圖6；c)分別提取用5μM AS、5μM SE、5μM SH、5μM MI處理過的SMMC-7721和未經(jīng)處理的SMMC-7721細胞的總蛋白，進行WESTERN實驗，并用ACTIN作為對照。結(jié)果如圖7所示；d)提取用5μMAS處理過的SMMC-7721和未經(jīng)處理的SMMC-7721細胞的mRNA，各自取3μg進行cDNA array實驗。結(jié)果見表4；表3
表4
權(quán)利要求
1.UBF反義核苷酸或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的UBF反義核苷酸或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物，其特征在于其中所述的衍生物是UBF與化學(xué)毒素、放射性核素或藥物形成的偶聯(lián)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的UBF反義核苷酸或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物，其特征在于它能特異性地與UBF基因結(jié)合，從而抑制UBF基因的表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的UBF反義核苷酸或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物的設(shè)計方法，其特征在于該方法包括首先找出UBF基因序列中編碼蛋白質(zhì)的核酸片段，將此片段為模板在整個人類基因序列的數(shù)據(jù)庫中進行掃描，找出具有UBF基因特異性的數(shù)個核酸片段，選取其中的15至30bp的核苷酸序列，其反向互補序列可作為UBF基因的反義核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的UBF反義核苷酸或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的UBF反義核苷酸或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于它可以作為抗腫瘤藥物的主要活性成分，通過抑制腫瘤細胞中的UBF基因表達來抑制腫瘤細胞的生長。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種UBF反義核苷酸和其衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出UBF在腫瘤細胞中的含量遠高于正常細胞，通過抑制UBF的表達，使腫瘤細胞的生長受到抑制，但不影響正常細胞的生長，達到抗腫瘤的目的。本發(fā)明公開了能特異性地與UBF基因結(jié)合的UBF反義核苷酸，或以UBF反義核苷酸為模板制備的衍生物，本發(fā)明還公開了反義核苷酸的設(shè)計方法。UBF反義核苷酸及其衍生物可作為制備抗腫瘤藥物的活性成分，在腫瘤治療方面有廣泛用途。
文檔編號C07H21/00GK1443845SQ0211097
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月8日
發(fā)明者胡賡熙 申請人:胡賡熙