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雙鏈多核苷酸的制作方法

文檔序號(hào):1178276閱讀:473來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:雙鏈多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及對(duì)RNA酶(RNase)具有抗性并且具有RNA干擾效應(yīng)的新型雙鏈多核苷 酸、所述雙鏈多核苷酸的用途、使用所述雙鏈多核苷酸抑制基因表達(dá)的方法、包含所述雙鏈 多核苷酸的藥物組合物等。
背景技術(shù)
抑制細(xì)胞、組織或個(gè)體內(nèi)的靶基因表達(dá)的方法包括將雙鏈RNA導(dǎo)入所述細(xì)胞、組 織或個(gè)體內(nèi)的方法。通過(guò)雙鏈RNA的導(dǎo)入,與其序列具有同源性的mRNA被降解,從而靶基因 的表達(dá)被抑制。這種效應(yīng)被稱作“RNA干擾”或“RNAi”。RNA干擾最初是在線蟲(C. elegans) 中報(bào)道的(例如參見非專利文獻(xiàn)1),然后在植物中也進(jìn)行了報(bào)道(例如參見非專利文獻(xiàn) 2)。已經(jīng)報(bào)道了由21個(gè)核苷酸的有義鏈和反義鏈組成、在3’末端具有2個(gè)核苷酸的 懸突(overhang)的雙鏈RNA (小干擾RNA: siRNA),在脊椎動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞中具有RNA干擾 效應(yīng)(例如參見非專利文獻(xiàn)3)。siRNA可用于基因功能的鑒定、適合于生產(chǎn)有用物質(zhì)的細(xì)胞株的篩選、參與疾病的 基因的調(diào)控等,但是,不利的是,會(huì)被RNA酶容易地降解(例如參見非專利文獻(xiàn)4)。RNA合 成比DNA合成困難得多,因此,據(jù)報(bào)道其成本高出5-10倍(例如參見非專利文獻(xiàn)幻。造成 這種情況的示例性原因包括2’ -羥基需要保護(hù)基團(tuán)、需要對(duì)該保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)、以及 由于保護(hù)基團(tuán)的空間位阻造成的縮合率的下降而引起的RNA合成產(chǎn)率差(例如參見非專利 文獻(xiàn)6)。因?yàn)椋枰_發(fā)對(duì)RNA酶具有高度抗性的、生產(chǎn)成本低的、并且保持RNAi活性的多 核苷酸。為了獲得對(duì)RNA酶具有抗性的siRNA,研究了這樣的方法其中構(gòu)成siRNA的全部 或部分RNA核苷酸被替換為2’ -脫氧核糖核苷酸(DNA)(例如參見專利文獻(xiàn)1和非專利文 獻(xiàn)7、8、9、10和11)。但是,尚未獲得對(duì)RNA酶具有抗性和等同于天然siRNA的RNA干擾效 應(yīng)兩者的siRNA。已知,具有硫代磷酸酯(phosphorothioate,PS)鍵(其中磷酸二酯鍵中的磷酸基 團(tuán)的非橋氧原子被替換為硫原子)的寡核苷酸對(duì)于核酸酶具有抗性(例如參見非專利文獻(xiàn) 12)。已經(jīng)報(bào)道以PS鍵替換磷酸二酯鍵的siRNA顯示出等同于未修飾的siRNA的RNA干擾 (例如參見非專利文獻(xiàn)9、13和14)。但是,寡核苷酸中PS鍵的數(shù)目的增加引起雙鏈RNA的 熱力學(xué)不穩(wěn)定性和與蛋白的非特異性結(jié)合,因此其不被認(rèn)為是優(yōu)選的(例如參見非專利文 獻(xiàn) 15) ο還已經(jīng)嘗試通過(guò)使用修飾的RNA替換天然RNA來(lái)獲得穩(wěn)定的siRNA。由于RNA的 2'-OH基對(duì)于RNA酶降解反應(yīng)是必需的,所以將該2’-0H基烷基化,從而其不作為RNA酶的 底物。已經(jīng)報(bào)道了大量的此類2’-0_烷基核苷衍生物。2’-0_甲基核苷酸是天然存在的修 飾的核苷酸,其也存在于tRNA中,并且在反義研究的早期階段已對(duì)其進(jìn)行了研究(例如參見非專利文獻(xiàn)16)。已經(jīng)報(bào)道,通過(guò)將SiRNA的有義鏈和反義鏈之一或二者替換為2’-0_甲基核苷酸, 則RNAi完全喪失(例如參見非專利文獻(xiàn)7、17和18),或者,當(dāng)把siRNA的有義鏈或反義鏈 中的全部核糖核苷酸替換為2’ -0-甲基核苷酸時(shí),僅觀察到弱的RNAi,當(dāng)將兩條鏈都替換 時(shí),RNAi完全喪失(例如參見非專利文獻(xiàn)9)。有報(bào)道指出當(dāng)有義鏈中的所有RNA替換為2’ -0-甲基核苷酸時(shí),獲得了等同于 未修飾的siRNA的RNAi,但是這受到該實(shí)驗(yàn)中所用的siRNA的序列的影響(例如參見非專 利文獻(xiàn)19)。已經(jīng)有報(bào)道稱當(dāng)向siRNA的末端引入4個(gè)2’ _0_甲基核苷酸時(shí),保留了其 RNAi(例如參見非專利文獻(xiàn)14);以及,當(dāng)向siRNA的有義鏈和反義鏈的末端都交替引入 2’-0-甲基核苷酸時(shí),獲得了等同于未修飾的siRNA的RNAi (例如參見非專利文獻(xiàn)18)。此 外,有報(bào)道稱引入3個(gè)連續(xù)的2’ -0-甲基核苷酸不引起有義鏈的活性的任何降低,但確實(shí) 引起反義鏈的活性的下降,尤其是,向有義鏈的5’ -末端引入時(shí),使活性顯著降低(例如參 見非專利文獻(xiàn)20)。此外,已經(jīng)報(bào)道了在有義鏈的3’和5’ -末端附近包含2’ -脫氧核糖核苷酸并且 在中間部分包含2’-0-甲基核苷酸的siRNA,但是沒(méi)有就RNAi活性與未修飾的siRNA進(jìn)行 比較(例如參見非專利文獻(xiàn)21)。具有人工合成的修飾的RNA即2’ -脫氧-2’ -氟核苷酸議"F)的寡核苷酸,優(yōu) 先形成與核糖核苷酸相同的N-型構(gòu)象,并且對(duì)于RNA具有較高的親和性(例如參見非專利 文獻(xiàn)2 。但是,具有磷酸二酯鍵的那些對(duì)于核酸酶沒(méi)有抗性,因此,為了具有核酸酶抗性, 必須使用硫代磷酸酯鍵對(duì)其進(jìn)行替換(例如參見非專利文獻(xiàn)22)。已經(jīng)有報(bào)道稱當(dāng)siRNA中的嘧啶核苷酸替換為2’ -F時(shí),得到的siRNA顯示出等 同于未修飾的siRNA的RNAi (例如參見非專利文獻(xiàn)9和14)。向反義鏈中導(dǎo)入3個(gè)連續(xù)的 2’_F部分時(shí)幾乎不降低其活性(例如參見非專利文獻(xiàn)20)。此外,已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)有義鏈和/ 或反義鏈中的嘧啶或嘌呤核苷酸被替換為2’-F并且將修飾的兩條鏈組合時(shí),得到的siRNA 顯示出等同于未修飾的siRNA的RNAi (例如參見非專利文獻(xiàn)23)。但是,在這些之中,顯示出RNA干擾效應(yīng)的那些,包含核糖核苷酸,因此被RNA酶降 解。已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)siRNA中的嘧啶核苷酸被2’ -F替換時(shí),在動(dòng)物模型中沒(méi)有觀察到RNAi 的增強(qiáng)或其效應(yīng)的延長(zhǎng)(例如參見非專利文獻(xiàn)24)。此外,已經(jīng)報(bào)道,作為非天然核苷的 2’ -脫氧_2’ -氟胞苷和2’ -脫氧_2’ -氟尿苷,當(dāng)向大鼠或土撥鼠施用時(shí),聲稱其不顯示 毒性,但通過(guò)細(xì)胞內(nèi)三磷酸化而作為DNA聚合酶或RNA聚合酶的底物,并且被摻入各種器 官的DNA、RNA和線粒體DNA(例如參見非專利文獻(xiàn)25和沈)。2,-脫氧-2,-氟核苷的三 磷酸酯形式作為DNA聚合酶α或γ的底物被摻入DNA中;而2’ _0_甲基核苷的三磷酸酯 形式已經(jīng)在體外被確認(rèn)為不作為DNA聚合酶α或γ的底物(例如參見非專利文獻(xiàn)27)。 2’ -脫氧_2’ -氟核苷的遺傳毒性是需要考慮的(例如參見非專利文獻(xiàn)28)。已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)siRNA中的所有核苷酸都被2’ -F替換時(shí),其RNAi相較于未修飾的 siRNA僅有稍許下降,并且此類siRNA對(duì)于RNA酶具有抗性(例如參見非專利文獻(xiàn)29)。已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)把2' -0-甲基核苷酸和2’_F交替導(dǎo)入siRNA的有義鏈和反義鏈時(shí), 獲得的siRNA具有等于或高于未修飾的siRNA的RNAi,并且在血清中是相對(duì)穩(wěn)定的(例如參見非專利文獻(xiàn)30)。但是,導(dǎo)入大量的非天然核酸所引起的細(xì)胞毒性或副作用是需要考慮 的。ENA(2‘ -0,4' _C_亞乙基-橋核酸)是修飾的核酸,其對(duì)于核酸酶具有穩(wěn)定性 (例如參見非專利文獻(xiàn)31和32)。已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)導(dǎo)入ENA以替換siRNA的有義鏈和反義鏈 之一或二者的3’-末端的懸突位點(diǎn)中的2核苷酸時(shí),RNAi活性降低(例如參見非專利文獻(xiàn) 33)。已經(jīng)報(bào)道,向細(xì)胞中導(dǎo)入化學(xué)合成的siRNA會(huì)使有義鏈和反義鏈二者的5’ -末端 被磷酸化(例如參見非專利文獻(xiàn)34)。在人類細(xì)胞中,已經(jīng)報(bào)道RNA激酶hClpl承擔(dān)siRNA 的5’-磷酸化(例如參見非專利文獻(xiàn)35)。當(dāng)把具有磷酸化的5’-末端的siRNA和具有非 磷酸化的5’-末端的siRNA分別導(dǎo)入細(xì)胞并比較它們的RNAi活性時(shí),沒(méi)有觀察到它們之間 的活性的差異,這表明具有非磷酸化的5’ -末端的siRNA在細(xì)胞中易于發(fā)生磷酸化(例如 參見非專利文獻(xiàn)14)。由反義鏈與已知參與RNAi活性的Argonaute蛋白(Ago)的復(fù)合物的X-射線分析 顯示,反義鏈的5’-末端的磷酸基團(tuán)及其鄰近的核苷酸與Ago的PIWI結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合(例 如參見非專利文獻(xiàn)36)。至于siRNA的鏈長(zhǎng)度,在3’ -末端具有2個(gè)核苷酸的懸突的有義鏈和反義鏈通常 各使用21個(gè)核苷酸。當(dāng)反義鏈設(shè)為21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度并且有義鏈的鏈長(zhǎng)度從3’或5’ -末 端變化時(shí),表明具有21個(gè)核苷酸的有義鏈的siRNA具有最強(qiáng)的RNAi活性(例如參見非專 利文獻(xiàn)7和37)。此外,已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)有義鏈的鏈長(zhǎng)度在3’-末端被截短至17或18個(gè)核苷 酸時(shí),得到的siRNA顯示出等同于具有21個(gè)核苷酸的有義鏈的siRNA的RNAi活性(例如 參見非專利文獻(xiàn)38)。已經(jīng)表明,當(dāng)3’ -末端懸突的長(zhǎng)度是2個(gè)核苷酸時(shí),由21個(gè)核苷酸組成的siRNA 具有最強(qiáng)的RNAi活性(例如參見非專利文獻(xiàn)7)。已經(jīng)報(bào)道,當(dāng)使用具有序列AA、CC、GG、 UU或UG(野生型)或TdG或TT(T和dG是2'-脫氧核糖核苷酸)作為3’ -末端懸突的 siRNA來(lái)檢查RNAi活性時(shí),所有的序列都具有RNAi活性(例如參見非專利文獻(xiàn)7)。此外, 已經(jīng)報(bào)道,具有UU序列作為3’ -末端懸突的siRNA顯示出比具有TT序列的siRNA更高的 RNAi活性(例如參見非專利文獻(xiàn)10)。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái),已經(jīng)知道雙鏈RNA例如多聚I:多聚C是干擾素誘導(dǎo)劑,并且 TLR3 (Toll-樣受體幻參與該機(jī)制。還已知siRNA被TLR3及其家族成員TLR7和TLR8識(shí) 別,并且已知誘導(dǎo)干擾素或細(xì)胞因子。特別地,已經(jīng)報(bào)道具有⑶、UGU⑶或⑶CCUUCAA序列的 siRNA傾向于引起免疫應(yīng)答(例如參見非專利文獻(xiàn)39、40和41)。此外,已經(jīng)表明向siRNA 中導(dǎo)入DNA或化學(xué)修飾的核苷酸例如2’-OMeRNA會(huì)抑制此類免疫應(yīng)答(例如參見非專利文 獻(xiàn) 41、42 和 43)。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)不懈的努力獲得了對(duì)RNA酶具有抗性、可以以低成本合成并且具有 RNA干擾效應(yīng)的多核苷酸,由此通過(guò)發(fā)現(xiàn)包含交替組合的DNA和2’ -0-甲基RNA的寡核苷 酸單元的雙鏈多核苷酸可以解決上述問(wèn)題,從而完成了本發(fā)明。[參考文獻(xiàn)][專利文獻(xiàn)]專利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開號(hào)WO 2003/044188
專利文獻(xiàn)2 美國(guó)專利公開號(hào)US2007/(^65220非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Nature, 1998,Vol. 391,p. 806-811非專利文獻(xiàn)2 =Science, 1999,Vol. 286,p. 950-952非專利文獻(xiàn)3 =Nature, 2001, Vol. 411, p. 494-498非專利文獻(xiàn)4 =Clinical Chemistry, 2002,Vol. 48,p. 1647-16535 =Sekine, Μ. and Taira K. , ed. , “ RNAi Method and Antisense Method",Kodansha Ltd.,發(fā)表于 2005 年 6 月 20 日,第 2. 4章RNAi Therapy-Application of siRNA to Therapeutic Drugs for Cancer, p.76-87非專利文獻(xiàn) 6 :Current Opinion in Drug Discovery & Development, 2008, Vol. 11,p.203-216非專利文獻(xiàn)7 =EMBO Journal, 2001, Vol. 20,p. 6877-6888非專利文獻(xiàn)8 =Nucleic Acids Research, 2002,Vol. 30,p. 1757-1766非專利文獻(xiàn)9 :RNA, Vol. 9,2003,p. 1034-1048非專利文獻(xiàn)10 =FEBS Letters, 2002, Vol. 521,p. 195-199非專利文獻(xiàn)11 =Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36,p. 2136-2151非專利文獻(xiàn)12 =Nucleic Acid Drug Development, 2000, Vol. 10,p. 117-121非專利文獻(xiàn)13 =Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31,p. 589-595非專禾Ij 文獻(xiàn) 14 :Antisense Nucleic Acid Drug Development, 2003, Vol. 13, p.83-105非專禾Ij 文獻(xiàn) 15 :Antisense Nucleic Acid Drug Development, 2000, Vol. 10, p.117-121非專利文獻(xiàn) 16 =Nucleic Acids Research, 1987,Vol. 15,p. 6131-6148非專利文獻(xiàn) 17 :Biochemistry,2003, Vol. 42,p. 7967-7975 非專利文獻(xiàn) 18 =Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, p. 2705-2716 非專利文獻(xiàn) 19 :RNA,2006, Vol. 12,p. 163-176非專利文獻(xiàn) 20 Journal of Medical Chemistry, 2005, Vol. 48, p. 4247-4253 非專利文獻(xiàn) 21 =Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids,2006, Vol. 25, p.889-907非專利文獻(xiàn)22Journal of Medical Chemistry, 1993, Vol. 36, p. 831-841非專利文獻(xiàn)23 = Chemistry & Biodiversity,2007,Vol. 4,p.858—873 非專利文獻(xiàn)24:RNA,2004, Vol. 10,p.766—771 非專利文獻(xiàn)25= Toxicologic Pathology, 1999,Vol. 27,p.607—617 非專利文獻(xiàn)26Chemical Research in Toxicology,2002, Vol. 15, p.922-926 非專利文獻(xiàn)27=Biochemical Pharmacology, 2000, Vol. 59,p.1045—1052 非專利文獻(xiàn)28!Oligonucleotides, 2006, Vol. 16, p.337-351 非專利文獻(xiàn)29 Chemical Biology & Drug Design,2007, Vol. 70, p. 113-122 非專利文獻(xiàn)30Journal of Medicinal Chemistry. ,2005, Vol. 48, p.901-904 ,非專利文獻(xiàn)31:Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. ,2002, Vol. 12P. 73-76非專利文獻(xiàn)32非專利文獻(xiàn)33 p. 301-309非專利文獻(xiàn)34非專利文獻(xiàn)35非專利文獻(xiàn)36非專利文獻(xiàn)37非專利文獻(xiàn)38非專利文獻(xiàn)39非專利文獻(xiàn)40非專利文獻(xiàn)41非專利文獻(xiàn)42非專利文獻(xiàn)43
:Bioorganic & Medicinal Chemistry,2003,Vol. 11,p. 2211-2226 Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,Vol. 12,Cell,2001, Vol. 107,p. 309-321
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=Nature,2005,Vol. 434,p. 663-666
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=Nucleic Acids Research,2008, Vol. 36, p.5812-5821
:Science,2003, Vol. 303,p. 1526-1529
=Nature Biotechnology,2005, Vol. 23,p.457-462
=Nature Medicine, 2005, Vol. 11,p.263-270
Journal of Molecular Biology, 2005, Vol. 348,p.1079—1090
=Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23,p.1002-100
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供對(duì)RNA酶具有抗性并且具有RNA干擾效應(yīng)的雙鏈多核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供使用上述雙鏈多核苷酸來(lái)抑制基因表達(dá)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含上述雙鏈多核苷酸的藥物組合物。解決問(wèn)題的方法因此,本發(fā)明包括(1)雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(I)表示的多核苷酸和式(II)表示的多核苷酸 組成,并且具有以下特征(a)至(d)5' -X-(Ci-^)trCip-Xm-S' (I)禾口5' -δ5-(α-β)Γ-Υ-υη-3' (II),(a) α和β不同地表示DNA或2' -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2 ‘ -OMeRNA, υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸,并且X 和Y表示由相同或不同種類的選自DNA、RNA和修飾的核酸中的核苷酸組成的寡核苷酸;(b) ρ表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù), q表示3至9的任意整數(shù),(α - β ) ^和X中的核苷酸總數(shù)是17或18,s表示0或1的整數(shù), η表示0至5的任意整數(shù),r表示3至9的任意整數(shù),并且(α - β ^和Y中的核苷酸總數(shù)是 17 或 18 ;(c)式(I)表示的多核苷酸中,X-(CI-^)q-Cip具有與靶基因相同的核苷酸序列; 和(d)式⑴中的ΧΗα-β)^和式(II)中的(α-β )r_Y具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序 列;(2)根據(jù)⑴的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)6、(α-β)-(Υ-β)5、 (α -β )2-( γ -β )4> ( α -β )3-( Y -β )3> ( α -β )4-( γ -β )2> (α-β)5-(γ-β)、 (α-β)6、β12、(α-β)-β10、(α-β)2-β8、(α-β)3-β6、(α-β)4-β4、(α-β)5-β2、 β-(Υ"β)5> β-(α-β)-(γ-β)4> β-(α-β)2-(γ-β)3、β-(α-β)3-(γ-β)2、 β-(α-β)4"(Υ-β)> β ιι> β -( α -β )-β 8> β-(α-β)2-β6、β-(α-β)3-β4、 β-(α-β)4-β2、禾口 β-(α-β)5,其中 γ 表示 RNA;(3)根據(jù)⑴或⑵的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(II)表示的多核苷酸中, r 是 3,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)6、(γ-β)5-(α-β), (γ-β)4-(α-β)2> (γ-β)3-(α-β)3, (γ-β)2-(α-β)4> (γ-β)-(α-β)5> (α-β)6、α6-(α-β)3、 α4-(α-β)4、α 2-( α -β )5> ( γ - β ) 5- α , (γ-β)4_(α-β)-α、(γ-β)3_(α-β)2-α、 (γ-β)2-(α-β)3"α > (γ-β)-(α-β)4"α > α6-(α-β)2-α、α4-(α-β)3-α、 β2-(α-β)4_α、和(α-β)5_α,其中 Y 表示 RNA ;(4)根據(jù)⑴或⑵的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多
核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任一項(xiàng)(Υ_β)6、(α-β)--(γ-β)5>(α -β )2"(Y - β ) 4> ( α -β )3"( Y "β )3> ( α -β )4-( Y -β )2、( α -(α-β)(5、β12、(α-β)-β10、(α-β)2-β8、(α-β)3-β6、( α - β ) 4- β ,i、(α-β)5-β2、β-(γ-β)5、β-(α-β)--(Υ"β)4> β-(α-β)2-(γ-β)3, β -(α -(γ-β)2>β -(α -"β),r ( Υ - β ) > β 、β-(α-β)-β8、β-(α-β)2-β6、β ■-(α --β )3-β 4、β-(α-β)4__β2、禾口 β_(α-β)5;并且在式(II)表示的多核苷酉ι中,r是3,并且Y是選自下列的任一項(xiàng)(Υ-β)6、(Υ"β)5-(α-β), (y-β)4-_(α-β)2、
(γ-β)3-(α-β)3, (γ-β)2-(α-β)4> (γ-β)-(α-β)5> (α-β)6、α6-(α-β)3、 α4-(α-β)4、α 2-( α -β )5> ( γ - β ) 5- α , (γ-β)4_(α-β)-α、(γ-β)3_(α-β)2-α、 (γ-β)2-(α-β)3"α > (γ-β)-(α-β)4"α > α6-(α-β)2-α、α4-(α-β)3-α、 α2-(α-β)4_α、禾口( α - β ) 5-α,其中 γ 表示 RNA ; (5)根據(jù)⑴的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q是
4,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Y_β)5、(α-β)-(γ-β)4、(α_β)2-(γ_β)3、((ι -β )3"( )2> (α-β)4"(Υ-β)>(α -β )5、β 10、(α -”(α _-β)2_ 3 6、(cι-β)3_β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4.β-(α-β)-(γ-β)3、β""(α"(γ_β)2、β-(α-β)3-(γ-β)> β 9、β-(α-β)-β6、β "(α - β )2-β4、β -ι -β)和
β-(α_β)4,其中 Y 表示 RNA;(6)根據(jù)(1)或(5)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(II)表示的多核苷酸中, r 是 4,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)5、(γ-β)4_(α-β)、(γ-β)3_(α-β)2、 (γ-β)2-(α-β)3> (γ-β)-(α-β)4> (α-β)5、β6-(α-β)2、β4-(α-β)3、 β2-(α-β)4、( γ - β ) 4- α , (α-β)4-α、(γ-β)3-(α-β)-α、(γ-β)2_(α-β)2-α、 (γ-β)-(α-β)3"α > α6-(α-β)-α、α4-(α-β)2_α、α2-(α-β)3_α 禾口 (α-β)4-α,其中 γ 表示 RNA;(7)根據(jù)⑴的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q是 4,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)5、(α-β)-(Υ-β)4、(α-β)2-(γ-β)3, (α -β )3-( Y-β )2> (α-β)4-(γ-β)、(α-β)5、β 10、(α-β)-β8、(α-β)2-β6、(α-β)3-β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4, β-(α-β)-(γ-β)3、β - ( α - β ) 2-( y - β ) 2> β-(α-β)3-(γ-β), β9、β-(α-β)-β6、β-(α-β)2-β4、β-(α-β)3-β2、禾口 旦-(0-舊4;并且在式(II)表示的多核苷酸中,r是4,并且Y是選自下列的任一項(xiàng)
(Υ-β)5、(Υ-β)4-(α-β)、(γ-β)3-(α-β)2、(γ-β)2-(α-β)3、(γ-β)-(α-β)4、 (α-β)5、α6-(α-β)2、α4-(α-β)3、α 2- ( α - β ) 4> ( γ - β ) 4_ α、( α - β ) 4-α、 (Υ-β)3-(α-β)_α、(Υ"β)2-(α-β)2-α > (Υ_β)-(α-β)3-α、α6-(α-β)-α、 α 4_(α — β )2_α、α 2-( α - β ) 3-α、禾口(α - β )4-α,其中 γ 表示 RNA ;(8)根據(jù)⑴的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(Υ-β)3、(α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)、(α-β)4、β8、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3、 β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、禾口 β-(α-β)3,其中 γ 表示 RNA;(9)根據(jù)(1)或(8)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(II)表示的多核苷酸中, r 是 5,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)4、(γ-β)3_(α-β)、(γ-β)2-(α-β)2> (γ-β)-(α-β)3> (α-β)4、β6-(α-β)、β4-(α-β)2、β2-(α-β)3、(γ-β)3_α、 (Υ-β)2-(α-β)_α、(γ-β)"(α-β)2-α > α 7> α4-(α-β)-α、α2-(α-β)2_α、禾口 (α - β ) 3- α,其中 γ 表示 RNA;(10)根據(jù)⑴的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(Υ-β)3、(α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)> (α-β)4、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3> β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、
和3-(0-舊3;并且在式(II)表示的多核苷酸中,r是5,并且Y是選自下列的任一 項(xiàng)(Υ-β)4、(γ-β)3"(α-β)> (γ-β)2-(α-β)2> ( y-β )-(α -β (α-β)4、 α6-(α-β)、α4-(α-β)2、α 2- ( α - β ) 3> ( Y - β ) 3" α > (γ-β)2"(α-β)-α > (γ-β)-(α-β)2-α> α 7、α4-(α-β)-α、α2-(α-β)2-α』Ρ(α-β)3_α,其中 γ 表 示 RNA ;(11)雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(I)和(III)表示的多核苷酸組成,并且具有以 下特征(a)至(d)5' -X-(Ci-^)trCip-Xm-S' (I)禾口5' - δ s- ( β - α ) r-Y- υ η-3 ‘ (III),(a) α和β不同地表示DNA或2' -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2 ‘ -OMeRNA, υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸,并且X 和Y表示由相同或不同種類的選自DNA、RNA和修飾的核酸中的核苷酸組成的寡核苷酸;(b) ρ表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù), q表示3至9的任意整數(shù),(α - β ) ^和X中的核苷酸總數(shù)是17或18,s表示0或1的整數(shù), η表示0至5的任意整數(shù),r表示3至9的任意整數(shù),并且(α - β ^和Y中的核苷酸總數(shù)是 17 或 18 ;(C)式⑴表示的多核苷酸中,X-(CI-^)q-CIp具有與靶基因相同的核苷酸序列; 和[O101] (d)式(工)中的X-(o—p).和式(III)中n9(13—1),-y具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列;
(12)根據(jù)權(quán)利要求11的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(工)表示的多核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任意-項(xiàng)(Y—p)。、(‘3-13)-(v-13)。、(‘3-13),-(v-13)+、(‘1-13),-(v-13),、(o—p)+-(Y—p),、(‘3-13)。-(v-13)、(o—p)s、p l、(‘~-13)-13 l。、(‘3-13)-p s、(c~-13)s—p s、(‘1-13)~、-13+、(‘1-13)s—p、13-(v-13)。、13-(‘3-13)-(v-13)+、13-(t1-13),-(v-13),、13-(‘3-13),-(v-13),、13-(o—p)+-(Y—p)、p、、、13-(c~-13)-13。、13-(‘3-13),-p。、13-(‘1-13),-p+、13-(o—p)。-p,、8~13-(c~-13)。,其中Y表示RNA;
(13)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(iii)表示的多核苷酸中,r是3,并K Y是選自下列的任-項(xiàng)(13-~.)。、(13-v)~-(13-o)、(13-v)~-(13-o),、(13-v),-(p—o),、(13-v),-(p—o)+、(13-v)-(13-o)。、(p—o)。、p。-(p—o),、13~、-(13-o)+、p,-(p—o)。、(13-v)。-p、(13-v)~、-(13-‘1)-13、(13-v),-(p—o),-p、(13-v),-(p—o),-p、(13-v)-(13-‘1)~、-13、p。-(p—o),-p、13~、-(13-o),-p、p,-(p—o)。-p、矛口(p—o)。-p,其中Y表示RNA;
(14)根據(jù)(1 1)nq雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(工)表示的多核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任-項(xiàng)(Y—p)。、(‘3-13)-(v-13)。、(‘3-13),-(v-13)+、(‘1-13),-(v-13),、(o—p)+-(Y—p),、(‘3-13)。-(v-13)、(o—p)s、p l、(‘~-13)-13 l。、(‘3-13)-p s、(c~-13)s—p s、(‘1-13)~、-13+、(‘1-13)s—p、13-(v-13)。、13-(‘3-13)-(v-13)+、13-(t1-13),-(v-13),、13-(‘3-13),-(v-13),、13-(o—p)+-(Y—p)、p、、、13-(c~-13)-13。、13-(‘3-13),-p。、13-(‘1-13),-p+、13-(o—p)。-p,、8~13-(c~-13)。;并且在式(iii)表示的多核苷酸中,r是3,并K Y是選自下列的任-項(xiàng)(13-~’)。、(13-v)~-(13-o)、(13-v)~-(13-o),、(13-v),-(p—o),、(13-v),-(p—o)+、(13-v)-(13-o)。、(p—o)。、p。-(p—o),、13~、-(13-o)+、p,-(p—o)。、(13-v)。-p、(13-v)~、-(13-‘~)-13、(13-v),-(p—o),-p、(13-v),-(p—o),-p、(13-v)-(13-o)+-p、p。-(p—o),-p、13~、-(13-o),-p、p,-(p—o)。-p、矛口(p—o)。-p,其中Y表示RNA;[OL05] (15)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(工)表示的多核苷酸中,q是4,并且X是選自下列的任意-項(xiàng)(v-13)。、(‘~-13)-(v-13)+、(‘3-13),-(v-13),、(‘3-13),-(v-13),、(‘3-13)~、-(v-13)、(‘~-13)。、p、。、(t1-13)-13。、(‘~-13),-p。、(‘1-13),-p+、(o—p)+-p,、13-(v-13)+、13-(t1-13)-(v-13),、F-(‘3-13),-(v-13),、13-(‘1-13),-(v-13)、p。、F-(‘-13)-13。、13-(‘3-13),-p+、13-(t1-13),-p,、 矛口13-(‘3-13)。,其中Y表示RNA;[OL063 (16)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(III)表示的多核苷酸中,r是4,并K Y是選自下列的任-項(xiàng)(13-v)。、(13-v)~-(13-o)、(13-v),-(p—o),、(13-v),-(p—o),、(13-v)-(13-o)+、(p—o)。、p。-(p—o),、13~、-(13-o),、p,-(p—o)+、(13-f)~-13、(p—o)+-p、(v-13),-(p-‘~)-13、(v-13),-(p—o),-p、(13-v)-(13-o),-p、p。-(p-‘~)-13、13~、-(13-o),-p、p,-(p—o),-p矛口(p—o)。-p,其中Y表示RNA;
(17)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q
是」4,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Y_β)5、(α-β)-(γ-β)4、(α_β)2-(γ(α-β )3"( )2> (α-β)4"(Υ-β)>(α -β )5、β 10、(α -”(α _-β)2" β(α-β)3-β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4.β-(α-β)-(γ-β)3、β""(α"(γ-(α-β)3-(γ-β)> β9、β-(α-β)-β6、β "(α - β )2-β4、β -ι -β))、 ■
3-(0-舊4;并且在式(III)表示的多核苷酸中,r是4,并且Y是選自下列的任一項(xiàng)
(β )5、(β )4-(β-α)、(β )3-(β-α)2、(β-γ)2-(β-α)3、(βι)-(β-α)4、 (β_α)5、β6-(β_α)2、β4-(β-α)3、β2_(β_α)4、( β - γ ) 4_ β、( β _ α ) 4-β、 (γ-β)3"(β-α)-β> (Υ-β)2-(β_α)2-β、(β )-(β-α)3-β、β6-(β-α)-β、 β4-(β-α)2_β、β2-(β-α)3_β 禾口(β-α)4_β,其中 Y 表示 RNA ;(18)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q 是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(γ-β)3, (α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)、(α-β)4、β8、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3、 β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、禾口 β-(α-β)3,其中 γ 表示 RNA;(19)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(III)表示的多核苷酸中, r 是 5,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(β )4、(β-γ)3-(β_α)、(β-γ)2-(β-α)2> (β-γ)-(β-α)3> (β_α)4、β6-(β-α)、β4-(β-α)2、β2-(β-α)3、( γ - β ) 3" β > (β-γ)2-(β_α)-β、(β-γ)-(β_α)2-β、β7、β4-(β-α)-β、β2_(β-α)2_β、禾口 (β-α)3-β,其中 γ 表示 RNA;(20)根據(jù)(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式⑴表示的多核苷酸中,q 是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(γ-β)3, (α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)> (α-β)4、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3> β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、 和3-(0-舊3;并且在式(III)表示的多核苷酸中,r是5,并且Y是選自下列的任一 項(xiàng)(β )4、(β-γ)3"(β-α)> (β - Y )2-(β -α )2> (β-γ)-(β-α)3, (β_α)4、 β6-(β_α)、β4-(β-α)2、β2-(β-α)3、( γ - β ) 3" β > (β-γ)2"(β-α)-β> (β-γ)-(β_α)2-β、β7、β4-(β_α)-β、β2-(β-α)2-β、禾口(β-α)3_β,其中 γ 表 示 RNA ;(21)根據(jù)(1)或(11)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)、(II)和(III)表示 的多核苷酸中,q是9,χ中的核苷酸數(shù)目是0,ρ和m是0,r是9,并且Y中的核苷酸數(shù)目是 0 ;(22)雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(IV)和(V)表示的多核苷酸組成,并且具有以 下特征(a)至(d)5' -(a-3)9-ap-Xm-3' (IV)和5' -δ5-(α-β)9-υη-3' (V),(a) α和β不同地表示DNA或2' -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2 ‘ -OMeRNA,并且υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸;(b) ρ表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù),s表示0或1的整數(shù),并且η表示0至5的任意整數(shù);(c)式(IV)表示的多核苷酸中,(α-β )9_ α ρ具有與靶基因相同的核苷酸序列;和(d)式(IV)中的(α-β )9和式(V)中的(α-β )9具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列;(23)雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(VI)和(VII)表示的多核苷酸組成,并且具有 以下特征(a)至(d)5' -3-(a-3)8-ap-Xm-3' (VI)和5' -δ5-(α-β)8-(α-β)-υη-3' (VII),(a) α和β不同地表示DNA或2' -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2 ‘ -OMeRNA,并且υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸;(b) ρ表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù), s表示0或1的整數(shù),并且η表示0至5的任意整數(shù);(c)式(VI)表示的多核苷酸中,3_(^!-舊8-%具有與靶基因相同的核苷酸序 列;和(d)式(VI)中的(α-β )8和式(VII)中的(α _ β ) 8具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列;(24)根據(jù)⑴至03)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中α是DNA,并且β是 2 ‘ -OMeRNA ;(25)根據(jù)(1)至04)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中\(zhòng)相同或不 同,它們是以下任意具有胸腺嘧啶堿基、腺嘌呤堿基或鳥嘌呤堿基的DNA ;或具有尿嘧啶 堿基、腺嘌呤堿基或鳥嘌呤堿基的2 ‘ -OMeRNA ;(26)根據(jù)⑴至05)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中m是0并且η是2;(27)根據(jù)⑴至06)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中ρ和m是0,s是1,并 且η是2 ;(28)根據(jù)(1)至07)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中任意或全部1至4個(gè) 2‘ -OMeRNA 殘基被 ENA 或 2‘ ,4' -BNA/LNA 替換;(29)根據(jù)(1)至08)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中任意或全部1至4個(gè) DNA 殘基被 RNA、ENA 或 2‘ ,4' -BNA/LNA 替換;(30)根據(jù)(1)至09)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵 或硫代磷酸酯鍵彼此結(jié)合;(31)根據(jù)(1)至(30)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中至少一個(gè)多核苷酸具有 磷酸化的5'-末端;(32)根據(jù)(1)至(31)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中反義鏈具有磷酸化的 5 ‘-末端;(33)包含(1)至(32)任一項(xiàng)的雙鏈多核苷酸或其鹽作為活性成分的藥物組合物; 和(34)抑制靶基因表達(dá)的方法,包括向哺乳動(dòng)物給予選自(1)至(3 的雙鏈多核苷 酸或其鹽。發(fā)明效果本發(fā)明提供了對(duì)RNA酶具有抗性并且具有RNA干擾效應(yīng)的新型雙鏈多核苷酸。本 發(fā)明允許使用該多核苷酸對(duì)各種基因進(jìn)行功能分析,并且提供了包含所述雙鏈多核苷酸的藥物組合物。


圖1顯示了針對(duì)人β-連環(huán)蛋白基因(β-catenin gene)的雙鏈多核苷酸(以 下,各圖中顯示作為有義鏈和反義鏈的多核苷酸的組合的實(shí)例;符號(hào)說(shuō)明空心方框(口) 表示RNA,實(shí)心圓圈(·)表示DNA,空心圓圈(〇)表示2' -0-甲基RNA,空心菱形( ) 表示ENA,實(shí)心菱形( )表示2' ,4' -BNA/LNA。在附圖中,s表示硫代磷酸酯鍵,ρ表示 磷酸基團(tuán),箭頭表示預(yù)測(cè)的被Arg0naUte2切割的位點(diǎn)。上述表示法適用于以下附圖)。圖2顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖3顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β-連環(huán)蛋白(β-catenin Protein)的表 達(dá),肌動(dòng)蛋白(Actin)表示用作對(duì)照的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核 苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。在附圖 中,注釋〃 CT001/CT005"表示〃 CT-OO1/CT-005";因此,雙鏈多核苷酸的注釋中的連字 符"可以省略。上述表示法適用于以下附圖。圖4顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖5顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖6顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖7顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖8顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖9顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖10顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖11顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖12顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖13顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖14顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖15顯示了雙鏈多核苷酸對(duì)于人β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β-連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照的β-肌動(dòng) 蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人連環(huán)蛋 白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖16顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖17顯示了雙鏈多核苷酸對(duì)于人β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的Western 印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β-連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照的β-肌動(dòng) 蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人連環(huán)蛋 白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖18顯示了用于RNA酶降解反應(yīng)的針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖19顯示了雙鏈多核苷酸的RNA酶降解反應(yīng)的聚丙烯酰胺電泳分析的結(jié)果。箭 頭表示雙鏈多核苷酸的帶的位置。圖20顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖21顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖22顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖23顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖M顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖25顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖沈顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖27顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖28顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖四顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖30顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖31顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖32顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖33顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖34顯示了針對(duì)人β-連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖35顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖36顯示了針對(duì)人β-連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖37顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖38顯示了針對(duì)人β-連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖39顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖40顯示了針對(duì)人β-連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖41顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖42顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖43顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人β -連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖44顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖45顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人β -連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖46顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖47顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人β -連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖48顯示了在未使用轉(zhuǎn)染試劑的情況下、由于給予雙鏈多核苷酸而引起的 IFN-α產(chǎn)生量的變化??v軸顯示了給予已知作用于Toll樣受體(TLR)的試劑或雙鏈多核 苷酸時(shí)IFN-α的產(chǎn)生量?!皩?duì)照”顯示了不給予已知作用于Toll樣受體(TLR)的試劑或雙 鏈多核苷酸時(shí)IFN-α的產(chǎn)生量。在該圖中,“TLR3”表示Toll樣受體3,“TLR7”表示Toll 樣受體7,“TLR8”表示Toll樣受體8,“TLR9”表示Toll樣受體9。同樣的表示法適用于圖 49。圖49顯示了在使用轉(zhuǎn)染試劑的情況下、由于給予雙鏈多核苷酸而引起的IFN-a 產(chǎn)生量的變化。縱軸顯示了給予已知作用于Toll樣受體(TLR)的試劑或雙鏈多核苷酸時(shí) IFN-α的產(chǎn)生量?!芭囵B(yǎng)基對(duì)照(Medium control) ”顯示了不給予已知作用于Toll樣受體 (TLR)的試劑或雙鏈多核苷酸時(shí)IFN-α的產(chǎn)生量?!稗D(zhuǎn)染對(duì)照’顯示了僅加入轉(zhuǎn)染試劑時(shí) IFN-α的產(chǎn)生量。圖50顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖51顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖52顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖53顯示了各種雙鏈多核苷酸對(duì)于人連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度 的Western印跡分析的結(jié)果。CTNNBl表示人β -連環(huán)蛋白的表達(dá),肌動(dòng)蛋白表示用作對(duì)照 的肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。數(shù)字表示添加的雙鏈多核苷酸的濃度。帶的顏色越淺表示對(duì)于人 β-連環(huán)蛋白基因表達(dá)的抑制活性越強(qiáng)。圖M顯示了針對(duì)DDX3 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽3,X-連接的)基因的雙 鏈多核苷酸。圖55顯示了針對(duì)人β -連環(huán)蛋白基因的雙鏈多核苷酸。圖56顯示了 DD-016/DD_017(在圖中表示為016/01 ;相同的表示法適用于以下描 述)、DD-022/DD-017 (022/017)、DD-022/DD_023(022/023)和 DD-022/DD-024(022/024),以 及天然雙鏈多核苷酸DDX3siRNA#5(恥)對(duì)于DDX3基因表達(dá)的抑制活性的強(qiáng)度。僅使用脂 轉(zhuǎn)染試劑處理的細(xì)胞衍生的那些用作對(duì)照,在圖中表示為"non"。
具體實(shí)施例方式1.術(shù)語(yǔ)的描述在本說(shuō)明書中,“靶基因”無(wú)特別限制,只要其可以在該基因所導(dǎo)入的細(xì)胞、組織或 個(gè)體(在下文中,它們可被稱作“被導(dǎo)入體”)中翻譯以產(chǎn)生mRNA和/或蛋白。特別地,靶 基因可以對(duì)于所導(dǎo)入的被導(dǎo)入體是內(nèi)源性的,或者可以是外源性的并且通過(guò)諸如基因轉(zhuǎn)移 的方式導(dǎo)入其中。其也可以是存在于染色體上的基因或染色體外的基因。外源性基因的實(shí) 例包括但不限于,可以感染被導(dǎo)入體的病毒、細(xì)菌、真菌和那些衍生自原生動(dòng)物的基因?;虻墓δ芸梢允且阎幕蛭粗?。這樣的靶基因的實(shí)例可以包括但不限于,人β -連環(huán)蛋白基因和 DDX3 (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)盒多肽 3,X-連接的)基因。在本說(shuō)明書中,“天然核苷”是指2’ -脫氧核苷,例如2’ -脫氧腺苷、2’ -脫氧鳥 苷、2’ -脫氧胞苷、2’ -脫氧-5-甲基胞苷和胸苷;或核糖核苷,例如腺苷、鳥苷、胞苷、5-甲 基胞苷和尿苷。此外,“寡核苷酸”是指由化合物組成的寡核苷酸,所述化合物中核苷的糖部 分與磷酸形成酯。在本說(shuō)明書中,2’ -脫氧腺苷可以稱作At ;2’ -脫氧鳥苷可以稱作Gt ;2’ -脫氧 胞苷可以稱作Ct ;2’ -脫氧-5-甲基胞苷可以稱作SmeCt ;胸苷可以稱作Tt ;2’ -脫氧尿苷 可以稱作Ut ;腺苷可以稱作Art ;鳥苷可以稱作Art ;胞苷可以稱作Crt ;5-甲基胞苷可以稱作 5meCrt;尿苷可以稱作Urt。此外,在本說(shuō)明書中,2’ -脫氧腺苷核苷酸O’-deoxyadenosine nucleotide)可以稱作Ap ;2’ -脫氧鳥苷核苷酸可以稱作Gp ;2’ -脫氧胞苷核苷酸可以稱作 Cp ;2’-脫氧-5-甲基胞苷核苷酸可以稱作5meCp ;胸苷核苷酸可以稱作Tp ;2’-脫氧尿苷核 苷酸可以稱作Up ;腺苷核苷酸可以稱作Ait ;鳥苷核苷酸可以稱作Git ;胞苷核苷酸可以稱作 Crp ;5-甲基胞苷核苷酸可以稱作5πιΘσρ ;尿苷核苷酸可以稱作Urp。在本說(shuō)明書中,當(dāng)存在硫代磷酸酯形式而非磷酸酯形式的核苷酸時(shí),Ap的對(duì)應(yīng)物 可以稱作As ;GP的對(duì)應(yīng)物可以稱作Gs ;CP的對(duì)應(yīng)物可以稱作Cs ;5meCp的對(duì)應(yīng)物可以稱作 5meCs ;Tp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Ts ;UP的對(duì)應(yīng)物可以稱作Us ;Arp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Ars ;Grp的對(duì) 應(yīng)物可以稱作Glrs ;Crp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Clrs ;5meCrp的對(duì)應(yīng)物可以稱作SmeClrs ;Urp的對(duì)應(yīng)物 可以稱作『。在本說(shuō)明書中,術(shù)語(yǔ)“具有修飾的糖的核苷”是指其糖部分經(jīng)過(guò)修飾的核苷。特別地,作為2 ‘ -0-甲基修飾的實(shí)例,Art的對(duì)應(yīng)物可以稱作Amlt ;Grt的對(duì)應(yīng)物可 以稱作Gmlt ;Crt的對(duì)應(yīng)物可以稱作Cmlt ;5meCrt的對(duì)應(yīng)物可以稱作5meCmlt ;Urt的對(duì)應(yīng)物可以 稱作Umlt ;Arp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Arip ;Grp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Gndp ;Crp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Crip ; 5meCrp的對(duì)應(yīng)物可以稱作5meCmlp ;Urp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Undp ;Ars的對(duì)應(yīng)物可以稱作Amld ;Grs 的對(duì)應(yīng)物可以稱作Gmls ;Crs的對(duì)應(yīng)物可以稱作Cmls ;5meCs的對(duì)應(yīng)物可以稱作SmeCmls ;Urs的 對(duì)應(yīng)物可以稱作Umls。在本說(shuō)明書中,2' -0,4' -C-亞乙基核苷酸單元和“ΕΝΑ單元”是指那些具有ENA 的核苷和核苷酸,還指具有ENA單元的核苷和核苷酸=At的對(duì)應(yīng)物可以稱作A2t ;ΑΡ的對(duì)應(yīng) 物可以稱作Ae2p ;As的對(duì)應(yīng)物可以稱作Ae2s #的對(duì)應(yīng)物可以稱作G2t ;GP的對(duì)應(yīng)物可以稱作 Ge2p ;Gs的對(duì)應(yīng)物可以稱作Ge2s ;SmeCt的對(duì)應(yīng)物可以稱作C2t ;5meCp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Ce2p ; 5meCs的對(duì)應(yīng)物可以稱作Jt的對(duì)應(yīng)物可以稱作T2t ;Tp的對(duì)應(yīng)物可以稱作Τ ρ ;Ts的對(duì)應(yīng) 物可以稱作r2s。在本說(shuō)明書中,2' -0,4' -C-亞甲基核苷酸單元和“2' ,4' -BNA/LNA單元”是 指那些具有2' ,4' -BNA/LNA的核苷和核苷酸,還指具有2' ,4' -BNA/LNA單元的核苷和 核苷酸=At的對(duì)應(yīng)物可以稱作Alt ;AP的對(duì)應(yīng)物可以稱作A- ;As的對(duì)應(yīng)物可以稱作Aels #的 對(duì)應(yīng)物可以稱作Glt ;GP的對(duì)應(yīng)物可以稱作G- ;Gs的對(duì)應(yīng)物可以稱作Gels ;SmeCt的對(duì)應(yīng)物可 以稱作Clt ;5meCp的對(duì)應(yīng)物可以稱作C^p ;5meCs的對(duì)應(yīng)物可以稱作Cels Jt的對(duì)應(yīng)物可以稱 作Tlt ;Tp的對(duì)應(yīng)物可以稱作T- ;Ts的對(duì)應(yīng)物可以稱作rls。
在下文中將顯示各核苷酸的結(jié)構(gòu)式。
[化學(xué)式1]
權(quán)利要求
1.雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(I)表示的多核苷酸和式(II)表示的多核苷酸組成, 并且具有以下特征(a)至(d)5' -X-(Ci-^)trCip-Xm-S' (I)和5' -δ5-(α-β)Γ-Υ-υη-3' (II),(a)α和β不同地表示DNA或2 ‘ -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2 ‘ -OMeRNA, υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸,并且X 和Y表示由相同或不同種類的選自DNA、RNA和修飾的核酸中的核苷酸組成的寡核苷酸;(b)ρ表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù),q表 示3至9的任意整數(shù),(α - β ) ^和X中的核苷酸總數(shù)是17或18,s表示0或1的整數(shù),η表 示0至5的任意整數(shù),r表示3至9的任意整數(shù),并且(α - β ^和Y中的核苷酸總數(shù)是17 或18 ;(c)式(I)表示的多核苷酸中,X-(Ci-^)trCip具有與靶基因相同的核苷酸序列;和(d)式⑴中的X-(Ci^)ti和式(II)中的(α-β),-Y具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核 苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(γ-β)6、(α-β)_(γ-β)5、 (α -β )2-( γ -β )4> ( α -β )3-( Y -β )3> ( α -β )4-( γ -β )2> (α-β)5-(γ-β)、 (α-β)6、β12、(α-β)-β10、(α-β)2-β8、(α-β)3-β6、(α-β)4-β4、(α-β)5-β2、 β-(Υ"β)5> β-(α-β)-(γ-β)4> β-(α-β)2-(γ-β)3、β-(α-β)3-(γ-β)2、 β-(α-β)4"(Υ-β)> β ιι> β -( α -β )-β 8> β-(α-β)2-β6、β-(α-β)3-β4、 β-(α-β)4-β2、禾口 β-(α-β)5,其中 γ 表示 RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(II)表示的多核苷酸 中,r 是 3,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)6、(γ-β)5-(α-β), (γ-β)4-(α-β)2> (γ-β)3-(α-β)3, (γ-β)2-(α-β)4> (γ-β)-(α-β)5> (α-β)6、α6-(α-β)3、 α4-(α-β)4、α 2-( α -β )5> ( γ - β ) 5- α , (γ-β)4_(α-β)-α、(γ-β)3_(α-β)2-α、 (γ-β)2-(α-β)3"α > (γ-β)-(α-β)4"α > α6-(α-β)2-α、α4-(α-β)3-α、 β2-(α-β)4_α、和(α-β)5_α,其中 Y 表示 RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的 多核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)6、(α-β)-(γ_β)5、 (α -β )2-( γ -β )4> ( α -β )3-( Y -β )3> ( α -β )4-( γ -β )2> (α-β)5-(γ-β)、 (α-β)6、β12、(α-β)-β10、(α-β)2-β8、(α-β)3-β6、(α-β)4-β4、(α-β)5-β2、 β-(Υ"β)5> β-(α-β)-(γ-β)4> β-(α-β)2-(γ-β)3、β-(α-β)3-(γ-β)2、 β-(α-β)4"(Υ-β)> β ιι> β -( α -β )-β 8> β-(α-β)2-β6、β-(α-β)3-β4、 β-(α-β)4-β2、禾口 β-(α-β)5;并且在式(II)表示的多核苷酸中,r是3,并 且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(Υ_β)6、(Υ-β)5-(α_β)、(Υ"β)4-(α-β)2> (γ-β)3-(α-β)3, (γ-β)2-(α-β)4> (γ-β)-(α-β)5> (α-β)6、α6-(α-β)3、 α4-(α-β)4、α 2-( α -β )5> ( γ - β ) 5- α , (γ-β)4_(α-β)-α、(γ-β)3_(α-β)2-α、 (γ-β)2-(α-β)3"α > (γ-β)-(α-β)4"α > α6-(α-β)2-α、α4-(α-β)3-α、 α2-(α-β)4_α、禾口( α - β ) 5-α,其中 γ 表示 RNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中,q是4,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Y_β)5、(α-β)-(γ-β)4、(α_β)2-(γ_β)3、(α -β )3-( Y-β )2> (α-β)4-(γ-β)、(α -β )5、β 10、(α -”(α _-β)2_ 3 6、(α-β)3-β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4.β-(α-β)-(γ-β)3、β""(α"(γ_β)2、β-(α-β)3-(γ-β), β 9、β-(α-β)-β6、β "(α - β )2-β4、β -ι -β)和β-(α_β)4,其中 Y 表示 RNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(II)表示的多核苷酸 中,r 是 4,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)5、(γ-β)4_(α-β)、(γ-β)3_(α-β)2、(γ-β)2-(α-β)3> (γ-β)-(α-β)4> (α-β)5、β6-(α-β)2、β4-(α-β)3、 β2-(α-β)4、( γ - β ) 4- α , (α-β)4-α、(γ-β)3-(α-β)-α、(γ-β)2_(α-β)2-α、 (γ-β)-(α-β)3"α > α6-(α-β)-α、α4-(α-β)2_α、α2-(α-β)3_α 禾口 (α-β)4-α,其中 γ 表示 RNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中,q是4,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Y_β)5、(α-β)-(γ-β)4、(α_β)2-(γ_β)3、(α -β )3-( Y-β )2> (α-β)4-(γ-β)、(α -β )5、β 10、(α -”(α _-β)2_ 3 6、(α-β)3-β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4.β-(α-β)-(γ-β)3、β""(α"(γ_β)2、β-(α-β)3-(γ-β), β 9、β-(α-β)-β6、β "(α - β )2-β4、β -ι -β)和旦-(0-舊4;并且在式(II)表示的多核苷酸中,r是4,并且Y是選自下列的任一項(xiàng)(Y、(Y「(α-β)、(γ-β)3-(α-β).” (γ-β)2--(α-β)3、(γ-β)-(α-β)4>(α5、06"( α:-β ) 2、α 4- ( α - β ) 3、α 2-(α -β )4、(Y - β ) 4" α > (α-β)4-α、(Y「(α-β)·-α、(γ-β)2-(α-β)2-α、(γ-β)-(α-β)3-α、α6-(α-β)-α、α4_-(α -.α、(ι2-(α-β)3-α、禾口(α-β)4-α,其中γ表示RNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中, q 是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(Υ-β)3、(α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)、(α-β)4、β8、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3、 β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、禾口 β-(α-β)3,其中 γ 表示 RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(II)表示的多核苷酸 中,r 是 5,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)4、(Y-β )3-( α-β)、(γ-β)2-(α-β)2> (γ-β)-(α-β)3> (α-β)4、β6-(α-β)、β4-(α-β)2、β2-(α-β)3、(γ-β)3_α、 (Υ-β)2-(α-β)_α、(γ-β)"(α-β)2-α > α 7> α4-(α-β)-α、α2-(α-β)2_α、禾口 (α - β ) 3- α,其中 γ 表示 RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中, q 是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(Υ-β)3、(α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)> (α-β)4、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3> β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、和3-(0-舊3;并且在式(II)表示的多核苷酸中,r是5,并且Y是選自下列的任一 項(xiàng)(Υ-β)4、(γ-β)3"(α-β)> (γ-β)2-(α-β)2> ( y-β )-(α -β (α-β)4、 α6-(α-β)、α4-(α-β)2、α 2- ( α - β ) 3> ( Y - β ) 3" α > (γ-β)2"(α-β)-α > (γ-β)-(α-β)2-α> α 7、α4-(α-β)-α、α2-(α-β)2-α』Ρ(α-β)3_α,其中 γ 表示 RNA。
11.雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(I)和(III)表示的多核苷酸組成,并且具有以下特 征(a)至(d)5' -X-(Ci-^)trCip-Xm-S' (I)和5' -δ5-(β-α)Γ-Υ-υη-3' (III),(a)α和β不同地表示DNA或2 ‘ -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2 ‘ -OMeRNA, υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸,并且X 和Y表示由相同或不同種類的選自DNA、RNA和修飾的核酸中的核苷酸組成的寡核苷酸;(b)ρ表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù),q表 示3至9的任意整數(shù),(α - β ) ^和X中的核苷酸總數(shù)是17或18,s表示0或1的整數(shù),η表 示0至5的任意整數(shù),r表示3至9的任意整數(shù),并且(α - β ^和Y中的核苷酸總數(shù)是17 或18 ;(c)式(I)表示的多核苷酸中,X-(Ci-^)trCip具有與靶基因相同的核苷酸序列;和(d)式⑴中的ΧΗα-β)^和式(III)中的(β-a具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多 核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(γ-β)6、(α-β)_(γ-β)5、 (α -β )2-( γ -β )4> ( α -β )3-( Y -β )3> ( α -β )4-( γ -β )2> (α-β)5-(γ-β)、 (α-β)6、β12、(α-β)-β10、(α-β)2-β8、(α-β)3-β6、(α-β)4-β4、(α-β)5-β2、 β-(Υ"β)5> β-(α-β)-(γ-β)4> β-(α-β)2-(γ-β)3、β-(α-β)3-(γ-β)2、 β-(α-β)4"(Υ-β)> β ιι> β -( α -β )-β 8> β-(α-β)2-β6、β-(α-β)3-β4、 β-(α-β)4-β2、禾口 β-(α-β)5,其中 γ 表示 RNA。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(III)表示的多核苷酸中,r是3,并且Y是選自下列的任一項(xiàng)(β"Y )6> ( β - Y ) 5_(β-α)、(β-Y )4"-(β-α )2、(β-Y )3"(β "α )3> (β "Y )2"(β -α )4>(β-Υ)"(β-α)5、(β -α )6、α )3、β4-_(β_α)4、β2-(β_α)5、( β - γ ) 5- β、)-β、(β-γ)Γ β、(β-Y )2-(β - α )3-β > (β - Y )-(β -α)4_ β、β 6_ ( β-α ) 2- β、β 4--(β --α )3-β、β2-(β-α)4_β、和(β-α)5_β,其中 Y 表示 RNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多 核苷酸中,q是3,并且X是選自下列的任一項(xiàng)(γ_β)6、(α-β)-(γ_β)5、 (α -β )2-( γ -β )4> ( α -β )3-( Y -β )3> ( α -β )4-( γ -β )2> (α-β)5-(γ-β)、 (α-β)6、β12、(α-β)-β10、(α-β)2-β8、(α-β)3-β6、(α-β)4-β4、(α-β)5-β2、 β-(Υ"β)5> β-(α-β)-(γ-β)4> β-(α-β)2-(γ-β)3、β-(α-β)3-(γ-β)2、 β-(α-β)4"(Υ-β)> β ιι> β -( α -β )-β 8> β-(α-β)2-β6、β-(α-β)3-β4、 β-(α-β)4-β2、禾口 β-(α-β)5;并且在式(III)表示的多核苷酸中,r是3,并-且Y是選自下列的任一項(xiàng)(β-γ)6、(β-γ)5-_(β-α)、(β-Y )4"-(β-α )2、(β-Y )3"(β "α )3> (β-Y )2-(β -α )4> (β - γ)-(β -α)5、(β -α )6、α )3、_(β_α)4、β2-(β-α)5、( β - Y ) 5- β、(β-γ)4"(β-α)-β、(β-γ)Γ β、(β-Y )2-(β - α )3-β >(β-γ)-(β-α)4-β> β 6-(β-α ) 2- β、β 4--(β --α )3-β、β 2"-(β-α)4-β、禾口(β-α)5-β,其中γ表示RNA。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中,q是4,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Y_β)5、(α-β)-(γ-β)4、(α_β)2-(γ_β)3、(α -β )3-( Y-β )2> (α-β)4-(γ-β)、(α -β )5、β 10、(α -”(α _-β)2_ 3 6、(α-β)3-β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4.β-(α-β)-(γ-β)3、β""(α"(γ_β)2、β-(α-β)3-(γ-β), β 9、β-(α-β)-β6、β "(α - β )2-β4、β -ι -β)和β-(α_β)4,其中 Y 表示 RNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(III)表示的多核苷酸 中,r 是 4,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(β-γ )5、(β-γ)4-(β-α)> (β-γ)3-(β-α)2, (β - Y )2-(β -α )3> (β - Y )-(β -α )4> (β-α)5、β6_(β_α)2、β4_(β_α)3、 β2-(β-α )4, (β-γ)4-β , (β-α)4-β、(γ-β)3-(β-α)-β、( γ - β ) 2_ ( β - α ) 2-β、 (β-γ)-(β-α)3-β> β6-(β_α)-β、β4-(β-α)2-β、β 2-( β - α ) 3-β 禾口 (β-α)4-β,其中 γ 表示 RNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中,q是4,并且X是選自下列的任意一項(xiàng)(Y_β)5、(α-β)-(γ-β)4、(α_β)2-(γ(α -β )3-( Y-β )2> (α-β)4-(γ-β)、(α -β )5、β 10、(α -”(α _-β)2" β(α-β)3-β4、(α-β)4-β2、β-(γ-β)4.β-(α-β)-(γ-β)3、β""(α"(γβ-(α-β)3-(γ-β), β 9、β-(α-β)-β6、β "(α - β )2-β4、β -ι -β))、 ■3-(0-舊4;并且在式(III)表示的多核苷酸中,r是4,并且Y是選自下列的任一項(xiàng)(β )5、(β )4-(β-α)、(β )3-(β-α)2、(β-γ)2-(β-α)3、(βι)-(β-α)4、 (β_α)5、β6-(β_α)2、β4-(β-α)3、β2_(β_α)4、( β - γ ) 4_ β、( β _ α ) 4-β、 (γ-β)3"(β-α)-β> (Υ-β)2-(β_α)2-β、(β )-(β-α)3-β、β6-(β-α)-β、 β4-(β-α)2_β、β2-(β-α)3_β 禾口(β-α)4_β,其中 Y 表示 RNA。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中, q 是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(Υ-β)3、(α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)、(α-β)4、β8、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3、 β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、禾口 β-(α-β)3,其中 γ 表示 RNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(III)表示的多核苷酸 中,r 是 5,并且 Y 是選自下列的任一項(xiàng)(β 1)4、(β-γ)3"(β-α), (β-γ)2-(β-α)2> (β-γ)-(β-α)3> (β_α)4、β6-(β-α)、β4-(β-α)2、β2-(β-α)3、( γ - β ) 3" β > (β-γ)2-(β_α)-β、(β-γ)-(β_α)2-β、β7、β4-(β-α)-β、β2_(β-α)2_β、禾口 (β-α)3-β,其中 γ 表示 RNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)表示的多核苷酸中, q 是 5,并且 X 是選自下列的任意一項(xiàng)(Υ_β)4、(α-β)-(Υ-β)3、(α-β)2-(γ-β)2> (α-β)3-(γ-β)> (α-β)4、(α-β)-β6、(α-β)2-β4、(α-β)3-β2、β-(γ-β)3> β-(α-β)-(γ-β)2> β-(α-β)2-(γ-β)、β7、β-(α-β)-β4、β-(α-β)2-β2、 和3-(0-舊3;并且在式(III)表示的多核苷酸中,r是5,并且Y是選自下列的任一 項(xiàng)(β )4、(β-γ)3"(β-α)> (β - Y )2-(β -α )2> (β-γ)-(β-α)3, (β_α)4、 β6-(β_α)、β4-(β-α)2、β2-(β-α)3、( γ - β ) 3" β > (β-γ)2"(β-α)-β>(β-γ)-(β_α)2-β、β7、β4-(β_α)-β、β2-(β-α)2-β、禾口(β-α)3_β,其中 γ 表 示 RNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或11所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中在式(I)、(II)和(III)表 示的多核苷酸中,q是9,X中的核苷酸數(shù)目是0,p和m是0,r是9,并且Y中的核苷酸數(shù)目是0。
22.雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(IV)和(V)表示的多核苷酸組成,并且具有以下特征 (a)至⑷5' -(a-^)9-ap-Am-3' (IV)和 5' -δ5-(α-β)9-υη-3' (V),(a)α和β不同地表示DNA或2 ‘ -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2,-OMeRNA,并且υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸;(b)p表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù),s表 示0或1的整數(shù),并且η表示0至5的任意整數(shù);(c)式(IV)表示的多核苷酸中,(α-β)9-αρ具有與靶基因相同的核苷酸序列;和(d)式(IV)中的(α-β)9和式(V)中的(α-β )9具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列。
23.雙鏈多核苷酸或其鹽,其由式(VI)和(VII)表示的多核苷酸組成,并且具有以下特 征(a)至(d)5' -i3-(a-i3)8-ap-Xm-3' (VI)和 5' -δ5-(α-β)8-(α-β)-υη-3' (VII),(a)α和β不同地表示DNA或2 ‘ -OMeRNA, δ和λ相同或不同地表示DNA或 2,-OMeRNA,并且υ相同或不同地表示選自DNA、RNA和2 ‘ -OMeRNA中的任意核苷酸;(b)p表示0或1的整數(shù),當(dāng)ρ是0時(shí)m是0,當(dāng)ρ是1時(shí)m表示0至5的任意整數(shù),s表 示0或1的整數(shù),并且η表示0至5的任意整數(shù);(c)式(VI)表示的多核苷酸中,β-(α-β)8-αρ具有與靶基因相同的核苷酸序列;和(d)式(VI)中的(α)8和式(VII)中的(α-β )8具有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中α是DNA,并且 β 是 2' OMeRNA。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至對(duì)中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中Un相同 或不同,它們是以下任意具有胸腺嘧啶堿基、腺嘌呤堿基或鳥嘌呤堿基的DNA ;或具有尿 嘧啶堿基、腺嘌呤堿基或鳥嘌呤堿基的2 ‘ -OMeRNA。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中m是0,并且η是2。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至沈中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中ρ和m是0,s是 1,并且η是2。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中任意或全部1至 4 個(gè) 2' -OMeRNA 殘基被 ENA 或 2‘,4' -BNA/LNA 替換。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中任意或全部1至 4 個(gè) DNA 殘基被 RNA、ENA 或 2' ,4' -BNA/LNA 替換。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至四中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵彼此結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中至少一個(gè)多核苷 酸具有磷酸化的5'-末端。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽,其中反義鏈具有磷酸 化的5'-末端。
33.包含權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的雙鏈多核苷酸或其鹽作為活性成分的藥物組 合物。
34.抑制靶基因表達(dá)的方法,包括向哺乳動(dòng)物給予選自權(quán)利要求1至33中的雙鏈多核 苷酸或其鹽。
全文摘要
旨在提供對(duì)RNA酶具有抗性并且具有RNA干擾效應(yīng)的雙鏈多核苷酸等。本發(fā)明提供了由有義鏈和反義鏈組成的雙鏈多核苷酸,所述有義鏈和反義鏈由包含交替組合的DNA和2′-O-甲基RNA的核苷酸單元的多核苷酸組成。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102137930SQ20098013463
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者小泉誠(chéng), 廣田泰秀 申請(qǐng)人:第一三共株式會(huì)社
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