專利名稱：內(nèi)過氧化物在治療由黃病毒科病毒(包括丙型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒 ...的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明大體上涉及倍半萜內(nèi)酯類(sesquiterpene lactones)在治療由黃病毒科(Flaviviridae)引起的感染中的應(yīng)用，特別是倍半萜內(nèi)酯內(nèi)過氧化物在治療丙型肝炎感染、黃熱病、登革熱、牛病毒性腹瀉和豬瘟(classical swine fever)中的應(yīng)用。
慢性丙型肝炎病毒感染是一個影響全世界1.8億人(總?cè)丝诘?％)的一個重要的公共健康問題，這里面包括美國的4百萬人，而且是導(dǎo)致肝慢性病的一個主要原因。有人預(yù)期美國的HCV感染將繼續(xù)增加，到2010年感染者將達到現(xiàn)在的3倍。丙型肝炎病毒的感染可能引起嚴重的，在一些病例中可能是威脅生命的慢性肝病，包括肝衰竭和肝癌。
在美國，慢性肝病是導(dǎo)致成人死亡的第十位原因，并且導(dǎo)致8每年接近25000例或接近1％的死亡人數(shù)。人口基礎(chǔ)上的研究表明40％的慢性肝病是HCV相關(guān)的，導(dǎo)致每年大約8000-10000的死亡。HCV相關(guān)的急性和慢性肝病的醫(yī)療和工作損失估計每年要超過6億美元。并且HCV相關(guān)的晚期肝病是成人肝移植最常見的原因。因為大多數(shù)的HCV感染者的年齡在30-49歲之間，由與HCV相關(guān)的慢性肝病引起的死亡數(shù)可能在未來的10-20年間大幅增加，這時候這組感染者將達到慢性肝病的并發(fā)癥通常發(fā)生的年齡。
HCV的傳播主要是通過皮膚與血的大量或重復(fù)的直接接觸。在美國，與HCV傳播有關(guān)的兩種最常見的接觸是輸血和注射毒品。丙型肝炎的治療是臨床實踐中變化快速的一個領(lǐng)域。干擾素和利巴韋林(一種核酸類似物)的聯(lián)合治療已被批準用于慢性丙型肝炎的首次治療。對應(yīng)用利巴韋林和干擾素的聯(lián)合治療的患者的研究證實，與單獨應(yīng)用干擾素治療的反應(yīng)率15-25％相比，其持久的反應(yīng)率有顯著增加，達到40-50％。多數(shù)患者在治療早期有干擾素一過性感冒樣癥狀，但是這些癥狀在繼續(xù)治療中減輕。隨后的副作用有疲勞、骨髓抑制和中樞精神作用(例如，淡漠、認知變化、暴躁和抑郁)。由于嚴重的副作用，10-40％的患者的干擾素的劑量必須減少，5-15％的患者必須間斷使用。利巴韋林能引起溶血性貧血，并且對于患者原來存在的貧血、骨髓抑制或腎衰竭來說也是有問題的。在這些患者，應(yīng)避免聯(lián)合治療，或應(yīng)該試圖糾正貧血。利巴韋林引起的溶血性貧血對有缺血性心臟疾病或腦血管疾病的患者也可能是威脅生命的。利巴韋林是引起畸形的，女性患者在治療過程中要避免妊娠。其他治療，包括皮質(zhì)類固醇、脫氧熊膽酸(ursodiol)和胸腺素，是無效的。肝臟的高鐵水平可降低干擾素的藥效。去鐵治療(靜脈切開放血術(shù)或螯合術(shù))與干擾素的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)研究了，但是，還尚無結(jié)論(www.cdc.gov)。所以，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要發(fā)現(xiàn)和發(fā)展可以用來治療HCV感染、同時具有較少或者能夠減少副作用的、并且與現(xiàn)有的治療相比有更好療效的新的生物活性分子。

發(fā)明內(nèi)容
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有以下通式的倍半萜內(nèi)酯 具有對抗由黃病毒科，包括丙型肝炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒和豬瘟病毒引起的感染的活性。本申請描述了一些具有代表性的、目前優(yōu)選的倍半萜內(nèi)酯類，不過，本領(lǐng)域人員顯然能夠理解，公知技術(shù)中其他倍半萜內(nèi)酯化合物在由黃病毒科引起的感染的治療中也是有效的。還包括此類化合物的藥學(xué)上可接受的鹽。
優(yōu)先選用的倍半萜內(nèi)酯是倍半萜內(nèi)酯內(nèi)過氧化物青蒿素(artemisinin)、雙氫青蒿素(dihydroartemisinin)、青蒿琥酯(artensunate)和蒿甲醚(artemether)。


圖1是對青蒿素、雙氫青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖解說明。
具體實施例方式
本申請中，我們將介紹倍半萜內(nèi)酯類的抗病毒效應(yīng)，特別是倍半萜內(nèi)酯內(nèi)過氧化物，例如青蒿素、雙氫青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚對特定的黃病毒科病毒例如丙型肝炎病毒的抗病毒作用。
本發(fā)明的優(yōu)選的倍半萜化合物包含具有以下通式的化合物 其中X1和X2選自O(shè)、S、Se和NH；Y選自O(shè)、S、Se和NH；Z選自O(shè)、NH、S和Se，且Q選自CO、CHOH、CHOCH3、CHOC2H5、CHOC3H7和CHOCOCCH2CH2COOH及其藥物可接受鹽。
本發(fā)明特別優(yōu)選的倍半萜化合物包括青蒿素，其X1和X2是O、Y是O、Z是O、并且Q是C＝O；雙氫青蒿素(同青蒿素，但Q為CHOH)；蒿甲醚(同青蒿素，但Q為CHOCH3)；蒿乙醚(arteether)(同青蒿素，但Q為COC2H5)；一種丙基產(chǎn)品(同青蒿素，但Q為CHOC3H7)；及青蒿琥酯(artesunate)(同青蒿素，但Q為CHOCOCH2CH2COOH)。本發(fā)明的最優(yōu)選的倍半萜化合物是雙氫青蒿素。
內(nèi)過氧化物有一個二氧鍵(peroxo linkage)(-O-O)，這個結(jié)構(gòu)被認為對這些產(chǎn)物具有抗瘧疾活性是很重要的。用-S-S-(二硫鍵)，或-Se-Se-(二硒鍵)，或-N-O-或-NH-NH-(肼)，以及上述鍵的不同組合，會產(chǎn)生新的化合物，也可能具有活性。
黃病毒科是人類和動物一個重要的RNA病毒病原體科(Rice CM.1996.Flaviviridaethe viruses and their replication.InFields BN，Knipe DM，Howley PM，eds.Fields virology.PhiladelphiaLippincott-Raven Publishers.Pp 931-960)。目前已發(fā)現(xiàn)的黃病毒科的屬在傳播途徑、宿主范圍和發(fā)病機理方面表現(xiàn)不同。典型的黃病毒成員是黃熱病毒、登革病毒和瘟病毒(pestiviruses)，例如牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和豬瘟病毒(CSFV)。該家族最新的最具特征的成員是人的常見的且專有的病原體，即丙型肝炎病毒(HCV)。黃病毒是具有(+)有義RNA基因組極性的單鏈RNA病毒。其他具有(+)有義RNA的病毒科包括小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、杯狀病毒科(Caliciviridae)和冠狀病毒科(Coronaviridae)。
本發(fā)明化合物可以應(yīng)用它們的原形或它們的鹽。在一些情況，這些化合物由足夠的堿性或酸性能夠形成穩(wěn)定的無毒的酸或堿的鹽，這些化合物以鹽的形式施用是適合的。藥學(xué)可接受的鹽的例子是與形成的生理學(xué)可接受陰離子的有機酸形成的有機酸鹽，例如抗壞血酸醋酸鹽，安息香酸鹽，檸檬酸鹽，etoglutarate，甘油磷酸鹽，丙二酸鹽，甲磺酸鹽，琥珀酸鹽和酒石酸鹽。合適的無機酸鹽也可以被合成，包括重碳酸鹽，碳酸鹽，鹽酸鹽，硝酸鹽，和硫酸鹽。
本發(fā)明可以含有所述化合物以及合適的賦形劑的藥物組合物而常規(guī)給藥，該組合物對抗病毒感染是有用的。根據(jù)所治療的是內(nèi)或外病毒感染，本發(fā)明的化合物和組合物可以經(jīng)胃腸外，局部，陰道內(nèi)，口服或直腸給藥。
對胃腸外給藥，活性成分或它的鹽溶液可以用水制備，任選地和無毒的表面活性劑混合。也可以在甘油，液體聚乙二醇，三乙酰甘油酯和上述試劑的混合物和在油劑里制備。
化合物可使用的劑量可以通過在體外比較其活性而決定。對人的有效量的外推方法是本領(lǐng)域已知的。
本化合物可以單位劑量的形式常規(guī)給藥；例如每單位劑量形式包含活性成分0.1-2000mg，優(yōu)選為100-1000mg，最優(yōu)選為100-500mg。所需藥量可以常規(guī)地一次性給藥或以合適的間隔分次給藥，例如每天可分2，3，4或更多次給藥。每次的亞劑量還可以進一步分開，例如分成一些分散的松散分隔的施用形式；例如多次從送藥器吸入或多次點眼給藥。
對體內(nèi)感染，組合物可以按游離藥物計算的劑量水平通過口服或胃腸外給藥，大約為1-30mg/kg(哺乳動物體重)，優(yōu)選1-10mg/kg(哺乳動物體重)。
在此揭示的化合物和組合物的給藥的精確的方案將必須依賴于被治療的個體的需要，治療的類型，當然還有主治醫(yī)師的判定。本發(fā)明的化合物可用于有該治療需求的動物。大多情況下，是用于人，但是家畜和寵物也可以特別地預(yù)期屬于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
材料和方法青蒿素購于Aldrich。洋艾(Artemisia absinthum)KE-4、黃花蒿(Artemisia annua)KE-5和龍蒿(Artemisia dracunculus)KE-6的植物粗提取物從美國Des Moines，Kemin工業(yè)有限公司獲得。為了制備KE-4、-5和-6樣品，將2g干的磨碎的苦艾、甜苦艾或龍蒿在200ml己烷中室溫攪拌8小時，然后，懸浮液經(jīng)過G3玻璃濾器過濾和低壓下蒸發(fā)。殘留的黑的濾渣用于生物篩選。蒿甲醚、雙氫青蒿素和青蒿琥酯購于Dafra Pharma。上述化合物都進行了抗不同致病病毒的篩選，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、水痘病毒(VV)、帶狀皰疹病毒(VZV)和人巨細胞病毒(CMV)。對所有的病毒，除了CMV外，檢測了EC50(對HIV在人CEM細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的致細胞病性、HSV和VV在人胚胎成纖維細胞E6SM細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的致細胞病性、和VZV在人胚胎肺(HEL)細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的噬斑形成達到50％的抑制所需的有效化合物的濃度)。為了檢測抗病毒活性，抗CMV用IC50表示，人胚胎肺成纖維(HEL)細胞用96孔板培養(yǎng)，每孔用20PFU病毒感染。
在37℃培養(yǎng)2小時后，感染的細胞中加入0.1ml含測試化合物的梯度稀釋的培養(yǎng)液。第7天經(jīng)細胞Giemsa染色后在顯微鏡下計數(shù)噬斑。最小抗病毒濃度以抑制病毒誘導(dǎo)的噬斑形成達到50％所需的劑量表示。
對這些化合物也進行了抗黃病毒的篩選。因為事實上沒有足夠的體外分析用于抗HCV篩選，所以決定篩選抗牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，因為它與丙型肝炎病毒有很多相似性(Frolovl，McBride S and Rice CM.Cis-acting RNA elements required for replication of bovine.Viral diarrheavirus-hepatitis C virus 5’non-translated region chimeras.RNA 4，1418-1435(1998))。進一步對蒿甲醚抗BVDV的不同株的作用進行了篩選。
對這些化合物也進行了抗腫瘤活性的檢測，通過對鼠白血病細胞(L1210/0)、鼠乳腺癌細胞(FM3A)和人T淋巴細胞(Molt4/C8，CEM/0)的增殖(的檢測)進行。觀察到的對CMV和VZV的最好的抗病毒活性來自KE-6。其次是青蒿素對HSV-2和VV的抗病毒活性。
結(jié)果和討論在第一批篩選中(見表1)，檢測了青蒿素和一些蒿屬粗提取物(KE-4、KE-5和KE-6)對HIV-1、HIV-2、HSV-1、HSV-2、VV、CMV和VZV的抗病毒活性。
表1抗HIV-1、HIV-2、HSV-1、HSV-2、VV、CMV和VZV的篩選結(jié)果

a50％對HIV在人淋巴細胞CEM細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的致細胞病性、HSV和VV在人胚胎成纖維細胞E6SM細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的致細胞病性、和CMV和VZV在人胚胎肺HEL細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)的噬斑形成達到50％的抑制所需的有效的化合物濃度。
另外進行了第二個篩選(表2)，以便檢測在牛腎(MDBK)細胞中抗牛病毒性腹瀉病毒的活性。
表2在MDBK細胞中抗BVDV的篩選結(jié)果

抗病毒活性用BVDV的Pe515株在MDBK細胞上來評估?？共《净钚院图毎拘缘臋z測都應(yīng)用MTS方法。
EC50是降低病毒引起的細胞毒性效果50％時所需要的濃度。MTC(最小毒性濃度)定義為引起細胞代謝降低＞＝20％的濃度。
當用蒿甲醚、青蒿素、KE4和KE5處理MDBK細胞時，在最高濃度(100μg/ml)仍沒有達到MTC。本試驗中觀察到內(nèi)過氧化物青蒿素、雙氫青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯具有很強的抗黃病毒BVDV的活性，同時具有低細胞毒性。所以，這些產(chǎn)品可以用于治療由黃病毒引起的感染。
以蒿甲醚進行了抗不同BVDV株，和抗BDV(邊界病病毒)的篩選(表3)表3蒿甲醚抗BVDV和BDV的篩選結(jié)果

+++所有細胞都是陽性的++ +/-50％細胞是陽性的+ +/-10％細胞是陽性的BVDV 牛病毒性腹瀉病毒BDV邊界病病毒cp 致細胞病變株ncp非致細胞病變株特別地抗BVDVIcp(與HCV最相似的BVDV株)，可以清楚地看到蒿甲醚的效果。該產(chǎn)品的EC90＝0.16μg/ml。這些實驗中發(fā)現(xiàn)的毒性濃度在100μg/ml附近。也可以觀察到抗BDV的效果(EC90＝0.8μg/ml)。
青蒿素和蒿屬粗提取物(KE-4、KE-5和KE-6)都進行了抗腫瘤細胞株L12 10/0、FM3A/0、Molt4/C8和CEM/0的篩選，但沒有發(fā)現(xiàn)有益結(jié)果。
結(jié)論在最初的抗DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的篩選中我們沒有發(fā)現(xiàn)任何明顯的抗病毒活性。在第二次抗BVDV(RNA病毒)的篩選中我們清楚地顯示青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和雙氫青蒿素的強抗病毒活性。這些產(chǎn)品都是內(nèi)過氧化物，與檢測過的蒿屬粗提取物相比較，顯示明顯更好的抗BVDV活性。因為BVDV與HCV有許多相似性，青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素及其他可能的過氧化物可能具有強的和選擇性的抗HCV的抗病毒性質(zhì)。
盡管本發(fā)明按期望已經(jīng)描述了優(yōu)選的具體實施方式
，但可以理解的是，本發(fā)明并不僅僅局限于此，因為對其作出的變化和修飾也屬于所附權(quán)利要求書中所定義的本發(fā)明完整范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療由黃病毒科病毒(Flaviviridea sp.)引起的感染的方法，包括施用有效量的一種倍半萜或其藥學(xué)可接受的鹽的步驟，所述倍半萜具有以下通式 其中X1和X2選自O(shè)、S、Se和N；Y選自O(shè)、S、Se和N；Z選自O(shè)、NH、S和Se；以及Q選自CO、CHOH、CHOCH3、CHOC2H5、CHOC3H7和CHOCOCCH2CH2COOH。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述倍半萜選自青蒿素和青蒿素的類似物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述感染是丙型肝炎。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述感染是牛病毒性腹瀉或豬瘟。
5.一種治療由黃病毒科病毒引起的感染的方法，包括施用有效量的一種內(nèi)過氧化物的步驟，且所述內(nèi)過氧化物與干擾素或聚乙二醇干擾素相組合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述內(nèi)過氧化物選自青蒿素和青蒿素的類似物。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述感染是丙型肝炎。
8.一種治療由(+)有義RNA病毒引起的感染的方法，包括施用有效量的一種內(nèi)過氧化物的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述內(nèi)過氧化物選自青蒿素和青蒿素的類似物。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述內(nèi)過氧化物的二氧鍵(-O-O-)被選自以下一組的一個基團取代，所述的組包括-S-S-、-Se-Se-、-N-O-和-N-N-鍵、以及所有上述鍵的組合。
11.一種治療由(+)有義RNA病毒引起的感染的方法，包括施用有效量的一種內(nèi)過氧化物的步驟，且所述內(nèi)過氧化物與干擾素或聚乙二醇干擾素相組合。
全文摘要
倍半萜類，特別是倍半萜內(nèi)酯內(nèi)過氧化物，例如青蒿素及其類似物，在治療丙型肝炎病毒感染中的應(yīng)用。對青蒿素、青蒿素的類似物和一些蒿的粗提取物進行了體外抗DNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和黃病毒科病毒(一種重要的人和動物RNA病原體科)的測試。篩選了這些化合物的抗腫瘤活性。觀察到青蒿素具有抗牛病毒性腹瀉病毒的強活性。由于瘟病毒(如BVDV)與丙型肝炎病毒(HCV)具有許多相似性，我們能夠得出結(jié)論，在治療丙型肝炎病毒感染方面，內(nèi)過氧化物具有一般的效果，青蒿素具有更特異的效果。
文檔編號A61K45/06GK1711091SQ200380102693
公開日2005年12月21日 申請日期2003年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月31日
發(fā)明者揚·范登凱爾克霍弗, 貝內(nèi)迪克特·薩斯, 埃里克·派斯, 約翰·范赫梅爾 申請人:凱敏食品公司