專(zhuān)利名稱(chēng)：一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
流感病毒(influenza virus)是嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的，可引起流行性感冒的病原體。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也稱(chēng)甲、乙、丙三型。這三種不同型的病毒的基因組結(jié)構(gòu)、多肽組成、感染性和致病性等方面都存在顯著差異。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負(fù)鏈RNA組成，分別以節(jié)段1至節(jié)段8命名。病毒基因組全長(zhǎng)約13. 6kb,分別編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、 PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進(jìn)一步分為16個(gè)H(H1-H16) 和9個(gè)N(m-N9)亞型。人流感病毒主要是HI、H2和H3亞型，而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感多為H5、H7、和H9亞型，其中以H5W亞型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆發(fā)，且至今未在除人以外的其它動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)其存在。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，可感染人類(lèi)和豬。流感病毒在病毒分類(lèi)學(xué)上屬正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒屬。流感病毒是分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒，所以病毒RNA不具有感染性，各個(gè)RNA節(jié)段必須與RNA聚合酶 (PB2、PB1和PA)及核蛋白(NP)結(jié)合后形成vRWs才有活性。感染的起始是病毒顆粒表面的HA刺突識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體。唾液酸與次末端半乳糖的連接鍵，決定了病毒的宿主特異性，該連接鍵在禽類(lèi)中為α 0-3)，在人類(lèi)中為α (2-6) 0流感病毒HA 蛋白分子中，個(gè)別氨基酸的替換及不同的糖基化修飾能改變其受體結(jié)合的特異性。病毒吸附細(xì)胞后，細(xì)胞通過(guò)網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用攝入病毒。在細(xì)胞內(nèi)，網(wǎng)格蛋白分子解離，病毒與內(nèi)涵體融合形成吞噬體，使得病毒粒子周?chē)腜H值下降至5. O左右。在此ρΗ條件下，病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使位于輕鏈(撤幻N端的融合肽暴露，從而引起病毒囊膜與細(xì)胞膜融合。低PH環(huán)境也致使大量H+經(jīng)由Μ2離子通道進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致Ml蛋白與VRWS的解離。兩者的共同結(jié)果致使病毒粒子的VRWS釋放到被感染細(xì)胞的胞漿。與其它RNA病毒不同，流感病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄均發(fā)生在宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。mRNA在核內(nèi)合成后轉(zhuǎn)移到胞漿，合成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。而后開(kāi)始裝配子代病毒，神經(jīng)氨酸酶可水解細(xì)胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點(diǎn)釋放出來(lái)。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解為HAl和HA2多肽，這樣的病毒粒子才具有感染性，從而開(kāi)始新一輪病毒的復(fù)制。流感病毒在人類(lèi)中已流行傳播了 300多年，數(shù)年即有一次暴發(fā)流行，全球性的流感大流行則數(shù)十年暴發(fā)一次。流感流行每年可導(dǎo)致25萬(wàn) 50萬(wàn)例死亡，300萬(wàn) 500萬(wàn)重病例，全球約共有5 15%的人被感染。對(duì)于全球性流感大流行而言，“在流行期間中疫苗和抗病毒藥物是降低發(fā)病率和死亡率最重要的應(yīng)對(duì)措施”。但是目前全球每年可生產(chǎn)3億人份三價(jià)流感疫苗-這僅夠西方國(guó)家的流感預(yù)防之用，而不能滿(mǎn)足全球性流感大流行的需求，而且由于流感病毒的抗原變異能力強(qiáng)，在新病毒株出現(xiàn)之前不可能研制疫苗。通常一個(gè)疫苗的大規(guī)模研發(fā)和制造至少需要六個(gè)月時(shí)間，即使到那時(shí)，由于全球生產(chǎn)能力有限及生產(chǎn)設(shè)施集中在發(fā)達(dá)國(guó)家，許多沒(méi)有生產(chǎn)設(shè)施的國(guó)家在第1波流行期間將使用不到疫苗。所以當(dāng)前疫苗能提供的保護(hù)率并不高。抗流感病毒藥物不僅問(wèn)世較晚，而且臨床上速效、顯效的治療藥物也較少，屬于抗感染類(lèi)藥物中的小品種。目前，經(jīng)美國(guó)食品和藥物管理局(FDA) 批準(zhǔn)正式上市的抗流感病毒藥物有兩類(lèi)(1)以金剛烷胺和金剛乙胺為代表的M2離子通道阻斷劑。此類(lèi)藥只對(duì)甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用，研究表明藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且由于廣泛使用使得耐藥株普遍存在，所以CDC建議此類(lèi)藥物不再用于預(yù)防流感病毒感染。( 神經(jīng)氨酸酶抑制劑，此類(lèi)藥的代表是奧斯他韋和扎拉米韋。此類(lèi)藥物對(duì)所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來(lái)關(guān)于奧斯他韋的耐藥株確不斷有報(bào)道。中藥的有效組分為生物堿，黃酮類(lèi)，揮發(fā)油，皂苷等，這些組分具有多種多樣的藥理活性，比如抑制病毒復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫功能、改善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎等綜合功效，且毒副作用小，所以中藥在防治流感方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景。中藥莪術(shù)為姜科姜黃屬植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)和溫郁金的根莖。莪術(shù)具有行氣，破血，消積，止痛的功效?？芍委熤伟Y瘕積聚，血瘀經(jīng)閉，跌打損傷，飲食積滯，脘腹脹痛。莪術(shù)揮發(fā)油中的主要成分有莪術(shù)醇、吉馬酮和莪術(shù)二酮等，揮發(fā)油對(duì)小鼠 80有較強(qiáng)的抑制作用。莪術(shù)醇對(duì)人的宮頸癌有較好療效。莪術(shù)揮發(fā)油還有抗炎、保肝作用，揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌有抑制作用。此外，文獻(xiàn)報(bào)道吉馬酮具有鎮(zhèn)咳平喘等功效。但是目前文獻(xiàn)報(bào)道中還沒(méi)有出現(xiàn)吉馬酮(Germacrone)在抗流感病毒方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防流感病毒(甲型或乙型)藥物中的應(yīng)用。吉馬酮又稱(chēng)大櫳牛兒酮、杜鵑酮，是吉馬烷的衍生物。植物來(lái)源有姜科植物莪術(shù)的揮發(fā)油，杜鵑花科植物興安杜鵑的葉，馬兜鈴科植物雙葉細(xì)辛揮發(fā)油等多種植物。吉馬酮在來(lái)源植物揮發(fā)油中的含量較高(20% 50%)，且具有多種活性，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道吉馬酮有抗菌抗炎、抗腫瘤、抗抑郁以及鎮(zhèn)咳平喘等作用。吉馬酮對(duì)A型流感病毒株抗病毒活性高，在50 μ M時(shí)抑制率達(dá)到88. 4% ；毒性小，在250 μ M吉馬酮處理下，4 后 MDCK(馬-達(dá)二氏犬腎細(xì)胞，流感病毒敏感細(xì)胞)存活率為100%，從而為臨床上流感病毒性疾病的治療提供一種安全有效毒副作用小的天然產(chǎn)物。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防流感病毒(甲型或乙型)藥物中的應(yīng)用，其步驟是首先，通過(guò)MTT法檢測(cè)了吉馬酮對(duì)MDCK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示在250 μ M濃度內(nèi)，藥物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。其次，通過(guò)檢測(cè)病毒感染細(xì)胞并給以藥物處理4 后，分別檢測(cè)了上清中釋放出的病毒數(shù)量(基于病毒特異抗原神經(jīng)氨酸酶和血凝素進(jìn)行檢測(cè))，結(jié)果顯示藥物在1. 56 50 μ M濃度內(nèi)，降低了釋放到上清中的病毒數(shù)量，抑制率呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。我們還檢測(cè)了藥物對(duì)病毒蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果同樣顯示吉馬酮抑制了病毒蛋白的表達(dá)，同時(shí)也檢測(cè)了藥物對(duì)病毒核酸復(fù)制的影響，結(jié)果顯示給以吉馬酮處理后，病毒核酸的合成也明顯被抑制。此外，通過(guò)病毒感染不同時(shí)間給藥，初步分析了吉馬酮抗病毒活性的機(jī)制，即檢測(cè)了吉馬酮在病毒單輪復(fù)制周期中發(fā)揮抗病毒活性的階段，結(jié)果提示吉馬酮抑制了病毒的吸附進(jìn)入以及病毒復(fù)制的早期階段，但是對(duì)病毒復(fù)制的晚期(病毒粒子的組裝和釋放) 沒(méi)有活性或較弱活性。最后，我們檢測(cè)了吉馬酮抗流感病毒活性的廣譜性，檢測(cè)了吉馬酮對(duì) A型流感病毒H3N2亞型、A型流感病毒金剛烷胺耐藥株和乙型流感病毒株的抗病毒活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示吉馬酮對(duì)檢測(cè)病毒株均有活性，且具有劑量依賴(lài)效應(yīng)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確定藥物吉馬酮可以用于預(yù)防和治療流感病毒的感染。所述的吉馬酮的給藥劑量按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用量為1. 56 50 μ Μ。所述的吉馬酮制成抗流感病毒復(fù)方藥物。所述的吉馬酮單獨(dú)制成抗流感病毒藥物。所述的流感病毒為甲型或乙型流感病毒。所述的流感病毒還有丙型，丙型對(duì)人類(lèi)影響較小。本發(fā)明通過(guò)神經(jīng)氨酸酶活性抑制檢測(cè)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)對(duì)病毒感染并給以藥物處理后分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒數(shù)量進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)通過(guò)間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的表達(dá)，還通過(guò)半定量逆轉(zhuǎn)錄PCRGemi-quantitative RT-PCR)檢測(cè)了病毒核酸的表達(dá)。結(jié)果顯示吉馬酮對(duì)病毒粒子的分泌，病毒蛋白的表達(dá)和病毒核酸的復(fù)制均有較好的抑制作用。通過(guò)在病毒感染不同時(shí)間給藥檢測(cè)了藥物對(duì)病毒單輪復(fù)制周期不同環(huán)節(jié)的作用，結(jié)果顯示吉馬酮對(duì)病毒的吸附與入侵、病毒基因復(fù)制的早期均有抗病毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥物均有開(kāi)發(fā)成抗流感病毒的有效藥物而應(yīng)用于臨床，并且可以作為臨床上潛在的抗病毒藥物進(jìn)一步開(kāi)放的廣闊前景。利用現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將吉馬酮制成膠囊劑，顆粒劑，分散劑等，從而采用比較方便的口服給藥形式。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1.吉馬酮是一種天然來(lái)源小分子化合物，在1. 35 50 μ M濃度內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性，其 CC5。在 250 μ M 以上。2.吉馬酮?jiǎng)┝恳蕾?lài)地抑制流感病毒感染，其EC5tl為6μΜ。選擇指數(shù)約為40。3.對(duì)Η3Ν2，B型流感病毒，和金剛烷胺耐藥株均有抗流感病毒作用。4.可口服給藥，使用方便。結(jié)果顯示吉馬酮對(duì)這三種病毒株均有抗病毒活性。具有鎮(zhèn)咳、平喘等作用。具有開(kāi)發(fā)成抗流感病毒藥物的前景。5、不同濃度吉馬酮對(duì)流感病毒復(fù)制抑制率如下所示
權(quán)利要求
1.一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
2.一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防乙型流感病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種吉馬酮在制備治療或預(yù)防流感病毒藥物中的應(yīng)用，首先檢測(cè)了吉馬酮對(duì)MDCK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示CC50大于250um。其次，通過(guò)檢測(cè)吉馬酮對(duì)病毒三種抗原表達(dá)的影響和對(duì)病毒基因組復(fù)制的影響，結(jié)果顯示吉馬酮能劑量依賴(lài)地抑制病毒抗原的表達(dá)及病毒基因組復(fù)制。再次，初步研究了吉馬酮抗病毒活性的機(jī)制。通過(guò)不同時(shí)間給藥實(shí)驗(yàn)研究了吉馬酮在流感病毒單輪復(fù)制周期中發(fā)揮抗病毒活性作用的階段，結(jié)果提示吉馬酮對(duì)病毒的吸附、進(jìn)入及復(fù)制早期有抑制作用。此外，還檢測(cè)了吉馬酮對(duì)金剛烷胺耐藥株、B型流感病毒株和A型流感病毒H3N2亞型株的抗病毒活性，結(jié)果顯示吉馬酮對(duì)這三種病毒株均有抗病毒活性。具有鎮(zhèn)咳、平喘等作用。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102274206SQ20111016912
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者錢(qián)正旭, 陳緒林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所