專利名稱：治療糖尿病的楤木提取物及楤木皂苷在治療糖尿病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的治療糖尿病的藥物。具體的說，本發(fā)明涉及治療糖尿病的含有楤木皂苷A和C等的植物提取物在，以及楤木皂苷A和C在治療糖尿病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
消渴病(糖尿病)在世界范圍內(nèi)仍是一種未被征服的頑癥，據(jù)不完全統(tǒng)計，在全世界發(fā)病率占3-5％，50歲以上的中老年人發(fā)病率占5-7％，我國就有2700多萬患者。目前由糖尿病及其并發(fā)癥導(dǎo)致傷殘和死亡的人數(shù)僅決于心血管病和腫瘤病，占第三位。糖尿病病因的中心環(huán)節(jié)是由于胰島素分泌相對不足，引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂，并繼發(fā)維生素、水、電解質(zhì)代謝障礙。主要臨床表現(xiàn)為“三多一少”(即多飲、多食、多尿、體重減少)，體力減退，并有頭暈、失眼多夢、周身不適等癥狀，并易引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心腦血管病、高血壓、腎病、糖尿病眼病、肢體壞疽、神經(jīng)病變等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。
1995年，原國家醫(yī)藥局醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)信息中心站對全國28個主要城市共28家中西醫(yī)醫(yī)院、醫(yī)藥批發(fā)公司(站)進(jìn)行了口服糖尿病用藥的市場調(diào)查目前市場占有率較高的西藥品種為優(yōu)降糖(格列本脲，glybenclamide)、降糖靈(苯乙雙胍，phenformine)、格列齊特等。中藥品種主要有消渴丸(中西結(jié)合方)、降糖丹、天安糖泰、玉泉丸、金芪降糖片和新產(chǎn)品糖脈康等。
上述這些中西藥為防治糖尿病起到了重大作用，但這份調(diào)查報告中也指出，長期口服西藥僅是對癥的治療，且易引起高胰島素血糖、低血糖、肥胖癥、惡心、頭痛等毒副作用。中藥品種絕大多數(shù)為大的復(fù)方制劑，質(zhì)量難以控制，并且具有直接降糖作用的極少。從中藥或天然產(chǎn)物中提取有效部位，研制開發(fā)符合國內(nèi)外市場需要的現(xiàn)代的中藥，既能達(dá)到“安全、有效”，質(zhì)量上又可“穩(wěn)定、可控”，是目前急需解決的課題之一。
遼東楤木(龍牙楤木)(Aralia elata(Miq.)Seem)，又名刺老牙、刺老鴉、虎牙刺等，是五加科楤木屬植物，為黑龍江、吉林、遼寧等省民間所食用之野菜。《中藥大辭典》第1268頁載本品功用“補(bǔ)氣安神，強(qiáng)精滋腎，祛風(fēng)活血。治神經(jīng)衰弱、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病以及陽虛氣弱、腎陽不足等證。”但是并沒有對此作出詳細(xì)說明。
五十年代初，自楤木中分得皂苷類成分。蘇聯(lián)、波蘭、日本及我國等通過藥理實(shí)驗(yàn)證明皂苷類化合物是其主要有效成分。前蘇聯(lián)以楤木根生產(chǎn)出了楤木浸劑、膠囊劑，后來又生產(chǎn)出楤木皂苷A、B和C的總銨鹽制劑，用作中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮劑，治療腦力和體力的疲勞過度等，發(fā)現(xiàn)其具有適應(yīng)原樣作用。
在對皂苷的研究中，各國學(xué)者先后研究分得數(shù)十種特有皂苷，分別稱為Aralosides、Elatosides、Tarasaponin、Congmunosides等。這些化合物均顯示皂苷反應(yīng)，其苷元結(jié)構(gòu)主要為齊墩果烷類五環(huán)三萜如齊墩果酸等。其中主要成分為楤木皂苷(Araloside)A、B、C等，都是最早從楤木中提取出的。其中楤木皂苷A和C的結(jié)構(gòu)分別如下。但是上述皂苷對于糖尿病的治療活性從未被報道過。
楤木皂苷A 楤木皂苷C1994、1995年，日本人吉川(Yoshikawa)等報道，自日本產(chǎn)的龍牙楤木中分離得到的Elatoside類化合物(Elatoside A、C、E、F、G～K等)，其中Elatoside E、G、H、I、K具有降血糖作用(Chem.Pharm.Bull.1994，42，1354-1356；ibid，1995，43，1878-1882)。但是這些化合物均為自龍牙楤木以甲醇或醇-水提取得到，其含量甚微，其中Elatoside C、E、F略高于萬分之一，其它均不足萬分之一。與龍牙楤木(遼東楤木)中5％乃至20％以上的總皂苷含量相去甚遠(yuǎn)(中藥通報，1986，11，428-430)。
對于楤木類的皂苷等的提取方法，以往公開的多是以甲醇、乙醇等醇或者含少量水的醇提取并分離的，如上述吉川等(Chem.Pharm.Bull.43，1878-1882，1995)，沈陽藥學(xué)院學(xué)報(1991，8，265-268)，Phytochemistry(2001，56，491-497)等。
方乍浦等(植物學(xué)報，1992，34，461-465)雖然采用了水提取黃毛楤木的方法制得了黃毛楤木皂苷，但是并未有收率、含量等的數(shù)據(jù)。
CN1355171A，雖然給出了用水提取龍牙楤木總皂苷的方法，但是并未有主要成分含量等的數(shù)據(jù)，也沒有主要成分含量的內(nèi)容，而且該發(fā)明提取的總皂苷是用于治療心、腦血管疾病的，是否可以用于治療糖尿病也屬未知。
另外，以往報道楤木有小毒(《中藥大辭典》，2583，上海人民出版社，1977年)，但是迄今為止并無降低毒性的方法，也不知道毒性的來源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人等在長期從事遼東楤木(龍牙楤木)等的研究中，意外地發(fā)現(xiàn)楤木水提皂苷類成分具有很強(qiáng)的降血糖作用，在此基礎(chǔ)上經(jīng)反復(fù)深入研究，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明具有以下內(nèi)容本發(fā)明第1方面涉及一種治療糖尿病的楤木提取物，其特征在于該提取物是以水提取而得到的，其中總皂苷含量在50％以上，且楤木皂苷A和C的總含量在10％以上。
本發(fā)明的提取物，優(yōu)選總皂苷含量在60％以上，不多于90％，更優(yōu)選不超過80％。
本發(fā)明的提取物中，楤木皂苷A和C的合計含量優(yōu)選在15％以上，更優(yōu)選不少于20％。
本發(fā)明的楤木提取物優(yōu)選不含有無梗五加苷D。
本發(fā)明第2方面涉及楤木皂苷A和/或C的制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明第3方面涉及采用含有楤木皂苷A和/或C的組合物治療糖尿病的方法。
本發(fā)明第4方面涉及一種治療糖尿病的楤木提取物的制備方法，其特征在于包括用水提取楤木活性成分，之后將所得提取物用醇沉淀，將所得濾液通過大孔吸附樹脂吸附，然后用醇洗脫、并用吸附劑脫色等步驟。
本發(fā)明第5方面還涉及降低楤木提取物毒性的方法，其特征在于在獲得以皂苷為主要成分的楤木提取物后，用吸附劑進(jìn)行脫色，同時脫去造成毒性的無梗五加苷D。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式和優(yōu)良效果，從以下的具體敘述中可以了解。
附圖簡要說明

圖1是楤木皂苷A的HPLC色譜圖。
圖2是楤木皂苷C的HPLC色譜圖。
圖3是制備實(shí)施例1所得的提取物的薄層色譜圖。
圖4是制備實(shí)施例4所得的各提取物的薄層色譜圖。
具體實(shí)施例方式
以下敘述中，若非特別注明，百分含量均指重量(質(zhì)量)百分含量。
一、關(guān)于楤木本發(fā)明中所述的楤木是指雙子葉植物綱五加科楤木屬的植物，例如遼東楤木Aralia elata(Miq.)Seem或稱龍牙楤木A.mandshuriaRupr.、楤木A.chinensis L.、黃毛楤木A.decaisneana Hance、虎陽刺楤木A.armata(Wall)Seem、長刺楤木A.spinfolia Merr.、遠(yuǎn)東楤木A.schmidtii、長白楤木A.continentalis Kitagawa、多刺楤木A.spinosa L.、太白楤木A.taibaiensis Z.Z.Wang et H.C.Zheng等。其中從分布廣泛，活性成分含量高等方面，優(yōu)選遼東楤木Araliaelata(Miq.)Seem即龍牙楤木A.mandshuria Rupr.，以下內(nèi)容中，若非特別指出，所說楤木就是指上述楤木屬植物，特別是遼東楤木Aralia elata(Miq.)Seem。本發(fā)明的治療糖尿病的楤木提取物就是主要從遼東楤木Aralia elata(Miq.)Seem的根皮或樹皮提取分離得到的，當(dāng)然只要能獲得本發(fā)明所述的治療糖尿病的效果，也可以從楤木的芽、葉或木質(zhì)部分等部位進(jìn)行提取，本發(fā)明中對此不進(jìn)行限制。
經(jīng)本發(fā)明人對上述植物的各種提取物的研究，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)特定的提取物以及單體楤木皂苷A和C具有抗糖尿病的活性。在這些具有抗糖尿病活性的提取物中，總皂苷含量總在50％以上，且其中楤木皂苷A和C的含量在10％以上。通過我們的研究也首次發(fā)現(xiàn)，單體楤木皂苷A或C等也具有抗糖尿病活性。
本發(fā)明的楤木提取物中，總皂苷量應(yīng)該在50％以上，優(yōu)選60％以上，更優(yōu)選75％以上，最優(yōu)選85％以上。楤木提取物中總皂苷的含量上限沒有特別限制，在50％～100％的范圍內(nèi)均具有抗糖尿病活性。從工藝路線的選擇和成本方面考慮，總皂苷的含量在60％以上即可較好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，如果把總皂苷的量提高到90％以上，不僅原料的成本要上升，而且還要增加額外的處理工序，因此總皂苷的含量最優(yōu)選在50％～90％的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的提取物中，楤木皂苷A和C的合計含量應(yīng)不少于10％，優(yōu)選不少于15％，更優(yōu)選不少于20％，由于提取工藝的限制以及出于化合物協(xié)同作用的考慮，楤木皂苷A、C的和為以不超過50％為宜。
我們提取了楤木的含楤木皂苷A和C的提取物(如上述所定義的)。通過后文實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，根據(jù)本發(fā)明方法制備的楤木提取物確有較好的抗糖尿病效果。
對于楤木提取物的毒性成分，通過我們的研究，發(fā)現(xiàn)主要源于其中所含的無梗五加苷D。在小鼠灌胃給藥的急性毒性實(shí)驗(yàn)中，無梗五加苷D的半數(shù)致死量LD50為11.45mg/kg，而去除該成分的本發(fā)明提取物的半數(shù)致死量LD50達(dá)到1028mg/kg，屬于實(shí)際無毒的范圍。雖然無梗五加苷D并不影響楤木皂苷的活性，但是由于抗糖尿病的藥物通常需要長期服用，因此最好從提取物中除去。本發(fā)明的楤木提取物優(yōu)選不含有無梗五加苷D。
在此，所謂“不含有”并不是指絕對的不含有，而是指僅有生理學(xué)上無顯著意義量以下的含量。在此基礎(chǔ)上雖然越少越好，但是通常只要低于0.01％就可以基本實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的了。
以下討論本發(fā)明楤木提取物的制備方法。
本發(fā)明楤木提取物的典型制備方法包含如下步驟〔藥材粉碎→〕水煎煮→(醇沉淀/過濾)→樹脂吸附→(水洗→)醇/水洗脫→后處理上述方法中，藥材的粉碎是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)步驟。對于粉碎的方法，本發(fā)明不加限制。粉碎后的粉末，如果粒度過粗，則有效成分難以充分提出；如果粉末過細(xì)，則會給煎煮后的分離提取液的步驟帶來不利，對此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)加以選擇，對此也不做限制。
在中藥提取中，為了提取出有效成分，可以采用水和/或醇浸潤提取的方式，但是由于有效成分的浸出不容易完全，所以采用加熱抽提的方式。加熱溫度為室溫-抽提溶劑的沸點(diǎn)。本發(fā)明中，為了避免不需要的雜質(zhì)，優(yōu)選水提取。
加熱提取時，優(yōu)選在水(或含水溶劑)的沸點(diǎn)進(jìn)行(回流)。
如單純用水時，優(yōu)選在常壓或加壓下進(jìn)行提取，從成本角度看優(yōu)選常壓提取。加壓提取可以減少提取時間，因此也可以采用。本申請對此不作限制。
常壓提取下，總提取時間為2-24小時，提取次數(shù)1-4次，每次提取加入的水量為生藥量的2-20倍。如果用醇或醇水溶液回流提取，則用量為生藥量的5-30倍，上述數(shù)據(jù)僅作為參考，實(shí)際中根據(jù)需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行適當(dāng)變動，應(yīng)予理解，這種變化不超過本發(fā)明的范圍。
獲得提取液以后，根據(jù)需要可以對提取液進(jìn)行減壓濃縮等以縮小體積，或者再加以過濾(例如用超濾膜等)或者用醇沉淀，以除去不需要的淀粉、粘液、蛋白質(zhì)等。此種操作屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員在提取中藥過程中的常規(guī)操作，對此不加限制。例如可以加醇到40％～80％(v/v)左右進(jìn)行沉淀等，也可以根據(jù)和沉淀效果溶劑回收情況進(jìn)行確定。
然后把提取液用樹脂吸附?？梢杂脕砦降臉渲侨鯓O性的大孔吸附樹脂，例如D-101、D-201、D-301樹脂等(滄州市寶恩化工有限公司)、AB-8樹脂(天津骨膠廠)、WLD樹脂(四川省中藥研究所)、CAD-40(華北制藥廠)等，但本發(fā)明方法并不受上述樹脂柱型號的限制，只要是弱極性的大孔吸附樹脂，即可以完成本發(fā)明方法。對于樹脂吸附的方法參見CN1072089A、WO02053164A等，上述文獻(xiàn)中對樹脂吸附方法進(jìn)行了詳細(xì)的描述，本申請引用了文獻(xiàn)中公開的方法，并作為本發(fā)明方法的一部分，記載在本申請文件中。
根據(jù)本發(fā)明人的研究結(jié)果，在提取本發(fā)明的楤木提取物的時候，這幾種樹脂中以D-101樹脂吸附容量最大，洗脫也更容易。故本提取方法優(yōu)選D-101型吸附樹脂為吸附劑。原藥材提取液與吸附樹脂的比例，視提取液的濃度而變，可以在0.3～2∶1(體積)之間適當(dāng)選擇，優(yōu)選0.6～1.6∶1，最優(yōu)選1∶1左右，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)適當(dāng)選擇。如果比例小于0.3∶1，則可能吸附不完全，如果大于2∶1，則因?yàn)槲降脑碥樟坎辉僭黾樱瑫速M(fèi)樹脂，不利于成本控制。
在使用吸附樹脂的時候，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的常識，樹脂應(yīng)該先進(jìn)行預(yù)處理然后才能使用，預(yù)處理可以采用已知方法進(jìn)行，例如可以按如下方法操作將樹脂裝柱，用95％乙醇沖洗，洗至流出液用2倍量水稀釋時，不顯渾濁后，再用水沖洗流出液無醇味，然后將藥液上柱。
以上說明僅為示例性質(zhì)，具體應(yīng)根據(jù)所使用的吸附樹脂的說明進(jìn)行。
吸附時當(dāng)然須控制提取液的流速，才能保證吸附完全和保證適當(dāng)?shù)乃俣?。對于適當(dāng)吸附速度的選擇屬于本領(lǐng)域的常規(guī)操作，在此不作限制。例如，在20mL樹脂的情況下，吸附流速在0.5～10ml/分左右都可以比較好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。高于或低于此值將降低分離效率或者造成收率的損失。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況加以決定。
上柱后洗脫所用的醇可以是低級醇如甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇等。從健康角度看優(yōu)選乙醇，采用乙醇洗脫時，濃度為30-80％(v/v)左右，優(yōu)選40-70％(v/v)。從乙醇可以回收利用的角度來看，最好50～70％(v/v)(因?qū)嶋H條件而變，也可以±5％)左右。
用醇洗脫后，收集洗脫液，回收洗脫液中的乙醇后再濃縮，最后，經(jīng)噴霧干燥或冷凍干燥或直接干燥后粉碎，得到本發(fā)明的楤木提取物的粉末，所得粉末可以進(jìn)一步精制，或直接制成適當(dāng)?shù)膭┬?，例如，膠囊劑、丸劑、片劑、顆粒劑、溶液劑或注射劑等。
另外，洗脫液也可以經(jīng)過脫色后再制成粉末。脫色可以采用氧化鋁、氧化鎂、硅藻土、活性炭、分子篩、碳酸鈣等或者它們的組合進(jìn)行。脫色時，可以采用常規(guī)脫色工藝，即將適量脫色劑加入洗脫液中，回流，之后放冷、過濾，以后按照上述方法制成粉末。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過脫色可以出乎意料的同時降低無梗五加苷D在提取物中的含量，就是說脫色可同時去除無梗五加苷D，降低楤木提取物的毒性。在CN1355171A和CN1355172A中沒有提到對楤木提取物進(jìn)行脫色的步驟，因此本發(fā)明也提供了對楤木提取物降低毒性的方法。
在脫色過程中的脫色劑優(yōu)選氧化鎂、氧化鋁、碳酸鈣、明膠、分子篩、活性炭、硅藻土等中的一種或多種的組合。特別優(yōu)選氧化鎂或者含有氧化鎂的脫色劑組合，如氧化鎂-活性炭、氧化鎂-氧化鋁、氧化鎂-硅藻土等。組合使用時，氧化鎂與另一組分的使用量比例可以根據(jù)情況適當(dāng)調(diào)整，比如在20∶1～1∶20間進(jìn)行調(diào)整。
如上所述本發(fā)明的提取物，可以按照常規(guī)的制劑工藝，制備成任何適用于臨床使用的藥物劑型，例如，膠囊劑、丸劑、片劑、顆粒劑，溶液劑或注射劑等。其中各劑型所含提取物的量依據(jù)劑型組成、所治療患者的狀況、臨床使用條件等而有所不同。由于糖尿病屬于慢性疾病，因此優(yōu)選各種口服劑型。大體來說，當(dāng)提取物中總皂苷含量以50％計時，體重70公斤左右的患者可以每天給藥0.1～10克(相當(dāng)于原藥材2～3克到2～300克左右)，分1～3次服用。由于本發(fā)明的提取物的原料楤木本身具有適應(yīng)原樣作用和滋補(bǔ)強(qiáng)壯作用等，因此用量適當(dāng)加大也不會有明顯的毒副作用。
動物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的楤木提取物對四氧嘧啶、鏈脲霉素、外源性葡萄糖、腎上腺素所致的多種試驗(yàn)性高血糖動物模型均具有顯著的降糖作用。同時楤木提取物還可以增加肝糖元的含量，增加血清胰島素水平。
另外，初步臨床試驗(yàn)表明，本發(fā)明的楤木提取物對中醫(yī)診斷為氣陰兩虛證消渴病患者，總療效63.33％，顯效率43.33％；對于消渴病證候療效，總療效83.33％，愈顯率56.67％。
以下舉出制備實(shí)施例、制劑實(shí)施例和藥理實(shí)驗(yàn)例具體說明本發(fā)明。但本發(fā)明不受以下實(shí)施例的任何限制。
制備實(shí)施例1稱取楤木藥材粗粉1kg，粉碎。水24升，分3次煎煮提取，每次提取前可適當(dāng)浸泡。每次時間分別為2小時、1小時40分、1小時。合并提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15。
在攪拌下加乙醇使含醇量達(dá)60％，放置過夜，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，濃縮至相對密度為1.20～1.25。將此濃縮濾液通過已處理完畢的大孔吸附樹脂(D101型)柱(2kg)以進(jìn)行吸附。水洗一個柱體積，再用10％乙醇洗脫一個柱體積，最后用60％乙醇洗脫樹脂柱，使吸附于樹脂柱上的皂苷被完全洗脫止，收集60％的洗脫液。
洗脫液中加入0.02kg脫色劑(MgO∶活性炭＝1∶1)，加熱至70-80℃，回流30分鐘，放冷，濾過。減壓回收乙醇，真空干燥。得到淺黃白色的本發(fā)明的提取物45克。
按本實(shí)施例方法制取的楤木總皂苷產(chǎn)品收率4.5％。
按比色法檢測總皂苷含量儀器722型紫外-可見分光光度計測定方法取楤木皂苷C，用甲醇制成每1ml含2mg的溶液。精密吸取對照品溶液30μl，60μl，90μl，120μl，150μl，180μl，置于具塞試管中，揮去甲醇，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，于70度水浴加熱20分鐘，取出，冷卻至室溫后精密加入醋酸乙酯5ml，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VB)，在595nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本發(fā)明提取物約50mg，精密稱取，置于具塞試管中，精密加入甲醇5ml，超聲處理20分鐘，濾過，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液25μl，置于具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“揮去甲醇”起，依法測定吸收度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液楤木皂苷C的量，計算，即得。
含量，以楤木皂苷C計，含總皂苷87％。
HPLC法檢測楤木皂苷A、楤木皂苷C含量之和色譜條件設(shè)備PE-1022色譜工作站色譜柱C18(Dikmosil，250×4.6mm，5μm)流動相乙腈∶0.2％磷酸水溶液(32∶68)柱溫30℃檢測波長207nm。
按照面積歸一化法測定，該產(chǎn)品含楤木皂苷A、楤木皂苷C含量之和25％。
楤木皂苷A、楤木皂苷C的高效液相(HPLC)色譜圖見附圖1和2。
本實(shí)施例的所得提取物的薄層色譜圖見圖3，展開系統(tǒng)為CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1。從圖中可見不含無梗五加苷D。
制備實(shí)施例2除大孔吸附樹脂分別改以D201樹脂、AB-8樹脂、WLD樹脂、CAD-40樹脂以外，按照上述制備實(shí)施例1同樣方法進(jìn)行提取，得到提取物。按照制備實(shí)施例1的方法測定總皂苷含量。樹脂種類、樹脂-提取液用量比(吸附量)、總皂苷含量、收率如表1所示。
表1

制備實(shí)施例3除洗脫乙醇濃度分別為30、40、50、70％以外，按照上述制備實(shí)施例1同樣方法進(jìn)行提取，得到提取物。按照制備實(shí)施例1的方法測定總皂苷含量以及楤木皂苷A和C的含量。乙醇濃度、收率、總皂苷含量、楤木皂苷A和C的含量和如表2所示。
表2

制備實(shí)施例4除脫色劑分別改為活性炭、氧化鋁、活性炭+氧化鋁、氧化鎂、活性炭+氧化鎂或者不進(jìn)行脫色以外，按照上述制備實(shí)施例1同樣方法進(jìn)行提取，得到提取物。按照制備實(shí)施例1的方法測定總皂苷含量。脫色劑用量(相對于提取物)、總皂苷含量、所得提取物的性狀和收率如下表3所示。
表3

本實(shí)施例的所得提取物的薄層色譜圖見圖4，其中1是未經(jīng)脫色的，2是以活性炭為脫色劑的，3是氧化鋁的，4是活性炭+氧化鋁的，5是氧化鎂的，6是活性炭+氧化鎂的。展開系統(tǒng)為CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1。從圖中可見加入脫色劑后無梗五加苷D明顯減少，尤其是采用含有氧化鎂的脫色劑后效果更明顯。
制劑實(shí)施例1膠囊劑取制備實(shí)施例1方法得到的提取物35g，粉碎，過80目篩，依次加入過80目篩的微晶纖維素55g、可壓性淀粉10g和適量淀粉，混勻，再過80目篩，裝入2號膠囊，制成1000粒，即得。
制劑實(shí)施例2片劑取按制備實(shí)施例1方法所得的提取物105g，以乙醇為粘和劑，一步法制粒。顆粒依次加入羧甲基纖維素鈉220g、硬脂酸鎂75g，混勻，壓片，分裝，制成1000片，即得。
藥理實(shí)驗(yàn)例1
消渴病是以多尿、多飲、多食、形體消瘦、或尿有甜味為主要臨床表現(xiàn)的病癥。中老年糖尿病患者中，還多呈現(xiàn)氣陰兩虛之證。這類病人，由于年事已高，通常在服用西藥降糖藥后，會因血糖突然下降而感到頭暈、乏力等癥愈加明顯。因此他們期有一種使血糖呈緩慢型下降的降糖藥。以下實(shí)驗(yàn)例證明本發(fā)明提取物可以緩慢降低血糖，同時能改善氣陰兩虛之癥狀。
因此我們用本發(fā)明的楤木提取物對氣陰兩虛證消渴病(II型糖尿病)患者46例(含對照組16例)，進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，其結(jié)果如下(一)病例標(biāo)準(zhǔn)參照《新藥(中藥)治療消渴病(糖尿病)臨床研究指導(dǎo)原則》確診為消渴病(糖尿病)且辨征為氣陰兩虛的病人同時，根據(jù)1980年WHO暫行標(biāo)準(zhǔn)(靜脈血漿真糖法)，診斷為分類屬輕、中度非胰島素依賴型(NIDDM，II型)糖尿病，分期屬糖尿病癥狀期(II期)，糖尿病合并癥早期(III期)者。
(二)、臨床試驗(yàn)方法給藥方法1.治療組服用制劑例1制備的膠囊(50mg/粒)，2粒/次，3次/日，口服。
2.對照組①口服降糖靈片，南通制藥廠生產(chǎn)，25mg/片，1片/次，3次/日。②口服優(yōu)降糖，北京雙橋制藥公司生產(chǎn)，按說明服用。
3.治療療程治療組與對照組均以用藥兩個月為一療程，療程結(jié)束，即結(jié)束臨床觀察。
(三)觀察指標(biāo)1.中醫(yī)療效性觀測按以下評價指標(biāo)，除特別指出外，相應(yīng)于正常、輕度、中度和重度分別評分為0、2、4、6分。
A.倦怠乏力正常，癥狀無或消失；輕度，易疲勞，但可勝任日常工作；中度，疲勞于休息后可緩解，不耐重工作或持久工作；重度，疲乏于休息后不能恢復(fù)，不能勝任工作。
B.頭暈正常，癥狀無或消失；輕度，偶有，輕微；中度，明顯，時有；重度，嚴(yán)重，持續(xù)不斷。
C.氣短懶言正常，癥狀無或消失；輕度，運(yùn)動后氣短，不喜多言；中度，稍動即氣短，不喜多言；重度，平靜時亦氣短，不欲言語，呈無欲狀。
D.口渴喜飲正常，癥狀無或消失；輕度，口渴，飲水后可緩解，日飲水量增加1/2倍以上；中度，口渴明顯，日飲水量＜4000ml，或增加1/2-1倍；重度，口干甚飲水不解，日飲水量＞4000ml，或增加＞1倍。
E.五心煩熱正常，癥狀無或消失；輕度，手足心熱，偶有心煩；中度，手足欲露衣被外，時感心煩；重度，手足熱，喜觸冷物，心煩不寧。
F.自汗正常，癥狀無或消失；輕度，動則微汗出；中度，不動即皮膚潮濕，稍動則汗出；重度，經(jīng)常汗出，動則汗出如水洗。
G.盜汗正常，癥狀無或消失；輕度，寐則偶汗出；中度，寐則汗出；重度，寐則大汗出如珠。
H.多食易饑正常，癥狀無或消失；輕度，有輕度饑餓感，食量略增加；中度，時感饑餓，尚能控制，或食量增加1/2-1倍；重度，易饑多食，不能自控，或食量增加1倍以上。
I.大便干結(jié)(0、1、2、3分)正常，癥狀無或消失；輕度，便干，排之不暢；中度，大便干結(jié)，排之困難，2-3日/次；重度，大便硬結(jié)，干澀難解，數(shù)日/次。
J.多尿或溲赤(0、1、2、3分)正常，癥狀無或消失；輕度，尿色深黃，或尿量增加1倍以上；中度尿色黃赤，或尿量增加1-2倍；重度尿呈茶褐色，尿量增加2倍以上。
K.心悸(0、1、2、3分)正常，癥狀無或消失；輕度，活動量稍大即感心悸；中度，輕微活動即感心悸；重度，休息時可感心悸。
F.失眠(0、1、2、3分)正常，癥狀無或消失；輕度，睡眠不足6小時；中度，睡眠不足4小時；重度，睡眠不足3小時。
I.舌象、脈象舌紅少津1分舌體胖大1分苔薄黃或少苔1分脈弦細(xì)或細(xì)數(shù)1分中醫(yī)癥狀分級標(biāo)準(zhǔn)以上累積分＞44分為重度；20分～44分為中度；＜20分為輕度2.空腹及餐后兩小時血糖檢測，用藥后每兩周一次。
3.24小時尿糖定量檢測，用藥后每兩周一次。
4.血脂測定5.糖基化血紅蛋白測定。
6.血液流變學(xué)測定。
(四)療效判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)臨床癥狀及化驗(yàn)檢查變化作為判定標(biāo)準(zhǔn)(以衛(wèi)生部一九九三年中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則為標(biāo)準(zhǔn))。
1.顯效治療后癥狀基本消失，空腹血糖＜7.2mmol/L(130mg/dl)，餐后2小時血糖＜8.3mmol/l(150mg/dl)，24小時尿糖定量＜10.0克；或血糖、24小時尿糖定量較治療前下降30％以上。
2.有效治療后癥狀明顯改善，空腹血糖＜8.3mmol/l(150mg/dl)，餐后2小時血糖＜10.0mmol/L(180mg/dl)。24小時尿糖定量＜25.0克；或血糖、24小時尿糖定量較治療前下降10-29％。
3.無效治療后癥狀無明顯改善，而血糖、尿糖下降未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)。
(五)中醫(yī)證侯療效標(biāo)準(zhǔn)證侯療效評定按半定量評分法。
綜合證侯療效評定方法

1.痊愈積分比100％2.顯效積分比≥70％3.有效70％＞積分比≥30％4.無效30％＞積分比(六)、臨床總結(jié)及統(tǒng)計處理所有資料匯總，輸入IBM/PC兼容計算機(jī)，建立數(shù)據(jù)庫，用POMS(醫(yī)學(xué)統(tǒng)計程序)、PEMS(華西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計程序)進(jìn)行統(tǒng)計處理。
統(tǒng)計處理方法計數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，等級資料用Ridit分析，計量資料用t檢驗(yàn)。
結(jié)果1.總療效(表4)表4

2.中醫(yī)證候療效(表5)表5

具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(a)取三七330g、冰片3.3g、木糖醇12g、黃原膠3g備用；(b)取三七加水煎煮5次，合并煎液，濾過，濾液濃縮，加入2倍量90％乙醇，靜置20小時，濾過，回收乙醇，濾液濃縮至在50℃條件下、相對密度為1.15～1.25的稠膏(1)；(c)取冰片溶于適量的乙醇中，得溶液(2)；將(1)(2)加入水浴融化的木糖醇和淀粉混合物中，攪拌均勻，保溫，在55～75℃溫度下滴制、滴管口徑為1.30～4.0毫米，以每分鐘30～60滴的速度滴制，滴入甲基硅油中，制成1000粒，成形后，將丸取出，用吸水紙拭干滴丸表面，即得。
實(shí)施例2(a)取三七20g、冰片1.5g、乳糖醇83g、淀粉17g備用；(b)取三七加水煎煮2次，合并煎液，濾過，濾液濃縮，加入4倍量85～95％乙醇，靜置36小時，濾過，回收乙醇，濾液濃縮至在70～80℃條件下、相對密度為1.10～1.25的清膏(1)；(c)取冰片溶于適量的乙醇中，得溶液(2)；將(1)(2)加入水浴融化的乳糖醇與淀粉的混合物中，攪拌均勻，保溫，在65～95℃溫度下滴制、滴管口徑為1.10～3.0毫米，以每分鐘20～50滴的速度滴制，滴入植物油中，制成1000粒滴丸，成形后，將丸取出，用吸水紙拭干滴丸表面，即得。
小結(jié)1.本發(fā)明的楤木提取物對氣陰兩虛證消渴病患者30例臨床預(yù)試，其療效觀察結(jié)果示總療效63.33％，顯效率43.33％。
2.本發(fā)明的楤木提取物證候療效分別為總療效83.33％，愈顯率56.67％。
3.本發(fā)明提取物對中醫(yī)癥狀改善情況優(yōu)于降糖靈、優(yōu)降糖，尤其對倦怠乏力、頭暈、氣短懶言、口渴喜飲、五心煩熱、自汗、盜汗之氣陰兩虛癥狀的改善效果更為明顯。
4.另外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的楤木提取物對血糖的下降不及降糖靈、優(yōu)降糖迅速，具有起效相對緩慢的特點(diǎn)，但患者一當(dāng)血糖下降后，一般不再出現(xiàn)反跳。
5.30例服用制劑例1膠囊的患者，在臨床觀察中，未發(fā)現(xiàn)1例毒、副反應(yīng)。
藥理實(shí)驗(yàn)例2.本發(fā)明楤木提取物對正常動物血糖的影響(1)單次給藥對正常動物血糖的影響取正常家兔48只，隨機(jī)分為6組，在飼養(yǎng)觀察室內(nèi)觀察7天，給藥前禁食12小時，耳緣靜脈取血，測定給藥前血糖值。分別灌胃給提取物100mg/kg、50mg/kg，25mg/kg，參芪降糖膠囊300mg/kg及優(yōu)降糖3.5mg/kg，給藥容積為5m/kg，空白對照組給相當(dāng)容積0.5％CMC-Na，給藥后3小時取血，離心，取血清20ul，加入葡萄糖氧化酶試劑，混勻后37℃保溫15分鐘，505nm波長處測定吸收度(A)。與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖吸收度比較，計算血清中葡萄糖含量。并與給藥前血糖濃度比較。試驗(yàn)結(jié)果如下表7所示，各給藥組給藥前后血糖值無明顯差異。
表7

注X±SD，給藥前后血糖值比較*p＜0.05(2)多次給藥對正常動物血糖的影響取正常小鼠60只，隨機(jī)分為6組，在飼養(yǎng)觀察室內(nèi)觀察7天，給藥前禁食12小時，眼球后靜脈取血，測定給藥前血糖值。分別灌胃給提取物120mg/kg、60mg/kg，30mg/kg，參芪降糖膠囊800mg/kg及優(yōu)降糖4mg/kg，空白對照組給相當(dāng)容積0.5％CMC-Na，給藥容積為0.2ml/10g，連續(xù)給藥7天，末次給藥后3小時眼球后靜脈取血，離心，取血清20ul，加入葡萄糖氧化酶試劑，混勻后37℃保溫15分鐘，505nm波長處測定吸收度A。與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖吸收度比較，計算血清中葡萄糖含量。并與給藥前血糖濃度比較。結(jié)果如表8所示。各給藥組給藥前后血糖值明顯下降，與給藥前血糖值比較有非常顯著差異(p＜0.01)表8

注X±SD，給藥前后血糖值比較*p＜0.05，**p＜0.01
藥理實(shí)驗(yàn)例3.本發(fā)明楤木提取物對四氧嘧啶致高血糖動物血糖的影響(1)單次給藥對血糖影響的時效關(guān)系取正常家兔，禁食12小時后用固定箱固定之。以酒精涂擦兔耳，使耳緣靜脈輪廓清晰，于試驗(yàn)前用生理鹽水配制四氧嘧啶，以150mg/kg從耳緣靜脈注入，誘導(dǎo)成高血糖動物模型，另準(zhǔn)備高滲葡萄糖溶液，以便在給藥初期低血糖痙攣發(fā)作時及時給予。待其血糖值穩(wěn)定后，取血，離心，測血糖值，取空腹血糖值在200mg/dl以上的家兔隨機(jī)分為6組，每組8只，分別灌胃給提取物100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，參芪降糖膠囊300mg/kg及降糖靈35mg/kg及相當(dāng)容積的0.5％CMC混懸液，分別在給藥后1、2、3、4小時取血，離心，用葡萄糖氧化酶法測血糖濃度，并與給藥前血糖值比較，結(jié)果如表9所示，楤木單次灌胃給藥后對四氧嘧啶高血糖家兔有降低血糖作用，但僅第3小時與模型組比較有顯著差異。
表9

X±SD，與給藥前相比*p＜0.05，**p＜0.001(2)連續(xù)給藥對四氧嘧啶所致高血糖家兔血糖影響如前所述方法制備四氧嘧啶高血糖模型家兔48只，測給藥前空腹血糖后，選合格動物均分為6組，每組8只，分別是模型對照組、楤木提取物組100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、兩組陽性對照組(包括參芪降糖膠囊300mg/kg，降糖靈35mg/kg)、空白對照組另取8只僅靜脈注射相當(dāng)容積的四氧嘧啶溶劑生理鹽水的正常家兔。每天灌胃給藥一次，給藥容積為5.0ml/kg，空白對照組和模型對照組給相當(dāng)容積的0.5CMC-Na，連續(xù)給藥4周(28天)，每給藥7天測定一次空腹血糖進(jìn)行組間比較并于末次給藥(28天)后不同時間(1，2，4，24h)采血，進(jìn)行比較，給藥后第7天楤木提取物100mg/kg和50mg/kg組開始出現(xiàn)明顯降糖作用，并隨給藥時間延長，降糖作用日趨明顯，停藥后其降糖作用可維持4小時左右(表10，11)表10連續(xù)給藥對血糖影響

X±SD，各給藥組血糖與模型對照組血糖值相比*p＜0.05，**p＜0.01
表11連續(xù)灌胃血糖影響

X±SD，各給藥組血糖與模型對照組血糖值相比*p＜0.05，**p＜0.01藥理實(shí)驗(yàn)例4.楤木提取物對鏈脲霉素致高血糖小鼠血糖的影響取昆明種小鼠，體重20-22g，禁食12小時后尾靜脈注射用生理鹽水新鮮配制的鏈脲霉素溶液，劑量180mg/kg，造成務(wù)糖模型，穩(wěn)定一周后取空腹血糖值在180mg/dl以上的小鼠60只，均分6組，各組給藥劑量如表6-7所示，模型對照組灌胃給相當(dāng)容積0.5CMC-Na。于給藥后0、2、4、6小時分別采血用葡萄糖氧化酶法測血糖，各給藥組血糖與模型組血糖進(jìn)行比較顯著性檢驗(yàn)、結(jié)果如表12所示，楤木皂苷對鏈脲霉素高血糖小鼠有明顯降糖作用。
表12楤木提取物對鏈脲霉素致高血糖小鼠血糖的影響

X±SD，各給藥組血糖值與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01
藥理實(shí)驗(yàn)例5.楤木提取物對腎上腺素致高血糖小鼠血糖的影響取小鼠70只，均分為7組，1、2組灌胃生理鹽水0.2ml/10g，3、4、5組灌胃給提取物(劑量120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg)，第6組灌胃給參芪降糖膠囊(300mg/kg)，第七組灌胃給降糖靈(40mg/kg)，連續(xù)給藥9天，末次給藥前禁食12小時，末次給藥后2小時，2、3、4、5、6組小鼠腹腔注射腎上腺素50ug/kg，30分鐘后眼眶取血，葡萄糖氧化酶法測血糖。結(jié)果見表13。腎上腺素能促進(jìn)肝臟及肌肉糖原分解，并能促進(jìn)糖異生作用，使動物血糖升高，本發(fā)明提取物對腎上腺素所致的試驗(yàn)性高血糖動物模型具有顯著的降糖作用。
表13對腎上腺素引起的高血糖小鼠血糖的影響

注X±SD，與模型對照組作t檢驗(yàn)p＜0.05，**與模型對照組作t檢驗(yàn)p＜0.01藥理實(shí)驗(yàn)例6.楤木提取物對葡萄糖致糖耐量的影響取四氧嘧啶致高血糖家兔48只，分為6組，分別是模型對照組(給0.5％CMC混懸液)、提取物組(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)、陽性對照組參芪降糖膠囊(300mg/kg)、降糖靈(35mg/kg)，禁食12小時，取血，測血糖后分別給藥30分鐘后，以2.5g/kg劑量灌胃給葡萄糖，給糖后分別在30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘耳緣靜脈取血，離心，用葡萄糖氧化酶法測血糖。結(jié)果見表14，試驗(yàn)結(jié)果表明楤木提取物能提高受試動物的糖耐受性。
表14楤木提取物對高血糖家兔糖耐量的影響

注X±SD，各給藥組血糖與模型對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01藥理實(shí)驗(yàn)例7.楤木提取物對肝糖元含量的影響取四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病小鼠60只，均分為6組，分別為提取物高劑量組(120mg/kg)、提取物中劑量組(60mg/kg)、提取物低劑量組(30mg/kg)及模型對照組(0.5％CMC)、陽性對照組為參芪降糖膠囊(800mg/kg)、降糖靈(40mg/kg)另取正常小鼠10只，作為空白對照組(0.5％CMC)，灌胃給藥，連續(xù)9天，末次給藥前禁食12小時，末末次給藥后2小時處死小鼠取小鼠肝臟，以生理鹽水洗凈血液，用濾紙吸干表面水分后分別稱取各組小鼠肝組織0.5g，加入事先加及1.5ml 30％KOH的溶液的試管中，置沸水浴中煮沸20min，取出冷卻，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，蒸餾水清洗，合并清洗液至刻度，混勻。用蒽酮法測定肝糖元的含量。結(jié)果如表15所示，試驗(yàn)結(jié)果表明楤木提取物可使四氧嘧啶高血糖小鼠肝糖元含量增加，與模型對照組肝糖元含量間有顯著差異。楤木提取物可以增加肝糖元的含量，說明其降糖作用與促進(jìn)動物的糖的合成代謝有一定關(guān)系。
表15楤木提取物對肝糖元含量的影響

注X±SD，*與模型對照組作t檢驗(yàn)p＜0.05，**與模型對照組作t檢驗(yàn)p＜0.01藥理實(shí)驗(yàn)例8.楤木提取物對血清胰島素含量的影響取四氧嘧啶誘發(fā)高血糖小鼠60只，分為6組，分別為提取物高劑量組(120mg/kg)、提取物中劑量組(60mg/kg)、提取物低劑量組(30mg/kg)及模型對照組參芪降糖膠囊(800mg/kg)，降糖靈組(40mg/kg)，另取正常小鼠10只，為正常對照組(0.5％CMC)，連續(xù)給藥9天，末次給藥前禁食12小時，于末次灌胃給藥后2小時眼眶取血，離心，取血清，測血清中的胰島素含量。結(jié)果見表16，本發(fā)明提取物可以增加血清胰島素水平。
表16楤木提取物對四氧嘧啶致高血糖小鼠血清胰島素含量的影響

注X±SD，*與模型對照組作t檢驗(yàn)p＜0.05，**與模型對照組作t檢驗(yàn)p＜0.0權(quán)利要求
1.一種治療糖尿病的楤木提取物，其特征在于該提取物是以水提取而得到的，其中總皂苷含量在50％以上，且楤木皂苷A和C的總含量在10％以上。
2.權(quán)利要求1的提取物，其中總皂苷含量在60％以上和/或總皂苷中，楤木皂苷A和C的合計含量在15％以上。
3.權(quán)利要求1的提取物，其中總皂苷含量在75％以上和/或在提取物中，楤木皂苷A和C的合計含量在20％以上。
4.權(quán)利要求1的提取物，其中楤木皂苷A和C的合計含量在50％以下。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的楤木提取物，其中不含有無梗五加苷D。
6.楤木皂苷A和/或C用于制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。
7.采用含有楤木皂苷A和/或C的中藥提取物治療糖尿病的方法。
8.一種楤木提取物的制備方法，其特征在于包括用水提取楤木活性成分，之后將所得提取物用醇沉淀，將所得濾液通過弱極性的大孔吸附樹脂吸附，然后用醇洗脫、并用含有氧化鎂的吸附劑脫色的步驟。
9.權(quán)利要求8的提取方法，其中大孔吸附樹脂為D101樹脂。
10.權(quán)利要求8的提取方法，其中所用醇為乙醇。
全文摘要
一種治療糖尿病的楤木提取物，其特征在于該提取物是以水提取而得到的，主要含有楤木皂苷A和C，而且其中優(yōu)選不含有無梗五加苷D。
文檔編號A61P3/10GK1626099SQ20031012038
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月11日
發(fā)明者徐綏緒, 宋少江, 謝鳳瑛, 陸全才, 張國剛, 曹穎林 申請人:岐黃藥業(yè)科技投資有限責(zé)任公司, 沈陽藥科大學(xué)