專利名稱：三七皂苷Rgl在制備治療肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三七皂苷Rg1在制備治療肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathicpulmonary Fibrosis，IPF)是指不明原因引起的患者肺間質(zhì)病變，以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征。肺間質(zhì)纖維化常以呼吸功能永久喪失為最終結(jié)局，目前尚缺乏有效的防治手段，其嚴(yán)重威脅患者的生命和生活質(zhì)量，急性患者病情發(fā)展迅速，即便是早期發(fā)現(xiàn)開始治療，其5年生存率也很低；而慢性患者也大約只有15年左右的病程。
特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化和有明確病因的肺間質(zhì)纖維化(如感染、毒物、藥物、環(huán)境污染、粉塵等)的發(fā)病率和死亡率均較高，目前尚沒有特效藥物可用。我國肺間質(zhì)纖維化的年發(fā)病率不詳，但有年輕化和逐年增高的趨勢，根據(jù)數(shù)地肺科醫(yī)院的臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病率每年約增加50％～60％，30歲以下的患者約占整個發(fā)病人群的10％。
近年來，特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的臨床治療主要采用激素、免疫抑制劑、細(xì)胞毒類藥物(如硫哇嚷吟、環(huán)磷酞胺等)和抗纖維化制劑(如秋水仙堿、D-青霉胺等)單用或聯(lián)用，也嘗試采用了一些中藥、中草藥和偏方治療，但療效幾乎都沒有確定性；而有些藥物存在著嚴(yán)重的毒副作用(如激素類和細(xì)胞毒類藥物等)。目前，對于肺間質(zhì)纖維化的治療及逆轉(zhuǎn)其病理變化的發(fā)展還缺少可靠的藥物，因此，研究和開發(fā)治療肺間質(zhì)纖維化的有效藥物，對于改善患者的生存率和生存質(zhì)量有著重要的社會和經(jīng)濟(jì)的雙重價(jià)值。
三七是云南省盛產(chǎn)的名貴中藥材，屬五加科人參植物，目前已知三七中含有20多種不同成分，其中三七皂苷Rg1是主要成分之一。三七皂苷Rg1具有式I所示結(jié)構(gòu)，分子量為801.01，水溶性好。

式I 本發(fā)明人在以往的研究中發(fā)現(xiàn)三七皂苷Rg1單體具有抗腦缺血、增加腦血流量、改善微循環(huán)和抗血栓等作用；近期又經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該單體還具有良好的抗肺間質(zhì)纖維化作用。我國IPF發(fā)病率較高，目前尚無完全有效的藥物，而三七皂苷Rg1作用效果顯著，副作用少，具有較強(qiáng)的發(fā)展前景。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供三七皂苷Rg1在制備治療肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用，特別是三七皂苷Rg1在制備治療特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述藥物是指以三七皂苷Rg1為活性成分，與可藥用載體制成的醫(yī)療上可接受的制劑，如片劑、膠囊劑及注射劑等。
其中，所述片劑按重量份計(jì)的配方為三七皂苷Rg1100～300份、崩解劑8～150份、潤滑劑5～15份；所述崩解劑為微晶纖維素(MCC)、低取代羥丙基纖維素或羧甲基淀粉鈉；所述潤滑劑為硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇。此外，還可以包括120～360份矯味劑，所述矯味劑為乳糖。
制備方法將除潤滑劑之外的原料混合均勻，用水潤濕，過篩(16～20目)，干燥，然后再過篩(18～22目)，加入潤滑劑，混合均勻后壓片。
所述膠囊劑按重量份計(jì)的配方為三七皂苷Rg1100～300份、潤滑劑5～15份；所述潤滑劑為硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇。此外，還可以包括矯味劑80～240份，所述矯味劑為乳糖。
制備方法將除潤滑劑之外的各種原料混合均勻，用水潤濕，過篩(18～22目)，干燥，然后再次過篩(20～24目)，加入潤滑劑，混合均勻后裝入膠囊。
所述注射劑按重量份計(jì)的配方為三七皂苷Rg1200～600份、氯化鈉120～360份、注射用水500～1500份。
制備方法將三七皂苷Rg1和氯化鈉溶于注射用水中，攪拌溶解，過濾，在無菌條件下將濾液裝入安瓶中。
本發(fā)明通過體外細(xì)胞試驗(yàn)以及小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，進(jìn)一步說明了本發(fā)明的三七皂苷Rg1在制備治療肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用，特別是在制備治療肺間質(zhì)纖維化中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 1、本發(fā)明提供了三七皂苷Rg1單體新的醫(yī)療用途，開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域；三七皂苷Rg1單體對特發(fā)性肺間質(zhì)纖維素化及各種原因所致肺間質(zhì)纖維化均具有較好的治療效果。
2、三七皂苷Rg1的藥理作用明顯，主要表現(xiàn)為體外能抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的活性，有較好的劑量依賴性；體內(nèi)能降低肺間質(zhì)纖維化小鼠的肺系數(shù)和肺組織羥脯氨酸的含量；還能減輕肺間質(zhì)纖維化小鼠的肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度。
3、三七皂苷Rg1原料易得，且能夠通過常規(guī)方法制成各種常用劑型，如片劑、膠囊劑、注射劑等，制備方法簡單。



圖1為本發(fā)明中正常對照組的MRC-5細(xì)胞的形態(tài)。
圖2～8依次為本發(fā)明中不同濃度(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、320μmol/L)三七皂苷Rg1對MRC-5細(xì)胞作用24h后的細(xì)胞形態(tài)。

具體實(shí)施例方式 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明。
實(shí)施例1三七皂苷Rg1片劑的制備(1000片) 配方三七皂苷Rg1(昆明制藥廠，以下實(shí)施例均相同)100g、MCC 100g、硬脂酸鎂5g。
制備方法將三七皂苷Rg1、MCC混合均勻，用水潤濕，然后過18目篩，干燥，再次過20目篩，然后加入硬脂酸鎂，混合均勻，壓片。
實(shí)施例2三七皂苷Rg1片劑的制備(1000片) 配方三七皂苷Rg1100g、乳糖120g、羧甲基纖維素鈉24g、硬脂酸鎂5g。
制備方法將三七皂苷Rg1、乳糖及羧甲基纖維素鈉混合均勻，用水潤濕，然后過18目篩，干燥，再次過20目篩，然后加入硬脂酸鎂，混合均勻，壓片。
實(shí)施例3三七皂苷Rg1膠囊劑的制備(1000粒) 配方三七皂苷Rg1100g、乳糖80g、硬脂酸鎂5g。
制備方法將三七皂苷Rg1、乳糖混合均勻，用水潤濕，然后過20目篩，干燥，再次過22目篩，然后加入硬脂酸鎂，混合均勻，裝入膠囊。
實(shí)施例4三七皂苷Rg1注射劑的制備(100瓶) 配方三七皂苷Rg120g、氯化鈉12g、注射用水1.5L。
制備方法將三七皂苷Rg1、氯化鈉溶于注射用水中，過濾，將濾液在無菌條件下裝入安瓶中。
以下通過體外及體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
試驗(yàn)例1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 1、實(shí)驗(yàn)材料 1.1藥品與試劑胎牛血清(杭州四季青公司)、MEM培養(yǎng)液(Gibco公司)、胰酶(Gibco公司)、MTT(廣州威佳生物科技有限公司)；三七皂苷Rg1(白色粉末，純度＞98％，昆明制藥廠)。
1.2供試細(xì)胞人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞，上海中科院細(xì)胞庫)。
MRC-5細(xì)胞在含有10％(體積百分?jǐn)?shù))新生小牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中貼壁生長，在37℃的溫度下，5％(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶鋪滿時用2.5g/L胰酶消化傳代，細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期。
1.3儀器CO2培養(yǎng)箱(MCO-15AC，日本三洋)、Mk3型自動酶標(biāo)儀(美國Thermro公司)、倒置顯微鏡(XDS-200D，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。
1.4統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS-10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料均用x±s表示。
2、方法與結(jié)果 2.1配制三七皂苷Rg1藥物原液定量稱取8.01mg(0.01mmol)三七皂苷Rg1，加入1mL MEM培養(yǎng)液，配制成1×104μmol/L的三七皂苷Rg1藥物原液，備用。
2.2MTT法測定三七皂苷Rg1對MRC-5細(xì)胞的抑制作用取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)約5×103個/mL，接種于96孔板中，每孔液體100μL，細(xì)胞貼壁后傾去原液；然后加入含有0.5％(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，饑餓培養(yǎng)；24h后更換培養(yǎng)液，并加入藥物原液，分別配制成終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L三七皂苷Rg1的七個不同濃度劑量組，同時設(shè)置正常細(xì)胞作為對照組(每組設(shè)置6個復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24h；然后每孔加入15μL MTT，4h后傾去所有液體，加入115μL DMSO，使固體溶解，在37℃溫度下靜置0.5h；用自動酶標(biāo)儀在570nm的波長下檢測，630nm波長下參考；計(jì)算三七皂苷Rg1對MRC-5細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。
結(jié)果表明，三七皂苷Rg1對MRC-5細(xì)胞的IC50為81.26μmol/L，抑制率結(jié)果如表1所示。
表1不同濃度的三七皂苷Rg1對MRC-5細(xì)胞的抑制率
注抑制率＝(1-劑量組OD值/正常對照組OD值)×100％ 2.3倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×104個/mL，接種于96孔板中，每孔液體100μL，細(xì)胞貼壁后傾去原液；加入含0.5％(體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，饑餓培養(yǎng)；24h后更換培養(yǎng)液，并加入三七皂苷Rg1藥物原液，分別配制成終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L和320μmol/L的三七皂苷Rg1七個不同濃度劑量組，同時設(shè)置正常細(xì)胞作為對照組(每組設(shè)置6個復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，在倒置顯微鏡下(10×20)拍照(如圖1-8所示)。
觀察結(jié)果表明正常對照組(圖1)和5μmol/L劑量組(圖2)，MRC-5細(xì)胞呈條索狀，細(xì)胞形態(tài)正常；10μmol/L劑量組(圖3)和20μmol/L劑量組(圖4)，MRC-5細(xì)胞部分變形，出現(xiàn)空泡、死亡；40μmol/L劑量組(圖5)和80μmol/L劑量組(圖6)，MRC-5細(xì)胞多數(shù)呈球形，細(xì)胞死亡明顯；160μmol/L劑量組(圖7)和320μmol/L劑量組(圖8)，MRC-5細(xì)胞基本完全死亡，失去正常成纖維細(xì)胞形態(tài)。
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三七皂苷Rg1對MRC-5細(xì)胞具有抑制作用，且有良好的濃度依賴性。
試驗(yàn)例2小鼠體內(nèi)試驗(yàn) 1、試驗(yàn)材料 1.1藥品與試劑三七皂苷Rg1(白色粉末，純度＞98％，昆明制藥廠)、博來霉素(BLM，日本化藥株式會社)、強(qiáng)的松片(5mg/片，安陽玉威制藥廠)、羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2供試動物ICR小鼠，體重18～22g，共84只，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性藥物對照組(強(qiáng)的松)、三七皂苷Rg1高劑量組(100mg/kg)、中劑量組(50mg/kg)、低劑量組(25mg/kg)6組，每組14只。
1.3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS-10進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料均用x±s表示，采用方差分析，兩兩比較，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Duttet法，P＜0.05者有顯著性差異。
2、方法與結(jié)果 2.1肺間質(zhì)纖維化模型的建立 采用BLM誘導(dǎo)法，按5mg/kg對ICR小鼠一次氣管內(nèi)給予博來霉素。
2.2給藥方法 ICR小鼠于造模后第2天開始給藥，正常對照組和模型組給予蒸餾水，三七皂苷Rg1高劑量組、中劑量組、低劑量組均按設(shè)置劑量給藥，各組供試小鼠均按20mL/kg的容積進(jìn)行腹腔注射；陽性對照組給予強(qiáng)的松，給藥量6mg/kg，將藥品溶解后，按20mL/kg灌胃給藥； 實(shí)驗(yàn)藥物均為每天給藥1次，連續(xù)用藥至所需天數(shù)。在用藥后第7天處死一半小鼠，剩余小鼠于給藥后第28天全部處死。
2.3肺系數(shù)測定 處死小鼠后打開胸腔，取全肺，用濾紙吸干血跡稱體重和全肺重，按下式計(jì)算出肺系數(shù)，肺系數(shù)＝肺重(mg)/體重(g)。結(jié)果如表2所示。
表2三七皂苷Rg1用藥7天后對小鼠肺系數(shù)的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較；#P＜0.05，##P＜0.01與陽性對照組比較；模型組與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01 從表2可以看出用藥后7天，模型組與正常組比較有顯著性差異(P＜0.01)，證明模型成功；三七皂苷Rg1中劑量組和高劑量組與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對照組比較也有顯著性差異(P＜0.01)；結(jié)果表明，三七皂苷Rg1有良好的抗肺間質(zhì)纖維化作用，且優(yōu)于強(qiáng)的松。
2.4形態(tài)學(xué)研究 取右肺用10％甲醛溶液固定，取中肺葉制作肺組織病理標(biāo)本，用石蠟冷凍兩用切片機(jī)進(jìn)行石蠟連續(xù)切片，間隔2張取1張，每個標(biāo)本取4張切片，每2張為一組，分別進(jìn)行HE和Masson染色，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和肺泡炎及肺間質(zhì)纖維化評分。
2.4.1一般光鏡觀察正常組無肺泡炎及肺間質(zhì)纖維化改變，肺泡結(jié)構(gòu)完整；模型組肺泡壁破壞，形成肺大泡，部分實(shí)變，肺泡隔增寬明顯，有纖維結(jié)締組織增生，呈中重度肺間質(zhì)纖維化改變，淋巴細(xì)胞浸潤，病損范圍廣泛；陽性對照組肺泡隔增寬，有間質(zhì)水腫，部分小鼠肺內(nèi)有片狀壞死，灶性膿腫，偶有纖維結(jié)締組織增生，部分肺泡實(shí)變；三七皂苷Rg1組呈輕度肺間質(zhì)纖維化改變，病損范圍有限，少量淋巴細(xì)胞浸潤。
2.4.2肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度評價(jià)HE染色和Masson染色后，進(jìn)行光鏡觀察，根據(jù)以下判別標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行評分。肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度的判別標(biāo)準(zhǔn)(共4級)為0級無明顯改變；1級輕度改變，病變范圍小于全肺的20％；2級中度改變，病變范圍占全肺的20％～50％；3級重度改變，病變范圍占全肺的50％以上。然后分別進(jìn)行評分，0級計(jì)0分，1級計(jì)1分，以此類推；對每組小鼠分別評分，求平均值。結(jié)果如表3-4所示。
表3三七皂苷Rg1用藥7天后對小鼠肺組織肺泡炎程度的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較；#P＜0.05，##P＜0.01與陽性對照組比較；模型組與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01 表4三七皂苷Rg1用藥28天后對小鼠肺組織纖維化程度的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較；#P＜0.05，##P＜0.01與陽性對照組比較；模型組與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01 從表3-4可以看出，用藥后7天肺泡炎程度和28天肺間質(zhì)纖維化程度的模型組與正常組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，證明模型成功；用藥后7天，三七皂苷Rg1中劑量組和高劑量組肺泡炎評分均低于與模型組，兩者比較有顯著性差異(P＜0.01)；用藥后28天，三七皂苷Rg1中劑量組和高劑量組肺間質(zhì)纖維化評分均低于與模型組，兩者比較有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對照藥比較也有顯著性差異(P＜0.05)；結(jié)果表明，三七皂苷Rg1能改善顯著改善小鼠肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化的程度，有良好的抗肺間質(zhì)纖維化作用，且效果優(yōu)于強(qiáng)的松。
2.5肺組織羥脯氨酸(HyP)含量測定 用酸解法測定肺組織HyP含量，測定步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果如表5所示。
表5三七皂苷Rg1用藥28天后對小鼠肺組織羥脯氨酸含量的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較；#P＜0.05，##P＜0.01與陽性對照組比較；模型組與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01 從表5可以看出模型組與正常組比較有顯著性差異(P＜0.01)，證明模型成功；三七皂苷Rg1中劑量組和高劑量組均能降低羥脯氨酸含量與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，與陽性對照藥比較也有顯著性差異(P＜0.01)；結(jié)果表明，三七皂苷Rg1有良好的抗肺間質(zhì)纖維化作用，且效果優(yōu)于強(qiáng)的松。
雖然，上文中已經(jīng)通過一般性說明、具體實(shí)施方案以及活性實(shí)驗(yàn)等對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.三七皂苷Rg1在制備治療肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肺間質(zhì)纖維化為特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物是指三七皂苷Rg1與可藥用載體制成的片劑、膠囊劑及注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述片劑按重量份計(jì)的配方為三七皂苷Rg1 100～300份、崩解劑8～150份、潤滑劑5～15份；所述崩解劑為微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素或羧甲基淀粉鈉；所述潤滑劑為硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述片劑的配方還包括矯味劑120～360份；所述矯味劑為乳糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膠囊劑按重量計(jì)的配方為三七皂苷Rg1 100～300份、潤滑劑5～15份；所述潤滑劑為硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述膠囊劑的配方還包括矯味劑80～240份；所述矯味劑為乳糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述注射劑按重量份計(jì)的配方為三七皂苷Rg1 200～600份、氯化鈉120～360份、注射用水500～1500份。
全文摘要
本發(fā)明提供了三七皂苷Rg1在制備治療肺間質(zhì)纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)藥理試驗(yàn)驗(yàn)證，三七皂苷Rg1在體外能抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的活性，有較好的劑量依賴性；體內(nèi)能降低肺間質(zhì)纖維化小鼠的肺系數(shù)和肺組織羥脯氨酸的含量；還能減輕肺間質(zhì)纖維化小鼠的肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度；并且三七皂苷Rg1原料易得，能夠通過常規(guī)方法制成各種常用劑型，如片劑、膠囊劑、注射劑等，制備方法簡單。
文檔編號A61K31/704GK101757009SQ20101000073
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者詹合琴, 郭蘭青, 張小毅, 尹雅玲, 海廣范, 劉巨源, 劉俊扇 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院