專利名稱：：蛋白酶變體及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的適用于配制洗滌劑組合物并在洗滌劑中顯示改良的洗滌性能的突變蛋白酶或酶變體，其在一個或多個活性位點環(huán)處含有插入；含有該酶的清潔和洗滌劑組合物；插入到合適的宿主細胞或生物體中時編碼表達該酶的突變基因；以及已被突變基因轉(zhuǎn)化并能夠表達該酶變體的宿主細胞。
背景技術(shù)：
：在洗滌劑工業(yè)中，酶在洗滌配方中已經(jīng)被應(yīng)用超過30年。用于這些制劑的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶以及其它酶，或者它們的混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。越來越多的商業(yè)上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程變體，如DURAZYM_(NovoNordiskA／S)、RELASE_(NovoNordiskA／S)、MAXAPEM_(Gist-BrocadesN．V．)、PURAFECT_(Genencor國際有限公司)。還有許多蛋白酶變體在本領(lǐng)域中已有描述，如EP130756(GENENTECH)(相應(yīng)于美國再頒專利34，606(GENENCOR))；EP214435(HENKEL)；WO87／04461(AMGEN)；WO87／05050(GENEX)；EP260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然(Nature)318375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物學雜志(J．Mol．Bilo)193803-813；Russell和Fersht(1987)自然328496-500(1987)；WO88／08028(Genex)；WO88／08033(AMGEN)；WO95／27049(SOLVAYS．A．)；WO95／30011(PROCTER&amp;GAMBLE公司；WO95／30010(PROCTER＆GAMBLE公司)；WO95／29979(PROCTER&amp;GAMBLE公司)；US5．543．302(SOLVAYSA．)；EP251446(GENENCOR)；WO89／06279(NovoNordiskA／S)；WO91／00345(NovoNordiskA／S)；EP525610Al(SOLVAY)和WO94／02618(GIST-BROCADESN．V．)。然而，盡管已經(jīng)描述了許多有用的蛋白酶變體，許多工業(yè)用途仍然需要新的改良的蛋白酶或蛋白酶變體。因此，本發(fā)明的目的是提供改良的蛋白酶或蛋白質(zhì)工程化蛋白酶變體，尤其是用于洗滌劑工業(yè)。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在BLSAVI的至少一個活性位點環(huán)處引入至少一個插入，可以構(gòu)建成與親本野生型BLSAVI相比在洗滌劑中的洗滌性能有所改良的BLSAVI變體(SAVINASE_)。推測有可能制備與BLSAVI類似的其它枯草桿菌酶(subtilase)的類似變體。此外，預(yù)計通過特異地篩選含有至少一個比BLSAVI內(nèi)相應(yīng)活性位點環(huán)更長的活性位點環(huán)的這種親本野生型枯草桿菌酶，有可能從自然界分離并鑒定出在洗滌劑中的洗滌性能有所改良的天然親本或野生型枯草桿菌酶。因此，本發(fā)明一方面涉及與BLSAVI相比在洗滌劑中的洗滌性能有所改良、并且氨基酸序列與成熟BLSAVI的氨基酸序列有至少40％相同的分離枯草桿菌酶，其特征在于所述分離枯草桿菌酶的至少一個活性位點環(huán)比BLSAVI內(nèi)的相應(yīng)活性位點環(huán)更長，從而所述分離枯草桿菌酶內(nèi)的這種活性位點環(huán)區(qū)最小氨基酸長度如下組所示(a)氨基酸殘基33-43之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有11個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(b)氨基酸殘基95-103之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有9個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(c)氨基酸殘基125-132之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有8個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(d)氨基酸殘基153-173之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有21個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(e)氨基酸殘基181-195之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有15個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(f)氨基酸殘基202-204之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有3個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；和(g)氨基酸殘基218-219之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有3個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)。本發(fā)明第二方面涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列。本發(fā)明第三方面涉及含有編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列的表達載體。本發(fā)明第四方面涉及轉(zhuǎn)化了第三方面的表達載體的微生物宿主細胞。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶的生產(chǎn)方法，包括將第三方面的表達載體插入到合適的微生物宿主中，培養(yǎng)宿主以表達需要的枯草桿菌酶，并回收酶產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶變體的組合物。最后本發(fā)明涉及突變酶在許多工業(yè)相關(guān)應(yīng)用中的用途，特別是在清潔組合物中的用途，本發(fā)明還涉及含有突變酶的清潔組合物，尤其是含有突變枯草桿菌蛋白酶的洗滌劑組合物。定義在進一步詳細論述本發(fā)明之前，先定義下列術(shù)語。氨基酸的命名A=Ala=丙氨酸V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸I=Ile=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬酰胺Q=Gln=谷氨酰胺D=Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸H=His=組氨酸X=Xaa=任何氨基酸核酸命名A=腺嘌呤G=鳥嘌呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧啶(只存在于DNA中)U=尿嘧啶(只存在于RNA中)變體的命名在描述本發(fā)明產(chǎn)生或包括的各種酶變體時，采用以下命名法以便簡化原始氨基酸位點取代氨基酸在原始氨基酸可以是任何氨基酸殘基的情況下，有時可以使用簡寫符號，只表示位點和取代氨基酸位點取代氨基酸這種符號在表示同源枯草桿菌酶內(nèi)的修飾時尤其合適(見下文)。類似地，當取代氨基酸殘基的身份不明確時，表示為原始氨基酸位點當原始氨基酸和取代氨基酸都可能是任何氨基酸時，則僅表示位點，如170。當原始氨基酸和／或取代氨基酸可包括一種以上氨基酸但非所有氨基酸時，則可選的氨基酸表示于括號{}中原始氨基酸位點{取代氨基酸1，…，取代氨基酸n}對于特定的變體，使用特異的三字母或單字母符號，包括用Xaa和X表示任何氨基酸殘基。取代在位點195由谷氨酸取代甘氨酸被記做Gly195Glu或G195E在位點195由任何氨基酸取代甘氨酸被記做Glv195Xaa或G195X，或者Gly195或G195因此在位點170由絲氨酸取代任何氨基酸殘基記作Xaa170Ser或X170S，或者170Ser或170S這種符號在表示同源枯草桿菌酶內(nèi)的修飾時尤其合適(見下文)。因此，170Ser意指包括例如BASBPN內(nèi)的Lys170Ser修飾和BLSAVI內(nèi)的Arg170Ser修飾。有關(guān)這些實例參見圖1。對于原始氨基酸和／或取代氨基酸可包括一種以上氨基酸但非所有氨基酸的修飾，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸取代170位的精氨酸可記作Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}以表示變體R170G，R170A，R170S，R170T。刪除195位的甘氨酸被刪除記做Gly195*或G195*相應(yīng)地，一個以上氨基酸殘基的刪除，如195和196位的甘氨酸和亮氨酸的刪除記作Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入一個額外的氨基酸殘基的插入如G195后插入賴氨酸記做Gly195GlyLys或G195GK；或者當插入一個以上氨基酸殘基時，如G195后插入賴氨酸、丙氨酸和絲氨酸，可記作Gly195GlyLysAlaSer或G195GKAS在這樣的情況下，插入的氨基酸殘基的編號用該插入氨基酸前的氨基酸殘基位點號加上小寫字母表示。在上述實例中，序列194-196可記作194195196BLSAVIA-G-L194195195a195b195c196變體A-G-K-A-S-L如果插入一個與已有氨基酸殘基相同的氨基酸殘基，顯然在命名上可以有幾種方式。例如，在上述實例中，在甘氨酸后插入一個甘氨酸可表示為G195GG。這一相同的改變也可以表示為A194AG，顯示由194195196BLSAVIA-G-L改變?yōu)?94195195a196變體A-G-G-L194194a195196這樣的情形是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，因此G195GG和表示同一類型插入的相應(yīng)記法意指包括這樣的等同簡并記法。缺口的填充當一種酶與用于編號的枯草桿菌蛋白酶序列相比存在刪除時，在該位點的插入記法類似于用*36Asp或*36D表示天冬氨酸在位點36的插入。多重修飾含有多重修飾的變體用加號分開，如Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E表示在位點170和195分別用酪氨酸和谷氨酸取代精氨酸和甘氨酸的修飾。或者例如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示變體Tyr167Gly+Arg170Gly，Tyr167Gly+Arg170Ala，Tyr167Gly+Arg170Ser，Tyr167Gly+Arg170Thr，Tyr167Ala+Arg170Gly，Tyr167A1a+Arg170Ala，Tyr167Ala+Arg170Ser，Tyr167Ala+Arg170Thr，Tyr167Ser+Arg170Gly，Tyr167Ser+Arg170Ala，Tyr167Ser+Arg170Ser，Tyr167Ser+Arg170Thr，Tyr167Thr+Arg170Gly，Tyr167Thr+Arg170Ala，Tyr167Thr+Arg170Ser，和Tyr167Thr+Arg170Thr．在表示有關(guān)具有特定的共同特征的氨基酸殘基的取代、替換、插入或刪除，例如帶正電荷的殘基(K，R，H)、帶負電荷的殘基(D，E)或保守氨基酸修飾時，這種命名法特別有用，例如Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示用小氨基酸取代另一小氨基酸。詳細內(nèi)容參見“發(fā)明詳述”部分。蛋白酶將能切開蛋白質(zhì)底物中酰氨鍵的酶歸類為蛋白酶或肽酶(可互換使用)(參閱Walsh，1979，酶反應(yīng)機制(EnzymaticReactionMechanisms)，W．H．FreemanandCompany，舊金山，第三章)。氨基酸位點／殘基的編號如果沒有特別指出，本文使用的氨基酸編號相應(yīng)于枯草桿菌酶BPN，(BASBPN)序列的編號。BPN’序列的進一步描述參閱Siezen等人，蛋白質(zhì)工程(ProteinEngng．)4(1991)719-737和圖1。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是指能催化肽鍵水解，并且在其活性位點存在必需絲氨酸殘基的酶(White，Handler和Smith，1973“生化原理”(PrinciplesofBiochemistry)，第五版，McGraw-Hill書籍公司，紐約，第271-272頁)。細菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍為20，000-45，000道爾頓。它們被二異丙基氟磷酸鹽抑制。它們水解簡單的末端酯，而且與真核生物的糜蛋白酶(也是絲氨酸蛋白酶)的活性相似。范圍更窄的術(shù)語-堿性蛋白酶(包括一個亞組)反映了一些絲氨酸蛋白酶最適pH高，從pH9．0到11．0(有關(guān)綜述參閱Priest(1977)細菌學回顧(BacteriologicalRev．)41711-753)。枯草桿菌酶絲氨酸蛋白酶的一個暫時命名為枯草桿菌酶的亞組，由Siezen等人[蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737]提出。它們由對40多種絲氨酸蛋白酶(以前被稱作類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-likeprotease))的氨基酸序列同源分析確定?？莶輻U菌蛋白酶以前被定義為由革蘭氏陽性細菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人的定義，它是枯草桿菌酶的一個亞組。已經(jīng)鑒定了多種枯草桿菌酶，而且許多枯草桿菌酶的氨基酸序列已經(jīng)測定。關(guān)于這些枯草桿菌酶更詳細的描述和它們的氨基酸序列參閱Siezen等人的文獻和本文圖1。枯草桿菌酶的一個亞組，I-S1，包括“經(jīng)典的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE_，NovoNordiskA／S)和枯草桿菌蛋白酶DY。由Siezen等人(見上文)劃分了枯草桿菌酶的另一個亞組，I-S2。I-S2亞組蛋白酶被描述成高度堿性的枯草桿菌蛋白酶，包括如枯草桿菌蛋白酶PB92(MAXACAL_，Gist-BrocadesNV)、枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE_，NovoNordiskA／S)、枯草桿菌蛋白酶147(ESPERASE_，NovoNordiskA／S)和堿性彈性蛋白酶YaB?！癝AVINASE_”SAVINASE_由NovoNordiskA／S出售。它是來源于遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶309，而且與BABP92只在一個位點不同(N87S，參閱本文圖1)。SAVINASE_具有命名為BLSAVI的氨基酸序列(參見本文圖1)。親本枯草桿菌酶術(shù)語“親本枯草桿菌酶”指根據(jù)Siezen等人(蛋白質(zhì)工程4719-737(1991))定義的枯草桿菌酶。進一步細節(jié)參閱上文“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是由天然來源分離得到的枯草桿菌酶，隨后進行了修飾而同時保留了枯草桿菌酶的特征。術(shù)語“親本枯草桿菌酶”或者可以稱作“野生型枯草桿菌酶”?？莶輻U菌酶變體的修飾本文討論的枯草桿菌酶變體修飾中使用的術(shù)語“修飾”被定義為包括化學修飾以及基因操作。修飾可以是在感興趣的氨基酸位點處的取代、刪除和／或插入?？莶輻U菌酶變體在本文中，術(shù)語枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該突變基因來源于具有原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物，其中親本基因已經(jīng)被突變以得到在合適的宿主中表達時產(chǎn)生突變枯草桿菌酶的突變基因。同源枯草桿菌酶序列本文鑒定了枯草桿菌酶SAVINASE_中的特異活性位點環(huán)區(qū)以及所述環(huán)中進行修飾的氨基酸插入以得到本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。然而，本發(fā)明并不限于這種特殊枯草桿菌酶的修飾，而可以擴展到與SAVINASE_有同源的一級結(jié)構(gòu)的其它親本(野生型)枯草桿菌酶。為了鑒定其它同源枯草桿菌酶，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，進行了枯草桿菌酶與以前對比的一組枯草桿菌酶的對比，并保持以前的對比不變。進行了枯草桿菌酶中18個高度保守殘基的比較。這18個高度保守殘基列于表Ⅰ(關(guān)于這些保守殘基的進一步細節(jié)參閱siezen等人)。表Ⅰ枯草桿菌酶中的18個高度保守殘基在進行了對比之后(為了實現(xiàn)對比，允許必要的插入和刪除)，鑒定出了合適的同源活性位點環(huán)區(qū)。然后該同源殘基可以根據(jù)本發(fā)明進行修飾。使用CLUSTALW(第1．7版，1997年6月)電腦對比程序(J．D．Thompson，D．Gmiggins和TJ．Gibson(1994)核酸研究(NucleicAcidResearch)，224673-4680)，利用系統(tǒng)設(shè)定對比參數(shù)，采用程序中的特征對比(Profilealignments)選項進行給定枯草桿菌酶與以前對比的枯草桿菌酶組中的對比。對于在本發(fā)明范圍中的給定枯草桿菌酶，優(yōu)選18個高度保守殘基100％保守。然而，在18個殘基中多于或等于17的對比，或少至16個保守殘基的對比也足夠用于鑒定同源殘基。在枯草桿菌酶中，應(yīng)當維持催化三組合Asp32／His64／Ser221的保守性。圖1顯示了10種枯草桿菌酶的對比。在本發(fā)明范圍內(nèi)鑒定同源親本(野生型)枯草桿菌酶的該過程中，上述18個保守殘基指的是所述同源親本枯草桿菌酶的親本(野生型)一級序列。也就是說，如果親本枯草桿菌酶在上述18個保守殘基的任何位置處存在修飾，則它是18個保守殘基的原始親本野生型序列，由它確定原始親本枯草桿菌酶和在上述18個保守殘基的任何位置有修飾的枯草桿菌酶變體是否在本發(fā)明范圍內(nèi)是同源的枯草桿菌酶。在此描述的基礎(chǔ)上；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地鑒定出合適的同源枯草桿菌酶以及可以根據(jù)本發(fā)明修飾的相應(yīng)的同源活性位點環(huán)區(qū)。洗滌性能酶在例如清洗過程中催化待清洗物體上的各種天然存在底物的降解的能力，通常被稱作它的洗滌能力(washingability)、可洗力(washability)、去垢力(detergency)或洗滌性能(washperformance)。在本申請中，用術(shù)語洗滌性能表示這種特性。分離DNA序列術(shù)語“分離的”，當應(yīng)用于DNA序列分子時，表示該DNA序列已從其天然遺傳環(huán)境中取出并且因而不含其它無關(guān)的或多余的編碼序列，而且以適合于在基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式存在。這些分離分子是與其天然環(huán)境分開的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含它們最初與之相關(guān)的其它基因，但是可能包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)如啟動子和終止子。這些相關(guān)區(qū)域的鑒定顯然是本領(lǐng)域的基本技術(shù)之一(參閱如Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。術(shù)語“分離DNA序列”也可稱作“克隆DNA序列”。分離蛋白質(zhì)當應(yīng)用于蛋白質(zhì)時，術(shù)語“分離的”說明該蛋白質(zhì)存在于不同于它的天然環(huán)境的條件下。分離蛋白質(zhì)優(yōu)選基本不含其它蛋白質(zhì)，尤其是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(見下文))。分離蛋白質(zhì)由SDS-PAGE測定純度高于10％，優(yōu)選高于20％，更優(yōu)選高于30％。優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質(zhì)，即由SDS-PAGE鑒定純度高于40％、純度高于60％、純度高于80％，更優(yōu)選純度高于95％，甚至更優(yōu)選純度高于99％。術(shù)語“分離蛋白質(zhì)”也可稱作“純化蛋白質(zhì)”。同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”指來自本發(fā)明多肽最初來源的同源細胞中的任何雜質(zhì)(如除本發(fā)明多肽外的另一種多肽)。來源于如本文與特殊微生物來源一起使用的術(shù)語“來源于”，指多核苷酸和／或多肽由特殊來源、或由插入了來自該來源的基因的細胞產(chǎn)生。底物術(shù)語“底物”與蛋白酶底物有關(guān)的使用，應(yīng)當被理解為其范圍最寬的形式，如含有至少一個易被蛋白酶水解的肽鍵的化合物。產(chǎn)物術(shù)語“產(chǎn)物”與來源于蛋白酶酶反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)的使用在本文中應(yīng)當被理解為包括涉及枯草桿菌酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可能是下一個水解反應(yīng)的底物。圖的簡要描述圖1顯示了10種同源枯草桿菌酶根據(jù)枯草桿菌酶中18個高度保守殘基的對比。這18個高度保守殘基以粗體標明。所有顯示的枯草桿菌酶，除了JP170外，在保守殘基處100％相同。JP170在位點146處是天冬氨酸“N”而不是保守的甘氨酸殘基“G”。圖2顯示本發(fā)明的三種枯草桿菌酶變體與圖1所示對比的對比。每種變體37．03、37．04和37．06均單獨與圖1的對比進行對比。所有三種變體示于同一圖中以便簡化。圖3顯示枯草桿菌酶(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)錄入號1SVN)的三維結(jié)構(gòu)。此圖顯示了本文感興趣的活性位點環(huán)。發(fā)明詳述具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體本發(fā)明的枯草桿菌酶一般性地描述于前面的“發(fā)明概述”部分。本發(fā)明第一方面的枯草桿菌酶可以是在自然界鑒定出的親本野生型枯草桿菌酶。這樣的親本野生型枯草桿菌酶可以通過本領(lǐng)域熟知的標準技術(shù)特異地篩選出來。完成這項工作的一種優(yōu)選途徑是從各種不同的微生物、優(yōu)選不同的芽孢桿菌菌株P(guān)CR特異性擴增已知編碼枯草桿菌酶的活性位點環(huán)的DNA區(qū)?？莶輻U菌酶是一組保守的酶，因為它們的DNA和氨基酸序列有同源性。因此，有可能構(gòu)建活性位點環(huán)側(cè)翼的相對特異引物。例如，通過分析不同枯草桿菌酶的對比(參見例如Siezen等人，蛋白質(zhì)科學(ProteinScience)，6501-523，1997)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地構(gòu)建例如對應(yīng)于BLSAVI的氨基酸殘基95-103之間的活性位點環(huán)的活性位點環(huán)側(cè)翼的PCR引物。利用這些引物，從不同的微生物，優(yōu)選不同的芽孢桿菌菌株擴增DNA，隨后對擴增出的PCR片段進行DNA測序，有可能鑒定出能生產(chǎn)含有相當于BLSAVI內(nèi)95-103的活性位點區(qū)、但更長的活性位點區(qū)的枯草桿菌酶的那些菌株。鑒定出菌株及感興趣的枯草桿菌酶的部分DNA序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地完成目的枯草桿菌酶的克隆、表達和純化。然而，預(yù)計本發(fā)明枯草桿菌酶主要是親本枯草桿菌酶的變體。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及本發(fā)明第一方面的分離枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是一種構(gòu)建變體，根據(jù)本發(fā)明第一方面，該變體在至少一個活性位點環(huán)內(nèi)含有至少一個氨基酸的至少一個插入。本發(fā)明的枯草桿菌酶在洗滌劑中具有比BLSAVI(Savinase_)有所改善的洗滌性能。不同的市售枯草桿菌酶蛋白酶產(chǎn)品在不同類型的洗滌劑組合物中將具有不同的洗滌性能。本發(fā)明的枯草桿菌酶在大多數(shù)不同類型的洗滌劑組合物中具有比BLSAVI有所改善的洗滌性能。優(yōu)選本發(fā)明的枯草桿菌酶在本文實施例3所示的洗滌劑組合物(見下文)中具有比BLSAVI有所改善的洗滌性能。為鑒定一種給定的枯草桿菌酶氨基酸序列(不論該枯草桿菌酶序列是分離自自然界的野生型枯草桿菌酶序列還是枯草桿菌酶變體序列)是否在本發(fā)明枯草桿菌酶序列的范圍之內(nèi)，可以進行下述步驟ⅰ)確定所述枯草桿菌酶序列與枯草桿菌酶BLSAVI第1-275位的氨基酸序列(BASBPN編號法)是否有至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者甚至95％相同；ⅱ)如果完成了步驟ⅰ)，則對所述枯草桿菌酶與圖1所列的枯草桿菌酶以前的對比進行對比(參見本文“定義”部分(見上文)，以明確該對比最好如何進行)；ⅲ)根據(jù)步驟ⅱ)進行的對比，鑒定出所述枯草桿菌酶序列中對應(yīng)于BLSAVI中下述活性位點環(huán)區(qū)的活性位點環(huán)(按照BASBPN編號法)(a)氨基酸殘基33-43之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；(b)氨基酸殘基95-103之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；(c)氨基酸殘基125-132之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；(d)氨基酸殘基153-173之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；(e)氨基酸殘基181-95之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；(f)氨基酸殘基202-204之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；和(g)氨基酸殘基218-219之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)；ⅳ)確定步驟ⅲ)中鑒定出的所述枯草桿菌酶序列中的一個或多個活性位點環(huán)是否比BLSAVI中的相應(yīng)活性位點環(huán)更長。如果一種枯草桿菌酶序列滿足步驟ⅳ)的標準，則該枯草桿菌酶是本發(fā)明范圍內(nèi)的枯草桿菌酶序列。按下文所述計算上述步驟ⅰ)中指示的本發(fā)明枯草桿菌酶和BLSAVI之間的相同性。本發(fā)明枯草桿菌酶氨基酸序列與BLSAVI之間的相同性上文所指的多肽相同性確定為兩個序列之間的相同性程度，顯示第一個序列由第二個序列派生的關(guān)系。相同性程度可以通過本領(lǐng)域熟知的計算機程序，例如GCG程序包(ProgramMannalfortheWisconsinPackage，第8版，1994年8月，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S．B．和Wunsch，C．D．(1970)，分子生物學雜志，48，443-453)提供的GAP合適地確定。利用下述設(shè)置的GAP進行多肽序列比較缺口產(chǎn)生罰分3．0，缺口延伸罰分0．1，確定本發(fā)明枯草桿菌酶氨基酸序列的成熟部分與BLSAVI第1-275位(BASBPN編號法)的氨基酸序列成熟部分是否有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者甚至95％相同。因此，相同性應(yīng)定義為相同殘基數(shù)除以269的值(BLSAVI成熟部分有269個氨基酸)。上述步驟ⅱ)中的對比如下述進行本發(fā)明枯草桿菌酶氨基酸序列與以前確定的同源枯草桿菌酶序列之間的對比的對比(上述步驟ⅱ))，以及確定所述枯草桿菌酶內(nèi)對應(yīng)于BLSAVI中的活性位點環(huán)區(qū)的同源活性位點環(huán)(上述步驟ⅲ))為鑒定本發(fā)明范圍內(nèi)的其它同源枯草桿菌酶，在保持以前的對比不變的同時將所述枯草桿菌酶與以前對比的一組枯草桿菌酶進行對比(上述步驟ⅱ))。使用CLUSTALW(第1．7版，1995年6月)電腦對比程序(J．D．Thompson，D．G．Higgins和T．J．Gibson(1994)核酸研究(NucleicAcidResearch)，224673-4680)，采用系統(tǒng)設(shè)定對比參數(shù)，用程序中的特征對比(Profilealignment)選項完成給定枯草桿菌酶與以前對比的一組枯草桿菌酶的對比。應(yīng)該保持枯草桿菌酶中催化性三組合Asp32／His64／Ser221的保守性。圖1顯示了上面確定的一組枯草桿菌酶的對比。在允許必要的插入和刪除以維持該對比而進行對比之后，按上文步驟ⅲ)所述在本發(fā)明枯草桿菌酶中鑒定出合適的同源活性位點環(huán)。根據(jù)上文描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地鑒定出合適的同源枯草桿菌酶以及所述枯草桿菌酶中相應(yīng)的同源的合適活性位點環(huán)。所描述的本發(fā)明枯草桿菌酶的優(yōu)選活性位點環(huán)是下文定義的環(huán)b)氨基酸殘基95-103之間的區(qū)(包括兩末端氨基酸在內(nèi))至少長10個氨基酸(即與BLSAVI相比，至少有一個氨基酸插入)；和c)氨基酸殘基125-132之間的區(qū)(包括兩末端氨基酸在內(nèi))至少長9個氨基酸(即與BLSAVI相比，至少有一個氨基酸插入)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)，如定點／隨機誘變或不同枯草桿菌酶序列的DNA重排構(gòu)建枯草桿菌酶變體。進一步的細節(jié)參閱“生產(chǎn)枯草桿菌酶變體”部分以及本文的材料與方法(見下文)。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及1．根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自T、G、A和S；2．根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自帶電氨基酸殘基D、E、H、K和R，更優(yōu)選選自D、E、K和R；3．根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選選自N、Q、S和T；4．根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自小的疏水性氨基酸殘基A、G和V；或5．根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自大的親水性氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y，更優(yōu)選選自F、I、L、M和Y。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中至少一個活性位點環(huán)中的所述插入與BLSAVI內(nèi)的相應(yīng)活性位點環(huán)相比包含有至少兩個氨基酸。在進一步的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶包含選自下組的至少一個插入(BASBPN編號法)G97GASGG97GAA；和G97GAS；以及根據(jù)本發(fā)明的一種分離枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶包含有選自下組的至少一個插入／修飾(BASBPN編號法)37．03G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A；37．04G97GAS+A98S+S99G；和37．06G97GAA+A98S+S99G+S101T。圖2顯示了后三種變體在殘基91-107之間的對比。本領(lǐng)域內(nèi)熟知一個氨基酸被類似的保守氨基酸取代通常只引起酶特性的微小改變。下面的表Ⅱ列出了幾組保守氨基酸。表Ⅱ保守氨基酸取代堿性的R=精氨酸K=賴氨酸H=組氨酸酸性的E=谷氨酸D=天冬氨酸極性的Q=谷氨酰胺N=天冬酰胺疏水性的L=亮氨酸I=異亮氨酸V=纈氨酸M=甲硫氨酸芳香族的F=苯丙氨酸W=色氨酸Y=酪氨酸小的G=甘氨酸A=丙氨酸S=絲氨酸T=蘇氨酸因此，枯草桿菌酶變體如G97GGG+A98S+S99G預(yù)計具有與變體G97GAA+A98S+S99G相似的洗滌性能改良。參見例如本文有關(guān)所述G97GAA+A98S+S99G變體的特異洗滌性能測試的實施例。根據(jù)本文公開的、尤其是舉例的枯草桿菌酶變體，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所有方面和實施方案可以常規(guī)地鑒定出尤其是舉例說明的變體的其它適當?shù)谋Ｊ匦揎?，以獲得具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體。在本發(fā)明的實施方案中，感興趣的是那些屬于I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶。關(guān)于I-S1亞組，優(yōu)選的親本枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR或它們的保留了I-S1亞組特征的功能性變體。關(guān)于I-S2亞組，優(yōu)選的親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLSAVI、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB或它們的保留了I-S2亞組特征的功能性變體。更具體地說，所述親本枯草桿菌酶是BLSAVI(SAVINASE_，NOVONORDISKA／S)或者與其95％或更多相同的枯草桿菌酶，因此本發(fā)明的優(yōu)選枯草桿菌酶變體是SAVINASE_或者與其95％或更多相同的枯草桿菌酶的變體。本發(fā)明還包括上述位點處的任何一個或多個修飾與對親本酶氨基酸序列的任何其它修飾的組合。尤其包括與本領(lǐng)域所知的用以改良酶特性的其它修飾的組合。本領(lǐng)域描述了許多具有不同改良特性的枯草桿菌酶變體，其中一部分在本文“發(fā)明背景”部分中提及(見上文)。那些參考文獻在本文公開，作為鑒定可以有利地與本發(fā)明枯草桿菌酶變體相組合的枯草桿菌酶變體的參考。這些組合包括位點222(改善氧化穩(wěn)定性)和218(改善熱穩(wěn)定性)，Ca結(jié)合位點內(nèi)的取代使酶穩(wěn)定，如位點76，和現(xiàn)有技術(shù)已知的許多其它修飾。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以有利地與下列任何位點處的一個或多個修飾組合27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。特別地，下面的BLS309和BAPB92變體被認為適合于組合K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。另外，包括V104N+S101G、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V1041或N76D+V104A變異或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合的任何變異與任何一個或多個上文提及的修飾組合的變體具有改良的特性。此外，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與129、131、133和194中任何位點處的一個或多個修飾(更優(yōu)選129K、131H、133P、133D和194P修飾，最優(yōu)選P129K、P131H、A133P、A133D和A194P修飾)組合。那些修飾中的任何一種都使本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的表達水平更高。因此，本發(fā)明更進一步的實施方案涉及本發(fā)明的變體，其中所述修飾選自下組Y167A+R170S+A194PY167A+R170L+A194PYt67A+R170N+A194PY167A+R170S+P129KY167A+R170L+P129KY167A+R170N+P129KY167A+R170S+P131HY167A+R170L+P131HY167A+R170N+P131HY167A+R170S+A133PY167A+R170L+A133PY167A+R170N+A133PY167A+R170S+A133DY167A+R170L+A133DY167A+R170N+A133D產(chǎn)生枯草桿菌酶變體用于克隆本發(fā)明的枯草桿菌酶和用于將插入引入基因(如枯草桿菌酶基因)的許多方法在本領(lǐng)域中是眾所周知。通常，可以使用克隆基因和在該基因中引入插入(隨機和／或定點)的標準方法得到本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。關(guān)于合適技術(shù)的進一步描述參閱本文實施例(見下文)和(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；F．M．Ausubel等人(主編)“分子生物學的最新方法”，JohnWileyandSons，1995；C．R．Harwood和S．M．Cutting(主編)“芽孢桿菌的分子生物學方法”，JohnWileyandSons，(1990)；和WO96／34946)。此外，本發(fā)明枯草桿菌酶變體可以通過不同枯草桿菌酶基因的DNA重排標準技術(shù)構(gòu)建(WO95／22625；StemmerWPC，自然370389-91，1994)。例如將Savinase_與自然界中鑒定出的包含比Savinase_活性位點環(huán)區(qū)更長的相應(yīng)區(qū)的一或多個枯草桿菌酶部分序列的DNA重排，隨后篩選洗滌性能有所改善的變體，可以提供本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。表達載體含有編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組表達載體可以是能夠方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于它將要導入的宿主細胞。由此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即以染色體外實體形式存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。或者，載體可以是這樣一種類型，當它被導入到宿主細胞中時，會部分或全部整合到宿主細胞基因組中，并與整合的染色體一起復(fù)制。載體優(yōu)選是表達載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地連接了DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加區(qū)段。一般來說，表達載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或者可以含有二者的元件。術(shù)語“可操作地連接”指的是諸區(qū)段的排列方式使得它們能夠行使與預(yù)期用途(如轉(zhuǎn)錄由啟動子起始并貫穿編碼酶的DNA序列)一致的功能。啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以來源于編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。適用于細菌宿主細胞的啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動子，或者λ噬菌體PR或PL啟動子，或者大腸桿菌lac、trp或tac啟動子。如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以可操作地連接合適的終止子。本發(fā)明的重組載體還可以含有使載體能夠在所選宿主細胞中復(fù)制的DNA序列。載體還可以含有選擇標記，如其產(chǎn)物補償宿主細胞缺陷的基因，或者編碼對卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉榱藢⒈景l(fā)明的酶導入宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱作前導序列、前體序列或前序列)。分泌信號序列以正確的閱讀框架與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號序列通常位于編碼酶的DNA序列的5’端。分泌信號序列可以是通常與酶有關(guān)的序列或可以來自編碼其它分泌蛋白的基因。用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動子和任選終止子和／或分泌信號序列，或用適當?shù)腜CR擴增方案將這些序列裝配起來，和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的合適載體的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參閱如Sambrook等人，出處同上)。宿主細胞導入宿主細胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以是與所選宿主同源或異源的序列。如果與宿主細胞同源，即由宿主細胞天然產(chǎn)生的，則通常將它可操作地連接另一個啟動子序列，或者如果可行的話，可連接另一分泌信號序列和／或終止子序列從而不處于其天然環(huán)境下。術(shù)語“同源”意指包括編碼所選宿主生物天然的酶的DNA序列。術(shù)語“異源”意指包括宿主細胞天然不表達的DNA序列。因此，DNA序列可以來自另一種生物體，或者可以是合成序列。待導入本發(fā)明DNA構(gòu)建體或重組載體的宿主細胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的任何細胞，包括細菌、酵母、真菌和高等真核細胞。經(jīng)過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的細菌宿主細胞的例子是革蘭氏陽性細菌，如芽孢桿菌屬的菌株，諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株，或鏈霉菌屬的菌株，諸如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細菌諸如大腸桿菌。細菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或通過感受態(tài)細胞以已知的方式進行(參閱Sambrook等人，見上文)。當在細菌諸如大腸桿菌中進行表達時，酶可以保留在細胞質(zhì)中，通常以不溶性顆粒存在(稱為包涵體)，或可以被細菌分泌序列引導到周質(zhì)空間。在前一種情況中，裂解細胞，回收顆粒，變性，然后稀釋變性劑使酶重新折疊。在后一種情況中，酶可以從周質(zhì)空間回收，如用超聲波或滲透休克破碎細胞，以釋放周質(zhì)空間的成分，并回收酶。當在革蘭氏陽性細菌諸如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株中表達酶時，酶可以保留在細胞質(zhì)中，或可以被細菌分泌序列引導到細胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況中，酶可以如下文所述從培養(yǎng)基中回收。生產(chǎn)枯草桿菌酶的方法本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明分離酶的方法，其中將轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細胞在允許酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的酶。當含有編碼酶的DNA序列的表達載體被轉(zhuǎn)化到異源宿主細胞中時，有可能異源重組產(chǎn)生本發(fā)明的酶。由此有可能得到高度純化的枯草桿菌酶組合物，其特征為不含同源雜質(zhì)。在本文中，同源雜質(zhì)指由本發(fā)明的酶最初來源的同源細胞產(chǎn)生的任何雜質(zhì)(如不同于本發(fā)明的酶的其它多肽)。用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細胞的培養(yǎng)基可以是適合于所選宿主細胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基?？梢院芊奖愕貙⒈磉_的枯草桿菌酶分泌到培養(yǎng)基中，并通過眾所周知的方法從中回收，所述方法包括經(jīng)離心或過濾將細胞與培養(yǎng)基分開、經(jīng)鹽(如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，隨后通過如離子交換層析、親和層析等層析方法純化。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的用途本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以用于許多工業(yè)用途，尤其是用于洗滌劑工業(yè)中。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的酶組合物。下文描述了關(guān)于優(yōu)選的工業(yè)應(yīng)用的概述和相應(yīng)的優(yōu)選酶組合物。此概述并非旨在完全列出本發(fā)明枯草桿菌酶變體的所有適當應(yīng)用。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可應(yīng)用于本領(lǐng)域內(nèi)已知使用蛋白酶、尤其是枯草桿菌酶的其它工業(yè)應(yīng)用中。含有突變酶的洗滌劑組合物本發(fā)明包括本發(fā)明的突變酶在清潔和去污組合物中的用途以及含有突變枯草桿菌蛋白酶的這種組合物。這些清潔和去污組合物在本領(lǐng)域中有很好的描述，關(guān)于合適的清潔和洗滌劑組合物的進一步描述參閱WO96／34946、WO97／07202和WO95／30011。還可以參考本文的實施例，顯示本發(fā)明的許多枯草桿菌酶變體改良的洗滌性能。洗滌劑的公開內(nèi)容和實例表面活性劑體系本發(fā)明的洗滌劑組合物中含有表面活性劑體系，其中表面活性劑可以選自非離子型和／或陰離子型和／或陽離子型和／或兩性型和／或兩性離子型和／或半極性型表面活性劑。表面活性劑一般以0．1-60重量％的量存在。優(yōu)選將表面活性劑配制成與組合物中存在的酶組分相容。在液體或凝膠組合物中，最優(yōu)選將表面活性劑配制成能促進或至少是不降低這些組合物中的任何酶的穩(wěn)定性。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選體系包括本文中所述的作為表面活性劑的一種或多種非離子和／或陰離子表面活性劑。烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯縮合物適合用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑，其中優(yōu)選聚氧乙烯縮合物。這些化合物包括具有含約6-14個碳原子，優(yōu)選約8-14個碳原子直鏈或支鏈構(gòu)型之烷基的烷基酚與烯化氧的縮合產(chǎn)物。在優(yōu)選的實施方案中，環(huán)氧乙烷存在的量等于每摩爾烷基酚約2-25摩爾，更優(yōu)選約3-15摩爾的環(huán)氧乙烷。這類市售的非離子表面活性劑包括由GAFCorporation銷售的IgepalTMCO-630；和均由Rohm&amp;HaasCompany銷售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。這些表面活性劑通常被稱之為烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物適合用作本發(fā)明的非離子表面活性劑。該脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈的、伯或仲的，并且通常含有約8-22個碳原子。優(yōu)選的是具有含約8-20個碳原子，更優(yōu)選約10-18個碳原子烷基的醇與每摩爾醇約2-10摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。所述的縮合產(chǎn)物中每摩爾醇有約2-7摩爾的環(huán)氧乙烷，最優(yōu)選2-5摩爾的環(huán)氧乙烷?？蓮氖袌錾腺彽玫倪@類非離子表面活性劑的例子包括由UnionCarbideCorporation銷售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)和TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的窄分子量分布的縮合產(chǎn)物)；和由ShellChemicalCompany銷售的NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇與3．0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-5(C14-C15直鏈醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；由Procter&amp;GambleCompany銷售的KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；和由Hoechst銷售的GenapolLA050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)。這些產(chǎn)物的HLB的優(yōu)選范圍是8-11，最優(yōu)選8-10。也可用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是在US4565647中公開的烷基多糖，該多糖具有含約6-30，優(yōu)選約10-16個碳原子的疏水基團和含約1．3-10，優(yōu)選約1．3-3，最優(yōu)選約1．3-2．7個糖單元的多糖如多糖苷親水基團。可以使用任何含有5或6個碳原子的還原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖基部分(任選地，在2-，3-，4-等位連接疏水基團從而得到與葡萄糖苷或半乳糖苷不同的葡萄糖或半乳糖)。該糖間鍵可以在，例如，附加糖單元的1位和前一糖單元的2-，3-，4-，和／或6-位之間。優(yōu)選的烷基多糖苷具有下式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基、和其混合形式，其中烷基含有約10-18，優(yōu)選約12-14個碳原子；n是2或3，優(yōu)選2；t是0-約10，優(yōu)選0；x是約1．3-10，優(yōu)選約1．3-3，最優(yōu)選約1．3-2．7。該糖基優(yōu)選是從葡萄糖衍生的。為了制備這些化合物，先形成醇或烷基多乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)，從而形成葡糖苷(在1-位連接)。然后另外的糖基單元在其1-位置與前面的糖基單元2-，3-，4-，和／或6-位置，優(yōu)選主要在2-位之間連接。環(huán)氧乙烷與通過環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的疏水基之間的縮合產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的附加非離子表面活性劑體系。這些化合物的疏水部分的分子量優(yōu)選為約1500-1800并顯示出水不溶性。將聚氧乙烯部分加成到該疏水部分會增加整個分子的水溶性，在聚氧乙烯含量不超過該縮合產(chǎn)物總重量的約50％(相當于與多達約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合)時，仍能保持該產(chǎn)品的液體性質(zhì)。這類化合物的例子包括某些可從市場上購得的由BASF銷售的PluronicTM表面活性劑。也適合用作本發(fā)明非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑是環(huán)氧乙烷與從環(huán)氧丙烷和乙二胺反應(yīng)得到的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的疏水部分由乙二胺和過量環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，并且分子量一般是約2500-3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合，縮合程度為該縮合產(chǎn)物含有約40-80重量％的聚氧乙烯并且分子量為約5000-11000。這類非離子表面活性劑的例子包括某些可從市場上購得的由BASF銷售的TetronieTM化合物。優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖、和其混合物。最優(yōu)選的是具有3-15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個乙氧基的C8-C18(優(yōu)選平均為C10)醇乙氧基化物、和其混合物。非常優(yōu)選的非離子表面活性劑是下式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑其中R1是H，或R1是C1-4烴基、2-羥基乙基、2-羥基丙基或其混合形式，R2是C5-31烴基，Z是具有直鏈烴基鏈、至少3個羥基直接連接到該鏈上的多羥基烴基，或其烷氧基化的衍生物。優(yōu)選地，R1是甲基，R2是直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或鏈烯基鏈，例如椰油烷基，或其混合形式，Z是在還原性胺化反應(yīng)中從還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖衍生的。非常優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化的硫酸鹽表面活性劑。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，一般為約0．5-6，更優(yōu)選約0．5-3，M是H或陽離子，該陽離子可以是例如金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代銨陽離子。本文也涵蓋烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽離子的具體例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和從烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些陽離子等。舉例說明的表面活性劑是C12-C18烷基聚乙氧基化物(1．0)硫酸鹽(C12-C18E(1．0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(2．25)硫酸鹽(C12-C18E(2．25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(3．0)硫酸鹽(C12-C18E(3．0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(4．0)硫酸鹽(C12-C18E(4．0)M)，其中M方便地選自鈉和鉀。適用的陰離子表面活性劑是烷基酯磺酸鹽表面活性劑，包括按照“TheJournaloftheAmericanOilChemistsSociety”，52(1975)，PP．323-329用氣態(tài)SO3磺化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直鏈酯。合適的原料包括從牛脂、棕櫚油等衍生的天然脂類物質(zhì)。優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑(尤其是用于洗衣用途的)包括下面結(jié)構(gòu)式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑其中R3是C8-C20烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，R4是C1-C6烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，M是與烷基酯磺酸根形成水溶性鹽的陽離子。合適的成鹽陽離子包括金屬陽離子(如鈉、鉀和鋰)和取代或未取代的銨陽離子(例如單乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。優(yōu)選地，R3是C10-C16烷基，R4是甲基、乙基或異丙基。特別優(yōu)選的是甲基酯磺酸鹽，其中R3是C10-C16烷基。其它合適的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，它們是式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選是C10-C24烴基，優(yōu)選具有C10-C20烷基部分的烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，M是H或陽離子，例如堿金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰)，或者銨或取代銨(如甲基、二甲基和三甲基銨陽離子，和季銨陽離子例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子，和從烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合形式衍生的季銨陽離子)等。一般地，對于較低的洗滌溫度(例如低于約50℃)，C12-C16烷基鏈是優(yōu)選的，而對于較高的洗滌溫度(例如高于約50℃)，C16-C18烷基鏈是優(yōu)選的。其它對洗滌目的有用的陰離子表面活性劑也可以包括在本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。它們可以包括皂的鹽(包括，例如鈉、鉀、銨、和取代的銨如單、二和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲烷烴磺酸鹽、C8-C24烯烴磺酸鹽、通過堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化多羧酸(例如在英國專利說明書號1082179中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚硫酸鹽(含有多達10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽、脂肪?；视突撬猁}、脂肪油基甘油硫酸鹽、烷基酚氧乙烯醚硫酸鹽、石蠟烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙磺酸鹽如?；u乙磺酸鹽、N-?；；撬猁}、烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸的單酯(特別是飽和和不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸的二酯(特別是飽和和不飽和C6-C12二酯)、?；“彼猁}、烷基多糖的硫酸鹽例如烷基多葡糖苷(下面所述的非離子型非硫酸化的化合物)的硫酸鹽、支鏈伯烷基硫酸鹽、和烷基多乙氧基羧酸鹽例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的鹽，其中R是C8-C22烷基，k是1-10的整數(shù)，M是形成水溶性鹽的陽離子。樹脂酸及氫化的樹脂酸也是合適的，例如松香、氫化松香，以及存在于或衍生于松漿油的樹脂酸和氫化樹脂酸。烷基苯磺酸鹽是非常優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中該烷基優(yōu)選含有10-18個碳原子。其它例子描述于“SurfaceActiveAgentsandDetergents”(Vol．ⅠandⅡ，Schwartz，PerryandBerch)中。各種這樣的表面活性劑也一般性地公開于US3929678中(第23欄58行-第29欄23行，該文獻引入本文作為參考)。當包括在其中時，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有約1-40％，優(yōu)選約3-20重量％的上述陰離子表面活性劑。本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物也可以含有陽離子、兩性、兩性離子和半極性表面活性劑，以及上文中并未述及的非離子和／或陰離子表面活性劑。適用于本發(fā)明衣物洗滌劑組合物中的陽離子洗滌表面活性劑是具有一個長鏈烴基的那些表面活性劑。這樣的陽離子表面活性劑的例子包括銨表面活性劑例如烷基三甲基銨鹵化物，和具有下式的那些表面活性劑[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2是在烷基鏈中具有約8-18個碳原子的烷基或烷基芐基，每個R3選自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-、和其混合形式；每個R4選自C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、由兩個R4連接在一起形成的芐基環(huán)結(jié)構(gòu)、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于約1000的己糖聚合物，并且當y不是0時是氫)；R5與R4所述相同或是烷基鏈，其中R2+R5的總碳原子數(shù)不大于約18；每個y是0-約10，且該y值的和是0至約15；X是任何相容的陰離子。非常優(yōu)選的陽離子表面活性劑是具有下式的、在本發(fā)明組合物中有用的水溶性季銨鹽化合物R1R2R3R4N+X-(ⅰ)其中R1是C8-C16烷基，每個R2、R3和R4各自獨立地是C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H4O)xH(其中x的值為2-5)，X是陰離子。R2、R3、R4中不多于1個是芐基。R1的優(yōu)選烷基鏈長度是C12-C15，當該烷基是從椰油或棕櫚仁脂衍生的鏈長度的混合物，或是通過烯烴合成或OXO醇合成而合成衍生的時尤為如此。用于R2、R3和R4的優(yōu)選基團是甲基和羥基乙基，陰離子X可以選自鹵素離子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根離子。用于本文中的合適的式(Ⅰ)季銨化合物的例子是氯化或溴化椰油基三甲基銨；氯化或溴化椰油基甲基二羥基乙基銨；氯化癸基三乙基銨；氯化或溴化癸基二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化C12-15二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化椰油基二甲基羥基乙基銨；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基銨；氯化或溴化月桂基二甲基芐基銨；氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4銨；膽堿酯(式(ⅰ)的化合物，其中R1是烷基，R2、R3、R4是甲基)。二烷基咪唑啉[式(ⅰ)的化合物]。其它在本文中有用的陽離子表面活性劑也描述于US4228044和EP000224中。當包括在其中時，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有約0．2-25％，優(yōu)選約1-8重量％的上述陽離子表面活性劑。兩性表面活性劑也適用于本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的脂族衍生物，或雜環(huán)仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基團可以是直鏈或支鏈的。其中1個脂族取代基含有至少約8個碳原子，一般約8-18個碳原子，并且至少一個脂族取代基含有陰離子型水增溶性基團，例如羧基、磺酸根、硫酸根。見US3929678(第19欄18-35行)的兩性表面活性劑的例子。當包括在其中時，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有約0．2-15重量％，優(yōu)選約1-10重量％的上述兩性表面活性劑。兩性離子表面活性劑也適用于本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的衍生物，雜環(huán)的仲或叔胺的衍生物，或者季銨、季鏻或叔锍化合物的衍生物。見US3929678(第19欄38行-22欄48行)的兩性離子表面活性劑的例子。當包括在其中時，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有約0．2-15重量％，優(yōu)選約1-10重量％的上述兩性離子表面活性劑。半極性非離子表面活性劑是一特殊類型的非離子表面活性劑，它們包括含有1個約10-18個碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的2個部分的水溶性氧化胺；含有1個約10-18個碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的2個部分的水溶性氧化膦；和含有1個約10-18個碳原子的烷基部分和1個選自含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基的部分的水溶性亞砜。半極性非離子表面活性劑包括具有下式的氧化胺表面活性劑其中R3是含有約8-22個碳原子的烷基、羥基烷基、或烷基苯基，或其混合形式；R4是含有約2-3個碳原子的亞烷基或羥基亞烷基或其混合形式；x是0-約3；每個R5是含有約1-3個碳原子的烷基或羥基烷基，或含有約1-3個氧乙烯基團的多氧乙烯基。R5基團可以彼此連接，例如通過氧或氮原子，從而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。特別地，這些氧化胺表面活性劑包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和氧化C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基胺。當包括在其中時，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物一般含有約0．2-15重量％，優(yōu)選約1-10重量％的上述半極性非離子表面活性劑。助洗劑體系本發(fā)明的組合物還可含有助洗劑體系。任何常規(guī)助洗劑體系都適用于本文中，其包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽的材料、金屬離子螯合劑例如氨基多膦酸鹽特別是乙二胺四亞甲基膦酸和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸。盡管由于明顯的環(huán)境原因并不優(yōu)選，但本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。合適的助洗劑可以是無機離子交換材料，通常是無機水合的硅鋁酸鹽材料，更具體地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。另一種合適的無機助洗劑材料是層狀硅酸鹽例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶層狀硅酸鹽。合適的含有1個羧基的多羧酸鹽包括乳酸、乙醇酸和其醚衍生物的水溶性鹽，如在比利時專利號831368、821369和821370中所公開的。含有2個羧基的多羧酸鹽包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及在德國專利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸鹽，和在比利時專利號840623中所述的亞硫?；人猁}。含有3個羧基的多羧酸鹽具體地包括水溶性檸檬酸鹽、烏頭酸鹽(aconitrate)和檸康酸鹽以及琥珀酸鹽衍生物，例如，在英國專利號1379241中所述的羧基甲氧基琥珀酸鹽，在荷蘭申請7205873中所述的乳氧琥珀酸鹽(1actoxysuccinate)，和氧多羧酸鹽材料例如在英國專利號1387447中所述的2-氧雜-1，1，3-丙三羧酸鹽。含有4個羧基的多羧酸鹽包括在英國專利號1261829中公開的氧聯(lián)二琥珀酸鹽、1，1，2，2-乙四羧酸鹽、1，1，3，3-丙四羧酸鹽和1，1，2，3-丙四羧酸鹽。含有磺基取代基的多羧酸鹽包括在英國專利號1398421和1398422和US3936448中公開的磺基琥珀酸鹽衍生物、和在英國專利號1082179中所述的磺化的熱解檸檬酸鹽，而英國專利號1439000中公開了含有膦取代基的多羧酸鹽。脂環(huán)和雜環(huán)多羧酸鹽包括環(huán)戊烷-順，順，順-四羧酸鹽、環(huán)戊二烯五羧酸鹽(cyclopentadienidepentacarboxylate)、2，3，4，5-四氫呋喃-順，順，順-四羧酸鹽、2，5-四氫呋喃-順-二羧酸鹽、2，2，5，5-四氫呋喃-四羧酸鹽、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸鹽和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸鹽包括苯六甲酸、1，2，4，5，—苯四酸和在英國專利號1425343中公開的苯二甲酸衍生物。在上面的多羧酸鹽中，優(yōu)選的多羧酸鹽是每分子含有最多達3個羧基的羥基羧酸鹽，更具體地是檸檬酸鹽。用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A或?qū)訝罟杷猁}(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸螯合劑例如檸檬酸。包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的合適的螯合劑包括乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代銨鹽，或其混合物。優(yōu)選的EDDS化合物是游離酸形式的和其鈉或鎂鹽。這樣的優(yōu)選EDDS鈉鹽的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。這樣的優(yōu)選EDDS鎂鹽的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽是最優(yōu)選包括在本發(fā)明組合物中的。優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A和水溶性羧酸螯合劑例如檸檬酸的混合物?？梢孕纬捎糜诹罱M合物的助洗劑體系中一部分的其它助洗劑材料包括無機材料例如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機材料例如有機膦酸鹽、氨基多亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸鹽。其它合適的水溶性有機鹽是均聚和共聚的酸或其鹽，其中該聚羧酸包括兩兩之間被不多于2個碳原子分開的至少兩個羧基。這類聚合物公開于GB-A-1596756中。這樣的鹽的例子是MW2000-5000的聚丙烯酸鹽和其與馬來酸酐的共聚物，這樣的共聚物具有20000-70000，特別是約40000的分子量。洗滌助洗劑鹽的量通常為組合物重量的5-80％。用于液體洗滌劑的助洗劑的優(yōu)選量是5-30％。酶除了本發(fā)明的酶制劑外，優(yōu)選洗滌劑組合物還含有提供清洗性能和／或織物護理益處的其它酶。這樣的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。蛋白酶可以使用適用于堿性溶液的其它任何蛋白酶。合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的。微生物來源是優(yōu)選的。包括化學或基因修飾的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是從芽孢桿菌衍生的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO89／06270中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于WO89／06270中的鐮孢屬蛋白酶。優(yōu)選的市售蛋白酶包括由NovoNordiskA／S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase銷售的那些，由GenencorInternational以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、和PurafectOXP銷售的那些，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase銷售的那些。按組合物重量計，可以以0．00001-2％，優(yōu)選0．0001-1％，更優(yōu)選0．001-0．5％，最優(yōu)選0．01-0．2％酶蛋白的量將蛋白酶摻入到本發(fā)明的組合物中。脂肪酶可以使用任何適用于堿性溶液的脂肪酶。合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的那些。包括化學或基因工程修飾的突變體。有用的脂肪酶的例子包括Humicolalanuginosa脂肪酶，例如描述于EP258068和EP305216中的，Rhizomucormiehei脂肪酶，例如描述于EP238023中的，假絲酵母屬脂肪酶例如C．a(chǎn)ntarctica脂肪酶，例如描述于EP214761中的C．a(chǎn)ntarctica脂肪酶A或B，假單胞菌屬脂肪酶例如描述于EP218272中的產(chǎn)堿假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶、例如描述于EP331376中的洋蔥假單胞菌脂肪酶、例如公開于GB1372034中的司徒茨氏假單胞菌脂肪酶，熒光假單胞菌脂肪酶，芽孢桿菌脂肪酶例如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，BiochemicaetBiophsicaacta1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶(JP64／744992)和短小芽孢桿菌脂肪酶(WO91／16422)。此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991年《基因》103，61-67上描述的沙門氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y等，(1989)，生物化學雜志，106，383-388)，和各種根霉屬脂肪酶例如德列馬根霉脂肪酶(Hass，M．J．等，(1991)，Gene109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci．Biotech．Biochem．56，716-719)和米根霉脂肪酶。其它類型的脂類分解酶，如角質(zhì)酶也是有用的，例如WO88／09867所述來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶，來自Fusariumsolanipisi的角質(zhì)酶(如WO90／09446所述)。特別合適的脂肪酶是下面這些脂肪酶例如M1LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(Genecor)，LipolaseTM和LipolaseUltraTM(NovoNordiskA／S)，和LipaseP“Amano”(AmanoPharmacemaceticalCo．Ltd．)。按組合物重量計，一般以0．00001-2％，優(yōu)選0．0001-1％，更優(yōu)選0．001-0．5％，最優(yōu)選0．01-0．2％酶蛋白的量將脂肪酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。淀粉酶可以使用適用于堿性溶液的任何淀粉酶(α和／或β)。合適的淀粉酶包括細菌和真菌來源的那些。包括化學或基因工程改性的突變體。淀粉酶包括例如，在GB1296839中詳細描述的從地衣芽孢桿菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(從NovoNordiskA／S得到)和RapidaseTM和MaxamylpTM(從Genencor得到)。按組合物重量計，一般以0．00001-2％，優(yōu)選0．0001-1％，更優(yōu)選0．001-0．5％，最優(yōu)選0．01-0．2％酶蛋白的量將淀粉酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。纖維素酶可以使用適用于堿性溶液的任何纖維素酶。合適的纖維素酶包括細菌和真菌來源的那些。包括化學或基因工程改性的突變體。合適的纖維素酶公開于US4435307(其中公開了從Humicolainsolens生產(chǎn)的真菌纖維素酶)，WO96／34108和WO96／34092(其中公開了來自芽孢桿菌的細菌嗜堿性纖維素酶BCE103)，WO94／21801、US5，475，101和US5，419，778(其中公開了木霉的EGⅢ纖維素酶)中。特別合適的纖維素酶是具有顏色護理益處的纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述于歐洲專利申請0495257中的纖維素酶。市售的纖維素酶包括從一株Humicolainsolens生產(chǎn)的CelluzymeTM(NovoNordiskA／S)以及KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。按組合物重量計，一般以0．00001-2％，優(yōu)選0．0001-1％，更優(yōu)選0．001-0．5％，最優(yōu)選0．01-0．2％酶蛋白的量將纖維素酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。過氧化物酶／氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)一起使用。氧化酶與氧一起使用。兩種類型的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗滌液中一起洗滌，優(yōu)選與例如WO94／12621和WO95／01426中所述的增強劑一起洗滌所述織物時，防止染料從染色織物轉(zhuǎn)移到另一織物上。合適的過氧化物酶／氧化酶包括植物、細菌或真菌來源的那些。包括化學或基因工程修飾的突變體。按組合物重量計，一般以0．00001-2％，優(yōu)選0．0001-1％，更優(yōu)選0．001-0．5％，最優(yōu)選0．01-0．2％酶蛋白的量將過氧化物酶和／或氧化酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。在本文中包括上述酶的混合物，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和／或纖維素酶的混合物。按組合物重量計，一般以0．00001-2％，優(yōu)選0．0001-1％，更優(yōu)選0．001-0．5％，最優(yōu)選0．01-0．2％酶蛋白的量將本發(fā)明的酶或摻入到洗滌劑組合物中的其它任何酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。漂白劑可以包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的附加的任選洗滌組分包括漂白劑，例如粒徑為400-800微米的PB1、PB4和過碳酸鹽。這些漂白劑組分可以包括一種或多種氧漂白劑，并且根據(jù)所選擇的漂白劑，可包括一種或多種漂白活化劑。當存在氧漂白化合物時，其存在的量一般是約1-25％。通常，在非液體配方例如粒狀洗滌劑中，漂白化合物是任選加入的組分。用于本文中的漂白劑組分可以是任何在洗滌劑組合物中有用的漂白劑，包括氧漂白劑以及本領(lǐng)域已知的其它漂白劑。適合于本發(fā)明的漂白劑可以是活化的或未活化的漂白劑。一類可以使用的氧漂白劑包括過羧酸漂白劑和其鹽。這類試劑的合適的例子包括單過氧鄰苯二甲酸鎂六水合物，間氯過苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸和雙過氧十二烷雙酸的鎂鹽。這樣的漂白劑公開于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常優(yōu)選的漂白劑也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。另一類可以使用的漂白劑包括鹵素漂白劑。例如，次鹵酸鹽漂白劑的例子包括三氯異氰脲酸，以及二氯異氰脲酸的鈉和鉀鹽，和N-氯代和N-溴代烷烴磺基酰胺。這樣的材料通常以最終產(chǎn)品重量的0．5-10％、優(yōu)選1-5％的量加入?？梢詫⑦^氧化氫釋放劑與漂白活化劑一起使用，該漂白活化劑是例如四乙?；叶?TAED)、壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS，描述于US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸鹽(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙?；咸烟?PAG)；將它們過水解后能形成過氧酸作為活性漂白物質(zhì)，導致改進的漂白作用。另外，非常合適的是這些漂白活化劑C8(6-辛酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽、C9(6-壬酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽和C10(6-癸酰胺基己酰基)羥苯磺酸鹽或其混合物。還合適的活化劑是酰化的檸檬酸酯，例如在歐洲專利申請?zhí)?1870207．7所公開的。可用于本發(fā)明清洗組合物中的有用的漂白劑，包括過氧酸和含有漂白活化劑和過氧漂白化合物的漂白體系描述于專利申請USSN08／136626中。通過在洗滌和／或漂洗過程的開始或期間加入能夠生成過氧化氫的酶體系(即酶和其底物)，也可以存在過氧化氫。這樣的酶體系公開于歐洲專利申請EP0537381中。除了氧漂白劑以外的漂白劑也是本領(lǐng)域已知的，并且可以在本文中使用。特別重要的一類非氧漂白劑包括光活化漂白劑，例如磺化的鋅和／或鋁酞菁。這些材料可以在洗滌期間沉積在被洗物上。當存在氧時用光照射，例如通過將衣服掛出在日光中干燥時，該磺化的鋅酞菁被活化，結(jié)果該被洗物被漂白。優(yōu)選的鋅酞菁和光活化漂白方法描述于US4033718中。洗滌劑組合物一般含有約0．025-1．25重量％的磺化鋅酞菁。漂白劑也可以包括錳催化劑。錳催化劑可以是例如在“低溫漂白的有效錳催化劑(Effcientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching)”，自然369，1994，pp．637-639中所述的一種化合物。抑泡劑另一個任選的組分是抑泡劑，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通?？梢杂猛榛木酃柩跬椴牧蟻肀硎?，而硅石一般以細分散形式使用，例如二氧化硅氣凝膠和干凝膠和各種類型的疏水二氧化硅。這些材料可以作為顆粒加入，其中抑泡劑有利地可釋放地摻入到水溶性或水分散性的、基本上無表面活性的洗滌劑不可滲透的載體中。另外，可以將抑泡劑溶解或分散在液體載體中并通過噴霧在一種或多種其它組分上來涂覆。優(yōu)選的硅氧烷抑泡劑公開于US3933672中。其它特別有用的抑泡劑是德國專利申請DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡劑。這樣的化合物的例子是可從DowCorning購得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特別優(yōu)選的抑泡劑是含有硅油和2-烷基-鏈烷醇混合物的抑泡劑體系。合適的2-烷基-鏈烷醇是以商品名Isofol12R購得的2-丁基-辛醇。這樣的抑泡劑體系公開于歐洲專利中請EPO593841中。特別優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑描述于歐洲專利申請92201649．8中。所述的組合物可以含有硅氧烷／硅石混合物以及熏制的無孔硅石例如AerosilR。按組合物重量計，通常以0．001-2％，優(yōu)選0．01-1％的量使用上述的抑泡劑。其它組分可以在洗滌劑組合物中使用的其它組分有例如污垢懸浮劑、污垢除去劑、熒光增白劑、磨料、殺菌劑、變色抑制劑、著色劑和／或包覆或未包覆的香料。特別合適的包覆材料是由多糖基質(zhì)和多羥基化合物組成的水溶性膠囊，如在GB1464616中所述的。其它合適的水溶性包覆材料包括從取代二羧酸的未凝膠化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的。這些酸酯糊精優(yōu)選是從諸如蠟質(zhì)玉米、蠟質(zhì)高粱、西米、木薯和馬鈴薯的淀粉制備的。所述的包覆材料的合適例子包括由NationalStarch制造的N-Lok。該N-Lok包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖組成。該淀粉是通過加上單官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。適合于本文中的防再污染劑和污垢懸浮劑包括纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，和均聚或共聚的聚羧酸或其鹽。這類聚合物包括上述作為助洗劑提到的聚丙烯酸鹽和馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及馬來酸酐與乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中馬來酸酐至少構(gòu)成共聚物的20％摩爾。按組合物重量計，這些材料通常以組合物重量的0．5-10％，更優(yōu)選0．75-8％，最優(yōu)選1-6％的量使用。優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子性的，其例子是4，4’-雙-(2-雙乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2∶2’-二磺酸二鈉鹽、4，4’-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2∶2’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2∶2’-二磺酸二鈉、4’，4’，-雙-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2∶2’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)芪-2∶2’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2∶2’-二磺酸二鈉、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’∶4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸鈉和4，4’-雙-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特別是分子量為1000-10000，更具體是2000-8000和最優(yōu)選是約4000的那些。以0．20-5重量％，更優(yōu)選0．25-2．5重量％的量使用這些聚合物材料。這些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸鹽對于存在過渡金屬雜質(zhì)時改進白度維持性，織物灰分沉積和對粘土、蛋白質(zhì)性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。在本發(fā)明組合物中有用的污垢除去劑是對苯二甲酸與乙二醇和／或丙二醇單元各種對比的常規(guī)共聚物或三元共聚物。這樣的聚合物的例子公開于US4116885和US4711730及EP0272033中。根據(jù)EP0272033特別優(yōu)選的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0．75(POH)0．25[(T-PO)2．8(T-PEG)0．4]T(POH)0．25((PEG)43CH3)0．75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。還非常有用的是作為二甲基對苯二甲酸酯、二甲基磺基間苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇無規(guī)共聚物的改性聚酯，該端基主要由磺基苯甲酸酯組成，還有一小部分是乙二醇和／或1，2-丙二醇的單酯。目的是“主要”得到在兩端由磺基苯甲酸基團封端的聚合物，本文中是絕大多數(shù)本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基團封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和／或1，2-丙二醇的單酯組成，其“次要”地由這樣的物質(zhì)組成。本文中選擇的聚酯含有約46重量％的二甲基對苯二甲酸，約16重量％的1，2-丙二醇，約10重量％的乙二醇，約13重量％的二甲基磺基苯甲酸和約15重量％的磺基間苯二酸，并且其分子量為約3000。該聚酯和其制備方法詳細地敘述于EP311342中。柔軟劑可以將織物柔軟劑加入到本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物中。這些試劑在類型上可以是無機或有機的。無機柔軟劑的例子是在GB-A-1400898和US5019292中公開的綠土粘土。有機的織物柔軟劑包括如在GB-A-1514276和EP0011340中公開的水不溶性叔胺，其與單C12-C14季胺鹽的混合物(公開于EP-B0026528中)，和如在EP0242919中所公開的二長鏈酰胺?？椢锶彳泟w系的其它有用有機組分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP0299575和0313146中所公開的。綠土粘土的含量一般在5-15重量％的范圍，更優(yōu)選8-12重量％，作為干混合組分材料加入到配方的其余部分中。以0．5-5重量％，一般1-3重量％的量加入有機織物柔軟劑，例如水不溶性叔胺或二長鏈酰胺材料，而以0．1-2重量％，一般0．15-1．5重量％的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性陽離子材料。盡管在某些情況下作為干混顆粒加入它們可以更方便，但一般將這些材料加到該組合物的噴霧干燥組分上，或者作為熔融的液體將它們噴霧到組合物的其它固體組分上。聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑按照本發(fā)明的洗滌劑組合物還包括0．001-10重量％，優(yōu)選0．01-2重量％，更優(yōu)選0．05-1重量％的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑。一般將所述的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑加入到洗滌劑組合物中以便抑制染料從有色織物轉(zhuǎn)移到與其一起洗滌的織物上。在染料于洗滌中附著到其它物品上之前，這些聚合物會絡(luò)合或吸附從染色織物洗滌下來的短效染料。特別合適的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基鎓唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。加入這樣的聚合物也增強了本發(fā)明酶的性能。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或粒狀形式?？梢园蠢鏤S4106991和US4661452(兩者均是NovoIndustriA／S的專利)中所公開的生產(chǎn)無塵的顆粒，并且該顆粒可以任選地用本領(lǐng)域已知的方法涂覆。蠟質(zhì)涂覆材料的例子是平均分子量為1000-20000的聚(氧乙烯)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中該醇含有12-20個碳原子并且其中有15-80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單一、二-及三-甘油酯。在GB1483591中給出了適合于流化床技術(shù)涂覆的成膜涂覆材料的例子。本發(fā)明的粒狀組合物也可以是“致密形式”的，即它們具有比常規(guī)的粒狀洗滌劑相對高的密度，即550-950g／l；在這樣的情況下，本發(fā)明的粒狀洗滌劑組合物將含有比常規(guī)顆粒洗滌劑更少量的“無機填料鹽”；一般的填料鹽是堿土金屬的硫酸鹽和氯化物，一般是硫酸鈉；“致密”的洗滌劑一般包括不多于10％的填料鹽。本發(fā)明的液體組合物也可以是“濃縮形式”的，在這樣的情況下，本發(fā)明的液體洗滌劑組合物將比常規(guī)的液體洗滌劑含有較低量的水。按洗滌劑組合物重量計，濃縮的液體洗滌劑的水含量一般低于30％，更優(yōu)選低于20％，最優(yōu)選低于10％。例如，可以將本發(fā)明的組合物配制為手洗或機洗衣物洗滌劑組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于臟織物預(yù)處理的組合物，漂洗加入的織物柔軟劑組合物，和用于普通家庭硬表面清洗和碗碟洗滌的組合物。下面的實例旨在舉例說明本發(fā)明的組合物，而不對本發(fā)明范圍作任何限制。在洗滌劑組合物中，縮寫組分符號具有下面的意義LAS直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS牛脂烷基硫酸鈉XYASC1x-C1Y烷基硫酸鈉SS式2-丁基辛酸的仲皂表面活性劑25EY與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇45EY與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇XYEZS每摩爾與平均Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1X-C1Y烷基硫酸鈉非離子由BASFGmbh以商品名PlurafaxLF404銷售的、平均乙氧基化程度為3．8和平均丙氧基化程度為4．5的C13-C15混合乙氧基化／丙氧基化脂肪醇CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽無定型硅酸鈉(SiO2∶Na2O比=2．0)NaSKS-6式d-Na2Si2O5的結(jié)晶層狀硅酸鹽碳酸鹽無水碳酸鈉磷酸鹽三聚磷酸鈉MA／AA1∶4的馬來酸／丙烯酸共聚物，平均分子量約80000聚丙烯酸酯BASFGmbH以商品名PA30銷售的平均分子量為約8000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A式Na12(AlO2SiO2)12．27H2O的水合硅鋁酸鈉，主要粒徑為1-10微米檸檬酸鹽檸檬酸三鈉二水合物檸檬酸檸檬酸過硼酸鹽無水過硼酸鈉一水合物漂白劑，經(jīng)驗式為NaBO2．H2O2PB4無水過硼酸鈉四水合物過碳酸鹽經(jīng)驗式為2Na2CO3．3H2O2的無水過碳酸鈉漂白劑TAED四乙?；叶稢MC羧甲基纖維素鈉DETPMP由Monsanto以商品名Dequest2060銷售的二乙三胺五(亞甲基膦酸)PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS鈉鹽形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]異構(gòu)體抑泡劑25％熔點為50℃的石蠟，17％的疏水性二氧化硅，58％的石蠟油顆粒抑泡劑顆粒形式的12％硅氧烷／二氧化硅，18％的硬脂醇，70％的淀粉硫酸鹽無水硫酸鈉HMWPEO高分子量聚氧乙烯TAE25牛脂醇乙氧基化物(25)洗滌劑實施例Ⅰ可以按如下所示制備本發(fā)明粒狀織物清洗組合物線性C12烷基苯磺酸鈉6．5硫酸鈉15．0沸石A26．0次氮基三醋酸鈉5．0本發(fā)明的酶0．1PVP0．5TAED3．0硼酸4．0過硼酸鹽18．0苯酚磺酸鹽0．1次要組份至100洗滌劑實施例Ⅱ可以按如下所示制備本發(fā)明的致密粒狀織物清洗組合物(密度800g／l)45AS8．025E3S2．025E53．025E33．0TFAA2．5沸石A17．0NaSKS-612．0檸檬酸3．0碳酸鹽7．0MA／AA5．0CMC0．4本發(fā)明的酶0．1TAED6．0過碳酸鹽22．0EDDS0．3粒狀抑泡劑3．5水／次要組份至100％洗滌劑實施例Ⅲ按如下所示制備在洗滌彩色織物中特別有用的本發(fā)明粒狀織物清洗組合物LAS10．7-TAS2．4-TFAA-4．045AS3．110．045E74．0-25E3S-3．068E111．8-25E5-8．0檸檬酸鹽15．07．0碳酸鹽-10檸檬酸2．53．0沸石A32．125．0NaSKS-6-9．0MA／AA5．05．0DETPMP0．20．8本發(fā)明的酶0．100．05硅酸鹽2．5-硫酸鹽5．23．0PVP0．5-聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物／-0．2乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽1．0-苯酚磺酸鹽0．2-水／次要組份至100％洗滌劑實施例Ⅳ可按如下所示制備本發(fā)明具有“通過洗滌進行軟化”的能力的粒狀織物清洗組合物45AS-10．0LAS7．6-68AS1．3-45E74．0-25E3-5．0氯化椰油烷基二甲基羥乙基銨1．41．0檸檬酸鹽5．03．0NaSKS-6-11．0沸石A15．015．0MA／AA4．04．0DETPMP0．40．4過硼酸鹽15．0-過碳酸鹽-15．0TAED5．05．0綠土粘土10．010．0HMWPEO-0．1本發(fā)明的酶0．100．05硅酸鹽3．05．0碳酸鹽10．010．0粒狀抑泡劑1．04．0CMC0．20．1水／次要組份至100％洗滌劑實施例Ⅴ可按如下制備本發(fā)明的重垢液體織物清洗組合物ⅠⅡ酸形式的LAS-25．0檸檬酸5．02．0酸形式的25AS8．0-酸形式的25AE2S3．0-25AE78．0-CFAA5-DETPMP1．01．0脂肪酸8-油酸-1．0乙醇4．06．0丙二醇2．06．0本發(fā)明的酶0．100．05氯化椰油烷基二甲基羥乙基銨-3．0綠土粘土-5．0PVP2．0-水／次要組份至100％在皮革工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以用于皮革工業(yè)，尤其是用于皮的脫毛。在該應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選在還含有另一種蛋白酶的酶組合物中使用。關(guān)于合適的其它蛋白酶的更詳細的描述參閱關(guān)于適用于洗滌劑組合物中的酶的部分(見上文)。在毛紡工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以用于毛紡工業(yè)，尤其是用于含毛衣物的洗滌。在該應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選在還含有另一種蛋白酶的酶組合物中使用。關(guān)于適當?shù)钠渌鞍酌傅母敿毭枋鰠㈤嗞P(guān)于適用于洗滌劑組合物中的酶的部分(見上文)。本發(fā)明在下列實施例中有更詳細的描述，這些實施例并不以任何方式意圖限制本發(fā)明要求的范圍。材料和方法菌株枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。遲緩芽孢桿菌309和147是遲緩芽孢桿菌的特殊菌株，保藏于NCIB，編號NCIB10309和10147，而且描述于美國專利號3，723，250中，該專利文獻本文引用作為參考。大腸桿菌MC1000(M．J．Casadaban和S．N．Cohen(1980)；分子生物學雜志138179-207)，用常規(guī)方法制成r-,m+，其還描述于美國專利申請?zhí)?39，298中。質(zhì)粒pJS3大腸桿菌一枯草芽孢桿菌穿梭載體，含有編碼枯草桿菌酶309的合成基因(由JacobSchiodt等人描述于“蛋白質(zhì)和肽通訊”(ProteinandPeptideletters)3∶39-44(1996))。pSX222枯草芽孢桿菌表達載體(描述于WO96／34946)。常用分子生物學方法除非特別指出，DNA操作和轉(zhuǎn)化用分子生物學的標準方法進行(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；F．M．Ausubel等人(主編)“分子生物學通用方法”(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWileyandSons，1995；C．R．Harwood和S．M．Cutting(主編)“芽孢桿菌的分子生物學方法”(MolecularBiologicalMethodsforBacillus)，JohnWileyandSons，199))。用于DNA操作的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用。用于DNA操作的酶除非特別指出，所有用于DNA操作的酶，如限制性內(nèi)切酶、連接酶等等，均購自NewEnglandBiolabs，Inc．。蛋白水解活性在本發(fā)明中蛋白水解活性以“千諾氏蛋白酶單位”(KiloNOVOProteaseUnits，KNPU)表示?；钚允窍鄬τ跇藴拭?SAVINASE_)測定的，而且測定是建立在標準條件下(即50℃，pH8．3，反應(yīng)時間9分鐘，測量時間3分鐘)蛋白水解酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液的基礎(chǔ)之上的?？梢韵虻淣ovoNordiskA／S索取文件AF220／1，該文件此處引用作為參考。GU即甘氨酸單位(Glycinllnit)，定義為以N-乙酰酪蛋白作為底物，在標準條件下，于40℃保溫15分鐘時，產(chǎn)生相當于1毫摩爾甘氨酸的氨基量的蛋白水解酶活性。酶活性也可以用PNA實驗，根據(jù)與可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-對硝基苯酚的反應(yīng)測量(描述于美國石油化學協(xié)會雜志(JournalofAmericanOilChemistsSociety)，T．M．Rothgeb，B．D．Goodlander，P．H．Garrison和L．A．Smith，(1988))。發(fā)酵枯草桿菌酶的發(fā)酵于30℃在搖床上(300r．p．m．)含100mlBPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板Erlenmeyer錐形瓶中進行5天。因此，為了得到例如2升培養(yǎng)液，需要20個Erlenmeyer錐形瓶同時進行發(fā)酵。培養(yǎng)基BPX組成(每升)土豆淀粉100g碾碎的大麥50g大豆粉20gNa2HPO4·12H2O9gPluronic0．1g酪蛋白鈉鹽10g培養(yǎng)基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培養(yǎng)基通過加熱至120℃并保持45分鐘滅菌。滅菌后加入NaHCO3至0．1M將培養(yǎng)基的pH調(diào)至9。實施例實施例1酶變體的構(gòu)建和表達定點誘變其中一個活性位點環(huán)被按照本發(fā)明導入特異插入的枯草桿菌酶309定點誘變體是使用“單一位點刪除(uniquesiteelimination，USE)”或“尿嘧啶-USE”技術(shù)(分別描述于Deng等人(分析生化(Anal．Biochem)20081-88(1992))，Markvardsen等人(生物技術(shù)(BioTechniques)18(3)371-372(1995)))制成的。模板質(zhì)粒是pJS3，或該質(zhì)粒含有枯草桿菌酶309變體的類似物，例如，用一段指導構(gòu)建G97GASG插入變體的寡核苷酸進行USE誘變，產(chǎn)生最終的G97GASG枯草桿菌酶309變體。然后用限制酶KpnI和MluI將在pJS3中構(gòu)建的枯草桿菌酶309變體亞克隆到枯草芽孢桿菌pSX222表達質(zhì)粒中。定域隨機誘變以將隨機插入導入確定區(qū)域中進行定域隨機誘變的完整策略是合成對應(yīng)于DNA序列中待修飾部分的誘變引物(寡核苷酸)，該引物在對應(yīng)于待通過插入進行修飾的氨基酸密碼子的核苷酸處不同。然后，將得到的誘變引物與適當?shù)姆聪蛞镆黄鹩糜赑CR反應(yīng)。將得到的PCR片段純化和消化并克隆到大腸桿菌一枯草芽孢桿菌穿梭載體中。或者如果有必要，將得到的PCR片段作為引物與第二個適當?shù)姆聪蛞镆黄鹩糜诘诙€PCR反應(yīng)，使得能夠消化誘變區(qū)并將其克隆到穿梭載體中。PCR反應(yīng)在常規(guī)條件下進行。遵循這種策略，構(gòu)建SAVINASE的定域隨機文庫，其中在95-103的活性位點環(huán)區(qū)內(nèi)導入插入。通過誘變引物(見下文)導入突變／插入，使四種氨基酸Thr、Glv、Ala和Ser各由兩個密碼子表示(R=50％A和G；S=50％C和G；Y=50％C和T)。將所產(chǎn)生的PCR片段克隆入質(zhì)粒pJS3的AvrⅡ和NotI位點，對隨機選出的10個大腸桿菌菌落進行測序，以證實含有所設(shè)計的突變。將誘變引物(5’-CTATACGCTAAAGTCCTAGGGGCGRSYRSYRSYRSYRSYRSYRSYGTCAGCTCGATTGCCCAAGC-3’(有義))與位于pJS3中MluI位點下游的適當?shù)姆戳x引物(如5’-CCCTTTAACCGCACAGCGTTT-3’(反義))一起用于PCR反應(yīng)，而質(zhì)粒pJS3作為模板。用限制酶AvrII和NotI將所得PCR產(chǎn)物克隆到pJS3穿梭載體中。然后用限制酶KpnI和MluI將在pJS3中構(gòu)建的定域隨機文庫亞克隆到枯草芽孢桿菌pSX222表達質(zhì)粒中。如此制備的文庫含有大約100，000個單克?。膸?。對隨機選取的10個菌落測序以確認設(shè)計的突變。為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，將含有本發(fā)明變體的枯草芽孢桿菌pSX222表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株中并如上文所述在含10ug／ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中發(fā)酵。實施例2酶變體的純化這項操作涉及枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309或其突變體的2升水平發(fā)酵的純化。將大約1．6升發(fā)酵液在1升離心杯中于5000rpm離心35分鐘。用10％醋酸將上清液調(diào)至pH6．5，并在SeitzSupraS100過濾板上過濾。使用配備了AmiconS1Y10UF柱體的AmiconCH2AUF裝置將濾出液濃縮至大約400ml。在上Bacitracin親和柱(室溫，pH7)吸附前，先將UF濃縮液離心并過濾。用含25％2-丙醇和1M氯化鈉的0．01M二甲基戊二酸、0．1M硼酸和0．002M氯化鈣緩沖液(pH7)于室溫將蛋白酶從Bacitracin柱上洗脫下來。將來自Bacitracin純化步驟具有蛋白酶活性的級分合并，并加到750mlSephadexG25柱(直徑5cm，用含0．01M二甲基戊二酸、0．2M硼酸和0．002M氯化鈣，pH6．5的緩沖液平衡過)上。將來自SephadexG25柱具有蛋白水解活性的級分合并，并加到150mlCMSepharoseCL6B陽離子交換柱(直徑5cm，用含0．01M二甲基戊二酸、0．2M硼酸和0．002M氯化鈣，pH6．5的緩沖液平衡過)上。用2升相同緩沖液中的線形梯度0-0．1M氯化鈉(枯草桿菌蛋白酶147的情況下用0-0．2M氯化鈉)將蛋白酶洗脫下來。在最后的純化步驟中，將來自CMSepharose柱含有蛋白酶的級分合并，并在配備了GR81PP膜(購自DanishSugarFactoriesInc．)的Amicon超濾室中濃縮。通過使用實施例1用于構(gòu)建的技術(shù)和上述分離方法，生產(chǎn)并分離得到下列枯草桿菌蛋白酶309變體37．03G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A；37．06G97GAA+A98S+S99G+S101T；和37．04G97GAS+A98S+S99G。實施例3含有酶變體的洗滌劑組合物的洗滌性能下列實施例提供了在指明的條件下進行的一些洗滌測試的結(jié)果。實驗條件表Ⅲ評價枯草桿菌蛋白酶309變體的實驗條件<tablesid="table1"num="002"><table>洗滌劑蛋白酶型洗滌劑95洗滌劑劑量3．0g／lpH10．5洗滌時間15min溫度15℃水硬度6°dH酶枯草桿菌蛋白酶309變體，如下文所示酶濃度10nM測試系統(tǒng)150ml帶有攪棒的玻璃燒杯紡織品／體積5片紡織品(φ2．5cm)于50ml洗滌劑中測試材料來自Testmaterials，Holland的EMPA117</table></tables>使用的洗滌劑是簡單型制劑。pH調(diào)至10．5，這在粉劑型洗滌劑的正常范圍內(nèi)。95型洗滌劑的組成如下STP(Na5P3O10)25％Na2SO425％Na2CO310％LAS(Nansa80S)20％非離子型表面活性劑(Dobanol25-7)5．0％Na2Si2O55．0％羧甲基纖維素(CMC)0．5％水9．5％水硬度通過向去離子水中加入CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+=2∶1)調(diào)整(也可參閱《消費品中的表面活性劑理論、技術(shù)和應(yīng)用》(SurfactantsinConsumerProductsTheory，TechnologyandApplication)，SpringerVerlag1986)。洗滌劑溶液的pH通過加入HCl調(diào)至pH10．5。使用MacbethColorEye7000型光度計測量測試材料在460nm的反射率(reflectance，R)。測量根據(jù)供應(yīng)商的說明書進行。枯草桿菌蛋白酶309變體的洗滌性能通過計算性能因子評價P=(R變體-R空白)／(Rsavinase-R空白)P性能因子R變體用變體洗滌后測試材料的反射率Rsavinase用Savinase_洗滌后測試材料的反射率R空白不用酶洗滌后測試材料的反射率要求保護的枯草桿菌蛋白酶309變體相對于Savinase_都具有改良的洗滌性能-即P＞1。變體被分成幾個改良等級，用大寫字母表示A級1＜P≤1．5B級1．5＜P≤2C級P＞2表Ⅳ枯草桿菌蛋白酶309變體及改良等級<tablesid="table2"num="003"><table>改良等級變體A37．03G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A37．04G97GAS+A98S+S99GB37．06G97GAA+A98S+S99G+S101TC</table></tables>從表Ⅳ可以看出，本發(fā)明的SAVINASE_變體在洗滌性能方面有所改善。權(quán)利要求1．與BLSAVI相比在洗滌劑中的洗滌性能有所改良、并且氨基酸序列與成熟BLSAVI的氨基酸序列有至少40％相同的分離枯草桿菌酶，其特征在于所述分離枯草桿菌酶的至少一個活性位點環(huán)比BLSAVI內(nèi)的相應(yīng)活性位點環(huán)更長，從而所述分離枯草桿菌酶內(nèi)的這種活性位點環(huán)區(qū)最小氨基酸長度如下組所示(a)氨基酸殘基33-43之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有12個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(b)氨基酸殘基95-103之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有10個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(c)氨基酸殘基125-132之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有9個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(d)氨基酸殘基153-173之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有22個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(e)氨基酸殘基181-195之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有16個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；(f)氨基酸殘基202-204之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有4個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)；和(g)氨基酸殘基218-219之間的區(qū)域(包括兩末端氨基酸)至少有3個氨基酸長(即與BLSAVI相比有至少一個氨基酸插入)。2．根據(jù)權(quán)利要求1的分離枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是在根據(jù)權(quán)利要求1的至少一個活性位點環(huán)內(nèi)含有至少一個氨基酸的至少一個插入的構(gòu)建變體。3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自T、G、A和S。4．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自帶電氨基酸殘基D、E、H、K和R，更優(yōu)選選自D、E、K和R。5．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選選自N、Q、S和T。6．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自小的疏水性氨基酸殘基A、G和V。7．根據(jù)權(quán)利要求1或2的分離枯草桿菌酶，其中所述插入氨基酸殘基中的至少一個選自大的親水性氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y，更優(yōu)選選自F、I、L、M和Y。8．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的分離枯草桿菌酶，其中至少一個活性位點環(huán)中的所述插入相比于BLSAVI內(nèi)的相應(yīng)活性位點環(huán)包含有至少兩個氨基酸。9．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的分離枯草桿菌酶，其中枯草桿菌酶含有選自下組的至少一個插入(BASBPN編號法)G97GASG；G97GAA；和G97GAS。10．根據(jù)權(quán)利要求9的分離枯草桿菌酶，其中枯草桿菌酶含有選自下組的至少一個插入／修飾(BASBPN編號法)37．03G97GASG+A98S+S99G+G100A+S101A；37．06G97GAA+A98S+S99G+S101T；和37．04G97GAS+A98S+S99G。11．根據(jù)前述任一權(quán)利要求的枯草桿菌酶，其中枯草桿菌酶或在所述枯草桿菌酶是變體時則其親本枯草桿菌酶選自I-S1亞組。12．根據(jù)權(quán)利要求11的變體，其中所述枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR或其保留了I-S1亞組特征的功能性變體。13．根據(jù)權(quán)利要求1-9中任何一項的變體，其中枯草桿菌酶或在所述枯草桿菌酶是變體時則其親本枯草桿菌酶選自I-S2亞組。14．根據(jù)權(quán)利要求13的變體，其中親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB或其保留了I-S2亞組特征的功能性變體。15．上述權(quán)利要求中任何一項的枯草桿菌酶變體，其中所述插入組合了任何其它位點處的一個或多個修飾。16．根據(jù)權(quán)利要求15的枯草桿菌酶變體，其中所述修飾組合了27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274位中的一個或多個位點處的修飾。17．根據(jù)權(quán)利要求16的枯草桿菌酶變體，其中所述枯草桿菌酶屬于I-S2亞組，而所述進一步改變選自K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。18．根據(jù)權(quán)利要求17的變體，其包含有V104N+S101G、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合中的任何一種，還包含有權(quán)利要求1-12中任何一項提及的任何一個或多個取代、刪除和／或插入。19．上述權(quán)利要求中任何一項的枯草桿菌酶變體，其中所述修飾組合了129、131、133和194位中一個或多個位點處的修飾。20．根據(jù)權(quán)利要求19的變體，其中所述枯草桿菌酶屬于I-S2亞組，而所述進一步修飾選自P129K、P131H、A133P、A133D和A194P。21．根據(jù)權(quán)利要求20的枯草桿菌酶變體，其中所述進一步修飾選自下組Y167A+R170S+A194PY167A+R170L+A194PY167A+R170N+A194PY167A+R170S+P129KY167A+R170L+P129KY167A+R170N+P129KY167A+R170S+P131HY167A+R170L+P131HY167A+R170N+P131HY167A+R170S+A133PY167A+R170L+A133PY167A+R170N+A133PY167A+R170S+A133DY167A+R170L+A133DY167A+R170N+A133D22．編碼權(quán)利要求1-21中任何一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的分離DNA序列。23．含有權(quán)利要求22的分離DNA序列的表達載體。24．轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求23的表達載體的微生物宿主細胞。25．根據(jù)權(quán)利要求24的微生物宿主，它是細菌，優(yōu)選芽孢桿菌，尤其是遲緩芽孢桿菌。26．根據(jù)權(quán)利要求25的微生物宿主，它是真菌或酵母，優(yōu)選絲狀真菌，尤其是曲霉。27．生產(chǎn)權(quán)利要求1-21中任何一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的方法，其中將權(quán)利要求23-26中任何一項的宿主在有利于表達和分泌所述變體的條件下培養(yǎng)，并回收變體。28．含有權(quán)利要求1-21中任何一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。29．根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其中還含有纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其它蛋白酶或淀粉酶。30．根據(jù)權(quán)利要求28或29的組合物，其中所述組合物是洗滌劑組合物。31．權(quán)利要求1-21中任何一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體或者權(quán)利要求28-30中任何一項的酶組合物在衣物和／或餐具洗滌劑中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及特征在于在至少一個活性位點環(huán)內(nèi)含有插入的蛋白酶－枯草桿菌酶。如果該酶是枯草桿菌酶變體,則其在洗滌劑中的洗滌性能相比于其親本酶有所改良。文檔編號C12N1/21GK1279715SQ98811325公開日2001年1月10日申請日期1998年11月17日優(yōu)先權(quán)日1997年11月21日發(fā)明者P·K·漢森,P·鮑迪茨,F·米凱爾森申請人:諾沃挪第克公司被以下專利引用(1),