專利名稱：蛋白酶變體及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的適用于配制洗滌組合物并在洗滌劑中顯示改良的洗滌性能的突變蛋白酶或酶變體、含有該酶的清潔和洗滌組合物、插入到合適的宿主細(xì)胞或生物體中時(shí)編碼表達(dá)該酶的突變基因；以及已被突變基因轉(zhuǎn)化并能夠表達(dá)該酶變體的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
在洗滌劑工業(yè)中，酶在洗滌配方中已經(jīng)被應(yīng)用超過30年。用于這些制劑的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶以及其它酶，或者它們的混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。
數(shù)目不斷增加的商業(yè)用途的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程變體，如DURAZYM(Novo Nordisk A/S)、RELASE(Novo Nordisk A/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(Genencor國際有限公司)。
還有許多蛋白酶變體在本領(lǐng)域中已有描述，如EP 130756(GENENTECH)(相應(yīng)于美國再頒專利34,606(GENENCOR))；EP214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然(Nature)318 375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)193 803-813；Russell和Fersht(1987)自然328496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(AMGEN)；WO95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE 公司)；WO95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAYS.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)；WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；WO94/02618(GIST-BROCADES N.V.)；和WO 96/34946(Novo NordiskA/S)。
然而，盡管已經(jīng)描述了許多有用的蛋白酶變體，許多工業(yè)用途仍然需要新的改良的蛋白酶變體。
因此，本發(fā)明的目的是提供改良的蛋白質(zhì)工程化蛋白酶變體，尤其是用于洗滌劑工業(yè)。
發(fā)明概述本發(fā)明深入研究了SAVINASE的殘基N252、T255和S259的許多種可能的組合，并且鑒定了具有增強(qiáng)的洗滌性能的一些變體。
進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參閱本文實(shí)施例(見下文)。
相應(yīng)地，本發(fā)明第一方面涉及在洗滌劑中具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶(subtilase)蛋白酶變體，該變體在位點(diǎn)252、255和/或259具有修飾。
根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選地在兩個(gè)位點(diǎn)252和255均有修飾，更優(yōu)選地在所有三個(gè)位點(diǎn)252、255和259都有修飾。
本發(fā)明第二方面涉及在洗滌劑中具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體，其含有至少一種選自下組的修飾252L+255I252V+255A252M+255C+259H252S+255E+259C252K+255S+259C或在上述任何變體中含有一個(gè)或多個(gè)保守修飾的變體(例如252L(疏水性氨基酸)+255I變體的保守修飾包括如252I(疏水性氨基酸)+255I和252V(疏水性氨基酸)+255I的變體)。
本發(fā)明第三方面涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列。
本發(fā)明第四方面涉及含有編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列的表達(dá)載體。
本發(fā)明第五方面涉及轉(zhuǎn)化了第四方面的表達(dá)載體的微生物宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的枯草桿菌蛋白酶的生產(chǎn)方法，包括將根據(jù)第四方面的表達(dá)載體插入到合適的微生物宿主中，培養(yǎng)宿主以表達(dá)需要的枯草桿菌酶，并回收酶產(chǎn)品。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶變體的組合物。
最后本發(fā)明涉及突變酶在許多工業(yè)相關(guān)應(yīng)用中的用途，特別是在清潔組合物中的用途，本發(fā)明還涉及含有突變酶的清潔組合物，尤其是含有突變枯草桿菌蛋白酶的洗滌組合物。
定義在進(jìn)一步詳細(xì)論述本發(fā)明之前，先定義下列術(shù)語。
氨基酸的命名A＝Ala＝丙氨酸V＝Val＝纈氨酸L＝Leu＝亮氨酸I＝Ile＝異亮氨酸P＝Pro＝脯氨酸F＝Phe＝苯丙氨酸W＝Trp＝色氨酸M＝Met＝蛋氨酸G＝Gly＝甘氨酸S＝Ser＝絲氨酸T＝Thr＝蘇氨酸C＝Cys＝半胱氨酸Y＝Tyr＝酪氨酸N＝Asn＝天冬酰胺Q＝Gln＝谷氨酰胺
D＝Asp＝天冬氨酸E＝Glu＝谷氨酸K＝Lys＝賴氨酸R＝Arg＝精氨酸H＝His＝組氨酸X＝Xaa＝任何氨基酸核酸命名A＝腺嘌呤G＝鳥嘌呤C＝胞嘧啶T＝胸腺嘧啶(只存在于DNA中)U＝尿嘧啶(只存在于RNA中)變體的命名在描述本發(fā)明產(chǎn)生或包括的各種酶變體時(shí)，采用以下命名法以便簡(jiǎn)化原氨基酸位點(diǎn)取代氨基酸根據(jù)這種命名法，在位點(diǎn)195由谷氨酸取代甘氨酸被記做Gly 195 Glu或G195E同一位點(diǎn)的甘氨酸被刪除記做Gly 195*或G195*而一個(gè)額外的氨基酸殘基如賴氨酸的插入記做Gly 195 GlyLys或G195GK在相對(duì)于用于編號(hào)的序列存在刪除的位點(diǎn)處的插入，用*36 Asp或*36D表示天冬氨酸在位點(diǎn)36的插入。
多重突變用加號(hào)分開，即Arg 170 Tyr+Gly 195 Glu或R170Y+G195E表示在位點(diǎn)170和195的突變，用酪氨酸和谷氨酸分別取代精氨酸和甘氨酸。
蛋白酶將能切開蛋白質(zhì)底物中酰氨鍵的酶歸類為蛋白酶或肽酶(可互換使用)(參閱Walsh，1979，酶反應(yīng)機(jī)制(Enzymatic Reaction Mechanisms)，W.H.Freeman and Company，舊金山，第三章)。
氨基酸位點(diǎn)/殘基的編號(hào)如果沒有特別指出，本文使用的氨基酸編號(hào)相應(yīng)于枯草桿菌酶BPN’(BASBPN)序列。BPN’序列的進(jìn)一步描述參閱Siezen等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)4(1991)719-737和

圖1。
絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是指能催化肽鍵水解，并且在其活性位點(diǎn)存在必需絲氨酸殘基的酶(White，Handler和Smith，1973“生化原理”(Principlesof Biochemistry)，第五版，McGraw-Hill書籍公司，紐約，第271-272頁)。
細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍為20,000-45,000道爾頓。它們被二異丙基氟磷酸鹽抑制。它們水解簡(jiǎn)單的末端酯，而且與真核生物的糜蛋白酶(也是絲氨酸蛋白酶)的活性相似。范圍更窄的術(shù)語-堿性蛋白酶(包括一個(gè)亞組)反映了一些絲氨酸蛋白酶最適pH高，從pH9.0到11.0(參閱Priest(1977)細(xì)菌學(xué)回顧(Bacteriological Rev.)41 711-753)。
枯草桿菌酶絲氨酸蛋白酶的一個(gè)暫時(shí)命名為枯草桿菌酶的亞組，由Siezen等人[蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737]提出。它們由對(duì)40多種絲氨酸蛋白酶(以前被稱作類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like protease))的氨基酸序列同源分析定義?？莶輻U菌蛋白酶以前被定義為由革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人的定義，它是枯草桿菌酶的一個(gè)亞組。已經(jīng)鑒定了多種枯草桿菌酶，而且許多枯草桿菌酶的氨基酸序列已經(jīng)測(cè)定。關(guān)于這些枯草桿菌酶更詳細(xì)的描述和它們的氨基酸序列參閱Siezen等人的文獻(xiàn)和本文圖1。
枯草桿菌酶的一個(gè)亞組，I-S1，包括“經(jīng)典的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN’、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE，Novo NordiskA/S)和枯草桿菌蛋白酶DY。
由Siezen等人(見上文)劃分了枯草桿菌酶的另一個(gè)亞組，I-S2。I-S2亞組蛋白酶被描述成高度堿性的枯草桿菌蛋白酶，包括如枯草桿菌蛋白酶PB92(MAXACAL，Gist-Brocades NV)、枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE，Novo NordiskA/S)、枯草桿菌蛋白酶147(ESPERASE，Novo NordiskA/S)和堿性彈性蛋白酶YaB。
“SAVINASE”SAVINASE由Novo NordiskA/S出售。
它是來源于遲緩芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶309，而且與BABP92只在N87S不同(參閱本文圖1)。
親本枯草桿菌酶術(shù)語“親本枯草桿菌酶”指根據(jù)Siezen等人(蛋白質(zhì)工程4719-737(1991))定義的枯草桿菌酶。進(jìn)一步細(xì)節(jié)參閱上文“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是由天然來源分離得到的枯草桿菌酶，隨后進(jìn)行了修飾而同時(shí)保留了枯草桿菌酶的特征。
術(shù)語“親本枯草桿菌酶”或者可以稱作“野生型枯草桿菌酶”。
枯草桿菌酶變體的修飾本文討論的枯草桿菌酶變體修飾中使用的術(shù)語“修飾”被定義為包括化學(xué)改性以及基因操作。修飾可以是在感興趣的氨基酸位點(diǎn)處的取代、刪除和/或插入。
枯草桿菌酶變體在本文中，術(shù)語枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達(dá)突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該突變基因來源于具有原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物，其中親本基因已經(jīng)被突變以得到在合適的宿主中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生突變枯草桿菌酶的突變基因。
同源枯草桿菌酶序列本文鑒定了SAVINASE枯草桿菌酶中的特殊氨基酸殘基用于修飾以得到本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。
然而，本發(fā)明并不限于這種特殊枯草桿菌酶的修飾，而是擴(kuò)展到與SAVINASE有同源的一級(jí)結(jié)構(gòu)的其它親本(野生型)枯草桿菌酶。
為了鑒定其它同源枯草桿菌酶，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，進(jìn)行了枯草桿菌酶與以前對(duì)比的一組枯草桿菌酶的對(duì)比，并保持以前的對(duì)比不變。進(jìn)行了枯草桿菌酶中18個(gè)高度保守殘基的比較。這18個(gè)高度保守殘基列于表I(關(guān)于這些保守殘基的進(jìn)一步細(xì)節(jié)參閱Siezen等人)。
表I枯草桿菌酶中的18個(gè)高度保守殘基位點(diǎn) 保守殘基23 G32 D34 G39 H64 H65 G66 T70 G83 G125 S127 G146 G154 G155 N219 G220 T221 S225 P
在進(jìn)行了對(duì)比之后(為了實(shí)現(xiàn)對(duì)比，允許必要的插入和刪除)，鑒定出了合適的同源殘基。然后該同源殘基可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾。
使用CLUSTALW(第1.5版，1995年4月)電腦對(duì)比程序(J.D.Thompson，D.G.Higgins和T.J.Gibson(1994)核酸研究(NucleicAcid Research)，224673-4680)，設(shè)定缺口開放罰分(GAP openpenalty)10.0和缺口延伸罰分(GAP extension penalty)0.1，用BLOSUM30蛋白質(zhì)質(zhì)量矩陣，使用程序中的特征對(duì)比(Profilealignments)選項(xiàng)進(jìn)行給定枯草桿菌酶在以前對(duì)比的枯草桿菌酶組中的對(duì)比。對(duì)于在本發(fā)明范圍中的給定枯草桿菌酶，優(yōu)選18個(gè)高度保守殘基100％保守。然而，在18個(gè)殘基中多于或等于17的對(duì)比，或少至16個(gè)保守殘基的對(duì)比也足夠用于鑒定同源殘基。在枯草桿菌酶中，應(yīng)當(dāng)維持催化三組合Asp32/His64/Ser221的保守性。
圖1顯示了以前確定的對(duì)比，還顯示了在此對(duì)比中各枯草桿菌酶對(duì)于18個(gè)高度保守殘基的相同性百分比。
在此描述的基礎(chǔ)上，鑒定適當(dāng)?shù)耐纯莶輻U菌酶和根據(jù)本發(fā)明可以進(jìn)行修飾的相應(yīng)同源殘基對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)工作。為了說明這一點(diǎn)，下文的表II顯示了部分同源枯草桿菌酶和可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的相應(yīng)合適殘基。表II同源枯草桿菌酶及根據(jù)本發(fā)明適合于修飾的相應(yīng)同源殘基

<p>顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地給出包含其它同源枯草桿菌酶的相似或更大的表格。
洗滌性能酶在例如清洗過程中催化待清洗物體上的各種天然存在底物的降解的能力，通常被稱作它的洗滌能力(washing ability)、可洗力(washability)、去垢力(detergency)或洗滌性能(wash performance)。在本申請(qǐng)中，用術(shù)語洗滌性能表示這種特性。
分離DNA序列術(shù)語“分離的”，當(dāng)應(yīng)用于DNA序列分子時(shí)，表示該DNA序列已從其天然遺傳環(huán)境中取出并且因而不含其它無關(guān)的或多余的編碼序列，而且以適合于在基因工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中使用的形式存在。這些分離分子是與其天然環(huán)境分開的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含它們最初與之相關(guān)的其它基因，但是可能包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)如啟動(dòng)子和終止子。這些相關(guān)區(qū)域的鑒定顯然是本領(lǐng)域的基本技術(shù)之一(參閱如Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。術(shù)語“分離DNA序列”也可稱作“克隆DNA序列”。
分離蛋白質(zhì)當(dāng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語“分離的”說明該蛋白質(zhì)存在于不同于它的天然環(huán)境的條件下。在優(yōu)選的形式中，分離蛋白質(zhì)基本不含其它蛋白質(zhì)，尤其是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(見下文))。優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質(zhì)，即由SDS-PAGE鑒定純度高于40％、純度高于60％、純度高于80％，更優(yōu)選純度高于95％，甚至更優(yōu)選純度高于99％。
術(shù)語“分離蛋白質(zhì)”也可稱作“純化蛋白質(zhì)”。
同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”指來自本發(fā)明多肽最初來源的同源細(xì)胞中的任何雜質(zhì)(如除本發(fā)明多肽外的另一種多肽)。
來源于如本文與特殊微生物來源一起使用的術(shù)語“來源于”，指多核苷酸和/或多肽由特殊來源、或由插入了來自該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。
底物術(shù)語“底物”與蛋白酶底物有關(guān)的使用，應(yīng)當(dāng)被理解為其范圍最寬的形式，如含有至少一個(gè)易被枯草桿菌蛋白酶水解的肽鍵的化合物。
產(chǎn)物術(shù)語“產(chǎn)物”與來源于蛋白酶酶反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)的使用在本文中應(yīng)當(dāng)被理解為包括涉及枯草桿菌酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可能是下一個(gè)水解反應(yīng)的底物。
圖的簡(jiǎn)要描述圖1顯示了許多同源枯草桿菌酶根據(jù)枯草桿菌酶中18個(gè)高度保守的殘基的對(duì)比。這18個(gè)高度保守殘基以粗體標(biāo)明。所有顯示的枯草桿菌酶，除了JP170外，在保守殘基處100％相同。JP170在保守殘基G146處是“N”而不是“G”。
發(fā)明詳述具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體本發(fā)明鑒定了BLS309(SAVINASE)的洗滌性能有所改善的變體。
相應(yīng)地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及枯草桿菌酶變體，其中修飾選自N252L+T255IN252V+T255AN252M+T255C+S259HN252S+T255E+S259CN252K+T255S+S259C或在上述任何變體中包含一個(gè)或多個(gè)保守修飾的變體(如N252L(疏水性氨基酸)+T255I變體的保守修飾包括如N252I(疏水性氨基酸)+T255I和N252V(疏水性氨基酸)+T255I之類變體)。
本文測(cè)試了許多本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，顯示在洗滌劑中有改良的洗滌性能(參閱本文實(shí)施例(見下文))。
本領(lǐng)域眾所周知，氨基酸的相似保守氨基酸取代只會(huì)給酶的特性帶來輕微改變。
下面的表III列出了幾組保守氨基酸。
表III保守氨基酸取代堿性的 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的 谷氨酸天冬氨酸極性的 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性的亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸因此，枯草桿菌酶變體如252L+255I、252I+255I和252V+255I將具有相似的洗滌性能改良。而且，枯草桿菌酶變體如N252L+T255I、N252I+T255I和N252V+T255I也將具有相似的洗滌性能改良。
根據(jù)本文公開的枯草桿菌酶變體，鑒定其它適當(dāng)?shù)谋Ｊ厝〈垣@得具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是常規(guī)工作。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，感興趣的是那些屬于I-S1和I-S2亞組的枯草桿菌酶。
關(guān)于I-S1亞組，優(yōu)選的親本枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR或它們的保留了I-S1亞組特征的功能性變體。
關(guān)于I-S2亞組，優(yōu)選的親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB或它們的保留了I-S2亞組特征的功能性變體。
本發(fā)明還包括上述位點(diǎn)處的任何一個(gè)或多個(gè)修飾與對(duì)親本酶氨基酸序列的任何其它修飾的組合。尤其包括與本領(lǐng)域所知的用以改良酶特性的其它修飾的組合。本領(lǐng)域描述了許多具有不同改良特性的枯草桿菌酶變體，其中一部分在本文“發(fā)明背景”部分中提及(見上文)。那些參考文獻(xiàn)在本文公開，作為鑒定可以有利地與本發(fā)明枯草桿菌酶變體相組合的枯草桿菌酶變體的參考。
這些組合包括位點(diǎn)222(改善氧化穩(wěn)定性)和218(改善熱穩(wěn)定性)，Ca結(jié)合位點(diǎn)的取代使酶穩(wěn)定，如位點(diǎn)76，和現(xiàn)有技術(shù)已知的許多其它修飾。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以有利地與下列任何位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)修飾組合27、36、57、76、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。
特別地，下面的BLS309和BAPB92變體被認(rèn)為適合于組合K27R，*36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A，V104N，V104Y，H120D，N123S，Y167A，Y167I，R170S，R170L，R170N，Q206E，N218S，M222S，M222A，T224S，K235L和T274A。
另外，包括V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A變異或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合的任何變異與任何一個(gè)或多個(gè)上文提及的修飾組合的變體具有改良的特性。
此外，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與129、131、133和194中任何位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)修飾(更優(yōu)選129K、131H、133P、133D和194P修飾，最優(yōu)選P129K、P131H、A133P、A133D和A194P修飾)組合。那些修飾中的任何一種都可能使本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的表達(dá)水平更高。
在枯草桿菌酶基因中產(chǎn)生突變用于克隆本發(fā)明的枯草桿菌酶和用于將突變引入基因(如枯草桿菌酶基因)的許多方法在本領(lǐng)域中是眾所周知。
通常，可以使用克隆基因和在該基因中引入突變(隨機(jī)和/或定點(diǎn))的標(biāo)準(zhǔn)方法得到本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。關(guān)于合適的技術(shù)的進(jìn)一步描述參閱本文實(shí)施例(見下文)和(Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；F.M.Ausubel等人(主編)“分子生物學(xué)的最新方法”，John Wiley and Sons，1995；C.R.Harwood和S.M.Cutting(主編)“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”，John Wiley andSons，(1990)；和WO 96/34946)。
表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。由此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即以染色體外實(shí)體形式存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。或者，載體可以是這樣一種類型，當(dāng)它被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中時(shí)，會(huì)部分或全部整合到宿主細(xì)胞基因組中，并與整合的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地連接了DNA轉(zhuǎn)錄所需的附加片段。一般來說，表達(dá)載體來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或者可以含有二者的元件。術(shù)語“可操作地連接”指的是諸片段的排列方式使得它們能夠行使與預(yù)期用途(如轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子起始并貫穿編碼酶的DNA序列)一致的功能。
啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以來源于與宿主細(xì)胞同源或異源的編碼蛋白質(zhì)的基因。
適用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動(dòng)子，或者λ噬菌體PR或PL啟動(dòng)子，或者大腸桿菌lac、trp或tac啟動(dòng)子。
如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以可操作地連接合適的終止子。
本發(fā)明的重組載體還可以含有使載體能夠在所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體還可以含有選擇標(biāo)記，如其產(chǎn)物補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，或者編碼對(duì)卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉?br> 為了將本發(fā)明的酶導(dǎo)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號(hào)序列(也稱作前導(dǎo)序列、前體序列或前序列)。分泌信號(hào)序列以正確的閱讀框架與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號(hào)序列通常位于編碼酶的DNA序列的5’端。分泌信號(hào)序列可以是通常與酶有關(guān)的序列或可以來自編碼另一個(gè)分泌蛋白的基因。
用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動(dòng)子和任選終止子和/或分泌信號(hào)序列，或用適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增方案將這些序列裝配起來，和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的合適載體的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參閱如Sambrook等人，出處同上)。
宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以是與所選宿主同源或異源的序列。如果與宿主細(xì)胞同源，即由宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的，通常將它可操作地連接另一個(gè)啟動(dòng)子序列，或者如果可行的話，則連接另一個(gè)分泌信號(hào)序列和/或終止子序列(非天然的)。術(shù)語“同源”意指包括編碼所選宿主生物天然的酶的DNA序列。術(shù)語“異源”意指包括宿主細(xì)胞天然不表達(dá)的DNA序列。因此，DNA序列可以來自另一種生物體，或者可以是合成序列。
待導(dǎo)入本發(fā)明DNA構(gòu)建體或重組載體的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞。
經(jīng)過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的例子是革蘭氏陽性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬的菌株，諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌菌株，或鏈霉菌屬的菌株，諸如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細(xì)菌諸如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或通過感受態(tài)細(xì)胞以已知的方式進(jìn)行(參閱Sambrook等人，見上文)。
當(dāng)在細(xì)菌諸如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，通常以不溶性顆粒存在(稱為包涵體)，或可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)空間。在前一種情況中，裂解細(xì)胞，回收顆粒，變性，然后稀釋變性劑使酶重新折疊。在后一種情況中，酶可以從周質(zhì)空間回收，如用超聲波或滲透休克破碎細(xì)胞，以釋放周質(zhì)空間的成分，并回收酶。
當(dāng)在革蘭氏陽性細(xì)菌諸如芽孢桿菌或鏈霉菌菌株中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，酶可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，或可以被細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況中，酶可以如下文所述從培養(yǎng)基中回收。
生產(chǎn)枯草桿菌酶的方法本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明分離酶的方法，其中將轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細(xì)胞在允許酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)生的酶。
當(dāng)含有編碼酶的DNA序列的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化到異源宿主細(xì)胞中時(shí)，有可能異源重組產(chǎn)生本發(fā)明的酶。
由此有可能得到高度純化的枯草桿菌酶組合物，其特征為不含同源雜質(zhì)。
在本文中，同源雜質(zhì)指由本發(fā)明的酶最初來源的同源細(xì)胞產(chǎn)生的任何雜質(zhì)(如不同于本發(fā)明的酶的其它多肽)。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適合于所選宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的任何常規(guī)培養(yǎng)基?？梢院芊奖愕貙⒈磉_(dá)的枯草桿菌酶分泌到培養(yǎng)基中，并通過眾所周知的方法從中回收，所述方法包括經(jīng)離心或過濾將細(xì)胞與培養(yǎng)基分開、經(jīng)鹽(如硫酸銨)沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，隨后通過如離子交換層析、親和層析等層析方法純化。
本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的用途本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以用于許多工業(yè)用途，尤其是用于洗滌劑工業(yè)中。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的酶組合物。
下文描述了關(guān)于優(yōu)選的工業(yè)應(yīng)用的概述和相應(yīng)的優(yōu)選酶組合物。
此概述并非旨在完全列出本發(fā)明枯草桿菌酶變體的所有適當(dāng)應(yīng)用。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可應(yīng)用于本領(lǐng)域內(nèi)已知使用蛋白酶、尤其是枯草桿菌酶的其它工業(yè)應(yīng)用中。
含有突變酶的洗滌組合物本發(fā)明包括本發(fā)明的突變酶在清潔和洗滌組合物中的用途以及含有突變枯草桿菌蛋白酶的這種組合物。這些清潔和洗滌組合物在本領(lǐng)域中有很好的描述，關(guān)于合適的清潔和洗滌組合物的進(jìn)一步描述參閱WO 96/34946、WO 97/07202和WO 95/30011。
還可以參考本文的實(shí)施例，顯示本發(fā)明的許多枯草桿菌酶變體改良的洗滌性能。
洗滌劑的公開內(nèi)容和實(shí)例本發(fā)明的洗滌組合物中含有表面活性劑體系，其中表面活性劑可以選自非離子型和/或陰離子型和/或陽離子型和/或兩性型和/或兩性離子型和/或半極性型表面活性劑。
表面活性劑一般以0.1-60％重量的量存在。
優(yōu)選將表面活性劑配制成與組合物中存在的酶組分相容。在液體或凝膠組合物中，最優(yōu)選將表面活性劑配制成能促進(jìn)或至少是不降低這些組合物中的任何酶的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選體系包括本文中所述的作為表面活性劑的一種或多種非離子和/或陰離子表面活性劑。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯縮合物適合用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑，其中優(yōu)選聚氧乙烯縮合物。這些化合物包括具有含約6-14個(gè)碳原子，優(yōu)選約8-14個(gè)碳原子直鏈或支鏈構(gòu)型之烷基的烷基酚與烯化氧的縮合產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，環(huán)氧乙烷存在的量等于每摩爾烷基酚約2-25摩爾，更優(yōu)選約3-15摩爾的環(huán)氧乙烷。這類市售的非離子表面活性劑包括由GAFCorporation銷售的IgepalTMC0-630；和均由Rohm &amp; Haas Company銷售的TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102。這些表面活性劑通常被稱之為烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物適合用作本發(fā)明的非離子表面活性劑。該脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈的、伯或仲的，并且通常含有約8-22個(gè)碳原子。優(yōu)選的是具有含約8-20個(gè)碳原子，更優(yōu)選約10-18個(gè)碳原子烷基的醇與每摩爾醇約2-10摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。所述的縮合產(chǎn)物中每摩爾醇有約2-7摩爾的環(huán)氧乙烷，最優(yōu)選2-5摩爾的環(huán)氧乙烷?？蓮氖袌?chǎng)上購得的這類非離子表面活性劑的例子包括由Union Carbide Corporation銷售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)和TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的窄分子量分布的縮合產(chǎn)物)；和由Shell Chemical Company銷售的NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇與3.0摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇與7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-5(C14-C15直鏈醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；由Procter &amp; Gamble Company銷售的KyroTMEOB(C13-C15醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)；和由Hoechst銷售的GenapolLA050(C12-C14醇與5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)。這些產(chǎn)物的HLB的優(yōu)選范圍是8-11，最優(yōu)選8-10。
也可用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是在US4565647中公開的烷基多糖，該多糖具有含約6-30，優(yōu)選約10-16個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)和含約1.3-10，優(yōu)選約1.3-3，最優(yōu)選約1.3-2.7個(gè)糖單元的多糖如多糖苷親水基團(tuán)。可以使用任何含有5或6個(gè)碳原子的還原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖基部分(任選地，在2-，3-，4-等位連接疏水基團(tuán)從而得到與葡萄糖苷或半乳糖苷不同的葡萄糖或半乳糖)。該糖間鍵可以在，例如，附加糖單元的1位和前一糖單元的2-，3-，4-，和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基多糖苷具有下式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基、和其混合形式，其中烷基含有約10-18，優(yōu)選約12-14個(gè)碳原子；n是2或3，優(yōu)選2；t是0-約10，優(yōu)選0；x是約1.3-10，優(yōu)選約1.3-3，最優(yōu)選約1.3-2.7。該糖基優(yōu)選是從葡萄糖衍生的。為了制備這些化合物，先形成醇或烷基多乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)，從而形成葡糖苷(在1-位連接)。然后另外的糖基單元在其1-位置與前面的糖基單元2-，3-，4-，和/或6-位置，優(yōu)選主要在2-位之間連接。
環(huán)氧乙烷與通過環(huán)氧丙烷與丙二醇縮合形成的疏水基之間的縮合產(chǎn)物也適合用作本發(fā)明的附加非離子表面活性劑體系。這些化合物的疏水部分的分子量?jī)?yōu)選為約1500-1800并顯示出水不溶性。將聚氧乙烯部分加成到該疏水部分會(huì)增加整個(gè)分子的水溶性，在聚氧乙烯含量不超過該縮合產(chǎn)物總重量的約50％(相當(dāng)于與多達(dá)約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合)時(shí)，仍能保持該產(chǎn)品的液體性質(zhì)。這類化合物的例子包括某些可從市場(chǎng)上購得的由BASF銷售的PluronicTM表面活性劑。
也適合用作本發(fā)明非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑是環(huán)氧乙烷與從環(huán)氧丙烷和乙二胺反應(yīng)得到的產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的疏水部分由乙二胺和過量環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，并且分子量一般是約2500-3000。該疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合，縮合程度為該縮合產(chǎn)物含有約40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量為約5000-11000。這類非離子表面活性劑的例子包括某些可從市場(chǎng)上購得的由BASF銷售的TetronicTM化合物。
優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖、和其混合物。最優(yōu)選的是具有3-15個(gè)乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個(gè)乙氧基的C8-C18(優(yōu)選平均為C10)醇乙氧基化物、和其混合物。
非常優(yōu)選的非離子表面活性劑是下式的多羥基脂肪酸酰胺表面活性劑

其中R1是H，或R1是C1-4烴基、2-羥基乙基、2-羥基丙基或其混合形式，R2是C5-31烴基，Z是具有直鏈烴基鏈、至少3個(gè)羥基直接連接到該鏈上的多羥基烴基，或其烷氧基化的衍生物。優(yōu)選地，R1是甲基，R2是直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或鏈烯基鏈，例如椰油烷基，或其混合形式，Z是在還原性胺化反應(yīng)中從還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖衍生的。
非常優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化的硫酸鹽表面活性劑。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，一般為約0.5-6，更優(yōu)選約0.5-3，M是H或陽離子，該陽離子可以是例如金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代銨陽離子。本文也涵蓋烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽離子的具體例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和從烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些陽離子等。舉例說明的表面活性劑是C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸鹽(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸鹽(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(3.0)硫酸鹽(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0)硫酸鹽(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地選自鈉和鉀。
適用的陰離子表面活性劑是烷基酯磺酸鹽表面活性劑，包括按照“美國油類化學(xué)家協(xié)會(huì)雜志”(The Journal of the American OilChemists Society)，52(1975)，第323-329頁用氣態(tài)SO3磺化的C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直鏈酯。合適的原料包括從牛脂、棕櫚油等衍生的天然脂類物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑(尤其是用于洗衣用途的)包括下面結(jié)構(gòu)式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑

其中R3是C8-C20烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，R4是C1-C6烴基，優(yōu)選烷基，或其組合，M是與烷基酯磺酸根形成水溶性鹽的陽離子。合適的成鹽陽離子包括金屬陽離子(如鈉、鉀和鋰)和取代或未取代的銨陽離子(例如單乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。優(yōu)選地，R3是C10-C16烷基，R4是甲基、乙基或異丙基。特別優(yōu)選的是甲基酯磺酸鹽，其中R3是C10-C16烷基。
其它合適的陰離子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，它們是式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選是C10-C24烴基，優(yōu)選具有C10-C20烷基部分的烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，M是H或陽離子，例如堿金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰)，或者銨或取代銨(如甲基、二甲基和三甲基銨陽離子，和季銨陽離子例如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子，和從烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺和其混合形式衍生的季銨陽離子)等。一般地，對(duì)于較低的洗滌溫度(例如低于約50℃)，C12-C16烷基鏈?zhǔn)莾?yōu)選的，而對(duì)于較高的洗滌溫度(例如高于約50℃)，C16-C18烷基鏈?zhǔn)莾?yōu)選的。
其它對(duì)洗滌目的有用的陰離子表面活性劑也可以包括在本發(fā)明的衣物洗滌組合物中。它們可以包括皂的鹽(包括，例如鈉、鉀、銨、和取代的銨如單、二和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲烷烴磺酸鹽、C8-C24烯烴磺酸鹽、通過堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化多羧酸(例如在英國專利說明書號(hào)1082179中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚硫酸鹽(含有多達(dá)10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽、脂肪酰基甘油磺酸鹽、脂肪油基甘油硫酸鹽、烷基酚氧乙烯醚硫酸鹽、石蠟烴磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙磺酸鹽如?；u乙磺酸鹽、N-酰基?；撬猁}、烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸的單酯(特別是飽和和不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸的二酯(特別是飽和和不飽和C6-C12二酯)、?；“彼猁}、烷基多糖的硫酸鹽例如烷基多葡糖苷(下面所述的非離子型非硫酸化的化合物)的硫酸鹽、支鏈伯烷基硫酸鹽、和烷基多乙氧基羧酸鹽例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的鹽，其中R是C8-C22烷基，k是1-10的整數(shù)，M是形成水溶性鹽的陽離子。樹脂酸及氫化的樹脂酸也是合適的，例如松香、氫化松香，以及存在于或衍生于松漿油的樹脂酸和氫化樹脂酸。
烷基苯磺酸鹽是非常優(yōu)選的。特別優(yōu)選的是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中該烷基優(yōu)選含有10-18個(gè)碳原子。
其它例子描述于“表面活性劑與去污劑”(Surface Active Agentsand Detergents)(第I和II卷，Schwartz，Perry and Berch)中。各種這樣的表面活性劑也一般性地公開于US3929678中(第23欄58行-第29欄23行，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌組合物一般含有約1-40％，優(yōu)選約3-20％重量的上述陰離子表面活性劑。
本發(fā)明的衣物洗滌組合物也可以含有陽離子、兩性、兩性離子和半極性表面活性劑，以及上文中并未述及的非離子和/或陰離子表面活性劑。
適用于本發(fā)明衣物洗滌組合物中的陽離子洗滌表面活性劑是具有一個(gè)長(zhǎng)鏈烴基的那些表面活性劑。這樣的陽離子表面活性劑的例子包括銨表面活性劑例如烷基三甲基銨鹵化物，和具有下式的那些表面活性劑[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-其中R2是在烷基鏈中具有約8-18個(gè)碳原子的烷基或烷基芐基，每個(gè)R3選自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-、和其混合形式；每個(gè)R4選自C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、由兩個(gè)R4連接在一起形成的芐基環(huán)結(jié)構(gòu)、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于約1000的己糖聚合物，并且當(dāng)y不是0時(shí)是氫)；R5與R4所述相同或是烷基鏈，其中R2+R5的總碳原子數(shù)不大于約18；每個(gè)y是0-約10，且該y值的和是0至約15；X是任何相容的陰離子。
非常優(yōu)選的陽離子表面活性劑是具有下式的、在本發(fā)明組合物中有用的水溶性季銨鹽化合物R1R2R3R4N+X-(i)其中R1是C8-C16烷基，每個(gè)R2、R3和R4各自獨(dú)立地是C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H4O)xH(其中x的值為2-5)，X是陰離子。R2、R3、R4中不多于1個(gè)是芐基。
R1的優(yōu)選烷基鏈長(zhǎng)度是C12-C15，當(dāng)該烷基是從椰油或棕櫚仁脂衍生的鏈長(zhǎng)度的混合物，或是通過烯烴合成或OXO醇合成而合成衍生的時(shí)尤為如此。
用于R2、R3和R4的優(yōu)選基團(tuán)是甲基和羥基乙基，陰離子X可以選自鹵素離子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根離子。
用于本文中的合適的式(I)季銨化合物的例子是氯化或溴化椰油基三甲基銨；氯化或溴化椰油基甲基二羥基乙基銨；氯化癸基三乙基銨；氯化或溴化癸基二甲基羥基乙基銨；氯化或溴化C12-15二甲基羥基乙基銨；
氯化或溴化椰油基二甲基羥基乙基銨；甲基硫酸肉豆蔻基三甲基銨；氯化或溴化月桂基二甲基芐基銨；氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4銨；膽堿酯(式(i)的化合物，其中R1是

烷基，R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
其它在本文中有用的陽離子表面活性劑也描述于US4228044和EP000224中。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌組合物一般含有約0.2-25％，優(yōu)選約1-8％重量的上述陽離子表面活性劑。
兩性表面活性劑也適用于本發(fā)明的衣物洗滌組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的脂族衍生物，或雜環(huán)仲或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基團(tuán)可以是直鏈或支鏈的。其中1個(gè)脂族取代基含有至少約8個(gè)碳原子，一般約8-18個(gè)碳原子，并且至少一個(gè)脂族取代基含有陰離子型水增溶性基團(tuán)，例如羧基、磺酸根、硫酸根。見US3929678(第19欄18-35行)的兩性表面活性劑的例子。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌組合物一般含有約0.2-15％重量，優(yōu)選約1-10％重量的上述兩性表面活性劑。
兩性離子表面活性劑也適用于本發(fā)明的衣物洗滌組合物中。這些表面活性劑可以概括地描述為仲或叔胺的衍生物，雜環(huán)的仲或叔胺的衍生物，或者季銨、季鏻或叔锍化合物的衍生物。見US3929678(第19欄38行-22欄48行)的兩性離子表面活性劑的例子。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌組合物一般含有約0.2-15％重量，優(yōu)選約1-10％重量的上述兩性離子表面活性劑。
半極性非離子表面活性劑是一特殊類型的非離子表面活性劑，它們包括含有1個(gè)約10-18個(gè)碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個(gè)碳原子的烷基或羥基烷基的2個(gè)部分的水溶性氧化胺；含有1個(gè)約10-18個(gè)碳原子的烷基部分和選自含有約1-3個(gè)碳原子的烷基或羥基烷基的2個(gè)部分的水溶性氧化膦；和含有1個(gè)約10-18個(gè)碳原子的烷基部分和1個(gè)選自含有約1-3個(gè)碳原子的烷基或羥基烷基的部分的水溶性亞砜。
半極性非離子表面活性劑包括具有下式的氧化胺表面活性劑

其中R3是含有約8-22個(gè)碳原子的烷基、羥基烷基、或烷基苯基，或其混合形式；R4是含有約2-3個(gè)碳原子的亞烷基或羥基亞烷基或其混合形式；x是0-約3；每個(gè)R5是含有約1-3個(gè)碳原子的烷基或羥基烷基，或含有約1-3個(gè)氧乙烯基團(tuán)的多氧乙烯基。R5基團(tuán)可以彼此連接，例如通過氧或氮原子，從而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。
特別地，這些氧化胺表面活性劑包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和氧化C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基胺。
當(dāng)包括在其中時(shí)，本發(fā)明的衣物洗滌組合物一般含有約0.2-15％重量，優(yōu)選約1-10％重量的上述半極性非離子表面活性劑。
助洗劑體系本發(fā)明的組合物還可含有助洗劑體系。任何常規(guī)助洗劑體系都適用于本文中，其包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽的材料、金屬離子螯合劑例如氨基多膦酸鹽特別是乙二胺四亞甲基膦酸和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸。盡管由于明顯的環(huán)境原因并不優(yōu)選，但本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。
合適的助洗劑可以是無機(jī)離子交換材料，通常是無機(jī)水合的硅鋁酸鹽材料，更具體地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
另一種合適的無機(jī)助洗劑材料是層狀硅酸鹽例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的結(jié)晶層狀硅酸鹽。
合適的含有1個(gè)羧基的多羧酸鹽包括乳酸、乙醇酸和其醚衍生物的水溶性鹽，如在比利時(shí)專利號(hào)831368、821369和821370中所公開的。含有2個(gè)羧基的多羧酸鹽包括琥珀酸、丙二酸、(亞乙二氧基)二乙酸、馬來酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及在德國專利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸鹽，和在比利時(shí)專利號(hào)840623中所述的亞硫酰基羧酸鹽。含有3個(gè)羧基的多羧酸鹽具體地包括水溶性檸檬酸鹽、烏頭酸鹽(aconitrate)和檸康酸鹽以及琥珀酸鹽衍生物，例如，在英國專利號(hào)1379241中所述的羧基甲氧基琥珀酸鹽，在荷蘭申請(qǐng)7205873中所述的乳氧琥珀酸鹽(lactoxysuccinate)，和氧多羧酸鹽材料例如在英國專利號(hào)1387447中所述的2-氧雜-1，1，3-丙三羧酸鹽。
含有4個(gè)羧基的多羧酸鹽包括在英國專利號(hào)1261829中公開的氧聯(lián)二琥珀酸鹽、1，1，2，2-乙四羧酸鹽、1，1，3，3-丙四羧酸鹽和1，1，2，3-丙四羧酸鹽。含有磺基取代基的多羧酸鹽包括在英國專利號(hào)1398421和1398422和US3936448中公開的磺基琥珀酸鹽衍生物、和在英國專利號(hào)1082179中所述的磺化的熱解檸檬酸鹽，而英國專利號(hào)1439000中公開了含有膦取代基的多羧酸鹽。
脂環(huán)和雜環(huán)多羧酸鹽包括環(huán)戊烷-順，順，順-四羧酸鹽、環(huán)戊二烯五羧酸鹽(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氫呋喃-順，順，順-四羧酸鹽、2，5-四氫呋喃-順-二羧酸鹽、2，2，5，5-四氫呋喃-四羧酸鹽、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸鹽和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸鹽包括苯六甲酸、1，2，4，5，-苯四酸和在英國專利號(hào)1425343中公開的苯二甲酸衍生物。
在上面的多羧酸鹽中，優(yōu)選的多羧酸鹽是每分子含有最多達(dá)3個(gè)羧基的羥基羧酸鹽，更具體地是檸檬酸鹽。
用于本發(fā)明組合物中的優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A或?qū)訝罟杷猁}(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸螯合劑例如檸檬酸。
包括在本發(fā)明洗滌組合物中的合適的螯合劑包括乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代銨鹽，或其混合物。優(yōu)選的EDDS化合物是游離酸形式的和其鈉或鎂鹽。這樣的優(yōu)選EDDS鈉鹽的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。這樣的優(yōu)選EDDS鎂鹽的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽是最優(yōu)選包括在本發(fā)明組合物中的。
優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑例如沸石A和水溶性羧酸螯合劑例如檸檬酸的混合物。
可以形成用于粒狀組合物的助洗劑體系中一部分的其它助洗劑材料包括無機(jī)材料例如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機(jī)材料例如有機(jī)膦酸鹽、氨基多亞烷基膦酸鹽和氨基多羧酸鹽。
其它合適的水溶性有機(jī)鹽是均聚和共聚的酸或其鹽，其中該聚羧酸包括兩兩之間被不多于2個(gè)碳原子分開的至少兩個(gè)羧基。
這類聚合物公開于GB-A-1596756中。這樣的鹽的例子是MW2000-5000的聚丙烯酸鹽和其與馬來酸酐的共聚物，這樣的共聚物具有20000-70000，特別是約40000的分子量。
洗滌助洗劑鹽的量通常為組合物重量的5-80％。用于液體洗滌劑的助洗劑的優(yōu)選量是5-30％。
酶除了本發(fā)明的酶制劑外，優(yōu)選洗滌組合物還含有提供清洗性能和/或織物護(hù)理益處的其它酶。
這樣的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶可以使用適用于堿性溶液的其它任何蛋白酶。合適的蛋白酶包括動(dòng)物、植物或微生物來源的。微生物來源是優(yōu)選的。包括化學(xué)或基因修飾的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是從芽孢桿菌衍生的那些，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO 89/06270中)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的)和描述于WO 89/06270中的鐮孢屬蛋白酶。
優(yōu)選的市售蛋白酶包括由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase銷售的那些，由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、和Purafect OXP銷售的那些，和由SolvayEnzymes以商品名Opticlean和Optimase銷售的那些。按組合物重量計(jì)，可以以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將蛋白酶摻入到本發(fā)明的組合物中。
脂肪酶可以使用任何適用于堿性溶液的脂肪酶。合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程修飾的突變體。
有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述于EP 258068和EP305216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如描述于EP 238023中的，假絲酵母屬脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶，例如描述于EP214761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假單胞菌屬脂肪酶例如描述于EP 218272中的產(chǎn)堿假單胞菌和類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶、例如描述于EP 331376中的洋蔥假單胞菌脂肪酶、例如公開于GB1372034中的司徒茨氏假單胞菌脂肪酶，熒光假單胞菌脂肪酶，芽孢桿菌脂肪酶例如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemicaet Biophsica acta 1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶(JP64/744992)和短小芽孢桿菌脂肪酶(WO91/16422)。
此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991年《基因》103，61-67上描述的沙門氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化學(xué)雜志，106，383-388)，和各種根霉屬脂肪酶例如德列馬根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，Gene 109，117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci.Biotech.Biochem.56，716-719)和米根霉脂肪酶。
其它類型的脂類分解酶，如角質(zhì)酶也是有用的，例如WO88/09867所述來自門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶，來自Fusarium solani pisi的角質(zhì)酶(如WO90/09446所述)。
特別合適的脂肪酶是下面這些脂肪酶例如M1 LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(Genecor)，LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovoNordisk A/S)，和Lipase P“Amano”(Amano Pharmacetical Co.Ltd.)。
按組合物重量計(jì)，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將脂肪酶摻入到本發(fā)明的洗滌組合物中。
淀粉酶可以使用適用于堿性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)。合適的淀粉酶包括細(xì)菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程修飾的突變體。淀粉酶包括例如，在GB1296839中詳細(xì)描述的從地衣芽孢桿菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(從Novo Nordisk A/S得到)和RapidaseTM和Maxamyl PTM(從Genencor得到)。
按組合物重量計(jì)，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將淀粉酶摻入到本發(fā)明的洗滌組合物中。
纖維素酶可以使用適用于堿性溶液的任何纖維素酶。合適的纖維素酶包括細(xì)菌和真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程修飾的突變體。合適的纖維素酶公開于US4435307(其中公開了從Humicolainsolens生產(chǎn)的真菌纖維素酶)，WO96/34108和WO96/34092(其中公開了來自芽孢桿菌的細(xì)菌嗜堿性纖維素酶BCE103)，WO94/21801、US5,475,101和US5,419,778(其中公開了木霉的EGIII纖維素酶)中。特別合適的纖維素酶是具有顏色護(hù)理益處的纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述于歐洲專利申請(qǐng)0495257中的纖維素酶。市售的纖維素酶包括從一株Humicola insolens生產(chǎn)的CelluzymeTM(Novo NordiskA/S)以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
按組合物重量計(jì)，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將纖維素酶摻入到本發(fā)明的洗滌組合物中。
過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或其源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)一起使用。氧化酶與氧一起使用。兩種類型的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗滌液中一起洗滌，優(yōu)選與例如WO94/12621和WO 95/01426中所述的增強(qiáng)劑一起洗滌所述織物時(shí)，防止染料從染色織物轉(zhuǎn)移到另一織物上。合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)或基因工程修飾的突變體。
按組合物重量計(jì)，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將過氧化物酶和/或氧化酶摻入到本發(fā)明的洗滌組合物中。
在本文中包括上述酶的混合物，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶的混合物。
按組合物重量計(jì)，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將本發(fā)明的酶或摻入到洗滌組合物中的其它任何酶摻入到本發(fā)明的洗滌組合物中。
漂白劑可以包括在本發(fā)明洗滌組合物中的附加的任選洗滌組分包括漂白劑，例如粒徑為400-800微米的PB1、PB4和過碳酸鹽。這些漂白劑組分可以包括一種或多種氧漂白劑，并且根據(jù)所選擇的漂白劑，可包括一種或多種漂白活化劑。當(dāng)存在氧漂白化合物時(shí)，其存在的量一般是約1-25％。通常，在非液體配方例如粒狀洗滌劑中，漂白化合物是任選加入的組分。
用于本文中的漂白劑組分可以是任何在洗滌組合物中有用的漂白劑，包括氧漂白劑以及本領(lǐng)域已知的其它漂白劑。
適合于本發(fā)明的漂白劑可以是活化的或未活化的漂白劑。
一類可以使用的氧漂白劑包括過羧酸漂白劑和其鹽。這類試劑的合適的例子包括單過氧鄰苯二甲酸鎂六水合物，間氯過苯甲酸、4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸和雙過氧十二烷雙酸的鎂鹽。這樣的漂白劑公開于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常優(yōu)選的漂白劑也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。
另一類可以使用的漂白劑包括鹵素漂白劑。例如，次鹵酸鹽漂白劑的例子包括三氯異氰脲酸，以及二氯異氰脲酸的鈉和鉀鹽，和N-氯代和N-溴代烷烴磺基酰胺。這樣的材料通常以最終產(chǎn)品重量的0.5-10％、優(yōu)選1-5％的量加入。
可以將過氧化氫釋放劑與漂白活化劑一起使用，該漂白活化劑是例如四乙?；叶?TAED)、壬酰氧基苯磺酸鹽(NOBS，描述于US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸鹽(ISONOBS，描述于EP120591中)或五乙?；咸烟?PAG)；將它們過水解后能形成過氧酸作為活性漂白物質(zhì)，導(dǎo)致改進(jìn)的漂白作用。另外，非常合適的是這些漂白活化劑C8(6-辛酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽、C9(6-壬酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽和C10(6-癸酰胺基己?；?羥苯磺酸鹽或其混合物。還合適的活化劑是?；臋幟仕狨?，例如在歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?1870207.7所公開的。
可用于本發(fā)明清洗組合物中的有用的漂白劑，包括過氧酸和含有漂白活化劑和過氧漂白化合物的漂白體系描述于專利申請(qǐng)USSN08/136626中。
通過在洗滌和/或漂洗過程的開始或期間加入能夠生成過氧化氫的酶體系(即酶和其底物)，也可以存在過氧化氫。這樣的酶體系公開于歐洲專利申請(qǐng)EP0537381中。
除了氧漂白劑以外的漂白劑也是本領(lǐng)域已知的，并且可以在本文中使用。特別重要的一類非氧漂白劑包括光活化漂白劑，例如磺化的鋅和/或鋁酞菁。這些材料可以在洗滌期間沉積在被洗物上。當(dāng)存在氧時(shí)用光照射，例如通過將衣服掛出在日光中干燥時(shí)，該磺化的鋅酞菁被活化，結(jié)果該被洗物被漂白。優(yōu)選的鋅酞菁和光活化漂白方法描述于US4033718中。洗滌組合物一般含有約0.025-1.25％重量的磺化鋅酞菁。
漂白劑也可以包括錳催化劑。錳催化劑可以是例如在“低溫漂白的有效錳催化劑(Efficient manganese catalysts for low-temperaturebleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一種化合物。
抑泡劑另一個(gè)任選的組分是抑泡劑，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。硅氧烷通?？梢杂猛榛木酃柩跬椴牧蟻肀硎荆枋话阋约?xì)分散形式使用，例如二氧化硅氣凝膠和干凝膠和各種類型的疏水二氧化硅。這些材料可以作為顆粒加入，其中抑泡劑有利地可釋放地?fù)饺氲剿苄曰蛩稚⑿缘摹⒒旧蠠o表面活性的洗滌劑不可滲透的載體中。另外，可以將抑泡劑溶解或分散在液體載體中并通過噴霧在一種或多種其它組分上來涂覆。
優(yōu)選的硅氧烷抑泡劑公開于US3933672中。其它特別有用的抑泡劑是德國專利申請(qǐng)DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡劑。這樣的化合物的例子是可從Dow Corning購得的DC-544，它是硅氧烷-二元醇共聚物。特別優(yōu)選的抑泡劑是含有硅油和2-烷基-鏈烷醇混合物的抑泡劑體系。合適的2-烷基-鏈烷醇是以商品名Isofol 12 R購得的2-丁基-辛醇。
這樣的抑泡劑體系公開于歐洲專利申請(qǐng)EPO593841中。
特別優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑描述于歐洲專利申請(qǐng)92201649.8中。所述的組合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的無孔硅石例如AerosilR。
按組合物重量計(jì)，通常以0.001-2％，優(yōu)選0.01-1％的量使用上述的抑泡劑。
其它組分可以在洗滌組合物中使用的其它組分有例如污垢懸浮劑、污垢除去劑、熒光增白劑、磨料、殺菌劑、變色抑制劑、著色劑和/或包覆或未包覆的香料。
特別合適的包覆材料是由多糖基質(zhì)和多羥基化合物組成的水溶性膠囊，如在GB 1464616中所述的。
其它合適的水溶性包覆材料包括從取代二羧酸的未凝膠化淀粉酸酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的。這些酸酯糊精優(yōu)選是從諸如蠟質(zhì)玉米、蠟質(zhì)高粱、西米、木薯和馬鈴薯的淀粉制備的。所述的包覆材料的合適例子包括由National Starch制造的N-Lok。該N-Lok包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖組成。該淀粉是通過加上單官能取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。
適合于本文中的防再污染劑和污垢懸浮劑包括纖維素衍生物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥乙基纖維素，和均聚或共聚的聚羧酸或其鹽。這類聚合物包括上述作為助洗劑提到的聚丙烯酸鹽和馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及馬來酸酐與乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸的共聚物，其中馬來酸酐至少構(gòu)成共聚物的20％摩爾。按組合物重量計(jì)，這些材料通常以組合物重量的0.5-10％，更優(yōu)選0.75-8％，最優(yōu)選1-6％的量使用。
優(yōu)選的熒光增白劑是陰離子性的，其例子是4，4’-雙-(2-雙乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉鹽、4，4’-雙-(2-嗎啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、4’，4”-雙-(2，4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)芪-22’-二磺酸二鈉、4，4’-雙-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羥乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-22’-二磺酸二鈉、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’4，5)-1，2，3-三唑-2”-磺酸鈉和4，4’-雙-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特別是分子量為1000-10000，更具體是2000-8000和最優(yōu)選是約4000的那些。以0.20-5％重量，更優(yōu)選0.25-2.5％重量的量使用這些聚合物材料。這些聚合物和上述均聚或共聚的聚羧酸鹽對(duì)于存在過渡金屬雜質(zhì)時(shí)改進(jìn)白度維持性，織物灰分沉積和對(duì)粘土、蛋白質(zhì)性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。
在本發(fā)明組合物中有用的污垢除去劑是對(duì)苯二甲酸與乙二醇和/或丙二醇單元各種對(duì)比的常規(guī)共聚物或三元共聚物。這樣的聚合物的例子公開于US4116885和US4711730及EP0272033中。根據(jù)EP0272033特別優(yōu)選的聚合物具有下式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。
還非常有用的是作為二甲基對(duì)苯二甲酸酯、二甲基磺基間苯二酸酯、乙二醇和1，2-丙二醇無規(guī)共聚物的改性聚酯，該端基主要由磺基苯甲酸酯組成，還有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯。目的是“主要”得到在兩端由磺基苯甲酸基團(tuán)封端的聚合物，本文中是絕大多數(shù)本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基團(tuán)封端的。然而，某些共聚物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯組成，其“次要”地由這樣的物質(zhì)組成。
本文中選擇的聚酯含有約46％重量的二甲基對(duì)苯二甲酸，約16％重量的1，2-丙二醇，約10％重量的乙二醇，約13％重量的二甲基磺基苯甲酸和約15％重量的磺基間苯二酸，并且其分子量為約3000。該聚酯和其制備方法詳細(xì)地?cái)⑹鲇贓P311342中。
柔軟劑可以將織物柔軟劑加入到本發(fā)明的衣物洗滌組合物中。這些試劑在類型上可以是無機(jī)或有機(jī)的。無機(jī)柔軟劑的例子是在GB-A-1400898和US5019292中公開的綠土粘土。有機(jī)的織物柔軟劑包括如在GB-A-1514276和EP 0011340中公開的水不溶性叔胺，其與單C12-C14季胺鹽的混合物(公開于EP-B 0026528中)，和如在EP 0242919中所公開的二長(zhǎng)鏈酰胺?？椢锶彳泟w系的其它有用有機(jī)組分包括高分子量的聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公開的。
綠土粘土的含量一般在5-15％重量的范圍，更優(yōu)選8-12％重量，作為干混合組分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般1-3％重量的量加入有機(jī)織物柔軟劑，例如水不溶性叔胺或二長(zhǎng)鏈酰胺材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧乙烯材料和水溶性陽離子材料。盡管在某些情況下作為干混顆粒加入它們可以更方便，但一般將這些材料加到該組合物的噴霧干燥組分上，或者作為熔融的液體將它們噴霧到組合物的其它固體組分上。
聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑按照本發(fā)明的洗滌組合物還包括0.001-10％重量，優(yōu)選0.01-2％重量，更優(yōu)選0.05-1％重量的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑。一般將所述的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑加入到洗滌組合物中以便抑制染料從有色織物轉(zhuǎn)移到與其一起洗滌的織物上。在染料于洗滌中附著到其它物品上之前，這些聚合物會(huì)絡(luò)合或吸附從染色織物洗滌下來的短效染料。
特別合適的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯基鎓唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。
加入這樣的聚合物也增強(qiáng)了本發(fā)明酶的性能。
本發(fā)明的洗滌組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或粒狀形式。
可以按例如US4106991和US4661452(兩者均是Novo Industri A/S的專利)中所公開的生產(chǎn)無塵的顆粒，并且該顆?？梢匀芜x地用本領(lǐng)域已知的方法涂覆。蠟質(zhì)涂覆材料的例子是平均分子量為1000-20000的聚(氧乙烯)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中該醇含有12-20個(gè)碳原子并且其中有15-80個(gè)環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-及三-甘油酯。在GB1483591中給出了適合于流化床技術(shù)涂覆的成膜涂覆材料的例子。
本發(fā)明的粒狀組合物也可以是“致密形式”的，即它們具有比常規(guī)的粒狀洗滌劑相對(duì)高的密度，即550-950g/l；在這樣的情況下，本發(fā)明的粒狀洗滌組合物將含有比常規(guī)顆粒洗滌劑更少量的“無機(jī)填料鹽”；一般的填料鹽是堿土金屬的硫酸鹽和氯化物，一般是硫酸鈉；“致密”的洗滌劑一般包括不多于10％的填料鹽。本發(fā)明的液體組合物也可以是“濃縮形式”的，在這樣的情況下，本發(fā)明的液體洗滌組合物將比常規(guī)的液體洗滌劑含有較低量的水。按組合物重量計(jì)，濃縮的液體洗滌劑的水含量一般低于30％，更優(yōu)選低于20％，最優(yōu)選低于10％。
例如，可以將本發(fā)明的組合物配制為手洗或機(jī)洗衣物洗滌組合物，包括洗衣添加劑組合物和適用于臟織物預(yù)處理的組合物，漂洗加入的織物柔軟劑組合物，和用于普通家庭硬表面清洗和碗碟洗滌的組合物。
下面的實(shí)例旨在舉例說明本發(fā)明的組合物，而不對(duì)本發(fā)明范圍作任何限制。
在洗滌組合物中，縮寫組分符號(hào)具有下面的意義LAS直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS牛脂烷基硫酸鈉XYAS C1X-C1Y烷基硫酸鈉SS 式2-丁基辛酸的仲皂表面活性劑25EY 與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇45EY 與平均Y摩爾環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇XYEZS 每摩爾與平均Z摩爾環(huán)氧乙烷縮合的C1X-C1Y烷基硫酸鈉非離子 由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404銷售的、平均乙氧基化程度為3.8和平均丙氧基化程度為4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇CFAA C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAA C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽 無定型硅酸鈉(SiO2Na2O比＝2.0)NaSKS-6式d-Na2Si2O5的結(jié)晶層狀硅酸鹽碳酸鹽 無水碳酸鈉磷酸鹽 三聚磷酸鈉MA/AA 1∶4的馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約80000聚丙烯酸酯 BASF GmbH以商品名PA30銷售的平均分子量為約8000的聚丙烯酸酯均聚物沸石A 式Na12(AlO2SiO2)12.27H2O的水合硅鋁酸鈉，主要粒徑為1-10微米檸檬酸鹽 檸檬酸三鈉二水合物檸檬酸 檸檬酸過硼酸鹽 無水過硼酸鈉一水合物漂白劑，經(jīng)驗(yàn)式為NaBO2.H2O2PB4無水過硼酸鈉四水合物過碳酸鹽 經(jīng)驗(yàn)式為2Na2CO3.3H2O2的無水過碳酸鈉漂白劑TAED 四乙?；叶稢MC羧甲基纖維素鈉DETPMP 由Monsanto以商品名Dequest 2060銷售的二乙三胺五(亞甲基膦酸)PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS 鈉鹽形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]異構(gòu)體抑泡劑 25％熔點(diǎn)為50℃的石蠟，17％的疏水性二氧化硅，58％的石蠟油顆粒抑泡劑 顆粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％的硬脂醇，70％的淀粉硫酸鹽 無水硫酸鈉HMWPEO 高分子量聚氧乙烯TAE 25 牛脂醇乙氧基化物(25)洗滌劑實(shí)施例I可以按如下所示制備本發(fā)明粒狀織物清洗組合物線性C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 15.0沸石A 26.0次氮基三醋酸鈉 5.0本發(fā)明的酶 0.1PVP0.5TAED 3.0
硼酸 4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽 0.1次要組份 至100洗滌劑實(shí)施例II可以按如下所示制備本發(fā)明的致密粒狀織物清洗組合物(密度800g/l)45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-612.0檸檬酸 3.0碳酸鹽 7.0MA/AA 5.0CMC0.4本發(fā)明的酶 0.1TAED 6.0過碳酸鹽 22.0EDDS 0.3粒狀抑泡劑 3.5水/次要組份至100％洗滌劑實(shí)施例III按如下所示制備在洗滌彩色織物中特別有用的本發(fā)明粒狀織物清洗組合物
LAS10.7 -TAS2.4 -TFAA - 4.045AS 3.1 10.045E7 4.0 -25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5 - 8.0檸檬酸鹽 15.0 7.0碳酸鹽 - 10檸檬酸 2.5 3.0沸石A 32.1 25.0NaSKS-6- 9.0MA/AA 5.0 5.0DETPMP 0.2 0.8本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 2.5 -硫酸鹽 5.2 3.0PVP0.5 -聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/ - 0.2乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽 1.0 -苯酚磺酸鹽 0.2 -水/次要組份至100％洗滌劑實(shí)施例IV可按如下所示制備本發(fā)明具有“通過洗滌進(jìn)行軟化”的能力的粒狀織物清洗組合物
45AS - 10.0LAS7.6 -68AS 1.3 -45E7 4.0 -25E3 - 5.0氯化椰油烷基二甲基羥乙基銨 1.4 1.0檸檬酸鹽 5.0 3.0NaSKS-6- 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP 0.4 0.4過硼酸鹽 15.0 -過碳酸鹽 - 15.0TAED 5.0 5.0綠土粘土 10.0 10.0HMWPEO - 0.1本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 3.0 5.0碳酸鹽 10.0 10.0粒狀抑泡劑 1.0 4.0CMC0.2 0.1水/次要組份至100％洗滌劑實(shí)施例V可按如下制備本發(fā)明的重垢液體織物清洗組合物I II酸形式的LAS- 25.0檸檬酸 5.0 2.0酸形式的25AS 8.0 -
酸形式的25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA 5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0本發(fā)明的酶 0.10 0.05氯化椰油烷基二甲基羥乙基銨 - 3.0綠土粘土 - 5.0PVP2.0 -水/次要組份至100％在皮革工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以用于皮革工業(yè)，尤其用于皮的脫毛。
在該應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選在還含有另一種蛋白酶的酶組合物中使用。
關(guān)于合適的其它蛋白酶的更詳細(xì)的描述參閱關(guān)于適用于洗滌組合物中的酶的部分(見上文)。
在毛紡工業(yè)中的應(yīng)用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以用于毛紡工業(yè)，尤其是用于含毛衣物的洗滌。
在該應(yīng)用中，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體優(yōu)選在還含有另一種蛋白酶的酶組合物中使用。
關(guān)于適當(dāng)?shù)钠渌鞍酌傅母敿?xì)描述參閱關(guān)于適用于洗滌組合物中的酶的部分(見上文)。
本發(fā)明在下列實(shí)施例中有更詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例并不以任何方式意圖限制本發(fā)明要求的范圍。
材料和方法菌株枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。
遲緩芽孢桿菌309和147是遲緩芽孢桿菌的特殊菌株，保藏于NCIB，編號(hào)NCIB 10309和10147，而且描述于美國專利號(hào)3,723,250中，該專利文獻(xiàn)本文引用作為參考。
大腸桿菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物學(xué)雜志138 179-207)，用常規(guī)方法制成r-，m+，其還描述于美國專利申請(qǐng)?zhí)?39,298。
質(zhì)粒pJS3大腸桿菌—枯草芽孢桿菌穿梭載體，含有編碼枯草桿菌酶309的合成基因(由Jacob Schiodt等人描述于“蛋白質(zhì)和多肽通訊”(Protein and Peptide letters)339-44(1996))。
pSX222枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(描述于WO 96/34946)。
常用分子生物學(xué)方法除非特別指出，DNA操作和轉(zhuǎn)化用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook等人(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約；F.M.Ausubel等人(主編)“分子生物學(xué)通用方法”(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，1995；C.R.Harwood和S.M.Cutting(主編)“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus)，John Wiley and Sons，1990)。
用于DNA操作的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用。
用于基因操作的酶除非特別指出，所有用于DNA操作的酶，如限制性內(nèi)切酶、連接酶等等，均購自New England Biolabs，Inc.。
蛋白水解活性在本發(fā)明中蛋白水解活性以“千諾氏蛋白酶單位”(Kilo NOVOProtease Units，KNPU)表示?；钚允窍鄬?duì)于標(biāo)準(zhǔn)酶(SAVINASE)測(cè)定的，而且測(cè)定是建立在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即50℃，pH8.3，反應(yīng)時(shí)間9分鐘，測(cè)量時(shí)間3分鐘)蛋白水解酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液的基礎(chǔ)之上的?？梢韵虻淣ovo Nordisk A/S索取文件AF 220/1，該文件此處引用作為參考。
GU即甘氨酸單位(Glycine Unit)，定義為以N-乙酰酪蛋白作為底物，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，于40℃保溫15分鐘時(shí)，產(chǎn)生相當(dāng)于1毫摩爾甘氨酸的氨基量的蛋白水解酶活性。
酶活性也可以用PNA實(shí)驗(yàn)，根據(jù)與可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-對(duì)硝基苯酚的反應(yīng)測(cè)量(描述于美國石油化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(Journal of American Oil Chemists Society)，T.M.Rothgeb，B.D.Goodlander，P.H.Garrison和L.A.Smith，(1988))。
發(fā)酵枯草桿菌酶的發(fā)酵于30℃在搖床上(300r.p.m.)含100ml BPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板Erlenmeyer錐形瓶中進(jìn)行5天。
因此，為了得到例如2升培養(yǎng)液，需要20個(gè)Erlenmeyer錐形瓶同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。
培養(yǎng)基BPX組成(每升)土豆淀粉 100g碾碎的大麥 50g大豆粉 20gNa2HPO4·12H2O9gPluronic 0.1g酪蛋白鈉鹽 10g培養(yǎng)基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培養(yǎng)基通過加熱至120℃并保持45分鐘滅菌。滅菌后加入NaHCO3至0.1M將培養(yǎng)基的pH調(diào)至9。
實(shí)施例實(shí)施例1酶變體的構(gòu)建和表達(dá)定點(diǎn)誘變枯草桿菌酶309的定點(diǎn)誘變體是使用“單一位點(diǎn)刪除(unique siteelimination，USE)”或“尿嘧啶-USE”技術(shù)(分別描述于Deng等人(分析生化(Anal.BioChem)20081-88(1992))，Markvardsen等人(生物技術(shù)(BioTechniques)18(3)371-372(1995)))制成的。
模板質(zhì)粒是pJS3，或該質(zhì)粒含有枯草桿菌酶309變體的類似物，例如，用一段針對(duì)T255I變體構(gòu)建體的寡核苷酸，對(duì)含有N252L變體編碼基因的pJS3類似物進(jìn)行USE誘變，產(chǎn)生最終的N252L+T255I枯草桿菌酶309變體。
然后用限制酶KpnI和MluI將pJS3構(gòu)建的枯草桿菌酶309變體亞克隆到枯草芽孢桿菌pSX222表達(dá)型質(zhì)粒中。
定域隨機(jī)誘變進(jìn)行定域隨機(jī)誘變的完整策略是合成對(duì)應(yīng)于DNA序列中待誘變部分的誘變引物(寡核苷酸)，該引物在對(duì)應(yīng)于待誘變氨基酸密碼子的核苷酸處不同。
然后，將得到的誘變引物與適當(dāng)?shù)姆聪蛞镆黄鹩糜赑CR反應(yīng)。將得到的PCR片段純化和消化并克隆到大腸桿菌—枯草芽孢桿菌穿梭載體中。
或者如果有必要，將得到的PCR片段作為引物與第二個(gè)適當(dāng)?shù)姆聪蛞镆黄鹩糜诘诙€(gè)PCR反應(yīng)，使得能夠消化誘變區(qū)并將其克隆到穿梭載體中。PCR反應(yīng)在常規(guī)條件下進(jìn)行。
遵循這種策略，構(gòu)建SAVINASE的定域隨機(jī)文庫，其中位點(diǎn)N252、T255和S259被完全隨機(jī)化。
合成寡核苷酸，在想要突變的氨基酸密碼子的第一個(gè)和第二個(gè)堿基處，四種堿基中的每一種(N)都占25％。在密碼子的第三個(gè)核苷酸(搖擺堿基)處，G和C(S)各占50％，以避免三個(gè)終止密碼子中的兩個(gè)(TAA和TGA)。
將誘變引物(5’-C TTC TGC GTT AAC AAG TCC GCT TCCATA CAA GTT CGT SNN TCC TAA ACT SNN TGC CGT SNN CTTTAG ATG ATT-3’(反義))與適當(dāng)?shù)姆聪蛞?如5’GAA CTC GATCCA GCG ATT TC 3’(有義))一起用于PCR反應(yīng)，而質(zhì)粒pJS3作為模板。將這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶XhoI和HpaI克隆到pJS3穿梭載體中。
然后用限制酶KpnI和MluI將pJS3構(gòu)建的定域隨機(jī)文庫亞克隆到枯草芽孢桿菌pSX222表達(dá)質(zhì)粒中。
如此制備的文庫含有大約100,000個(gè)單克隆/文庫。
對(duì)隨機(jī)選取的10個(gè)菌落測(cè)序以確認(rèn)設(shè)計(jì)的突變。
為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，將含有本發(fā)明變體的枯草芽孢桿菌pSX222表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株中并如上文所述在含10ug/ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中發(fā)酵。
實(shí)施例2酶變體的純化這項(xiàng)操作涉及枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309或其突變體的2升水平發(fā)酵的純化。
將大約1.6升發(fā)酵液在1升離心杯中于5000rpm離心35分鐘。用10％醋酸將上清液調(diào)至pH6.5，并在Seitz Supra S100過濾板上過濾。
使用配備了Amicon S1Y10 UF柱體的Amicon CH2A UF裝置將濾出液濃縮至大約400ml。在上Bacitracin親和柱(室溫，pH7)吸附前，先將UF濃縮液離心并過濾。用含25％ 2-丙醇和1M氯化鈉的0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣緩沖液(pH7)于室溫將蛋白酶從Bacitracin柱上洗脫下來。
將來自Bacitracin純化步驟具有蛋白酶活性的級(jí)分合并，并加到750ml Sephadex G25柱(直徑5cm，用含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣，pH6.5的緩沖液平衡過)上。
將來自Sephadex G25柱具有蛋白水解活性的級(jí)分合并，并加到150mlCM Sepharose CL 6B陽離子交換柱(直徑5cm，用含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣，pH6.5的緩沖液平衡過)上。
用2升相同緩沖液中的線形梯度0-0.1M氯化鈉(枯草桿菌蛋白酶147的情況下用0-0.2M氯化鈉)將蛋白酶洗脫下來。
在最后的純化步驟中，將來自CM Sepharose柱含有蛋白酶的級(jí)分合并，并在配備了GR81PP膜(購自Danish Sugar Factories Inc.)的Amicon超濾室中濃縮。
通過使用實(shí)施例1用于構(gòu)建的技術(shù)和上述分離方法，產(chǎn)生并分離得到下列枯草桿菌蛋白酶309變體N252L+T255IN252V+T255AN252M+T255C+S259HN252S+T255E+S259C和N252K+T255S+S259C。
實(shí)施例3含有酶變體的洗滌組合物的洗滌性能下列實(shí)施例提供了在指明的條件下進(jìn)行的一些洗滌測(cè)試的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)條件表IV評(píng)價(jià)枯草桿菌蛋白酶309變體的實(shí)驗(yàn)條件

<p>使用的洗滌劑是簡(jiǎn)單型制劑。pH調(diào)至10.5，這在粉劑型洗滌劑的正常范圍內(nèi)。95型洗滌劑的組成如下25％STP(Na5P3O10)25％Na2SO410％Na2CO320％LAS(Nansa 80S)5.0％ 非離子型表面活性劑(Dobanol 25-7)5.0％ Na2Si2O50.5％ 羧甲基纖維素(CMC)9.5％ 水水硬度通過向去離子水中加入CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝2∶1)調(diào)整(也可參閱《消費(fèi)品中的表面活性劑理論、技術(shù)和應(yīng)用》(Surfactants in Consumer ProductsTheory，Technology andApplication)，Springer Verlag 1996)。洗滌劑溶液的pH通過加入HCl調(diào)至pH10.5。
使用Macbeth ColorEye 7000型光度計(jì)(Macbeth，Kollmorgen器械公司(Division of Kollmorgen Instruments Corporation)，德國)測(cè)量測(cè)試材料在460nm的反射率(reflectance，R)。測(cè)量根據(jù)供應(yīng)商的說明書進(jìn)行。
枯草桿菌蛋白酶309變體的洗滌性能通過計(jì)算性能因子評(píng)價(jià)P＝(R變體-R空白)/(RSavinase-R空白)P 性能因子R變體 用變體洗滌后測(cè)試材料的反射率RSavinase 用Savinase洗滌后測(cè)試材料的反射率R空白 不用酶洗滌后測(cè)試材料的反射率要求保護(hù)的枯草桿菌蛋白酶309變體相對(duì)于Savinase都具有改良的洗滌性能—即P＞1。
變體被分成幾個(gè)改良等級(jí)，用大寫字母表示
A級(jí)1＜P≤1.5B級(jí)1.5＜P≤2C級(jí)P＞2表V枯草桿菌蛋白酶309變體及改良等級(jí)

權(quán)利要求
1.在洗滌劑中具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體，其在位點(diǎn)252、255和/或259(BASBPN編號(hào))具有修飾。
2.在洗滌劑中具有改良的洗滌性能的枯草桿菌酶變體，其含有選自下組的至少一種修飾(BASBPN編號(hào))252L+255I252V+255A252M+255C+259H252S+255E+259C252K+255S+259C或在上述任何變體中包含一個(gè)或多個(gè)保守修飾的變體(如252L(疏水性氨基酸)+255I變體的保守修飾包括如252I(疏水性氨基酸)+255I和252V(疏水性氨基酸)+255I之類變體)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的枯草桿菌酶變體，其中所述修飾選自下組(BASBPN編號(hào))N252L+T255IN252V+T255AN252M+T255C+S259HN252S+T255E+S259CN252K+T255S+S259C或在上述任何變體中包含一個(gè)或多個(gè)保守修飾的變體(如N252L(疏水性氨基酸)+T255I變體的保守修飾包括如N252I(疏水性氨基酸)+T255I和N252V(疏水性氨基酸)+T255I之類變體)。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的變體，其中親本枯草桿菌酶選自I-S1亞組。
5.權(quán)利要求4的變體，其中親本枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR或其保留了I-S1亞組特征的功能性變體。
6.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的變體，其中親本枯草桿菌酶選自I-S2亞組。
7.權(quán)利要求6的變體，其中親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB或其保留了I-S2亞組特征的功能性變體。
8.上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的變體，其中所述修飾是與任何其它位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)修飾組合的。
9.權(quán)利要求8的變體，其中所述修飾是與27、36、57、76、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274位中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的修飾組合的。
10.權(quán)利要求9的變體，其中所述枯草桿菌酶屬于I-S2亞組而且所述進(jìn)一步改變選自K27R，*36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A，V104N，V104Y，H120D，N123S，Y167A，Y167I，R170S，R170L，R170N，Q206E，N218S，M222S，M222A，T224S，K235L，和T274A.
11.權(quán)利要求10的變體，其包含有V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合中的任何一種變異，還包含有權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)提及的任何一個(gè)或多個(gè)取代、刪除和/或插入。
12.上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體，其中所述修飾是與129、131、133和194位中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的修飾組合的。
13.權(quán)利要求12的變體，其中所述枯草桿菌酶屬于I-S2亞組而且所述進(jìn)一步改變選自P129K、P131H、A133P、A133D和A194P。
14.編碼權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體的分離DNA序列。
15.含有權(quán)利要求14的分離DNA序列的表達(dá)載體。
16.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求15的表達(dá)載體的微生物宿主細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的微生物宿主，它是細(xì)菌，優(yōu)選芽孢桿菌，尤其是遲緩芽孢桿菌。
18.權(quán)利要求16的微生物宿主，它是真菌或酵母，優(yōu)選絲狀真菌，尤其是曲霉。
19.生產(chǎn)權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的變體的方法，其中將權(quán)利要求16-18中任何一項(xiàng)的宿主在有利于表達(dá)和分泌所述變體的條件下培養(yǎng)，并回收變體。
20.含有權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體的組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中還含有纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、另一種蛋白酶或淀粉酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的組合物，其中所述組合物是洗滌組合物。
23.權(quán)利要求1-13中任何一項(xiàng)的枯草桿菌酶變體或權(quán)利要求20-22中任何一項(xiàng)的酶組合物在衣物和/或餐具洗滌劑中的用途。
24.鑒定在洗滌劑中的洗滌性能有所改善的蛋白酶變體的方法，包括在編碼枯草桿菌酶或者其酶原或酶原前體的DNA中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處實(shí)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于下述氨基酸(BASBPN編號(hào))的突變N252L+T255IN252V+T255AN252M+T255C+S259HN252S+T255E+S259CN252K+T255S+S259C或在上述任何變體中包含一個(gè)或多個(gè)保守修飾的變體；用所述突變DNA轉(zhuǎn)化芽孢桿菌菌株；篩選產(chǎn)生這些蛋白酶變體的菌株；將這種菌株進(jìn)行發(fā)酵或培養(yǎng)；回收所述蛋白酶變體，和檢測(cè)其在洗滌劑中的改善的洗滌性能。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過突變?cè)S多枯草桿菌酶基因并在合適的宿主中表達(dá)突變基因而生產(chǎn)的酶。這些酶在任何洗滌劑中相對(duì)于它們的野生型親本酶顯示改良的洗滌性能。
文檔編號(hào)C11D17/00GK1272138SQ9880965
公開日2000年11月1日 申請(qǐng)日期1998年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月29日
發(fā)明者P·K·漢森, P·鮑迪茲, F·米克爾森, K·V·安德森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司