一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8及其編 碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵過程，植物的開花時間直接控制植物營 養(yǎng)生長期和生育期的長短。植物經(jīng)過長期的演化已經(jīng)進(jìn)化出了精確調(diào)節(jié)開花時間的復(fù)雜網(wǎng) 絡(luò)，其中，泛素/26S蛋白酶體途徑和類泛素化作為廣泛存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式，在植 物開花時間調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。泛素/26S蛋白酶體途徑和類泛素化還可調(diào)節(jié)蛋白 質(zhì)功能，參與真核生物體內(nèi)的細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控及生長發(fā)育各個過程。 泛素/26S蛋白酶體途徑主要由泛素、泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3、去 泛素化酶和26S蛋白酶體組成。目前，PUB類E3泛素連接酶基因先后在擬南芥、水稻等植物中 克隆出來。擬南芥中的PUB類E3泛素連接酶基因在抗高溫、黑暗及干旱脅迫中發(fā)揮著重要功 能。

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的是提供一種大豆HJB類E3泛素連接酶GmPUB8。 本發(fā)明的另一目的是提供該大豆E3泛素連接酶GmPUBS的編碼基因。 本發(fā)明的又一目的是提供該大豆E3泛素連接酶的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8，具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。 本發(fā)明所述的大豆PUB類E3泛素連接酶的編碼基因 GmPUBS，其最大開放閱讀框序列如 SEQIDN0.1所示，含有1257bp，編碼SEQIDN0.2所示的418個氨基酸殘基。 含有本發(fā)明GmPUB8基因 SEQ ID N0.1的表達(dá)載體。 所述的表達(dá)載體優(yōu)選將SEQ ID N0.1所示的大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8的編碼基 因利用gateway技術(shù)插入植物表達(dá)載體pMDC83得到的植物過量表達(dá)載體pMDC83-GmPUB8。 使用GmPUB8構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動 子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工， 如加入可在植物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因(GUS基因、螢光素酶基因等)或抗生素標(biāo)記物(慶 大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物、潮霉素標(biāo)記物等)的抗性基因。 含有所述大豆HJB類E3泛素連接酶GmPUB8編碼基因的工程菌。 所述的工程菌優(yōu)選將所述的大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUBS編碼基因轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105 所得。 擴(kuò)增所述大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8編碼基因的引物，正向引物序列為SEQ ID NO.3,反向引物序列為SEQ ID NO.4。 擴(kuò)增所述大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUB8編碼基因的實(shí)時熒光定量RT-PCR引物，正向 引物序列為SEQ ID NO.5,反向引物序列為SEQ ID NO.6。 所述的大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUBS在不同光周期下調(diào)控開花時間方面的應(yīng)用。所 述的大豆PUB類E3泛素連接酶GmHJBS的編碼基因在不同光周期下調(diào)控開花時間方面的應(yīng) 用。 有益效果： 本發(fā)明在大豆基因組中克隆得到一種大豆PUB類E3泛素連接酶GmPUBS的編碼基因 GmPUB8，GmPUB8基因在大豆組織器官中特異性表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥中過量表達(dá)GmPUB8基因， 與對照組相比，在長日照下開花比野生型植株晚，開花時間推遲5天以上，開花時蓮座葉片 數(shù)較對照增加11片以上；在中日照和短日照下培養(yǎng)，過表達(dá)GmPUBS擬南芥植株與對照組相 比，開花比野生型植株早，開花時間分別提前9天和13天以上，開花時蓮座葉片數(shù)較對照分 別減少11片和13片以上。上述結(jié)果說明GmPUBS可以在不同光周期下調(diào)控植物的開花時間。 本發(fā)明的GmPUBS為在不同光周期下調(diào)控大豆的開花時間提供基因材料與理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】 圖1 GmPUB8蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹 圖2 GmPUB8基因在大豆中的表達(dá)特性。 其中：1，根;2,莖;3,葉片;4,花;5,開花后5天幼莢;6,開花后10天幼莢；7,開花后15天 幼莢；8,開花后20天幼莢；9,開花后25天幼莢；10,開花后30天幼莢；11，開花后35天幼莢； 12,開花后40天幼莢；13,開花后45天幼莢；14,開花后50天幼莢。 圖3含有重組表達(dá)載體pET24b-GmPUB8的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS菌液PCR產(chǎn)物電泳圖 譜。 其中：1，DNA marker;2，含有重組表達(dá)載體pET24b-GmPUB8的大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS 菌液PCR產(chǎn)物。 圖4 GmPUB8重組蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖。 其中：1，蛋白marker; 2，含有空載體pET24b的大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS誘導(dǎo)12h; 3，含 有重組表達(dá)載體pET24b-GmPUB8的大腸桿菌BL21 (DE3) pLy s S誘導(dǎo)12h。 圖5 GmPUBS的體外泛素化活性檢測。 利用原核細(xì)胞體外重組表達(dá)并純化的GmPUB8-6X組氨酸(His)融合蛋白與兔子泛素激 活酶E1、人泛素結(jié)合酶E2及泛素(Ub)混合后，30°C孵育1.5小時。樣品經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠 電泳(SDS-PAGE)分離，分別采用ant i-Hi s和ant i-Ub的抗體進(jìn)行蛋白雜交檢測。 圖6 GmPUB8過量表達(dá)植物表達(dá)載體的構(gòu)建。 圖7轉(zhuǎn)GmPUB8基因擬南芥和對照組RT-PCR檢測。 WT:野生型;#1-9:轉(zhuǎn)基因型。 圖8轉(zhuǎn)GmPUB8基因擬南芥和對照在不同光周期條件下的表型觀察。 WT:野生型;#9:轉(zhuǎn)基因株系。 圖9轉(zhuǎn)GmPUB8基因擬南芥和對照植株在不同光周期條件下的蓮座葉片數(shù)和開花時間比 較。**表示野生型WT與轉(zhuǎn)基因株系在0.01水平差異顯著。
【具體實(shí)施方式】 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的含義。 下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng) 理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用 到的引物，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。 下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1 GmPUB8基因的克隆與鑒定 實(shí)驗(yàn)材料為大豆(Glycine max(L. )Merr.) '科豐1號'，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良 中心種質(zhì)庫提供，材料種植于溫室，常規(guī)田間管理。 根據(jù)擬南芥中已克隆的PUB類E3泛素連接酶AtPUB23 (At2g35930)序列，在Phy tozome中 的大豆基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTP搜索，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)GmPUBS基 因開放閱讀框(0RF)正向引物GmPUB8-0RF-F: 5 '-ATGGACGAGATCGACGTGCC-3 '（ SEQ ID NO · 3) 和反向引物GmPUB8-0RF-R:5'-TCACGAACTCATTGGAAACGAAG-3'（SEQIDN0·4)，以大豆嫩葉 的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增GmPUB8的0RF，具體方法如下：取大豆'科豐1號'嫩葉片，置于液 氮中研碎，RNA提取依據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒RNA Plant Extraction Kit DP417進(jìn)行。 cDNA第一鏈合成依據(jù)TaKaRa試劑公司cDNA第一鏈合成試劑盒TaKaRa PrimeScript? 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具體詳見操作說明。以得到的cDNA片段為模板，用上 述引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。50μ1 PCR反應(yīng)體系為：2μ1 cDNA第一鏈(0.05yg)、1.6μ1引物 (SEQ ID Ν0.3和SEQ ID Ν0·4,5μΜ)、5μ1 10XPCR緩沖液、4μ1 Mg 2+、4μ1 dNTP和 1.25U Ex Taq DNA聚合酶，用超純水補(bǔ)足50μ1。反應(yīng)在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，其程序?yàn)?5 。(:變性 5111丨11;941€3〇86(3,581€3〇86(3,72 1€21^11，共35個循環(huán)；然后72°(：延伸1〇1^11;4°(：保存。 PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(天根）回收后連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受 態(tài)細(xì)胞、藍(lán)白斑篩選、搖菌、測序。序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物具有序列表中SEQID NO. 1的核 苷酸序列，命名為GmPUB8。從NCBI中收集多個物種的PUB類E3泛素連接酶PUB蛋白序列， ClustalX進(jìn)行蛋白序列比對分析，發(fā)現(xiàn)GmPUB8與其他物種中的同類蛋白序列同源度較低， 與擬南芥中的AtPUB22和AtPUB23的同源性分別達(dá)到69.91 %和53.83%。然后構(gòu)建了大豆 GmPUB8基因與其他物種PUB基因的系統(tǒng)化樹(圖1)。 實(shí)施例2大豆GmPUB8基因在不同器官中的表達(dá)特征 以大豆品種'科豐1號'為材料，利用實(shí)時熒光定量RT-PCR技術(shù)對大豆不同組織根、莖、 葉片、花及開花后不同時間茄果中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。各組織總RNA的提取及cDNA第一 鏈合成同實(shí)施例1，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)GmPUBS基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定 量PCR檢測引物GmPUB8-qPCR-F: 5 ' -TCGTGTGCCCTATTTCATTAGAGC-3 '（ SEQ ID NO · 5)， GmPUB8-qPCR-R:5 '-TGCGGAGCGTGTGGTTCG-3 '（SEQ ID NO·6);內(nèi)參基因采用大豆Actinl 1基 因 （Hu et al，2009，BMC Molecular Biology，10:93)，引物序列為八。衍111卜卩：5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3 '（SEQ ID NO.7)，Actin11-R:5 '-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3 ' (SEQ ID NO.8)。以來自不同組織的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT-PCR分析。 結(jié)果分析表明（圖2)，GmPUB8雖然在不同組織中均有表達(dá)，但在根中的表達(dá)量最高，在 開花后5d幼莢中的表達(dá)量最低。 實(shí)施例3 GmPUB8基因的異源表達(dá)及泛素連接酶活性測定 一、 攜帶GmPUB8基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建 以大豆cDNA為模板，根據(jù)序列SEQ ID No.l設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增大豆PUB類E3泛素連接酶 GmHJB8基因編碼區(qū)的DNA序列。引物兩端分別引入Nhe I和Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列為 GmPUB8-pET24b