Ub-Nanoluc、Ub-Ub-GS-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的Ub-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)以及 Ub-Ub-GS-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)，及其在去泛素化酶活性檢測中的應(yīng)用，在通量化篩選去 泛素化酶抑制劑或激動劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway)是細(xì)胞內(nèi)一個重要的蛋 白質(zhì)降解調(diào)節(jié)系統(tǒng)。通過對底物蛋白的多聚泛素化并經(jīng)蛋白酶體降解，可以影響或調(diào)節(jié)多 種細(xì)胞活動，包括：基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)、細(xì)胞配體受體功能及腫瘤生長、炎癥發(fā) 生等。
[0003] 去泛素化酶是一類數(shù)量很大的蛋白酶家族，這類去泛素化酶通過水解泛素羧基末 端的酯鍵，肽鍵或異肽鍵，將泛素分子特異性地從連接有泛素的蛋白或者前體蛋白上水解 下來。去泛素化酶可以分為五類：（1)泛素羧基末端水解酶家族（UCHs)，屬于半胱氨酸蛋白 酶，通常是小分子蛋白，已發(fā)現(xiàn)UCHL1、3、5等分子。它們作用的底物通常也是一些分子量較 小的多肽。UCHs可以通過裂解C末端76位甘氨酸，將泛素分子從小的多肽底物上釋放出 來，使泛素成熟。UCHs活性位點(diǎn)上的狹窄裂隙和環(huán)狀結(jié)構(gòu)直徑的限制在一定程度上起到了 特異性識別底物的功能，阻止了它對一些大分子泛素化蛋白的結(jié)合和催化。（2)泛素特異性 酶家族（USPs)，該家族是目前已知的去泛素化酶中成員最多，且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類，大 約有50多種半胱氨酸蛋白酶，包括很重要的癌癥調(diào)控因子USP4、USP7、USP11、USP15、USP21 等。這些酶分子都含有兩個短而保守的片段即賴氨酸和組氨酸，能將泛素分子從大的底物 蛋白上移除。（3)卵巢腫瘤（0TU)相關(guān)蛋白酶，這類去泛素化酶與其他去泛素化酶同源性上 有不小差別，但也具有Cys，組成的核心結(jié)構(gòu)域，與USP家族蛋白有很大相似性，并且已證明 能起到去泛素化的作用。（4)MJD蛋白酶，這一類去泛素化酶主要被研究的是Ataxin-3含有 一個稱為Josephin的結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含的氨基酸序列與UCH和USPs有一定的相似性。目前已 發(fā)現(xiàn)Ataxin-3可以水解Ub-AMC。（5)JAMM(Jabl / MPN域相關(guān)金屬異肽酶）序列。這一序 列含有較為保守的兩個組氨酸殘基和一個天冬氨酸殘基，它們與二價(jià)鋅離子共同構(gòu)成催化 中心，可以在催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合泛素分子。
[0004] 從以上分類來看，去泛素化酶在細(xì)胞水平上具有如下功能：UCH家族能夠使原始 的泛素化分子成熟，使泛素化分子的碳末端暴露出來；USP家族去泛素化底物蛋白分子的 泛素化鏈，調(diào)節(jié)對底物蛋白的降解，剪切非降解的泛素化鏈，調(diào)節(jié)底物蛋白的活性以及功 能，使泛素化鏈成為單泛素化修飾，調(diào)節(jié)修飾的方式，防止泛素被蛋白酶體途徑降解，使泛 素分子進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，可以被重新利用。
[0005] 于此同時(shí)，去泛素化酶也能夠發(fā)揮一些生理功能，如：
[0006] (1)腫瘤與癌癥：許多的轉(zhuǎn)錄因子與癌癥密切相關(guān)，例如重要的轉(zhuǎn)錄因子p53, p53 的表達(dá)已經(jīng)證明了與癌癥的發(fā)生息息相關(guān)，而這個轉(zhuǎn)錄因子能夠被泛素連接酶mdm2通過 泛素蛋白酶體途徑降解促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。而已經(jīng)有報(bào)道USP7作為去泛素化酶能夠在體內(nèi) 體外去泛素化P53從而保護(hù)p53不被蛋白酶體所降解，這就暗示了 USP7可能作為一個重 要的癌癥調(diào)控因子。同時(shí)，現(xiàn)在已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道許多去泛素化酶在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如 J0SD1、CSN5、UCHL1、USP9X 在非小細(xì)胞肺癌中顯著高表達(dá)，而 USP10、USP11、USP22、USP48 和CSN5則在惡性淋巴瘤細(xì)胞中高表達(dá)，USP1與結(jié)直腸癌的初始形成相關(guān)而USP2在卵巢癌 和前列腺癌中高表達(dá)，USP17在食道癌和宮頸癌中高表達(dá)，這些高表達(dá)的去泛素化酶可能作 為一個很好的抗癌藥物靶點(diǎn)。
[0007] (2)干細(xì)胞：干細(xì)胞的分化過程中涉及到許多基因的時(shí)空特異性表達(dá)，去泛素化 酶通過調(diào)控組蛋白的單泛素化調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。一項(xiàng)基于分化和未分化干細(xì)胞蛋白質(zhì) 組學(xué)的差異性研究中顯示干細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子NAN0G和0CT4可能受到多種泛素連接酶和 去泛素化酶的調(diào)控。
[0008] (3)免疫：NF-kB信號通路在免疫反應(yīng)中起著非常重要的作用，其中非降解泛素 化信號調(diào)控了該信號通路的活性，細(xì)胞中的去泛素化酶CYLD、USP4、USP2a能夠通過水解 K63泛素化鏈影響這一信號通路，進(jìn)而調(diào)控免疫反應(yīng)。
[0009] 由此可見，去泛素化酶在生物體內(nèi)通過其去泛素化活性起著非常重要的生理功 能，也可以作為非常好的藥物靶點(diǎn)，因此，建立通量化篩選去泛素化酶活性的方法對于癌癥 治療研究具有重要意義。在現(xiàn)有技術(shù)中，目前已知的高通量篩選去泛素化酶活性的方法主 要有Ub-AMC，但是由于Ub-AMC并不能很好模擬泛素鏈的形成，并且AMC讀值激發(fā)區(qū)域位于 紫外激發(fā)光區(qū)域，受到很多小分子本身激發(fā)吸收光譜的影響，會導(dǎo)致大約20%假陽性的產(chǎn) 生。其他檢測去泛素化酶活性的通量化方法有著高成本、不易獲得等缺點(diǎn)，而0TULIN作為 一種新的水解線性泛素化鏈的去泛素化酶，對于Ub-AMC沒有水解能力，所以至目前尚未見 有報(bào)道檢測0TULIN活性的有效高通量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于構(gòu)建新的檢測去泛素化酶活性的Ub-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)以 及檢測0TULIN去泛素化酶活性的Ub-Ub-GS-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)。本發(fā)明構(gòu)建檢測去泛 素化酶活性的高通量篩選系統(tǒng)及篩選方法，篩選去泛素化酶的抑制劑或者激動劑，從而找 到新的診斷標(biāo)志物和去泛素化酶相關(guān)的腫瘤藥物靶標(biāo)。本發(fā)明首次提出Ub-Nanoluc報(bào)告 基因系統(tǒng)可以用來檢測一些去泛素化酶的活性，本發(fā)明首次提出Ub-Ub-GS-Nanoluc報(bào)告 基因系統(tǒng)能有效檢測重要免疫調(diào)控因子0TULIN活性。本發(fā)明為新的去泛素化酶抑制劑的 篩選提供了一條新的途徑和選擇。
[0011] 本發(fā)明提出的Ub-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)包括泛素蛋白和Nanoluc突光素酶，所述 泛素蛋白與Nanoluc突光素酶通過肽腱相連。
[0012] 本發(fā)明Ub-Nanoluc報(bào)告基因中，在Nanoluc突光素酶蛋白分子融合泛素蛋白分子 之后，通過泛素分子氮末端融合的6X組氨酸標(biāo)簽固定在鎳柱固相介質(zhì)上。
[0013] 本發(fā)明中，泛素蛋白分子與Nanoluc熒光素酶蛋白分子通過肽腱相連接，該肽鍵 能被去泛素化酶分子所水解，而泛素分子依然固定在鎳柱上，Nanoluc分子被釋放出來，通 過加入底物對Nanoluc分子讀值定量。
[0014] 本發(fā)明中，所述Ub-Nanoluc報(bào)告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；其氨基 酸序列如3￡0 10勵.2所示；所述泛素蛋白和所述似11〇111(3熒光素酶的連接序列如3￡0 10 NO. 3所示。
[0015] 本發(fā)明中，構(gòu)建pET-28a-Ub-Nanoluc分子克隆的圖譜如圖8所示。
[0016] 本發(fā)明Ub-Nanoluc分子的核苷酸序列，如SEQ IDN0. 1所示，為：
[0017] atgcagatcttcgtgaaaacccttaccggcaagaccatcacccttgaggtggagcccagtgacaccatc gaaaatgtgaaggccaagat ccaggataaggaaggcattccccccgaccagcagaggctcatctttgcaggcaag cagctggaagatggccgtactctttctgactacaacatc cagaaggagtcgaccctgcacctggtcctgcgtctga gaggtggtatggaattcatggtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgaca gacagccggctacaacc tggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaag g attgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgac caaatgggccagatcgaaa aaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcact atggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgat cgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccg tgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatc gacgagcgcctgatca accccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggc gta(SEQ ID NO. 1)
[0018] 本發(fā)明Ub-Nanoluc報(bào)告基因的表達(dá)蛋白序列，如SEQ ID NO. 2所示，為：
[0019] MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYN IQKESTLH LVLRLRGGMEFMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVT PIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYE GLS⑶QMGQIEKIFKWYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVT PNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIID ERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCE RILA(SEQ ID NO. 2)
[0020] 本發(fā)明Ub-Nanoluc報(bào)告基因系統(tǒng)中，泛素分子和Nanoluc突光素酶通過肽腱相 連，連接序列如SEQ ID N0. 3所示，為：
[0021] LRLRGG-MEFMVF(SEQIDN0. 3)〇
[0022] 本發(fā)明還提供了 Nanoluc的多克隆抗體，其來自于重組蛋白，作為免疫原產(chǎn)生的 特異性抗體。
[0023] 本發(fā)明還提供了 Ub-Nanoluc報(bào)告基因的制備方法，用分子克隆方法將Nanoluc 基因融合在泛素分子之后，構(gòu)建融合表達(dá)的泛素報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒。大腸桿菌誘導(dǎo)純化 His-Ub-Nanoluc，、純化得到Ub-Nanoluc蛋白，步驟詳見實(shí)施例1。
[0024] 本發(fā)明還提供了 Ub-Nanoluc報(bào)告基因在檢測去泛素化酶活性、通量化篩選去泛 素化酶抑制劑中的應(yīng)用，方法如下：
[0025] 本發(fā)明還提供了利用Ub-Nanoluc檢測去泛素化酶活性的方法，將上述純化好的 蛋白固定在鎳柱上，通過在反應(yīng)溶液中加入去泛素化酶，將Nanoluc從鎳柱上切除下來，離 心轉(zhuǎn)移上清至白色無吸附力96孔板中，通過加入Nanoluc底物furimazine，在報(bào)告基因機(jī) 器上讀值，反映切除下來的Nanoluc的量。通過