專利名稱：革蘭氏陽性微生物甲酸途徑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及芽孢桿菌屬(Bacillus)中參與甲酸運(yùn)輸和利用的分子的鑒定。本發(fā)明還提供用于增加芽孢桿菌屬(Bacillus)生產(chǎn)多肽的產(chǎn)量的方法。
序言革蘭氏陽性微生物，例如芽孢桿菌屬已被應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵，部分原因是其能將發(fā)酵產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中。分泌的蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁導(dǎo)出，隨后釋放到胞外培養(yǎng)基中。因?yàn)閷?dǎo)出的蛋白質(zhì)通常保持其天然構(gòu)象，所以在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)是有利的。
Suppmann等(1994，分子微生物學(xué)(Molecular Microbiology)，vol．11(5)，965-982頁)描述了革蘭氏陰性微生物大腸桿菌(E．coli)中的一種推斷的甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Nagy等(1995，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal ofBacteriology)，vol177，1292頁)描述了大腸桿菌中的甲酰四氫葉酸水解酶。Mazel等(1997，分子生物學(xué)雜志(J．Mol．Biol．)266939-949)描述了真細(xì)菌系統(tǒng)中的多肽去甲酰酶功能。然而，關(guān)于大規(guī)模發(fā)酵法生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)所使用的革蘭氏陽性微生物中甲酸的攝取和利用，人們知之甚少。
芽孢桿菌屬中可能與甲酸利用相關(guān)的基因產(chǎn)物已經(jīng)得到鑒定。deSiazieu(1997，微生物學(xué)(Microbiology)143979-989)揭示了產(chǎn)生輔酶四氫葉酸(THF)的操縱子?？莶菅挎邨U菌(B．subtilis)中已顯示存在10-甲酰四氫葉酸合成酶(連接酶)活性和5，10-亞甲四氫葉酸脫氫酶(Whitehead等，1988，細(xì)菌學(xué)(Bacteriology)170995-997)。而且，Saxild等(1994，Mol．Gen．Genet．242415-420)已鑒定了嘌呤生物合成中催化單碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)的5-磷酸核糖-1-甘氨酰胺(GAR)轉(zhuǎn)甲酰酶(transforylase)。該酶是purT位點(diǎn)的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其依賴于生長培養(yǎng)基或無細(xì)胞提取物體外實(shí)驗(yàn)中添加的甲酸鹽。
在本領(lǐng)域中，仍需要優(yōu)化革蘭氏陽性表達(dá)系統(tǒng)以便增加這些系統(tǒng)的產(chǎn)物產(chǎn)量。
本發(fā)明概要在本發(fā)明之前，對革蘭氏陽性微生物中甲酸的運(yùn)輸、利用或循環(huán)知之甚少。當(dāng)在搖瓶中研究不同添加物對革蘭氏陽性微生物芽孢桿菌屬生長的影響時，觀察到向培養(yǎng)基中添加甲酸鈉時生長增加。還觀察到在革蘭氏陽性微生物發(fā)酵過程中沒有外源甲酸鹽時，產(chǎn)生內(nèi)源甲酸。
因此本發(fā)明部分地基于內(nèi)源或外源甲酸鈉存在時觀察到的革蘭氏陽性微生物生長的改變。本發(fā)明還基于本文提出的證據(jù)，即甲酸是通過一種共運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制運(yùn)送至芽孢桿菌屬的。因此，本發(fā)明提供了改變革蘭氏陽性微生物生長的方法，其包括更改革蘭氏陽性微生物中甲酸的運(yùn)輸。
本發(fā)明還部分基于枯草芽孢桿菌基因組核酸序列編碼的四個芽孢桿菌屬蛋白的鑒定和特性分析，這些蛋白看來與甲酸的運(yùn)輸、利用和循環(huán)相關(guān)甲酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白1(FTAP1)和甲酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白2(FTAP2)，其分別與大腸桿菌蛋白FocA(一種甲酸通道蛋白)大約35％和30％相同；枯草芽孢桿菌PurU，其與大腸桿菌PurU(在四氫葉酸和甲酰四氫葉酸循環(huán)中涉及的N10-甲酰四氫葉酸水解酶)在氨基酸水平上大約48％相同；甲酰甲硫氨酸去甲酰酶(FMD)，其與另一種甲酰甲硫氨酸去甲酰酶(YkrB)大約40％相似。
本發(fā)明還基于如下數(shù)據(jù)，即在有外源甲酸存在時，搖瓶培養(yǎng)的中斷了FTAP1編碼基因的芽孢桿菌屬細(xì)胞顯示其生長增加比外源甲酸存在時正常觀察到的生長增加降低大約50％。在有外源甲酸存在時，搖瓶培養(yǎng)的中斷了FTAP2編碼基因的芽孢桿菌屬細(xì)胞生長得更慢，而且培養(yǎng)物的密度隨著時間下降。因此，看來在芽孢桿菌屬中FTAP1和FTAP2與甲酸運(yùn)輸和利用相關(guān)。
因此，調(diào)整甲酸運(yùn)輸、利用和循環(huán)所涉及分子(例如，F(xiàn)TAP1、FTAP2、PurU和FMD單獨(dú)、彼此聯(lián)合或和其它相關(guān)分子聯(lián)合)的表達(dá)，提供了一種調(diào)節(jié)革蘭氏陽性微生物的甲酸產(chǎn)生水平的方法。人們可能期望增加這些分子的表達(dá)、降低這些分子的表達(dá)或調(diào)節(jié)這些分子的表達(dá)，即提供一種根據(jù)革蘭氏陽性微生物類型和希望的培養(yǎng)條件在細(xì)胞生長的一定時期表達(dá)這些分子的方法。
因此，本發(fā)明提供了一種增加革蘭氏陽性微生物中產(chǎn)品產(chǎn)量的方法，其包括如下步驟獲得能表達(dá)所述產(chǎn)品的微生物，所述微生物還包含編碼1)甲酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白1(FTAP1)和2)甲酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白2(FTAP2)之一或兩者的核酸序列；在甲酸存在并適合所述產(chǎn)品生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述微生物。所述產(chǎn)品包括可從革蘭氏陽性微生物中獲得的天然存在的產(chǎn)品，例如抗菌化合物、抗生素、抗原、抗體、表面活性劑、化學(xué)產(chǎn)品和酶，也包括重組導(dǎo)入的核酸編碼的產(chǎn)品，如蛋白質(zhì)和多肽。
一方面，所述產(chǎn)品是重組蛋白。在一個實(shí)施方案中，重組蛋白與所述革蘭氏陽性微生物同源，在另一個實(shí)施方案中，重組蛋白與所述革蘭氏陽性微生物異源。本發(fā)明的一方面，所述革蘭氏陽性微生物是芽孢桿菌屬，而在另一實(shí)施方案中所述芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、短芽孢桿菌( Bacillus brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B. alkalophilus)、淀粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)。
本發(fā)明的一個方面，所述重組蛋白包括激素、酶、生長因子和細(xì)胞因子，而另一方面，所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、漆酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
在無外源甲酸存在的大規(guī)模芽孢桿菌發(fā)酵條件下，在培養(yǎng)基中可觀察到過量內(nèi)源性甲酸或甲酸“溢出物”。因此，為了維持合適的內(nèi)源甲酸水平，可能應(yīng)缺失、突變或以其它方式中斷FTAP1和2的編碼基因。因此，本發(fā)明提供了一種在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，其包括步驟a)獲得一種能表達(dá)所述產(chǎn)品的革蘭氏陽性微生物，所述微生物在編碼FrAP1和2之一或兩者的核酸中含有突變，所述突變導(dǎo)致所述微生物FTAP1和／或FTAP2活性的產(chǎn)生受到抑制；和b)在適合所述產(chǎn)品表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述微生物。
此外，基于芽孢桿菌PurU和大腸桿菌PurU整體氨基酸序列的同源性，看來芽孢桿菌PurU通過充當(dāng)N10-甲酰四氫葉酸水解酶在甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。Saxi1d等(1994，Mol．Gen．Genet，242415-420)推測枯草芽孢桿菌可通過N10-甲酰四氫葉酸和N-甲酰甲硫氨酸的去甲酰化產(chǎn)生甲酸。因此，在過量內(nèi)源甲酸似乎從正常甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)通道之外溢出的生長條件下，為了減少N10-甲酰四氫葉酸的水解從而增加細(xì)胞內(nèi)留存的甲酸，可能應(yīng)在革蘭氏陽性微生物細(xì)胞中缺失、突變或以其它方式中斷PurU編碼基因。在某些細(xì)胞生長條件下也可能希望增加PurU的表達(dá)。而且，正如下文所闡明的，PurU的表達(dá)也可通過向培養(yǎng)基中添加甘氨酸或甲硫氨酸來進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)。
因此，本發(fā)明提供了一種在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，其包括獲得能表達(dá)所述產(chǎn)品并在PurU編碼核酸中含有突變的革蘭氏陽性微生物，所述突變導(dǎo)致所述微生物PurU活性生產(chǎn)的抑制；在適合所述產(chǎn)品表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述微生物。
基于與芽孢桿菌Def全序列的同源性，看來革蘭氏陽性FMD在修飾起始甲硫氨酸中起作用。所以，在大規(guī)模發(fā)酵條件下修飾革蘭氏陽性宿主細(xì)胞的FMD表達(dá)可能是可取的。因此，本發(fā)明提供了一種增加革蘭氏陽性微生物中產(chǎn)品產(chǎn)量的方法，其包括步驟a)獲得能表達(dá)所述產(chǎn)品的革蘭氏陽性微生物；b)修飾所述微生物的FMD表達(dá)；和c)在適合所述產(chǎn)品表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述微生物。
本發(fā)明還提供了含有分離的FTAP1和／或2和／或PurU和／或FMD編碼核酸的表達(dá)載體和革蘭氏陽性微生物。本發(fā)明還提供在編碼FTAP1和／或2和／或PurU和／或FMD的部分或全部核酸中含有缺失或突變的革蘭氏陽性微生物。
本發(fā)明也提供了檢測枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD同源多核苷酸的方法，其包括將枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的部分或全部核酸序列與革蘭氏陽性微生物的來源于基因組或cDNA的核酸進(jìn)行雜交。
附圖的簡要說明

圖1A-1C為FTAP1(YRHG)的核酸序列(序列識別號SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖2A-2C為FTAP2(YWCJ)的核酸序列(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖3A-3C為PurU(YKKE)的核酸序列(SEQ ID NO5)和氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖4A和4B為FMD(Def)的核酸序列(SEQ ID NO7)和氨基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖5為加或不加MOPS緩沖液和3克／升甲酸鈉的1％SBG中枯草芽孢桿菌(BG125)培養(yǎng)物的生長和pH值隨時間變化的比較。
圖6為在1％SBG、含有80mM MOPS的1％SBG和含有3克／升甲酸鈉的1％SBG中連續(xù)加入鹽酸時，pH值的改變。
圖7為不加或加入遞增濃度甲酸的1％SBG枯草芽孢桿菌(BG125)培養(yǎng)物的生長隨時間變化的比較。
圖8為按“材料和方法”所述之高效液相色譜法測定的圖5之培養(yǎng)物對甲酸的攝取量。
圖9為按“材料和方法”所述之高效液相色譜法測定的圖5之培養(yǎng)物隨時間產(chǎn)生的乙酸的量。
圖10為按“材料和方法”所述之高效液相色譜法測定的圖5之培養(yǎng)物的葡萄糖攝取量。
圖11為加入甲氧芐胺嘧啶(trimethaprim)對在含所指明添加劑和甲酸的1％SBG中培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌的生長的影響。所指明處甲氧芐胺嘧啶(藥物)的添加量為25Klett單位。
圖12為FTAP1(YRHG)與EcopFlz．p1(其含有大腸桿菌FocA)(SEQ IDNO9)的氨基酸序列對比。
圖13為FTAP2(YWCJ)與EcopFIz．p1的氨基酸序列對比。
圖14為大腸桿菌PurU(SEQ ID NO10)與枯草芽孢桿菌PurU(YKKE)的氨基酸序列對比。
圖15為革蘭氏陽性微生物甲酸運(yùn)輸、利用和循環(huán)相關(guān)分子的示意圖。
圖16說明yrgh基因中斷(int．)對BG125細(xì)胞生長的影響。含有中斷基因的細(xì)胞生長在按所示加入3克／升甲酸和卡那霉素的1％SBG中。生長情況按“材料和方法”所述測定。對照(-□-)，甲酸 (……)ywcJint．(…○…)，ywcJ int．+甲酸(---△---)，ywcJ int．+卡那霉素 ywcJ int．+甲酸+卡那霉素 圖17說明ywcJ基因中斷(int．)對BG125細(xì)胞生長的影響。含有中斷基因的細(xì)胞生長在按所示加入3克／升甲酸和卡那霉素的1％SBG中。生長情況按“材料和方法”所述測定。對照(-□-)，甲酸 (……)，ywcJ int．(…○…)，ywcJ int．+甲酸(---△---)，ywcJ int．+卡那霉素 ywcJ int．+甲酸+卡那霉素 本發(fā)明詳細(xì)描述定義本文所用的芽孢桿菌屬包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的所有成員，包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌。
本發(fā)明包含革蘭氏陽性生物的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述革蘭氏陽性生物為芽孢桿菌屬。另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述革蘭氏陽性生物為枯草芽孢桿菌。本文所用“枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD”分別指圖1、2、3和4所示氨基酸序列，并分別命名為YRHG，YWCJ，YKKE和DeF。本發(fā)明包括枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的同源氨基酸序列，即圖1、2、3和4所示氨基酸序列的保留了功能的變體，本文也稱作FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。
本文所用的“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列和其片段或部分，也指來源于基因組或合成的DNA或RNA，其既可是雙鏈也可是單鏈，既可是有義鏈也可是反義鏈。本文所用的“氨基酸”是指多肽或蛋白序列或其部分。本文所用的“同源多核苷酸”是指革蘭氏陽性微生物多核苷酸，其與枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD至少80％、至少85％、至少90％和至少95％同源，或其能在高度嚴(yán)格的雜交條件下與枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD雜交。
本文所用的術(shù)語“分離的”或“純化的”是指去除了至少一種天然聯(lián)合成分的核酸或蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明中，分離的核酸可包括含有所述核酸的載體。
本文所用的術(shù)語“產(chǎn)物”是指可從革蘭氏陽性微生物獲得的任何天然存在或重組導(dǎo)入的產(chǎn)物，例如蛋白、多肽、肽、化學(xué)物質(zhì)，也包括但不限于抗菌化合物、抗生素、抗原、抗體、表面活性劑、化學(xué)產(chǎn)品和酶。重組蛋白質(zhì)指由導(dǎo)入所述微生物的核酸編碼的蛋白質(zhì)。所述核酸可通過表達(dá)載體導(dǎo)入，該表達(dá)載體含有能表達(dá)所述導(dǎo)入核酸編碼的蛋白質(zhì)的信號，所述核酸也可整合入所述微生物的染色體。重組蛋白質(zhì)可與所述微生物同源也可與所述微生物異源。本文所用的術(shù)語“異源蛋白質(zhì)”是指非天然存在于革蘭氏陽性宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。異源蛋白質(zhì)的例子包括酶，如水解酶(包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶和脂酶)；異構(gòu)酶(如消旋酶、差向異構(gòu)酶、互變異構(gòu)酶或變位酶)；轉(zhuǎn)移酶，激酶和磷酸酶。所述的異源基因可編碼治療上重要的蛋白質(zhì)或多肽，例如生長因子、細(xì)胞因子、配體、受體和抑制劑，以及疫苗和抗體。所述的基因可編碼商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)或多肽，如蛋白酶、糖酶(如淀粉酶和葡糖淀粉酶)、纖維素酶、氧化酶和脂酶。感興趣的基因可以是天然存在的基因，也可是突變基因或合成基因。
術(shù)語“同源蛋白質(zhì)”指革蘭氏陽性宿主細(xì)胞中與生俱來的或天然存在的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明包括通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。本發(fā)明包括革蘭氏陽性宿主細(xì)胞，其在編碼天然存在的同源蛋白質(zhì)(如蛋白酶)的核酸中含有突變或中斷，并且其編碼所述同源蛋白質(zhì)的核酸以重組形式重新導(dǎo)入。在另一實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)所述同源蛋白質(zhì)。
在本領(lǐng)域中很好理解，甲酸可以以各種電離狀態(tài)存在，如果處于溶液形式，則依賴于周圍的介質(zhì)，如果處于固體形式，則依賴于其從中制備的溶液。用諸如甲酸的術(shù)語命名這些分子意在包括所指有機(jī)分子的所有電離狀態(tài)。因此，例如，甲酸和甲酸鹽均指相同的物質(zhì)，而不是旨在指定特定的電離狀態(tài)。優(yōu)選實(shí)施方案的描述Ⅰ．芽孢桿茵屬甲酸的運(yùn)輸向枯草芽孢桿菌的搖瓶培養(yǎng)物中添加甲酸鈉觀察到生長增強(qiáng)的現(xiàn)象，揭示了關(guān)于甲酸運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制的信息。加入甲酸鈉后，總細(xì)胞密度高出很多，而且所述培養(yǎng)物能更長時間地保持其生長速率。在1％SBG培養(yǎng)基中生長時，甲酸的生長增強(qiáng)作用與避免pH值正常地降至6．0以下相關(guān)，從3g／l(44 mM)到21g／l(308mM)范圍的甲酸鈉濃度對總的生長增強(qiáng)產(chǎn)生相似的效果。然而，3g／l甲酸鈉僅引起最初生長速率的微小的延遲，隨著甲酸濃度的增加所述延遲變得更加明顯?？莶菅挎邨U菌在1％SBG中的生長伴隨乙酸的產(chǎn)生，這可能是正常的pH降低和生長速率下降的原因。使用MOPS緩沖液的實(shí)驗(yàn)顯示，緩沖液的pH控制在很大程度上重現(xiàn)了甲酸引起的生長增強(qiáng)。我們觀察到對于甲酸和甲酸加MOPS的培養(yǎng)瓶，從培養(yǎng)基中攝取甲酸均始于早指數(shù)生長期，并在穩(wěn)定期開始之前已完全停止。此外，與對照和對照加MOPS培養(yǎng)瓶相比，甲酸和甲酸加MOPS的培養(yǎng)瓶的確顯示了乙酸產(chǎn)生的增加。盡管乙酸濃度更高，但甲酸培養(yǎng)瓶的pH并不降到6．4以下。在甲酸、甲酸加MOPS和MOPS培養(yǎng)瓶中葡萄糖攝取速率相同，提示甲酸引起的乙酸產(chǎn)生增加與葡萄糖代謝的某步而不是與葡萄糖運(yùn)輸相連。看來甲酸對pH的控制是由于甲酸共運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞伴隨質(zhì)子從培養(yǎng)基中去除。實(shí)施例中顯示的采用甲氧芐胺嘧啶的研究提示，被運(yùn)輸?shù)募姿嵋笏臍淙~酸合成以避免生長速率下降。Ⅱ．FTAP1和2，PurU和FMD序列具有如圖所示序列的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD多核苷酸編碼枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，由于遺傳密碼的簡并性，許多種多核苷酸能編碼枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD。本發(fā)明囊括所有這些多核苷酸。
所述DNA可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序獲得，例如從克隆DNA(如DNA文庫)獲得，通過化學(xué)合成、CDNA克隆或克隆從目的細(xì)胞純化的基因組DNA或其片段獲得(見例如Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Glover，D．M．(ed．)，1985，DNA克隆實(shí)用手冊，MRL Press，LtdOxford，U．K．Vol．I，11．)。優(yōu)選來源是基因組DNA。從基因組DNA來源的核酸序列除編碼區(qū)外還可含有調(diào)節(jié)區(qū)。無論何種來源，分離的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因應(yīng)分子克隆至合適載體上以增殖該基因。
從基因組DNA分子克隆所述基因時，先產(chǎn)生DNA片段，其中一些片段編碼期望的基因?；蚪MDNA可用各種限制性酶在特異位點(diǎn)切開。此外，還可在錳離子存在時用DNase使DNA片段化，或用物理法例如超聲處理剪切DNA。然后，得到的線性DNA片段可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳以及柱層析法按大小分離。
一旦產(chǎn)生了DNA片段，含有FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的特異DNA片段的鑒定就可用許多方法來實(shí)現(xiàn)。例如，可分離和標(biāo)記本發(fā)明的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因或其特異RNA，或其片段(例如探針或引物)，然后用于雜交分析以檢測產(chǎn)生的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因(Benton，W．a(chǎn)nd Davis，R1977，Science 196180；Grunstein，M．And Hogness，D1975，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 723961)。那些真正與探針序列類似的DNA片段會在嚴(yán)格的條件下雜交。
本發(fā)明包括分別編碼革蘭氏陽性微生物FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD同源多核苷酸，這些同源多核苷酸與從枯草芽孢桿菌得到的FTAP1、FTAP2、PurU和FMD至少有80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％的相同性，只要所述同源多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)保持功能活性。
枯草芽孢桿菌的革蘭氏陽性微生物同源多核苷酸可通過基因組或cDNA來源的革蘭氏陽性微生物核酸的核酸雜交來鑒定。所述同源多核苷酸序列可通過用圖中所公開的探針、部分或片段進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來檢測。因此，本發(fā)明提供了檢測枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD同源多核苷酸的方法，其包括用枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD核酸序列的部分或全部與基因組或cDNA來源的革蘭氏陽性微生物核酸雜交。
本發(fā)明的范圍還包括能在中等到最大嚴(yán)格的條件下與枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD核苷酸序列雜交的革蘭氏陽性微生物多核苷酸序列。雜交條件基于核酸結(jié)合復(fù)合體的變性溫度(Tm)，如Berger和Kimmel所示(1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法，Vol 152，AcademicPress，San Diego CA)，后者并入本文作為參考?！皣?yán)格”的定義參照下文解釋。
典型地，“最大嚴(yán)格”在約Tm-5℃進(jìn)行(比探針的Tm低5℃)；“高度嚴(yán)格”在Tm以下約5℃到10℃進(jìn)行；“中等嚴(yán)格”在Tm以下約10℃到20℃進(jìn)行；“低度嚴(yán)格”在Tm以下約20℃到25℃進(jìn)行。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，最大嚴(yán)格雜交可用于鑒定或檢測相同多核苷酸序列，而中等或低度嚴(yán)格雜交可用于鑒定或檢測同源多核苷酸序列。
本文所用術(shù)語“雜交”應(yīng)包括“核酸的一條鏈和互補(bǔ)鏈通過堿基配對結(jié)合的過程”(Coombs J(1994)生物技術(shù)詞典，Stockton Press，NewYork NY)。
用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行的擴(kuò)增過程參見Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995，PCR Primer，a Laboratory Manual，冷泉港出版社，Plainview NY)。從枯草芽孢桿茵FTAP1、FTAP2、PurU或FMD來源的至少約10個核苷酸、多至約60個核苷酸，優(yōu)選約12至30個核苷酸，更優(yōu)選20至25個核苷酸的核酸序列可用作探針或PCR引物。
枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的氨基酸序列(分別見圖1，2，3和4所示)通過枯草芽孢桿菌基因組核酸序列的FASTA搜索來鑒定。本發(fā)明包括枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的革蘭氏陽性微生物氨基酸序列變體，這些變體與枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU和FMD有至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％的相同性，只要所述氨基酸序列變體保持功能活性。Ⅲ．表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明提供了用于在革蘭氏陽性微生物中提高生產(chǎn)和分泌異源或同源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞、表達(dá)方法和系統(tǒng)。在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞通過遺傳工程在編碼革蘭氏陽性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的基因中產(chǎn)生缺失或突變，從而缺失了各自的活性。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中革蘭氏陽性微生物通過遺傳工程增加FTAP1、FTAP2、PurU或FMD、或其它甲酸運(yùn)輸、利用或循環(huán)相關(guān)分子的水平。宿主細(xì)胞中FTAP1、2或PurU的失活獲得不能產(chǎn)生天然存在的甲酸相關(guān)蛋白質(zhì)的革蘭氏陽性微生物表達(dá)宿主細(xì)胞，需要替換和／或失活宿主細(xì)胞基因組天然存在的這些基因。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變是不可逆突變。
突變革蘭氏陽性甲酸相關(guān)蛋白質(zhì)編碼核酸的一種方法是克隆所述核酸或其部分，通過定點(diǎn)突變更改所述核酸并將突變的核酸通過質(zhì)粒重新導(dǎo)入細(xì)胞。通過同源重組，突變的基因可被導(dǎo)入染色體。在親本宿主細(xì)胞中，結(jié)果是天然存在的核酸和突變核酸串聯(lián)存在于染色體上。第二輪重組之后，在染色體上留下更改的序列，因此有效地將突變導(dǎo)入至親本宿主細(xì)胞后裔的染色體基因中。
另一個失活天然基因活性的方法是通過缺失染色體基因拷貝來實(shí)現(xiàn)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，缺失完整基因，以這種方式進(jìn)行的缺失不可能產(chǎn)生回復(fù)突變。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生部分缺失，其條件是留在染色體上的核酸序列太短，不足以與編碼FTAP1、FTAP2、PurU和FMD基因的質(zhì)粒發(fā)生同源重組。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，缺失編碼催化氨基酸殘基的核酸。
天然存在的革蘭氏陽性微生物的甲酸運(yùn)輸、利用和循環(huán)相關(guān)蛋白質(zhì)的缺失可按如下方法進(jìn)行。分離編碼甲酸相關(guān)蛋白的基因，包括其5’和3’區(qū)域，并將其插入克隆載體。體外缺失載體上的基因編碼區(qū)，同時保留足夠長的5’和3’側(cè)翼序列用于和親本宿主細(xì)胞中天然存在的基因發(fā)生同源重組。然后，將載體轉(zhuǎn)化至革蘭氏陽性宿主細(xì)胞中。通過側(cè)翼區(qū)的同源重組載體整合至染色體中。本方法可產(chǎn)生甲酸相關(guān)基因缺失的革蘭氏陽性菌株。
整合法采用的載體優(yōu)選質(zhì)粒。可包括選擇性標(biāo)記以便鑒定重組微生物。此外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到的，所述載體優(yōu)選可選擇性整合入染色體的載體。這可通過向質(zhì)粒中導(dǎo)入一個誘導(dǎo)型復(fù)制起點(diǎn)如溫度敏感型起點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。在復(fù)制起點(diǎn)敏感的溫度條件下使轉(zhuǎn)化體生長，質(zhì)粒的復(fù)制功能失活，從而提供了一種選擇染色體整合體(integrant)的方法。整合體可通過能在高溫和存在選擇性標(biāo)記如抗生素時生長來篩選。整合機(jī)制的描述見WO 88／06623。
通過坎貝爾型(Campbell-type)機(jī)制的整合可發(fā)生在蛋白酶基因的5’側(cè)翼區(qū)，導(dǎo)致蛋白酶陽性菌株在染色體甲酸相關(guān)蛋白位點(diǎn)帶有整個質(zhì)粒載體。因?yàn)楫惓Ｖ亟M會產(chǎn)生不同的結(jié)果，所以有必要確定完整基因是否已被缺失，例如通過核酸序列分析或限制性圖譜分析。
失活天然存在基因的另一種方法是通過用突變的寡核苷酸轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性微生物來突變其染色體基因拷貝。另一種方法是，所述染色體基因可通過同源重組用突變基因替代。
本發(fā)明包括具有額外蛋白酶缺失或突變的宿主細(xì)胞，如在apr、npr、epr、mpr和其它本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的基因中缺失或突變。Ⅳ．FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的產(chǎn)生為了在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生FTAP1、FTAP2、PurU或FMD，將含有至少一個編碼革蘭氏陽性微生物FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的核酸拷貝(優(yōu)選含有多個拷貝)的表達(dá)載體，在適合表達(dá)所述蛋白的條件下轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，編碼革蘭氏陽性微生物FTAP1、FTAP2、PurU或FMD或其片段、或融合蛋白的多核苷酸，或編碼具有活性的枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD氨基酸變體的同源多核苷酸序列，均可用于產(chǎn)生指導(dǎo)其在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組DNA分子。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，革蘭氏陽性宿主細(xì)胞屬于芽孢桿菌屬。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，革蘭氏陽性宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌。
正如本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所理解的，產(chǎn)生含有非天然存在密碼子的多核苷酸序列可能是有利的。例如可選擇特定革蘭氏陽性宿主細(xì)胞偏倚的密碼子，以增加表達(dá)率或產(chǎn)生具有期望特性的重組RNA轉(zhuǎn)錄本，例如具有比天然存在序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本更長的半衰期。
根據(jù)本發(fā)明，可使用的改變的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸序列包括不同核苷酸殘基的缺失、插入或替換，其產(chǎn)生編碼相同蛋白的多核苷酸或分別編碼功能上等同的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD同源蛋白的多核苷酸。本文所用的“缺失”，定義為分別缺少一或多個核苷酸或氨基酸殘基的核苷酸或氨基酸序列上的改變。
本文所用的“插入”或“添加”是指導(dǎo)致比天然存在的蛋白分別多出一或多個核苷酸或氨基酸殘基的核酸或氨基酸序列上的改變。
本文所用的“替換”是指一或多個核苷酸或氨基酸分別被不同的核苷酸或氨基酸替代。
所編碼的蛋白也可表現(xiàn)為產(chǎn)生沉默突變而導(dǎo)致FTAP1、FTAP2、PurU或FMD功能變體的氨基酸殘基的缺失、插入或替換。慎重的氨基酸替換可基于殘基在極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和／或兩親性上的相似性，只要變體保持調(diào)節(jié)分泌的能力。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水值和非荷電極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
為了修飾基因產(chǎn)物的克隆、加工和／或表達(dá)，可人工改造本發(fā)明的FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸。例如，可采用本領(lǐng)域熟知技術(shù)(例如定點(diǎn)誘變)引入突變以插入新的限制酶切位點(diǎn)、改變糖基化模式或改變密碼的偏倚性等。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，革蘭氏陽性微生物FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸可與異源序列連結(jié)以編碼融合蛋白。融合蛋白也可改造成在FTAP1、FTAP2、PurU或FMD核苷酸序列和異源蛋白質(zhì)序列之間包含一個切割位點(diǎn)，以便所述蛋白能與異源部分切割并純化出來。Ⅴ．載體序列用于在革蘭氏陽性微生物中表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達(dá)載體包含至少一個與選自FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的蛋白相關(guān)的啟動子，該啟動子在宿主細(xì)胞中有功能。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述啟動子是所選蛋白的野生型啟動子，在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述啟動子與該蛋白異源，但在宿主細(xì)胞中仍有功能。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼所述蛋白的核酸穩(wěn)定整合或以別的方式穩(wěn)定存在于所述微生物基因組中。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)載體含有多克隆位點(diǎn)盒，其優(yōu)選含有至少一個載體特有的限制性酶切位點(diǎn)，以便核酸操作。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體還含有一個或多個選擇性標(biāo)記。本文所用之術(shù)語“選擇性標(biāo)記”是指能夠在革蘭氏陽性宿主中表達(dá)的基因，其允許方便地篩選含有所述載體的宿主。這些選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于抗生素，例如紅霉素、放線菌素、氯霉素和四環(huán)素。Ⅵ．轉(zhuǎn)化多種宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)FTAP1、FTAP2、PurU和FMD，包括細(xì)菌、真菌、哺乳動物和昆蟲細(xì)胞。標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化程序見John Wiley & Sons公司1987年出版Ausubel等編輯的“分子生物學(xué)最新方法”第一卷第九章(CurrentProtocols In Molecular Biology vol．1，edited by Ausubel et alJohn Wiley & Sons，Inc．1987，chapter 9)，包括磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)化法和電穿孔轉(zhuǎn)化法。植物轉(zhuǎn)化方法見Rodriquez(WO 95／14099，1995年5月26日出版)。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陽性微生物，在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明一個或多個蛋白質(zhì)的核酸通過能在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中復(fù)制的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。能在芽孢桿菌屬中復(fù)制的合適質(zhì)粒參見Harwood和Cutting編輯John Wiley & Sons 1990年出版的“芽孢桿菌屬分子生物學(xué)方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus，Ed．Harwood and Cutting，John Wiley & Sons，1990)，特此以參考文獻(xiàn)方式并入；見關(guān)于質(zhì)粒的第三章。能在芽孢桿菌屬中復(fù)制的合適質(zhì)粒列在第92頁。
在另一個實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸穩(wěn)定整合到所述微生物基因組中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是革蘭氏陽性宿主細(xì)胞。另一個優(yōu)選宿主是芽孢桿菌屬。另一個優(yōu)選宿主是枯草芽孢桿菌。在芽孢桿菌屬中直接克隆DNA的幾種策略參見文獻(xiàn)。質(zhì)粒標(biāo)記獲救轉(zhuǎn)化涉及含有部分同源之宿主質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞攝取供體質(zhì)粒(Contente等，質(zhì)粒(Plasmid)2555-571(1979)；Haima等，Mol．Gen．Genet．223185-191(1990)；Weinrauch等，細(xì)菌學(xué)雜志(J．Bacteriol．)154(3)1077-1087(1983)；和Weinrauch等，細(xì)菌學(xué)雜志．169(3)1205-1211(1987))。攝入的供體質(zhì)粒以類似染色體轉(zhuǎn)化的過程與宿主“輔助”質(zhì)粒的同源區(qū)重組。
對于不同宿主的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參見下列文獻(xiàn)芽孢桿菌屬見Chang和Cohen，(1979)Mol. Gen．Genet 168111-115；巨大芽孢桿菌(B．Megaterium)見Vorobjeva等，(1980)FEMS Microbiol．Letters7261-263；淀粉液化芽孢桿菌(B．a(chǎn)myloliquefaciens)見Smith等，(1986)Appl．a(chǎn)nd Env．Microbiol．51634；蘇云金芽孢桿菌(B．thuringiensis)見Fisher等，(1981)Arch．Microbiol．139213-217；球狀芽孢桿菌(B．sphaericus)見McDonald(1984)普通微生物學(xué)雜志(J．Gen．Microbiol．)130203；幼蟲芽孢桿菌(B．larvae)見Bakhiet等，(1985)49577。Mann等(1986，Current Microbiol．13131-135)報(bào)道了芽孢桿菌屬原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，Holubova(1985，F(xiàn)olia Microbiol．3097)公開了使用包含DNA的脂質(zhì)體將DNA導(dǎo)入原生質(zhì)體的方法。Ⅶ．轉(zhuǎn)化體的鑒定不論宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的是突變的還是天然存在的編碼革蘭氏陽性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD基因，檢測標(biāo)記基因是否表達(dá)可提示所感興趣的基因是否存在。但是，所述基因的表達(dá)應(yīng)進(jìn)一步確證。例如，如果編碼FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的核酸插入標(biāo)記基因序列中，則含有插入基因的重組細(xì)胞可用標(biāo)記基因功能的缺失來鑒定。另一種方法是，標(biāo)記基因可與編碼FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的核酸串聯(lián)在同一個啟動子的控制下。誘導(dǎo)或選擇引起的標(biāo)記基因的表達(dá)通常也指示了FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的表達(dá)。
此外，含有FTAP1、FTAP2、PurU和FMD編碼序列并表達(dá)該蛋白的宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的各種程序來鑒定。這些程序包括但不局限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交，和蛋白質(zhì)生物測定或免疫測定技術(shù)，其包括用于檢測和／或定量核酸或蛋白質(zhì)的基于膜的、溶液的或芯片的技術(shù)。
所述多核苷酸的存在可通過采用枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的探針、部分或片段進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴(kuò)增來檢測。Ⅷ．重組蛋白質(zhì)的分泌用于確定革蘭氏陽性宿主細(xì)胞異源或同源蛋白質(zhì)的分泌水平和檢測分泌蛋白的方法，包括使用對所述蛋白特異的多克隆或單克隆抗體。例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)。這些分析或其它分析參見Hampton R等(1990，SerologicalMethods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，J Exp Med 1581211)及其它文獻(xiàn)．本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的廣泛的標(biāo)記和偶聯(lián)技術(shù)可用于各種核酸和氨基酸分析。產(chǎn)生用于檢測特異多核苷酸序列的標(biāo)記雜交或PCR探針的方法包括寡核苷酸標(biāo)記、切口平移、末端標(biāo)記或用標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。另一種方法是，所述核苷酸序列或其任何部分可克隆到載體中以產(chǎn)生mRNA探針。這些載體是本領(lǐng)域已知的，可通過商業(yè)途徑獲得，并可通過加入合適的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6聚合酶和標(biāo)記核苷酸用于體外合成RNA探針。
許多公司例如Pharmacia Biotech (Piscataway NJ)、Promega(Madison WI)和US Biochemical Corp (Cleveland OH)提供用于這些方法的商業(yè)試劑盒和操作程序。適合的報(bào)告分子或標(biāo)記物包括那些放射形核素、酶、熒光、化學(xué)發(fā)光或生色試劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒和諸如此類的物質(zhì)。這些標(biāo)記物的使用參見美國專利3，817，837；3，850，752；3，939，350；3，996，345；4，277，437；4，275，149和4，366，241。重組免疫球蛋白還可按美國專利4，816，567號所示生產(chǎn)，上述專利作為參考文獻(xiàn)并入本文。Ⅸ．蛋白質(zhì)純化轉(zhuǎn)化了編碼異源或同源蛋白質(zhì)之多核苷酸序列的革蘭氏陽性宿主細(xì)胞可在適合于表達(dá)的條件下培養(yǎng)并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收所編碼蛋白。含有本發(fā)明FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的重組革蘭氏陽性宿主細(xì)胞產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)會分泌到培養(yǎng)基中。其它重組構(gòu)建可將異源或同源多核苷酸序列和編碼便于純化可溶性蛋白的多肽域核苷酸序列連接起來(Kroll DJ等(1993) DNA Cell Biol 12441-53)。
這些便利純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于可用固定化金屬純化的金屬螯合多肽例如組氨酸-色氨酸組件(Porath J (1992) Protein Expr Purif3263-281)，可用固定化免疫球蛋白純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，和FLAGS延伸／親合純化系統(tǒng)(Immunex Corp，Seattle WA)所使用的結(jié)構(gòu)域。為了便于純化可在純化結(jié)構(gòu)域和異源蛋白質(zhì)之間插入可切割的接頭序列例如因子XA或腸激酶(Invitrogen，San Diego CA)。Ⅹ．本發(fā)明的用途FTAP1、FTAP2、PurU和FMD以及遺傳工程化宿主細(xì)胞本發(fā)明提供了遺傳工程化革蘭氏陽性微生物，其優(yōu)選在編碼FTAP1、FTAP2、PurU或FMD的天然存在基因中包含導(dǎo)致活性完全喪失或消除的不可逆突變或缺失。
在另一個實(shí)施方案中，所述微生物可進(jìn)一步遺傳改造以產(chǎn)生重組蛋白或多肽。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌。
在可替代的另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞被遺傳改造以產(chǎn)生革蘭氏陽性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在大規(guī)模發(fā)酵條件下生長，并分離和／或純化FTAP1、FTAP2、PurU或FMD。FTAP1、FTAP2、PurU和FMD多核苷酸枯草芽孢桿菌FTAP1、FTAP2、PurU或FMD多核苷酸或其任何部分提供了利用雜交技術(shù)或PCR技術(shù)檢測革蘭氏陽性微生物同源多核苷酸存在的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的一個方面是提供核酸雜交和PCR探針，其用于檢測編碼革蘭氏陽性FTAP1、FTAP2、PurU或FMD或其部分的多核苷酸序列(包括基因組或cDNA序列)。
上述說明書中提及的所有出版物和專利均以參考文獻(xiàn)并入本文。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將明了本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變更而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明是聯(lián)系特定優(yōu)選實(shí)施方案來描述的，但應(yīng)該理解本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)鼐窒抻谶@些特定實(shí)施方案。事實(shí)上，為分子生物學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的實(shí)施本發(fā)明的所描述模式的各種修改都應(yīng)當(dāng)包含在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例材料和方法菌株和培養(yǎng)基所用的枯草芽孢桿茵菌株是I168衍生茵株，稱為BG125(hisAl thr5trpC2)，由J．A．Hoch提供。該菌株生長于Luria-Bertani瓊脂(LA．1％SBG)培養(yǎng)基上，其含有如下成分豆胨(soytone)，Difco，10g／L；葡萄糖，Sigma，10g／L；酵母提取物，Difco，5g／L；NaCl，Norton，10g／L，pH7．0。1％SBG加MOPS(Sigma)含有pH7．0的80mM MOPS。在指明的地方向1％SBG中加入各種濃度的甲酸鈉(EM Science)。所有培養(yǎng)基的pH值用NaOH調(diào)節(jié)至7。甲酸殺菌測試所用生長培養(yǎng)基是1％SBG，其補(bǔ)充了50mM MES(Sigma)和50mM HEPES(Sigma)，然后用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至所指明的值。然后加入甲酸至終濃度50mM，這不會導(dǎo)致生長培養(yǎng)基的pH值改變。質(zhì)粒的構(gòu)建和增殖采用MM294感受態(tài)細(xì)胞(Ausubel等。1992，Short Protocols in Molecular Biology。JohnWiley and Sons，New York)。LB液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基用于MM294感受態(tài)細(xì)胞的生長，用于篩選時補(bǔ)充50ug／ml羧芐青霉素。用于篩選時BG125生長在補(bǔ)充了10ug／ml卡那霉素的LB瓊脂或LB液體培養(yǎng)基上。
甲氧芐胺嘧啶溶解在50％乙醇中，在指明處當(dāng)生長達(dá)到克萊特(Klett)讀數(shù)在20-30單位時，添加至終濃度50ug／ml。用于甲氧芐胺嘧啶實(shí)驗(yàn)的添加物按下列終濃度加入10ug／ml甘氨酸，10ug／ml甲硫氨酸，50ug／ml胸苷，20ug／ml腺苷和20ug／ml鳥苷。DNA操作染色體DNA提取、質(zhì)粒DNA提取、PCR產(chǎn)物純化和DNA片段凝膠回收分別使用QIAGEN血液和培養(yǎng)細(xì)胞DNA提取試劑盒、QlAprep SpinMiniprep試劑盒、QlAquick PCR純化試劑盒和QlAquick凝膠回收試劑盒進(jìn)行。DNA的PCR酶法擴(kuò)增按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。DNA的限制酶消化和連接按生產(chǎn)廠家說明進(jìn)行。yrhG(FTAP1)和ywcJ(FTAP2)基因的DNA序列同源性搜索用GCG軟件包進(jìn)行(Genetics Computer Group)。質(zhì)粒構(gòu)建本研究所用克隆載體是pUC／Ts／Kan，一種大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體。該質(zhì)粒含有pUC19質(zhì)粒、來自金黃色葡萄球菌(Staphylcoccusaureus)質(zhì)粒衍生物pEl94Ts的溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)(Fleming等。1995，App．Env．Microb．613775-3780)和來自于糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)的卡那霉素基因(Trieu-Cuot等1983，Gene 23331-341)。
通過PCR從枯草芽孢桿菌BG125染色體DNA中擴(kuò)增yrhG基因的一個0．483kb DNA片段，擴(kuò)增采用Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)和寡核苷酸引物GCGCGCGGATCCGTAATTGGCGATCTTCCGAAAGAATGG(SEQ ID NO11)和GCGCGCCTGCAGGGGAACCAGATGCCAAGGATTTTTCC(SEQ IDNO12)(BamHⅠ和PstⅠ位點(diǎn)以下劃線表示)。PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和PstⅠ消化，并與質(zhì)粒pUC／Ts／Kan的5．3-Kb BamHⅠ-PstⅠ片段連接，以構(gòu)建yrhG同源基因中斷的質(zhì)粒pTRANS1。質(zhì)粒pTRANS2的構(gòu)建采用類似方法用Taq DNA聚合酶和寡核苷酸引物GCGCGCGGATCCTTGGTTTTGGCATTACAGCCGC (SEQ ID NO13)和GCGCGCCTGCAGAGGGTGCTCGATCAAAAGCGAGATGG (SEQ ID NO14)擴(kuò)增ywcJ基因的一個0．543kb DNA片段(BamHⅠ和PstⅠ位點(diǎn)以下劃線表示)，PCR產(chǎn)物用BamHⅠ和PstⅠ消化，并與質(zhì)粒pUC／Ts／Kan的5．3-Kb BamHⅠ-PstⅠ片段連接，以構(gòu)建ywcJ同源基因中斷的質(zhì)粒。在pTRANS1和pTRANS2中斷質(zhì)粒上用Applied Biosystems 373A DNA測序儀進(jìn)行DNA序列分析，以確證PCR產(chǎn)生片段的正確性。所用測序引物是從New England Biolabs購買的mp19／pUC19 24-mer反向測序引物和mp19／pUC19 24-mer測序引物。中斷基因?qū)肟莶菅挎邨U菌為了構(gòu)建含有中斷的yrhG或ywcJ基因的枯草芽孢桿菌菌株，用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(見Chang等1979，Mol．Gen．Genet．168111-115)分別將pTRANS1和pTRANS2轉(zhuǎn)化至BG125中，并在30℃鋪平板于含200ug／ml卡那霉素的原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上。產(chǎn)生的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中45℃過夜生長。將整合體鋪平板，然后含卡那霉素的LB平板上于45℃進(jìn)行菌落純化。然后將分離的菌落置于含30％甘油的LB液體培養(yǎng)基中，-70℃冰凍保存。生長條件搖瓶實(shí)驗(yàn)之前，取自冰凍儲存物的BG125在LB瓊脂平板上37℃生長過夜。將細(xì)胞從平板轉(zhuǎn)移至含有6ml 1％SBG的試管中，37℃生長三小時。取0．2ml上述種子培養(yǎng)物接種于預(yù)熱的含有20ml適宜培養(yǎng)基的300ml濁度計(jì)(nephlometer)燒瓶中。將燒瓶置于New Brunswick科研用搖床(New Brunswick Scientific Shaker)在37℃(除非特殊指出)以300rpm孵育，在指定的時間點(diǎn)，用Klett-Summerson光電色度計(jì)測定細(xì)胞量，用Corning pH計(jì)(Corning pH／iometer)測量燒瓶pH值，并取1．25ml培養(yǎng)物用于進(jìn)一步分析。將該樣品在eppendorf微量離心機(jī)中離心，取1ml上清液與30μl高氯酸混合進(jìn)行HPLC分析。保存剩余上清用于葡萄糖分析。所有樣品在分析之前均保存在-70℃。以逐步加入HCl并測定pH值來進(jìn)行培養(yǎng)基pH滴定。PH值和甲酸對枯草芽孢桿菌的殺菌實(shí)驗(yàn)通過按上述方法在1％SBG中培養(yǎng)BG125至5×106cfu／ml密度來進(jìn)行。然后用pH已調(diào)至所指明值的含或不含50mM甲酸的緩沖1％SBG調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×104cfu／ml。之后，將培養(yǎng)物在37℃振蕩培養(yǎng)3小時。分別在0、1、2和3小時取樣，系列稀釋，并鋪板于37℃LB上，用于細(xì)胞活力測定。代謝副產(chǎn)物分析將1ml酸處理的培養(yǎng)物上清液通過0．2μm薄膜濾器過濾。代謝副產(chǎn)物的濃度用高效液相層析(HPLC)測定。采用加熱至50℃的Shodex SH1011陽離子交換柱。所用的溶劑是流速為0．4ml／min的5mM硫酸(H2SO4)。所述HPLC系統(tǒng)包括帶有LP-21型脈沖阻尼器SSI的Waters 510型泵，折射率檢測器Waters 410型示差折光儀，每個樣品用712WISP型Waters自動進(jìn)樣器注射20μl。所述HPLC和Millennium 2．15．01 HPLC控制系統(tǒng)連接，用于流動相的流量控制、積分以及數(shù)據(jù)收集和儲存。為了鑒定不同的峰，分析標(biāo)準(zhǔn)樣品并與樣品中的峰比較。所述標(biāo)準(zhǔn)品包括3-羥基丁酮，乙酸，2，3-丁二醇，丁酸，檸檬酸，甲酸，乙醇，富馬酸，蘋果酸，甘油，乳酸，丙酸，丙酮酸，所有標(biāo)準(zhǔn)品均來自Sigma。
實(shí)施例Ⅰ實(shí)施例Ⅰ闡明了甲酸的添加通過控制pH值來提高生長。
按“材料和方法”所述培養(yǎng)BG125。在含或不含3g／l(44mM)甲酸鈉的1％SBG(pH7)培養(yǎng)基中，與對照燒瓶相比添加甲酸鹽導(dǎo)致了總生長的增加，并且避免了搖瓶pH值降至6．5以下，而對照燒瓶pH值降至5．5(圖5)。甲酸的pKa值為3．73，在起始pH值為7時應(yīng)沒有緩沖活性。為排除我們培養(yǎng)基的任何緩沖效果，對1％SBG和含有3g／l甲酸鈉或80mMMOPS的1％SBG進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)。圖6顯示，1％SBG和含有甲酸鈉的1％SBG在pH值一直降至5．0的過程中均無緩沖活性。含MOPS(pKa 7．20)的1％SBG在期望范圍內(nèi)表現(xiàn)出緩沖活性。當(dāng)BG125在含有避免pH降至6．3以下的80mM MPOS的1％SBG中生長時，所述茵株的生長與含有甲酸鹽燒瓶的水平相近(圖5)。此外，含有MOPS和甲酸鹽的燒瓶中菌株的生長與MOPS燒瓶中菌株的生長基本相同(圖5)。
實(shí)施例Ⅱ?qū)嵤├蜿U明了甲酸鹽濃度的增加造成起始生長速率的延遲。
當(dāng)使用3g／l甲酸鈉時，觀察到起始生長速率的輕微延遲。為進(jìn)一步研究這種延遲，檢測了更高濃度甲酸鈉(高達(dá)21g／l)存在下BG125的生長。發(fā)現(xiàn)在甲酸濃度增加和初始延遲期的持續(xù)時間之間存在相關(guān)性。所有測試的培養(yǎng)物在延遲期之后以相似的速率保持生長，并達(dá)到比對照更高的密度。
實(shí)施例Ⅲ實(shí)施例Ⅲ闡明了添加甲酸導(dǎo)致了乙酸產(chǎn)生的增加。
為進(jìn)一步研究甲酸對BG125生長的影響，我們還研究了在圖5的搖瓶中各種有機(jī)副產(chǎn)物的產(chǎn)生和葡萄糖的利用。圖8顯示，對于甲酸和甲酸加MOPS的燒瓶，從培養(yǎng)基中攝取甲酸開始于指數(shù)生長早期，并在穩(wěn)定期開始之前完全停止(圖8)。乙酸水平(圖9)的測定揭示這種化合物在所有燒瓶中大量產(chǎn)生，這可能是在1％SBG中生長期間pH降低的原因；然而，在不同燒瓶中所產(chǎn)生的乙酸量的確不同。首先，僅含1％SBG的對照燒瓶產(chǎn)生乙酸緩慢，并達(dá)到約1．5g／l。有MOPS緩沖的燒瓶以比對照更快的速率達(dá)到接近2g／l的乙酸。含有甲酸的兩個燒瓶產(chǎn)生乙酸的持續(xù)時間最長，并達(dá)到2．5-3g／l的乙酸。
實(shí)施例Ⅳ實(shí)施例Ⅳ闡明了甲酸不能增強(qiáng)葡萄糖的攝取。
實(shí)驗(yàn)過程中測定葡萄糖水平(圖10)時，MOPS、甲酸、和MOPS加甲酸燒瓶以同樣速率利用葡萄糖，至450分鐘葡萄糖的利用不能檢測為止。對照燒瓶以相同速率利用葡萄糖，直至250分鐘時攝取開始減慢并終止于6g／l。
實(shí)施例Ⅴ實(shí)施例Ⅴ顯示了在存在甲酸時甲氧芐胺嘧啶的添加減緩菌株生長。
為研究甲氧芐胺嘧啶(一種四氫葉酸合成抑制劑)的作用，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)向含1％SBG、1％SBG加甲酸加生長添加劑的燒瓶和含有1％SBG加生長添加劑的對照燒瓶中加入甲氧芐胺嘧啶。還測定了用于溶解甲氧芐胺嘧啶的乙醇的作用。圖11顯示，與僅含1％SBG的培養(yǎng)基相比，在1％6SBG培養(yǎng)基中添加甲氧芐胺嘧啶對培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌的生長有抑制作用。向含甲氧芐胺嘧啶的燒瓶中加入添加劑，通過依賴四氫葉酸的輔助途徑菌株生長得以部分恢復(fù)。當(dāng)甲酸加入含有甲氧芐胺嘧啶和生長增強(qiáng)添加劑的燒瓶中，生長速率明顯降低，但仍然高于僅含甲氧芐胺嘧啶的燒瓶的生長速率。乙醇對生長無任何作用。
實(shí)施例Ⅵ甲酸增強(qiáng)了低pH對枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物的殺菌效果為了確定在pH7．0時所觀察到的甲酸的任何作用如枯草芽孢桿菌生長延遲是否涉及對一部分細(xì)胞群體的致死毒性，我們測定了甲酸對pH7或更低的培養(yǎng)物中細(xì)胞活力的影響。因?yàn)榧姿醦Ka值為3．75，我們認(rèn)為甲酸在該pH值附近是有毒的。在pH3．6、4．0、4．6和7．0時，將BG125培養(yǎng)物接種至含或不含50mM甲酸的緩沖1％SBG培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示，在pH3．6時，含有或不含甲酸的培養(yǎng)物在2小時孵育時間內(nèi)完全喪失了活力。在pH3．6培養(yǎng)1小時后，基于初始滴定量的存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為1．8％，而甲酸的加入使存活百分?jǐn)?shù)持續(xù)降低至平均0．13％。在pH4．0時，在不含甲酸的培養(yǎng)基中孵育導(dǎo)致了比pH3．6時較少的活力喪失，孵育3小時后存活細(xì)胞達(dá)到38％。在pH4．0時，甲酸使活力喪失增加，3小時后存活細(xì)胞降至1．2％。含或不含甲酸的培養(yǎng)物在pH4．6孵育時沒有顯示活力降低。在pH7．0孵育時也沒有顯示活力的降低，并有細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，提示出現(xiàn)了該濃度甲酸下期望的某種生長。
這些結(jié)果提示革蘭氏陽性微生物發(fā)酵需要控制pH值，并且，如果在培養(yǎng)物中產(chǎn)生了甲酸則不應(yīng)使pH降至4．6以下。
實(shí)施例ⅦFTAP1和FTAP2的同源基因FTAP1(YrhG)和FTAP2(YwcJ)的同源基因顯示在表1A和表1B中。已發(fā)現(xiàn)的所有這些同源基因指示YrhG和YwcJ與甲酸或其它小分子運(yùn)輸中涉及的蛋白質(zhì)相關(guān)。預(yù)測YrhG和YwcJ是含有多個跨膜區(qū)的小分子疏水蛋白質(zhì)。
實(shí)施例Ⅷ實(shí)施例Ⅷ闡明了中斷FTAP1或FTAP2編碼基因?qū)ρ挎邨U菌屬細(xì)胞生長的影響，分別見圖16和17。
對于兩個基因，構(gòu)建PCR引物以擴(kuò)增基因的內(nèi)部區(qū)用于基因中斷。將這些內(nèi)部片段克隆至帶有芽孢桿菌屬溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制性質(zhì)粒中。當(dāng)轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌測試菌株時，通過質(zhì)粒標(biāo)記的抗生素篩選來維持所述質(zhì)粒。
在抗生素存在時提高溫度，獲得了所述質(zhì)粒已通過同源區(qū)整合入芽孢桿菌屬染色體中的克隆。這就導(dǎo)致了被測基因的中斷，這種基因中斷通過在抗生素存在時高于復(fù)制起點(diǎn)活性溫度的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞來維持。在含有1％SBG、抗生素和含或不含甲酸的搖瓶中測定了整合體。據(jù)測定，單獨(dú)存在抗生素對整合體的生長無影響。以含有無所述質(zhì)粒的菌株的燒瓶為對照測定整合體。
結(jié)果顯示，每種基因的中斷僅在加入甲酸時對生長有影響。YrhG基因中斷使正常的甲酸生長增強(qiáng)效果降低了一半。這些現(xiàn)象可用基因中斷引起的甲酸攝入降低來解釋。YwcJ(FTAP2)基因中斷導(dǎo)致了毒性作用，致使細(xì)胞生長遠(yuǎn)低于不含甲酸的對照菌株的生長。因此看來兩個基因都在甲酸運(yùn)輸或利用中起作用。
在閱讀了本公開書的本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會明了各種其它例子和以上描述和實(shí)施例的修改，而不違背本發(fā)明的精神和范圍，并且所有這些例子和修改都應(yīng)包含在附及的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文所參考的所有出版物和專利在此以參考文獻(xiàn)完整并入本文。
表1AYrhG和YwcJ蛋白與有關(guān)多肽之間的氨基酸序列同源性與YrhG蛋白的同源性 aSalmonella thyphimuriun鼠傷寒桿菌bMethanobacteria甲烷細(xì)菌cHaemophilus influenzae流感嗜血桿菌表1B與YwcJ蛋白的同源性 所有值都是序列相同百分?jǐn)?shù)aSalmonella thyphimuriun鼠傷寒桿菌bMethanobacteria甲烷細(xì)菌cHaemophilus influenzae流感嗜血桿菌
權(quán)利要求
1．一種用于在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，其包括a)獲得能表達(dá)所述產(chǎn)品的微生物，所述微生物包含ⅰ)甲酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白1(FTAP1)和ⅱ)甲酸運(yùn)輸相關(guān)蛋白2(FTAP2)之一或二者兼有；和b)在存在甲酸并適合所述產(chǎn)品生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述微生物。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)品是重組蛋白。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述重組蛋白與所述微生物同源。
4．權(quán)利要求2的方法，其中所述重組蛋白與所述微生物異源。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述革蘭氏陽性微生物是芽孢桿菌屬。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
7．權(quán)利要求2的方法，其中所述重組蛋白包括激素、酶、生長因子和細(xì)胞因子。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述蛋白是酶。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、漆酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述FTAP1具有圖1所示的氨基酸序列。
11．權(quán)利要求1的方法，其中所述FTAP2具有圖2所示的氨基酸序列。
12．一種在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，其包括a)獲得可表達(dá)所述產(chǎn)品并在編碼PurU的核酸中含有一個突變的革蘭氏陽性微生物，所述突變導(dǎo)致所述微生物PurU活性生產(chǎn)的抑制；b)在適合生產(chǎn)所述產(chǎn)品的條件下培養(yǎng)所述微生物。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所述產(chǎn)品是重組蛋白。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組蛋白與所述革蘭氏陽性微生物同源。
15．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組蛋白與所述革蘭氏陽性微生物異源。
16．權(quán)利要求13的方法，其中所述革蘭氏陽性微生物是芽孢桿菌屬。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。
18．權(quán)利要求13的方法，其中所述重組蛋白包括激素、酶、生長因子和細(xì)胞因子。
19．權(quán)利要求18的方法，其中所述蛋白是酶。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、漆酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
21．一種在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，其包括步驟a)獲得可表達(dá)所述產(chǎn)品并在編碼FTAP1和FTAP2的核酸之一或兩者中有一個突變的革蘭氏陽性微生物，所述突變導(dǎo)致所述微生物FTAP1和／或FTAP2活性生產(chǎn)的抑制；和b)在適合生產(chǎn)所述產(chǎn)品的條件下培養(yǎng)所述微生物。
22．一種在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，其包括步驟a)獲得可表達(dá)所述產(chǎn)品的革蘭氏陽性微生物；b)修飾所述微生物的FMD表達(dá)；和c)在適合生產(chǎn)所述產(chǎn)品的條件下培養(yǎng)所述微生物。
23．權(quán)利要求21或22的方法，其中所述產(chǎn)品是重組蛋白。
24．一種改變革蘭氏陽性微生物生長的方法，其包括修改所述革蘭氏陽性微生物中的甲酸運(yùn)輸。
25．一種革蘭氏陽性微生物，其包括編碼FTAP1和FTAP2之一或兩者的分離的核酸。
26．一種革蘭氏陽性微生物，其PurU編碼基因中含有一個突變，所述突變導(dǎo)致PurU活性的抑制。
27．權(quán)利要求25或26的微生物，其還包括編碼一種蛋白質(zhì)的核酸。
28．權(quán)利要求27的微生物，其中所述蛋白質(zhì)是酶。
29．權(quán)利要求28的微生物，其中所述酶包括蛋白酶、脂酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、漆酶和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。
30．一種表達(dá)載體，其包含編碼至少FTAP1、FTAP2、PurU和FMD之一的核酸。
31．包含權(quán)利要求30的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及革蘭氏陽性微生物甲酸運(yùn)輸系統(tǒng),并提供在革蘭氏陽性微生物中生產(chǎn)產(chǎn)品的方法。本發(fā)明還提供與甲酸運(yùn)輸有關(guān)的四個分子FTAP1、FTAP2、PurU和FMD的核酸和氨基酸序列。
文檔編號C12R1/07GK1279722SQ98811347
公開日2001年1月10日 申請日期1998年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月20日
發(fā)明者B·米勒, M·狄亞茲－托瑞斯 申請人:金克克國際有限公司