專利名稱：環(huán)氧化物水解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)氧化物水解酶的核苷酸序列和氨基酸序列，以及它們在環(huán)氧化物的對映異構(gòu)水解中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)氧化物在精細(xì)化合物、特別是對映體純的化合物的有機(jī)合成中，環(huán)氧化物被作為手性結(jié)構(gòu)單元。它們是反應(yīng)活性分子，因?yàn)槠洵h(huán)能被很容易地打開而生成多種產(chǎn)物。由于這個(gè)原因，它們是重要的藥物和專用化學(xué)品的前體?，F(xiàn)存的某些化學(xué)方法是由旋光前體來制備這些分子，但是除了僅限于對烯丙基醇使用的、Sharpless環(huán)氧化方法外，仍缺乏有效的不對稱合成(涉及不對稱化作用)和拆分的方法(美國化學(xué)學(xué)會會志102，P．5974(1980))。利用生物反應(yīng)來進(jìn)行環(huán)氧化物合成已有研究(參閱例如de BontJ．A．M．的綜述，四面體不對稱性4，P．1331(1993))。
由多種工業(yè)來源釋放到環(huán)境中或者在其他合成化學(xué)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程中形成的另外一些環(huán)氧化物，比如鹵化的脂族環(huán)氧化物，是潛在的污染物。例如表氯醇(3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷)就是一種用途廣泛的工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，已被確認(rèn)是誘變劑和致癌劑。
環(huán)氧化物水解酶環(huán)氧化物水解酶(EC3．3．2．3．)是這樣一些水解酶，它們催化環(huán)氧化物環(huán)的打開，將其底物轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的二元醇。其最有趣的一個(gè)性質(zhì)是它們通常具有高度的區(qū)域選擇性和對映體選擇性，可用于制備純的對映體。
各種有機(jī)體中的環(huán)氧化物水解酶都已得到研究。研究最為透徹的是來源于哺乳動(dòng)物的環(huán)氧化物水解酶。它們主要存在于肝、睪丸、腎、卵巢和肺中。因其參與生物異源物質(zhì)的代謝(對具細(xì)胞毒性、誘變性和致癌性的中間產(chǎn)物的解毒作用)而得到廣泛研究(Seidegard等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)695，P．251(1983))。
對于存在于其他高等真核生物如植物和昆蟲中的環(huán)氧化物水解酶也已有描述。
由于其低可獲得性上述來源的酶對于大規(guī)模加工過程沒有實(shí)用價(jià)值。微生物群體是一個(gè)合適的替代選擇，因?yàn)槲⑸锬軌蜻M(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。使用完整細(xì)胞進(jìn)行環(huán)氧化物的生物轉(zhuǎn)化已得到研究。多種微生物的微生物環(huán)氧化物水解酶已有描述。以下對這些描述的一些實(shí)例進(jìn)行概括-黑曲霉LPC521和Beauvaria sulfurescens ATCC7159含有對映體互補(bǔ)的環(huán)氧化物水解酶，該酶可水解苯乙烯環(huán)氧化物的兩種外消旋形式(Pedragosa-Moreau等，有機(jī)化學(xué)雜志58，P．5533(1993))。
-棉色二孢ATCC16391可催化將外消旋的茚氧化物動(dòng)力學(xué)拆分為1(S)、2(R)茚氧化物。(Zhang等，發(fā)酵與生物工程雜志，80，p244(1995))。
-在棒桿菌N-1074菌株中進(jìn)行研究的環(huán)氧化物水解酶可將表氯醇(3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷)轉(zhuǎn)化為(R)-3-氯-2-丙醇(Nakamura等，細(xì)菌學(xué)雜志174，P．7613(1992))。從假單胞菌AD1菌株中已純化到了類似的酶(Jacobs等，歐洲生物化學(xué)雜志202，P．1217(1991))。
-從紅球菌NCIMB 11216中分離到一種催化手性環(huán)氧化物和二元醇中各種外消旋環(huán)氧化物進(jìn)行不對稱水解的環(huán)氧化物水解酶(Mischitz等，生物技術(shù)快訊17，P．893(1995))。
-株黃桿菌能將反式-1-環(huán)氧琥珀酸轉(zhuǎn)化為內(nèi)消旋酒石酸(Martin等，生物化學(xué)雜志70，P．405(1955))。
-酒石酸諾卡氏菌的環(huán)氧化物水解酶能催化順式-環(huán)氧琥珀酸水解產(chǎn)生L(+)酒石酸(Patentschrift DE 2605921)。其他一些微生物如無色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬(美國專利3957579)、產(chǎn)酒石酸不動(dòng)桿菌、金色土壤桿菌、粘稠土壤桿菌、健康根瘤菌(Rhizobium validum)、假單胞菌(Offenlegungsschrift DT 2619311)可進(jìn)行同樣的反應(yīng)。
上述例子的一個(gè)共同特點(diǎn)是使用完整細(xì)胞或細(xì)胞的完整粗提物去完成反應(yīng)?？梢酝ㄟ^物理方法破碎細(xì)胞或用去污劑處理使細(xì)胞壁和／或細(xì)胞膜具有通透性來釋放這些酶。
酒石酸酒石酸在食品工業(yè)中有多種用途(軟飲料中的添加劑，食品防腐劑，合成乳化劑的原料，…)?？梢杂神R來酸為原料化學(xué)合成酒石酸，但該過程會產(chǎn)生包括L(+)形式的酒石酸和D(+)形式的酒石酸的外消旋產(chǎn)物。在食品中，只批準(zhǔn)使用L(+)形式的酒石酸，而D(+)形式的酒石酸被認(rèn)為有害人體健康。
在酒類發(fā)酵中，L(+)-酒石酸是一種自然產(chǎn)生的副產(chǎn)物，但各年這種化合物的供應(yīng)量不定，因?yàn)樗艽蟪潭壬弦Q于氣候變化。
利用順式環(huán)氧琥珀酸水解酶酶促水解順式環(huán)氧琥珀酸可以只得到L(+)形式的酒石酸。因此這種生物轉(zhuǎn)化可以作為生產(chǎn)L(+)-酒石酸的一種有價(jià)值的替代方法。
工藝現(xiàn)狀Rink等人(生物的化學(xué)雜志272(23)(1997年6月6日))描述了分離自放射形土壤桿菌AD1菌株的環(huán)氧化物水解酶的一級結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。
Murdiyatmo等人(生物化學(xué)雜志284，pp．87-93(1992年5月))描述了分離自洋蔥假單胞菌MBA4的2-鹵代酸-鹵化物水解酶-IVa的分子生物學(xué)。
Mischitz等人(生物技術(shù)快訊，No．17(9)，pp．893-898(1995))描述了從一株紅球菌中分離一種高度對映體選擇性的環(huán)氧化物水解酶，該酶分子量為33-35000kD并得自凝膠過濾層析SDS page。這篇文獻(xiàn)報(bào)道了該環(huán)氧化物水解酶的最適溫度為30℃。但該文沒有描述此酶的氨基酸序列和編碼此酶的可能核苷酸序列。
Yamagishi和Cho(紐約科學(xué)院年報(bào)Vol．799，pp．784-785(1996))描述了使用惡臭假單胞菌MCI3037菌株由順式環(huán)氧琥珀酸生產(chǎn)酒石酸的酶學(xué)制備方法。
日本專利申請JP-08245497報(bào)道了制備酒石酸的類似方法，是用假單胞菌微生物的培養(yǎng)物來處理順式環(huán)氧酒石酸。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及得自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)，優(yōu)選保藏號為LMGP-18079的菌株的分離并純化的編碼環(huán)氧化物水解酶的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，所述核苷酸序列(基因組DNA、cDNA、RNA)與下文描述的序列SEQ ID NO 5有50％以上的同源性，優(yōu)選70％以上的同源性，更優(yōu)選90％以上的同源性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述分離并純化的核苷酸序列對應(yīng)于核苷酸序列SEQ ID NO 5或其編碼具有環(huán)氧化物水解酶活性的肽的部分。
“核苷酸序列SEQ ID NO 5的部分”是指所述序列SEQ ID NO 5的一個(gè)片段，它有該核苷酸序列中的100多個(gè)核苷酸并編碼特征在于環(huán)氧化物水解酶活性的蛋白質(zhì)，此活性與完整氨基酸序列SEQ ID NO 6的環(huán)氧化物水解酶活性類似。
優(yōu)選地，所述部分的環(huán)氧化物水解酶酶活性是氨基酸序列SEQ ID NO 6的環(huán)氧化物水解酶酶活性的80％以上，優(yōu)選具有與SEQ ID NO 6對應(yīng)的任何氨基酸序列對應(yīng)的環(huán)氧化物水解酶酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種重組核苷酸序列，它包含與本發(fā)明的以及上述的核苷酸序列可操縱地連接的一個(gè)或多個(gè)相鄰調(diào)控序列，優(yōu)選來源于同源微生物的調(diào)控序列。
但所述相鄰調(diào)控序列也可能來源于異源的微生物。
這些相鄰調(diào)控序列是一些特定序列，比如啟動(dòng)子、分泌和終止信號序列。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及載體，它包含本發(fā)明的核苷酸序列，后者可能與一個(gè)或多個(gè)來源于同源或異源微生物的相鄰調(diào)控序列可操縱地連接。
“載體”是指可用于將核苷酸序列(通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)導(dǎo)入細(xì)胞的任何生化構(gòu)建體。較有利的是，本發(fā)明的載體選自質(zhì)粒、病毒、噬菌粒、脂質(zhì)體、陽離子泡囊或其混合物。所述載體可以已包含一個(gè)或多個(gè)上述相鄰調(diào)控序列。
優(yōu)選地，所述載體是保藏號為LMBP-3666的質(zhì)粒。
本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，優(yōu)選用上述本發(fā)明的核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。
“用本發(fā)明的核苷酸序列或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”是指這樣一個(gè)細(xì)胞，它含有導(dǎo)入其中的所述核苷酸序列或所述載體，但不是天然含有該核苷酸序列或載體。
優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞還能表達(dá)所述核苷酸序列或載體并能有利地產(chǎn)生由該核苷酸序列或載體所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明的分離并純化的核苷酸序列可以整合到所選宿主細(xì)胞的基因組上或以宿主細(xì)胞中的附加型載體的形式存在。
較有利的是，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞選自微生物群體，優(yōu)選細(xì)菌或真菌，包括酵母。
優(yōu)選地，將所述重組宿主細(xì)胞修飾以便高水平表達(dá)環(huán)氧化物水解酶。
優(yōu)選地，通過使用能引導(dǎo)本發(fā)明的核苷酸序列在重組宿主細(xì)胞中過量表達(dá)的相鄰調(diào)控序列來實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及由分離并純化的核苷酸序列編碼和／或由本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞表達(dá)的分離并純化的(從可能的雜質(zhì)中)環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列。
本發(fā)明的分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列的特性在于，其有利的pH活性曲線為pH在7．0和10之間時(shí)，優(yōu)選pH在7．5和9．5之間，酶活性極高(是最佳酶活性的80％以上)(見圖5)。
較有利的是，所述分離并純化的環(huán)氧化物水解酶分子量在26-30kD之間，優(yōu)選分子量約為28kD(理論分子量為28，136kD)。
所述環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列或肽是由本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞在胞外或胞內(nèi)表達(dá)和／或分泌的。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列與氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于50％，優(yōu)選高于70％，更優(yōu)選高于90％。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列或該氨基酸序列的一小部分(多于50個(gè)氨基酸，優(yōu)選多于100個(gè)氨基酸)，此序列至少有完整SEQ ID NO 6氨基酸序列的環(huán)氧化物水解酶80％以上的活性，優(yōu)選95％以上的酶活性。換句話說，本發(fā)明的已分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列可以被部分地缺失而保持其酶活，活性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法測量。所述分離并純化的環(huán)氧化物水解酶或其部分分子量小于30kD，優(yōu)選約為28kD或更低的分子量。
通過酶學(xué)檢測(該方法對于本發(fā)明并不重要)，比如在L(+)酒石酸中水解順式環(huán)氧琥珀酸來鑒定目的環(huán)氧化物水解酶。將微生物培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中以產(chǎn)生目的酶來進(jìn)行檢測(例如，通過順式環(huán)氧琥珀酸進(jìn)行誘導(dǎo))。對完整細(xì)胞或培養(yǎng)基分別檢測酶活性。
一旦鑒定到環(huán)氧化物水解酶，可以在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)自然產(chǎn)生該酶的微生物或本發(fā)明的重組細(xì)胞，誘導(dǎo)其產(chǎn)生目的酶(環(huán)氧化物水解酶)，采用已知方法比如柱層析來分離所需環(huán)氧化物水解酶，然后確定純化過的該酶氨基酸序列的“活性部分”，這樣可以得到編碼該環(huán)氧化物水解酶的DNA序列。
從提純環(huán)氧化物水解酶的微生物的基因文庫中獲得編碼此酶的DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明，由以上確定的氨基酸序列的一部分得到寡核苷酸探針。用該寡核苷酸探針篩選提純目的環(huán)氧化物水解酶的微生物的部分基因文庫。得到一個(gè)作為質(zhì)粒載體pBlueScript SK(+)中的插入片段、包含環(huán)氧化物水解酶的編碼序列的8kb BamHⅠ-EcoRⅠ基因組DNA片段。所得到的質(zhì)粒被命名為pREHBE。
用限制酶SphⅠ和XhoⅠ消化并插入到質(zhì)粒載體pBlueScript SK(+)中的適當(dāng)限制位點(diǎn)，使質(zhì)粒pREHBE的插入片段大小縮小到1．4kb。此時(shí)得到的質(zhì)粒被命名為pREHXS并(在E．coli DH10B中)保藏于LMBP(BCCM／LMBP質(zhì)粒保藏中心，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，K．L．Ledenganckstraat，35，B-9000 Gent)，保藏號為LMBP-3666。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)經(jīng)手工測序來確定插入片段的全部序列。
如上所述的表達(dá)構(gòu)建體可以在E．coli宿主中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，在合適的培養(yǎng)基中(如LB培養(yǎng)基)培養(yǎng)所述含有質(zhì)粒pREHXS的E．coli宿主，培養(yǎng)基中加入合適的抗生素以保證質(zhì)粒持續(xù)存在于宿主細(xì)胞中，然后收集細(xì)胞并測定環(huán)氧化物水解酶的酶活力。本發(fā)明的范圍并不將環(huán)氧化物水解酶基因的表達(dá)局限于E．coli。根據(jù)本發(fā)明，較為有利的是，在細(xì)菌或真菌，包括酵母中表達(dá)編碼環(huán)氧化物水解酶的DNA片段。為了使目的基因能在這些宿主中表達(dá)，可最終將編碼環(huán)氧化物水解酶的DNA序列與允許其在所選宿主中(過量)表達(dá)的DNA序列(如啟動(dòng)子、終止子、UAS等序列)可操縱地連接。
優(yōu)選將編碼環(huán)氧化物水解酶的DNA序列進(jìn)行修飾以便使環(huán)氧化物水解酶分泌(細(xì)胞外表達(dá))到宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。這類修飾通常是添加一段編碼能被所選宿主的分泌機(jī)構(gòu)識別的前導(dǎo)序列的DNA序列，以便在培養(yǎng)基中回收環(huán)氧化物水解酶。
本發(fā)明還提供了用于培養(yǎng)所選表達(dá)環(huán)氧化物水解酶的宿主的條件(培養(yǎng)基、溫度、…)。
本發(fā)明的最后一個(gè)方面涉及本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞或者本發(fā)明的分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列用于水解環(huán)氧化物的用途，優(yōu)選水解順式環(huán)氧琥珀酸。
較為有利的是，可以用本發(fā)明的新酶水解環(huán)氧化物底物中的環(huán)氧化物環(huán)。已知的環(huán)氧化物的例子有苯乙烯環(huán)氧化物、辛烯環(huán)氧化物、萘環(huán)氧化物、菲環(huán)氧化物、苯環(huán)氧化物、estroxide、雄烯氧化物、表氯醇，和順式環(huán)氧琥珀酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的環(huán)氧化物水解酶能用來水解順式環(huán)氧琥珀酸，但不能水解環(huán)氧化物底物表氯醇。
本發(fā)明的酶能以幾種方式使用可培養(yǎng)后直接使用經(jīng)過或不經(jīng)通透化處理的細(xì)胞，酶也可以以細(xì)胞抽提物的形式使用(即經(jīng)一步或多步離心和抽提步驟處理的宿主細(xì)胞部分)或以純化蛋白質(zhì)的形式使用。上述任何一種形式都可以和上述任何一種形式的另一種酶聯(lián)合使用。此外，可以從宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收該酶，所述細(xì)胞能夠表達(dá)該環(huán)氧化物水解酶并將其分泌到胞外。在這種情況下，酶制品能以粗制品或者以部分或完全純化的制品形式與或不與和一種或多種其它酶結(jié)合使用。
可以將完整細(xì)胞、細(xì)胞提取物、無細(xì)胞提取物或純化的環(huán)氧化物水解酶固定化(用常規(guī)方法固定在固相支持物如層析柱上)，以便使環(huán)氧化物底物能連續(xù)水解或者使酶制品(完整細(xì)胞、細(xì)胞提取物、無細(xì)胞提取物，完全或部分純化的環(huán)氧化物水解酶等)能循環(huán)使用。
參考附圖，在下列實(shí)施例中將進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，所述實(shí)施例并非以任何方式限定本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
附圖簡述

圖1顯示了從MonoQ柱上洗脫的各組份的含量及這些組份相應(yīng)的活性。
圖2顯示了使用基于順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列的寡核苷酸來探查紫紅紅球菌LMGP-18079全部基因組DNA的典型Southern印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖3顯示了紫紅紅球菌LMGP-18079順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因及其旁側(cè)區(qū)域的核苷酸序列。
圖4顯示了由紫紅紅球菌LMGP-18079順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因序列推測的氨基酸序列。通過對該酶進(jìn)行化學(xué)測序得出的氨基酸序列加有下劃線。
圖5代表本發(fā)明酶的相對酶活性。
實(shí)施例實(shí)施例1環(huán)氧化物水解酶的部分純化菌株將紫紅紅球菌LMGP-18079常規(guī)保存于含有0．4％葡萄糖、0．4％酵母提取物、1％麥芽提取物和2％瓊脂的瓊脂斜面上。
順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性的測定于37℃、在終體積為9．3ml的體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，體系中包括以下成分0．7ml 0．1N Tris．HCl緩沖液(pH 8．0)，2．6ml 1．14％ Triton-X100溶液，5．0ml 30％順式環(huán)氧琥珀酸鈉溶液和1．0ml細(xì)胞懸浮液。用經(jīng)H3PO4酸化到pH 2．2的水將混合物稀釋100-500倍來終止反應(yīng)。
于室溫下在Vydac C18柱子(貨號201HS3410)上，經(jīng)HPLC(流速在400-600μl／min之間，樣品體積為20μl)測定反應(yīng)過程中形成的L-酒石酸。溶劑與稀釋樣品所用溶劑相同。在210nm處檢測順式環(huán)氧琥珀酸和酒石酸。
用1g干細(xì)胞在一天中形成的L(+)-酒石酸的數(shù)量表示酶活力。
為了對含有酶的可溶性級分進(jìn)行快速定性分析，酶反應(yīng)是在37℃，在終體積為1ml的溶液(10mM Tris-HCl(pH 8．0)，0．5ml順式環(huán)氧琥珀酸鈉(30％)為底物)中進(jìn)行的。
菌株培養(yǎng)以及順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力的誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基含有以下組分(g／l)丙二醇10、酵母抽提物2、KH2PO42、Na2HPO4·2H2O 2．2、(NH4)2SO43、CaCl2·2H2O 0．03、MnSO4·H2O 0．003，MgSO4·7H2O 0．1、FeSO4·7H2O 0．01將pH調(diào)至7．0并于30℃下振蕩溫育培養(yǎng)物。24小時(shí)后添加10g／l的順式環(huán)氧琥珀酸來誘導(dǎo)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性。離心收集細(xì)胞并于-20℃貯存待用。
順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的部分純化1．無細(xì)胞提取物的獲得將約26克的凍存細(xì)胞懸浮于含有5mM DTT、0．5mM PMSF、5mM EDTA和2μg／ml胃蛋白酶抑制劑的35ml磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7．2)中。
在液態(tài)CO2的冷卻下，用Braun MSK勻漿機(jī)通過玻璃珠破碎細(xì)胞。
首先在Sorvall RC5B離心機(jī)的SS34轉(zhuǎn)頭中以7000 rpm離心勻漿液。用50ml的冷緩沖液重新抽提所得沉淀并再次離心。然后在相同的轉(zhuǎn)頭中于4℃，16000rpm下將兩次合并的上清液離心20分鐘。最后一步是使用Beckman L8-70離心機(jī)的A641轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速38000rpm離心60分鐘，從而得到無細(xì)胞提取物。
于4℃將提取物(138ml)對含有1M(NH4)2SO4、2．5mM DTT和2．5mM EDTA的2升鉀緩沖液(50mM，pH7．2)透析過夜。
2．Phenyl-Sepharose上層析透析后，將提取物上樣到用透析緩沖液平衡過的30ml Phenyl Sepharose(Pharmacia Biotech)柱上。用相同的緩沖液洗滌后，在相同的緩沖液中用240ml的1M-OM(NH4)2SO4線性梯度在3ml／min下洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集3ml級分并檢測其順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
將活性級分合并，并對含有2．5mM EDTA和2．5mM DTT的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7．2)透析。
3．Q-Sepharose上層析將步驟2得到的透析液上樣到用透析緩沖液平衡過的10ml Q-Sepharose(Pharmacia Biotech)柱上。經(jīng)相同的緩沖液洗滌后，在相同的緩沖液中用80ml的0-0．5M NaCl線性梯度在1ml／min下從柱上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。收集1ml級分并檢測其順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
4．MonoQ上層析將步驟3中的活性級分合并，取其中大約1／10用含有2．5mM EDTA和2．5mM DTT的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7．2)稀釋2．7倍，并上樣到MonoQ HR5／5柱(Pharmacia Biotech)上。在相同的緩沖液中用0-0．5M NaCl線性梯度從柱上洗脫蛋白質(zhì)，流速為0．25ml／min。收集0．25ml的級分并檢測其順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活力。
5．SDS-PAGE上電泳將從MonoQ柱上收集的25μl級分加入12．5％的丙烯酰胺SDS凝膠(Mini-PROTEAN Ⅱ Electrophoresis system-Bio-Rad)。用考馬斯蘭染色將凝膠上的蛋白質(zhì)顯跡。
實(shí)施例2順式環(huán)氧琥珀酸水解酶氨基酸序列的測定在經(jīng)SDS-PAGE電泳和PVDF Immobilon-P膜(Millipore)上進(jìn)行電印跡后，依照一般程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的氨基端測序。測序使用偶聯(lián)HPLC 120A分析儀的477A蛋白自動(dòng)測序儀(Applied Biosystem)。
為了測定內(nèi)部片段的序列，首先在膜上用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)。在HPLC上經(jīng)反相層析來分離所得肽，然后如上所述進(jìn)行氨基端測序。
得到以下序列氨基末端 MQLNNANDNTQF SEQ ID NO 1第一內(nèi)部肽SWPDVPSGLEQLR SEQ ID NO 2第二內(nèi)部肽RPLEYGPTGRSEQ ID NO 3實(shí)施例3順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的鑒定1．設(shè)計(jì)寡核苷酸探針根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基端序列(SEQ ID NO 1)，合成地高辛配基(digoxigenine)標(biāo)記的寡核苷酸。該寡核苷酸序列如下5′AAYAAYGCNAAYGAYAAYAC 3′SEQ ID NO 4Y代表C或T，N代表4種堿基中的任何一種堿基。
2．寡核苷酸與紫紅紅球菌總DNA的雜交2．1分離基因組DNA將紫紅紅球菌LMGP-18079菌株在200ml LBroth中于37℃培養(yǎng)過夜。離心收集后，細(xì)胞在80℃用，TE緩沖液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH8．0)洗滌30分鐘，再次離心，重新懸浮于含120mg溶菌酶的15ml，TSE緩沖液(Tris-HCl 50mM、蔗糖200mM、EDTA 1mM，pH8．0)中，并于37℃保溫2小時(shí)，然后加入1．5ml 250mM的EDTA(pH8．0)?；旌衔锢^續(xù)保溫60分鐘。加入1ml STE(SDS 20％、Tris-HCl50mM、EDTA 20mM，pH8．0)之后，將混合物于55℃保溫30分鐘。
經(jīng)酚和酚-氯仿連續(xù)抽提以及乙醇沉淀后從雜質(zhì)中分離出DNA。
2．2 Southern印跡將大約6μg紫紅紅球菌DNA用不同的限制酶(EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、PstⅠ)或這些酶的組合(EcoRⅠ+BamHⅠ、EcoRⅠ+PstⅠ、EcoRⅠ+SalⅠ、BamHⅠ+SalⅠ、BamHⅠ+PstⅠ、SalⅠ+PstⅠ)進(jìn)行消化。將樣品加到20×20cm的1％瓊脂糖凝膠上，在TAE緩沖液(Tris-乙酸40 mM，EDTA 1mM，pH8．0)中40伏走電泳過夜。
DNA遷移后，按生產(chǎn)商所推薦的在Hybond N+膜(Amersham)上處理并轉(zhuǎn)移凝膠。雜交緩沖液和檢測條件依照地高辛配基檢測試劑盒(Boehringer Mannheim)的推薦條件。于42℃過夜進(jìn)行預(yù)雜交。雜交于42℃進(jìn)行6小時(shí)。洗滌條件如下室溫下用2×SSC，0．1％ SDS洗2×5分鐘，用0．5×SSC，0．1％SDS于42℃洗2×15分鐘，用0．1×SSC，0．1％SDS于42℃洗滌2×15分鐘。
典型的Southern印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。
實(shí)施例4順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的克隆1．構(gòu)建部分基因文庫約15μg紫紅紅球菌的總?cè)旧wDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ消化。用同樣的酶消化質(zhì)粒pBlueScript SK(+)(Stratagene)。消化過的DNA在TAE緩沖液(見上述)中的1％瓊脂糖上分離。通過分析Southern印跡的結(jié)果(1600-2200bp)確定出長度合適的瓊脂糖片段，切下相應(yīng)的凝膠條。使用QIAEX Ⅱ凝膠抽提試劑盒(QIAGEN)抽提瓊脂糖塊中的DNA。在質(zhì)粒載體和紅球菌DNA片段之間進(jìn)行連接，用連接混合物經(jīng)電穿孔法的標(biāo)準(zhǔn)操作(Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ)來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B。
2．順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的克隆
2．1不完整的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因的克隆將得自步驟1的轉(zhuǎn)化子合并為十個(gè)克隆一組。從各組中提取質(zhì)粒DNA。用限制酶BamHⅠ和salⅠ消化純化過的DNA并在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳以便如實(shí)施例2所述進(jìn)行Southern印跡。
依照同樣方法再對陽性組中的各個(gè)克隆進(jìn)行分析。
得到一個(gè)陽性克隆(pREHBS)并對其做進(jìn)一步的分析。它含有大于期望值(約6．8kb)的插入片段，是由紫紅紅球菌菌株染色體DNA經(jīng)部分消化得到的。
經(jīng)限制酶消化并連接，使插入片段縮小到長度大約1800bp(對應(yīng)預(yù)期的BamHⅠ-SalⅠ片段)。對該插入片段的兩端進(jìn)行DNA測序表明它含有對應(yīng)于篩選文庫所用的寡核苷酸的序列。但好象丟失了基因的3′端。
2．2獲得完整的基因根據(jù)1中描述的方法來構(gòu)建部分基因文庫，但要使用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ。此文庫用同樣的寡核苷酸進(jìn)行篩選。對一個(gè)陽性克隆(pREHBE)的BamHⅠ端進(jìn)行DNA測序以確定其與BamHⅠ-SalⅠ片段的重疊。
pREHBE插入片段的大小約為8kb。此插入片段的限制性酶切分析顯示基因位于1．4kb的SphⅠ-XhoⅠ片段。為了克隆此片段，質(zhì)粒pREHBE首先用SphⅠ消化，用DNA聚合酶的Klenow片段處理并用XhoⅠ消化。將目的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化并通過連接插入到pBluescriptSK(+)中，后者已經(jīng)用BamHⅠ消化、DNA聚合酶的Klenow片段處理并經(jīng)XhoⅠ消化。得到的質(zhì)粒命名為pREHXS并加以保藏(在大腸桿菌DH10B中)，保藏號為LMBP-3666。
實(shí)施例5鑒定順式環(huán)氧琥珀酸基因使用雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger，F(xiàn)．，Nickelen，S．，Coulson，A．R．，美國自然科學(xué)院院報(bào)745463，(1977))手工測定pREHXS中插入片段的DNA序列。測序反應(yīng)中用特異寡核苷酸作為引物。用PC／GENE程序進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。
測定了完整的核苷酸序列，見圖3(SEQ ID NO 5)。
所得序列包含1366 bp，5’非編碼區(qū)有67bp，3’非編碼區(qū)有543bp。由編碼序列得出的多肽長度為253個(gè)氨基酸，預(yù)期分子量為28kDa。順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的氨基酸序列見圖4(SEQ ID NO 6)。實(shí)施例2中測定出的氨基酸序列片段也存在于此序列中。SEQ ID NO 1對應(yīng)1到12位氨基酸，SEQ ID NO 2對應(yīng)112到124位氨基酸，SEQ ID NO 3對應(yīng)209到218位氨基酸。
實(shí)施例6在大腸桿菌中表達(dá)順式環(huán)氧琥珀酸水解酶基因?qū)⒑匈|(zhì)粒pREHXS的大腸桿菌DH10B菌株在添加100μg／ml氨芐青霉素的2×LB培養(yǎng)基(酵母提取物1％、Bacto-胰化蛋白胨2％、氯化鈉2％)中培養(yǎng)過夜。用含有不帶插入片段的pBluescriptSK(+)質(zhì)粒的相同菌株作為對照。
使用實(shí)施例1中描述的方法測定從上述兩種培養(yǎng)物中收集到的細(xì)胞中的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶活性。在對照細(xì)胞中測不到活性。在表達(dá)順式環(huán)氧琥珀酸基因的菌株中活性約為150單位。
實(shí)施例7制備L-酒石酸1．酶的制備將含有質(zhì)粒pREHXS的大腸桿菌菌株在添加100μg／ml氨芐青霉素的100ml LB培養(yǎng)基中于35℃，攪拌培養(yǎng)8小時(shí)。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1升相同培養(yǎng)基中并再培養(yǎng)8小時(shí)。用所得培養(yǎng)物接種15升Braun Biostat E發(fā)酵罐。24小時(shí)后，停止培養(yǎng)并于4℃，10000g離心10分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞用10mM的磷酸鉀緩沖液(pH7．0)洗滌一次，并再次離心。最后將細(xì)胞懸浮于一體積的緩沖液中并于-20℃貯存待用，或者將其用凍干法干燥。也可以用噴霧干燥法來干燥細(xì)胞。優(yōu)選將細(xì)胞儲存于密閉的袋子或容器中以防潮。儲存在更低溫度和真空下有助于延長干細(xì)胞的保存期。周圍溫度為25℃時(shí)，干細(xì)胞在密封的聚乙烯袋子中貯存三個(gè)月后能保持原活力的90％。
在pH高于7時(shí)，優(yōu)選在pH 7．0-10之間，更優(yōu)選在pH 7．5-9．5之間有利地保持恒定的酶活性。
2．順式環(huán)氧琥珀酸的生物轉(zhuǎn)化在15升Braun Biostat E發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。將10升20％的順式環(huán)氧琥珀酸與50g干細(xì)胞以及625ml 2％(w／v)的Triton-X100溶液混合。用NaOH或HCl使pH維持恒定在8．0?；旌衔镉?7℃攪拌下(200rpm)保溫40小時(shí)。通過HPLC來跟蹤順式環(huán)氧琥珀酸的消耗和L-酒石酸的合成(見實(shí)施例1)。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約將微生物紫紅紅球菌保藏在BCCM／LMG質(zhì)粒保藏中心，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，K．L．Ledenganckstraat，35，B-9000 Gent，保藏號為LMGP-18079。將包含攜有本發(fā)明序列的質(zhì)粒的大腸桿菌保藏在BCCM／LMBP質(zhì)粒保藏中心，Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Gent，K．L．Ledenganckstraat，35，B-9000 Gent，保藏號為LMBP-3666。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名稱PURATOS N．V．(B)街道Industrialaan 25(C)城市Groot-Bijgaarden(E)國家比利時(shí)(F)郵政編碼(ZIP)B-1702(ⅱ)發(fā)明題目環(huán)氧化物水解酶(ⅲ)序列數(shù)11(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1．0，Version #1．25(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度12個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的非(ⅲ)反義非(ⅴ)片段類型氨基端(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln Phe1 5 10(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征(A)長度13個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的非(ⅲ)反義非(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2Ser Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln Leu Arg1 5 10(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假設(shè)的非(ⅲ)反義非(ⅴ)片段類型內(nèi)部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly Arg1 5 10
(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)的是(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4AAYAAYGCNA AYGAYAAYAC20(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度1366個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5
GTCTTATCCT GGTAGCGCCC GTAATTTCGT GGGCTATCTT CGTTCTTCCG AGTGGATTGT60GAGCACAATG CAACTGAACA ATGCGAACGA CAACACGCAG TTCCGGGCCC TGCTTTTCGA 120CGTGCAGGGG ACTCTGACAG ATTTCCGTTC CACACTCATC GAGCACGGCT TATCGATTCT 180CGGAGACAGA GTGGATCGAG AACTCTGGGA GGAATTGGTC GACCAATGGC GCGGCTGCTA 240TCGAGACGAG CTCGATTCCT TGGTCAAACA GGAGAAATGG CGCTCGGTCC GCGCCGTGTA 300CCGAGATTCT CTTATCAATC TTCTCGCAAA ATTCTCTGAC AGTTTCTGCG CCACCTCGGC 360CGAAGTGGAA TTGCTGACCG ATGGTTGGGA ACGTCTTCGG TCGTGGCCGG ACGTCCCCTC 420TGGATTGGAA CAGCTGCGGT CTAAGTACCT CGTCGCGGCA CTGACGAATG CGGACTTTTC 480CCATCGTC AACGTCGGGC GTAGCGCCAA ACTGCAATGG GACGCTGTTC TTTCAGCTCA 540ACTCTTTGGA GCCTACAAGC CCCACCGGTC AACATATGAG GGAGCCGCGA CACTCCTGGG 600TATCGCTCCG TCAGAGATCC TCATGGTCGC CTCCCATGCA TACGATCTCG AAGCGGCGCG 660GGAAGTGGGA GCCGGCACAG CGTACGTCAG ACGGCCACTG GAATACGGAC CGACGGGGCG 720AACCGAGGAC GTTCCCGATG GACGTTTCGA TTTCTTGGTC GACAGCATCA GTGAACTGGC 780TGATCAGCTG GGCTGCCCAC GACTCGGTGG AACTGCCGGT ATCGATTGAC ATCGACCGGC 840GGTTCCACGC GTCCCTTGTT TTCGGTGCCT GCATTCCCCG TGACGGCAAT TCAGTCACGG 900GGAATGCAGG CTCTGCTCTG TGCCCAGGAT TTCAGGCGCT TCCCAGGCAA CTGGAGTTTT 960TGCAGCGTAG AGGCGCGCTT CGTTCATGAG TTCCTGTGCG GGGGGTGTGA GATGACTCCG 1020CCTACAGACA GCGGCGATGT GAAGGTAGGA CTCCGGGACG AACGCGGTGC ACGGTGGCGC l080CGACCTGCCG TGCCGATGGC GCCCAGGAGG ACGGCATGAC AGCCTGTCCG AATCCGCTGA 1140GCACCATCGG CAGGATCGAG GTCCGGTGGG CAACTTCGGC GACGATGGTG GCTTCGACAC 1200CGCTGGCGAG AACCTCGTCG ACCAGCGTTC GCATCAATGA TCCTCGCTGG GAGACAATCA 1260ATCGGAAGCC GGACAGTTCC GACCGGTAAA TTTCCGGACG GTCCGGCGTC TCTGACCCGG 1320GCCCGGACAT GAGGATCAGC GGTTGACTTT CCAGTGCCAC AACCTC 1366(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長度253個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅲ)假設(shè)的非(ⅲ)反義非(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln Phe Arg Ala Leu Leu15 10 15Phe Asp Val Gln Gly Thr Leu Thr Asp Phe Arg Ser Thr Leu Ile Glu20 25 30His Gly Leu Ser Ile Leu Gly Asp Arg Val Asp Arg Glu Leu Trp Glu35 40 45Glu Leu Val Asp Gln Trp Arg Gly Cys Tyr Arg Asp Glu Leu Asp Ser50 55 60Leu Val Lys Gln Glu Lys Trp Arg Ser Val Arg Ala Val Tyr Arg Asp65 70 75 80Ser Leu Ile Asn Leu Leu Ala Lys Phe Ser Asp Ser Phe Cys Ala Thr85 90 95Ser Ala Glu Val Glu Leu Leu Thr Asp Gly Trp Glu Arg Leu Arg Ser100 105 110Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ser Lys Tyr Leu115 120 125Val Ala Ala Leu Thr Asn Ala Asp Phe Ser Ala Ile Val Asn Val Gly130 135 140Arg Ser Ala Lys Leu Gln Trp Asp Ala Val Leu Ser Ala Gln Leu Phe145 150 155 160Gly Ala Tyr Lys Pro His Arg Ser Thr Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Leu165 170 175Leu Gly Ile Ala Pro Ser Glu Ile Leu Met Val Ala Ser His Ala Tyr180 185 190Asp Leu Glu Ala Ala Arg Glu Val Gly Ala Gly Thr Ala Tyr Val Arg195 200 205
Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly Arg Thr Glu Asp Val Pro Asp210 215 220Gly Arg Phe Asp Phe Leu Val Asp Ser Ile Ser Glu Leu Ala Asp Gln225 230 235 240Leu Gly Cys Pro Arg Leu Gly Gly Thr Ala Gly Ile Asp245 250(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7CTGCAGAG GAGGAGCACA ATGCAACTG29(2)SEQ ID NO8的資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8AAGAATTCCT GGGCACAGAG C21(2)SEQ ID NO9的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9GGGATGCATA GGAGGTAACA TATGTTTAAG30(2)SEQ ID NO10的資料(ⅰ)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10GGGAATTCAA TGGAAGGTGC GTTATAACG29(2)SEQ ID NO11的資料(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11AACTGCAGCA ATGCAACTGA ACAATGCG28
權(quán)利要求
1．一種得自紅球菌、編碼環(huán)氧化物水解酶的分離并純化的核苷酸序列。
2．權(quán)利要求1的核苷酸序列，它分離自紫紅紅球菌，優(yōu)選分離自保藏號為LMGP-18079的紫紅紅球菌。
3．權(quán)利要求1或2的核苷酸序列，與核苷酸序列SEQ ID NO 5的同源性高于50％。
4．上述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的核苷酸序列，與核苷酸序列SEQ ID NO 5的同源性高于70％。
5．上述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的核苷酸序列，與核苷酸序列SEQ ID NO 5的同源性高于90％。
6．一種分離并純化的核苷酸序列，對應(yīng)于核苷酸序列SEQ ID NO 5或其編碼具有環(huán)氧化物水解酶活力的肽的一部分。
7．一種重組核苷酸序列，包含與上述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的核苷酸序列可操縱地連接的一個(gè)或多個(gè)相鄰調(diào)控序列。
8．權(quán)利要求7的重組核苷酸序列，包含一個(gè)或多個(gè)來源于同源微生物的相鄰調(diào)控序列。
9．含有上述權(quán)利要求任何一項(xiàng)的核苷酸序列的載體。
10．權(quán)利要求9的載體，它是摻入大腸桿菌中，保藏號為LMBP-3666的質(zhì)粒。
11．用權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的核苷酸序列或權(quán)利要求9或10的載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞。
12．權(quán)利要求11的重組宿主細(xì)胞，選自細(xì)菌或真菌，含括酵母。
13．由權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)的核苷酸序列編碼的已分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，其分子量小于30kD。
14．權(quán)利要求13的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，其特征在于pH高于7．0時(shí)表現(xiàn)最佳酶活力，在pH 7．5-9．5之間達(dá)到最佳酶活力的80％。
15．權(quán)利要求13或14的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，其特征在于它是由權(quán)利要求11或12的重組宿主細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)的。
16．權(quán)利要求13或14的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，其特征在于它是由權(quán)利要求11或12的重組宿主細(xì)胞胞外表達(dá)的。
17．權(quán)利要求13-16任何一項(xiàng)的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，與氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于50％。
18．權(quán)利要求13-17任何一項(xiàng)的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，與氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于70％。
19．權(quán)利要求13-18任何一項(xiàng)的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，與氨基酸序列SEQ ID NO 6的同源性高于90％。
20．一種已分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列，其分子量小于30kD，具有氨基酸序列SEQ ID NO 6或其具有環(huán)氧化物水解酶活力的部分。
21．一種固相支持物，它固定一種選自權(quán)利要求11或12的細(xì)胞、權(quán)利要求11或12的細(xì)胞的提取物和／或權(quán)利要求13-20任何一項(xiàng)的已分離并純化的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列的成分。
22．權(quán)利要求11或12的重組宿主細(xì)胞或權(quán)利要求13-20任何一項(xiàng)的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列或權(quán)利要求21的固相支持物用于水解環(huán)氧化物的用途。
23．權(quán)利要求22的用途，用于順式環(huán)氧琥珀酸的水解。
全文摘要
本發(fā)明涉及來源于微生物的一種已分離并純化的編碼環(huán)氧化物水解酶的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的載體、用該核苷酸序列轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞,以及由該核苷酸序列編碼的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列和/或由所述重組宿主細(xì)胞表達(dá)的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列。
文檔編號C12N1/21GK1279714SQ98811273
公開日2001年1月10日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月24日
發(fā)明者T·道威里, P·德斯里 申請人:普瑞圖斯股份有限公司