本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自由基是指含有未配對的電子的原子、分子或基團(tuán)，由于自由基中含有未成對電子，具有配對的傾向，狀況不穩(wěn)定，具有高度的活性。在正常情況下，人體內(nèi)的自由基是處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中。自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，多余的自由基通過攻擊生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞，會造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程并誘發(fā)各種疾病，如自由基造成dna氧化損傷，細(xì)胞遺傳信息轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；自由基使脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致動脈硬化等等。

抗氧化物的定義為“任何以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)的物質(zhì)”，其作用機(jī)理可以是直接作用在自由基，或是間接消耗掉容易生成自由基的物質(zhì)，防止發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)。人體在不可避免地產(chǎn)生自由基的同時，也在自然產(chǎn)生著抵抗自由基的抗氧化物質(zhì)，以抵消自由基對人體細(xì)胞的氧化攻擊。研究證明，人體的抗氧化系統(tǒng)是一個可與免疫系統(tǒng)相比擬的、具有完善和復(fù)雜的功能的系統(tǒng)，機(jī)體抗氧化的能力越強(qiáng)，就越健康，生命也越長。

通過篩選具有抗氧化特性的物質(zhì)來輔助提高機(jī)體的抗氧化能力、延緩衰老的直接、有效、方便的重要方法之一。微藻作為一類具有重要研究利用價值的海藻，其抗氧化性一直是研究的熱點之一。目前，已報道具有抗氧化活性的微藻主要有以下幾種：螺旋藻、球等鞭金藻、薔薇藻、紫球藻、扁藻和小球藻。

隱鞘鞘絲藻(lyngbyacryptovaginatus)，有時也叫隱鞘浮絲藻，植物單生，直或略彎曲，除不正常條件外，無堅硬的鞘；藻絲從中部到頂端漸漸變細(xì)，具有冒狀結(jié)構(gòu)，不能運動或不明顯運動，寬3.5～10μm；細(xì)胞圓柱形，罕見方形，氣囊充滿細(xì)胞。經(jīng)檢索，現(xiàn)有技術(shù)中未見有關(guān)于隱鞘鞘絲藻相關(guān)應(yīng)用的報道，特別是關(guān)于隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的抗氧化應(yīng)用的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備方法。本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物具有顯著的抗氧化作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明的技術(shù)方案將通過下面的詳細(xì)描述來進(jìn)一步體現(xiàn)和說明。

一種隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備方法，包括如下步驟：

s1、取新鮮的隱鞘鞘絲藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復(fù)凍融3～5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；上清液即為隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液；

s2、向步驟s1所述的沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，即得隱鞘鞘絲藻乙醇提取物。

優(yōu)選地，步驟s2中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入乙醇進(jìn)行超聲提取。

優(yōu)選地，步驟s2中超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃。

優(yōu)選地，步驟s2中每次超聲提取的時間為10～30min。

本發(fā)明的另一目的是提供隱鞘鞘絲藻乙醇提取物在制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物可以顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(sod)活力并促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)水平，具有顯著的抗氧化作用。

(2)本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物可以延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，提高其存活率，具有顯著的抗衰老和抗氧化作用。

(3)本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備方法具有周期短，有機(jī)溶劑消耗少，工藝簡單，安全無毒，穩(wěn)定高效等特點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖2隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

圖3隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod活力的影響。

圖4隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖5隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod活力的影響。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明所述隱鞘鞘絲藻(lyngbyacryptovaginatus)由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，其在藻種庫中的編號為fachb-890。

本發(fā)明所述一級水符合gb/t6682-2008中一級水的標(biāo)準(zhǔn)。

本發(fā)明人在對微藻進(jìn)行研究的過程中，進(jìn)行了大量的試驗，意外發(fā)現(xiàn)隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液和對提取隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液后剩余的殘渣進(jìn)行乙醇超聲提取制得到的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物均具有顯著的抗氧化作用。而隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的抗氧化作用尤為顯著。

在整體動物水平上以氧化應(yīng)激模型及衰老相關(guān)模型進(jìn)行試驗，試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物能夠顯著延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，提高其存活率；同時，其能顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶(sod)的活力和促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)的水平。本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物具有顯著的抗氧化作用，試驗過程未發(fā)現(xiàn)隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲具有毒性作用，說明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物安全無毒，可應(yīng)用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明所述的抗氧化作用是指對以病理或生理條件下因發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的變化為主要特征的衰老及衰老相關(guān)疾病的防治作用。

本發(fā)明隱鞘鞘絲藻乙醇提取物可單獨或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應(yīng)用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優(yōu)選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發(fā)明實施例中所使用的試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。其中，sbasal溶液和smedium溶液的制備方法如下：

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃?zhèn)溆谩?/p>

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無色透明轉(zhuǎn)為微乳白透明，無明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實施例1隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的隱鞘鞘絲藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復(fù)凍融4次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為85％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，調(diào)節(jié)其相對于隱鞘鞘絲藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示隱鞘鞘絲藻濕藻)，即得隱鞘鞘絲藻乙醇提取物。

此外，取步驟s1離心后分離得到的上清液，加一級水調(diào)節(jié)其相對于隱鞘鞘絲藻(濕藻)重量的濃度為2ga/ml(a表示隱鞘鞘絲藻濕藻)，即得隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液。

實施例2隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的隱鞘鞘絲藻濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復(fù)凍融5次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心8min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為35khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為30min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，調(diào)節(jié)其相對于隱鞘鞘絲藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示隱鞘鞘絲藻濕藻)，即得隱鞘鞘絲藻乙醇提取物。

實施例3隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的隱鞘鞘絲藻濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復(fù)凍融3次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為90％的乙醇超聲提取4次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為15min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，調(diào)節(jié)其相對于隱鞘鞘絲藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示隱鞘鞘絲藻濕藻)，即得隱鞘鞘絲藻乙醇提取物。

實施例4隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

取實施例1制得的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物，按終濃度300mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國明尼蘇達(dá)大學(xué)秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示，隱鞘鞘絲藻乙醇提取物能夠延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，提高其存活率。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實施例5隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗組和對照組，每組設(shè)兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例1制得的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物，隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組隱鞘鞘絲藻乙醇提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購于sigma公司，cas號：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標(biāo)儀在485nm激發(fā)波長和538nm發(fā)射波長下檢測熒光強(qiáng)度，室溫檢測2h，每10min測一次。結(jié)果用f檢驗分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)隱鞘鞘絲藻乙醇提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除，降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

實施例6隱鞘鞘絲藻乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod活力的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗組和對照組，每組設(shè)兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例1制得的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物，隱鞘鞘絲藻乙醇提取物的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組隱鞘鞘絲藻乙醇提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)72h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，利用總sod活性檢測試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)研宄所，產(chǎn)品編號：s0101)測定秀麗隱桿線蟲勻漿上清液中sod活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示，與對照組相比，隱鞘鞘絲藻乙醇提取物能顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod的活力。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻乙醇提取物能夠顯著提高體內(nèi)sod的活力，具有顯著的抗氧化能力。

實施例7隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

取實施例1制得的隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液，按終濃度300mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示。

圖4結(jié)果顯示，隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液能夠延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時間，提高其存活率。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實施例8隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod活力的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗組和對照組，每組設(shè)兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例1制得的隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液，隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)72h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，利用總sod活性檢測試劑盒(購于碧云天生物技術(shù)研宄所，產(chǎn)品編號：s0101)測定秀麗隱桿線蟲勻漿上清液中sod活力。結(jié)果如圖5所示。

圖5結(jié)果顯示，與對照組相比，隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液能顯著提高秀麗隱桿線蟲體內(nèi)sod的活力。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的隱鞘鞘絲藻胞內(nèi)液能夠顯著提高體內(nèi)sod的活力，具有顯著的抗氧化能力。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。