芯片表面toehold協(xié)助下增強的單堿基突變檢測的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于toehold協(xié)助下的芯片表面增強DNA鏈替換反應來檢測單堿基突變的技術(shù)。該技術(shù)將雙鏈DNA(toehold交換探針)接枝到芯片表面，利用雙偏振干涉測量技術(shù)(DPI)，根據(jù)toehold協(xié)助下的DNA鏈替換反應原理，實現(xiàn)在DPI上實時定量研究單堿基突變進程。該技術(shù)大幅度提高了正確目標鏈DNA的替換效率同時又能很好的抑制有突變目標鏈DNA的替換效率，大大提高了單堿基突變檢測的信號。
【專利說明】芯片表面toehold協(xié)助下增強的單堿基突變檢測

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA分子檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及用于檢測單堿基突變的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，連接有所述分子的芯片，及其應用。

【背景技術(shù)】
[0002]單堿基突變是一種普遍存在的基因變異種類，在人類基因組中幾乎有1%的等位基因會出現(xiàn)單堿基突變?；蛐蛄兄械淖儺惻c人類遺傳病密切相關(guān)，對早期診斷，藥物響應測試，疾病預防，和特定遺傳疾病的治療至關(guān)重要，因此基因多態(tài)性的研究成為遺傳病學和預防醫(yī)學的研究重點。發(fā)明一種簡單，省時和高靈敏度的基因多樣性檢測方法非常有價值和必要。
[0003]目前為止，實現(xiàn)單堿基突變檢測的方法有很多種，其中重要的方法有酶輔助方法以及DNA雜交的方法。酶輔助方法具有很高的靈敏度以及強的特異性，但是操作過程復雜，酶的不穩(wěn)定性，價格昂貴和嚴格的實驗條件等固有的缺點，限制了其在復雜樣品檢測中的應用。另外一種方法，DNA雜交具有獨一無二的優(yōu)勢，其中無需酶參與反應，有效克服了以上缺點，同時具備高靈敏度以及特異性，很好實現(xiàn)了的單堿基突變檢測。
[0004]在DNA雜交檢測單堿基突變的方法中主要有界面檢測方法和溶液檢測方法兩大類。其中，采用界面檢測方法的，主要集中于SNP基因分型的研究，借助于toehold的調(diào)控，來實現(xiàn)單堿基突變檢測，但是只能檢測toehold上的突變，無法實現(xiàn)DNA全序列不同位點和不同突變類型(SNP，插入和缺失)的單堿基突變檢測。溶液檢測的方法由Zhang [ZhangDY.Nature Chemistry2012, 4, 208-214]等人提出，設(shè)計了新穎的雙鏈 DNA“toehold 交換探針”，該探針具有對檢測條件(PH，溫度和濃度)不敏感的優(yōu)點，能進行不同突變點和突變類型的單堿基突變檢測。但同時由于可逆反應的影響，存在著正確的DNA目標鏈替換效率低下的缺點。
[0005]因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中在DNA單堿基突變上檢測的困難，本發(fā)明人進行了深入研究。本發(fā)明采用DNA雜交的方法，整合界面檢測和溶液檢測的優(yōu)勢，首次將雙鏈DNA “toehold交換探針”分子接枝到芯片表面，利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)，借助toehold的DNA鏈替換反應原理實現(xiàn)在芯片表面實時定量研究單堿基突變進程。該發(fā)明不僅實現(xiàn)了DNA全序列不同位點的突變檢測，而且克服了溶液中正確的DNA目標鏈替換效率低的缺點，大幅度提高了正確的目標鏈DNA的替換效率(達到86.1% )同時又能很好的抑制有突變的目標鏈DNA的替換效率(約14% )，從而大大提高單堿基檢測信號。同時，我們設(shè)計了一種簡單實用的DNA微陣列芯片，借助普通熒光顯微鏡，在玻璃芯片表面實現(xiàn)了高通量的單堿基突變檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供用于檢測單堿基突變的基于toehold的芯片。
[0007]具體地，本發(fā)明涉及以下各項:
[0008]1.一種配體修飾的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，其特征在于:所述分子由N端帶有配體的固定鏈和C端與固定鏈C端互補的互補鏈退火得到,從而固定鏈和互補鏈的互補區(qū)形成雙鏈DNA剛性端，所述雙鏈DNA剛性端靠近配體側(cè)具有自發(fā)解離端，互補鏈的N端非互補部分形成粘性toehold末端。
[0009]2.根據(jù)I所述的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子，其中所述配體選自由生物素，抗體，抗原組成的組。
[0010]3.根據(jù)I所述的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，其中所述雙鏈DNA剛性端為10-50個堿基對，優(yōu)選20個堿基對。
[0011]4.根據(jù)I所述的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，所述自發(fā)解離端為2-20個堿基對，優(yōu)選5個堿基對。
[0012]5.根據(jù)I所述的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，所述粘性toehold末端為2-20個堿基，優(yōu)選6個堿基。
[0013]6.一種DNA芯片，其特征在于:所述芯片由1-5任一項所述的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子通過芯片表面的受體接枝于芯片表面形成。
[0014]7.根據(jù)6所述的DNA芯片,其中，所述受體選自由NeutrAvidin蛋白，抗原,抗體組成的組，所述芯片為微陣列芯片，其可以包含任意數(shù)量的反應池。
[0015]8.1-5任一項所述的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子和/或權(quán)利要求6-7任一項所述的芯片用于檢測單堿基突變的用途。
[0016]9.一種檢測單堿基突變的方法，其中包括以下步驟:
[0017]I)將不同種類待檢測目標鏈DNA，與如1-5任一項所述的或如6或7中所述的芯片上接枝的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子發(fā)生鏈替換反應；
[0018]2)進行定性和/或定量檢測。
[0019]10.根據(jù)9所述的方法，所述定性和/或定量檢測包括:
[0020]I)加入熒光基團標記的報告鏈DNA，用熒光顯微鏡定性檢測；其中所述熒光基團優(yōu)選FAM ；
[0021]2)使用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)實時定量檢測。
[0022]發(fā)明詳述
[0023]以下對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細闡述。應當指出，本發(fā)明的各實施方案可以根據(jù)需要以任何方式組合。
[0024]本發(fā)明的第一個方面是提供一種生物素修飾的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子以及基于其的DNA微陣列芯片。
[0025]在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種配體修飾的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，其特征在于:所述雙鏈DNA由N端帶有配體的固定鏈(P)與其互補鏈(C)雜交退火得到，從而P鏈和C鏈的互補區(qū)形成雙鏈DNA剛性端，所述雙鏈DNA剛性端靠近配體側(cè)具有自發(fā)解離端，C鏈的N端非互補部分形成粘性toehold末端。如圖1所示為當配體為生物素(b1tin)時的分子結(jié)構(gòu)。
[0026]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雙鏈DNA剛性端為10-50個堿基對，優(yōu)選10_40個，更優(yōu)選10-30個，還更優(yōu)選10-20個堿基對，最優(yōu)選20個堿基對。
[0027]在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述自發(fā)解離端為2-20個堿基對，優(yōu)選2-15個堿基對，更優(yōu)選2-10個堿基對,還更優(yōu)選2-5個堿基對,最優(yōu)選5個堿基對。
[0028]在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述粘性toehold末端為2-20個堿基，優(yōu)選2-15個堿基，更優(yōu)選2-10個堿基,還更優(yōu)選2-6個堿基,最優(yōu)選6個堿基。
[0029]在進一步優(yōu)選的實施方案中，所述雙鏈DNA分子通過連于其上的配體與連于芯片表面的受體間的相互作用接枝到芯片表面。通過將雙鏈DNA“toehold交換探針”分子連接于芯片，一方面實現(xiàn)聞通量單喊基突變檢測，另一方面大幅度提聞?wù)_DNA目標鏈的替換效率同時很好地抑制突變的DNA目標鏈的替換效率。
[0030]因此，在該進一步實施方案中，提供一種用于檢測單堿基突變的DNA微陣列芯片，如圖2所示，所述微陣列芯片為載玻片(75mm*25mm)通過一系列經(jīng)表面化學處理過程得到的醛基表面，與含有12孔反應池的微陣列墊片對齊后加壓粘在一起形成，所述芯片的反應池中的表面連接有受體，所述受體與所述雙鏈DNA “toehold交換探針”分子上的配體相互作用，從而接枝所述雙鏈DNA “toehold交換探針”分子。
[0031]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述配體包括但不限于生物素，抗體，抗原，相應的，所述受體包括但不限于NeutrAvidin蛋白，抗原,抗體,本領(lǐng)域已知的相互結(jié)合的兩種分子均可以用于本發(fā)明。
[0032]在一個最優(yōu)選的實施方案中，所述雙鏈DNA由25堿基的5’端生物素修飾的固定鏈DNA和26個堿基的互補鏈DNA雜交退火得到，其中含有P鏈的C端20個堿基與C鏈的C端20個堿基形成的雙鏈DNA剛性端以及6個堿基的DNA鏈引發(fā)鏈替換反應的粘性toehold末端以及5個堿基DNA鏈的自發(fā)解離端(被稱為6/5toehold方案)。雙鏈DNA分子通過生物素和NeutrAvidin蛋白特異性相互作用接枝到修飾NeutrAvidin蛋白后的芯片表面。該DNA分子通過粘性末端與多種待檢測目標鏈堿基配對，發(fā)生鏈替換反應，實現(xiàn)單堿基突變檢測。
[0033]本發(fā)明的第二個方面提供一種基于本發(fā)明的第一個方面的DNA微陣列芯片用于檢測單堿基突變的方法。
[0034]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法使用突光基團的報告鏈DNA通過突光顯微鏡獲得定性結(jié)果，所述熒光基團優(yōu)選FAM。
[0035]在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法中使用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)獲得定量結(jié)果O
[0036]在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述方法將所述雙鏈DNA “toehold交換探針”接枝到芯片表面，利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)和DNA微陣列技術(shù)，借助toehold協(xié)助下的DNA鏈替換反應原理實現(xiàn)單堿基突變在芯片表面的檢測。該光刻技術(shù)無需嚴格的操作條件，操作簡單。
[0037]本發(fā)明的單堿基突變檢測方法中首次利用雙鏈DNA “toehold交換探針”接枝到芯片表面，利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)和DNA微陣列技術(shù)，借助toehold協(xié)助下的DNA鏈替換反應原理，最終實現(xiàn)單堿基突變在芯片表面的檢測。其原理見圖3，首先將NeutrAvidin蛋白接枝到醛基芯片表面。接著通過生物素與NeutrAvidin蛋白特異性相互作用，將生物素修飾的雙鏈DNA “toehold交換探針”固定到表面。緊接著通入待檢測目標鏈(正確目標鏈或者突變目標鏈)與雙鏈DNA “toehold交換探針”分子發(fā)生鏈替換反應，實現(xiàn)在DPI上的實時定量研究單堿基突變。在隨后的DNA微陣列實驗中，重復以上步驟，最后加入熒光修飾的DNA報告鏈，從而實現(xiàn)了熒光顯微鏡下的高通量單堿基突變檢測。
[0038]在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的界面單堿基突變檢測技術(shù)包括如下步驟:
[0039]I)根據(jù)被檢DNA寡核苷酸的實際長度設(shè)計所需要的各種單鏈DNA序列，所述單鏈DNA序列的設(shè)計按照實際的需要可以進行調(diào)整；
[0040]2)氨基芯片表面通入戊二醛溶液孵育，得到醛基芯片表面；
[0041]3)通入NeutrAvidin蛋白溶液孵育使蛋白接枝到醒基表面；
[0042]4)將退火后的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面；
[0043]5)通入待檢測目標鏈DNA (正確目標鏈DNA或突變目標鏈DNA)溶液，在toehold協(xié)助下，與雙鏈DNA發(fā)生鏈替換反應，實現(xiàn)在DPI上實時定量的研究單堿基突變進程；
[0044]6)在食人魚洗液清洗后的玻璃表面進行氨基化修飾以及醛基化修飾；
[0045]7)將12孔反應池的微陣列墊片固定到醛基玻璃表面得到DNA微陣列；
[0046]8)在DNA微陣列芯片的12個反應池里均加入NeutrAvidin蛋白溶液,使蛋白接枝到芯片表面；
[0047]9)在DNA微陣列芯片的12個反應池里均加入生物素修飾的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子，使之固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面；
[0048]10)在DNA微陣列芯片的12個反應池里分別同時加入不同種類待檢測目標鏈DNA (正確目標鏈DNA和多種突變目標鏈DNA)溶液以及緩沖液對照組溶液，在toehold協(xié)助下，與雙鏈DNA發(fā)生鏈替換反應，替換掉大部分或極少量的互補鏈DNA(C)；
[0049]11)在DNA微陣列芯片的12個反應池里均加入熒光素FAM修飾的報告鏈DNA，通過堿基互補配對連接到固定鏈DNA上，最后用熒光顯微鏡進行拍照，最終實現(xiàn)在DNA微陣列上的高通量單堿基突變檢測；
[0050]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟中所述DNA濃度可根據(jù)實際要求在1nM-1 μ M進行調(diào)節(jié)。
[0051]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟2)中所述氨基芯片通入戊二醛溶液孵育時間為6分鐘。
[0052]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟3)中通入NeutrAvidin蛋白溶液孵育時間為6分鐘。
[0053]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟4)中雙鏈DNA “toehold交換探針”分子固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面反應時間為15分鐘。
[0054]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟5)中通入待檢測的目標鏈DNA溶液孵育時間為15分鐘。
[0055]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟6)中氨基化時間為2小時。
[0056]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟6)中氨基化時間為4小時，然后放入120°C烘箱半小時。
[0057]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟8)中涉及的NeutrAvidin蛋白接枝到醒基表面反應時間為I小時。
[0058]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟9)中生物素修飾的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子與接枝了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面的反應條件是室溫下孵育I小時。
[0059]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟10)中同時分別加入的不同待檢測目標鏈DNA溶液和緩沖液對照組溶液孵育時間為I小時。
[0060]在一個優(yōu)選的實施方案中，步驟11)中加入的熒光素FAM修飾的報告鏈DNA溶液孵育時間為I小時。
[0061]在一個最優(yōu)選的實施方案中，步驟11)中不加入報告鏈DNA，從而通過DPI進行檢測，即用Farfield軟件和Oringinlab軟件進行數(shù)據(jù)分析處理,分析界面絕對質(zhì)量的變化情況從而實現(xiàn)實時定量的研究單堿基突變的進程。
[0062]本發(fā)明的第三個方面是提供一種基于本發(fā)明的第一個方面的DNA微陣列芯片，利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)在檢測堿基錯配、堿基缺失或堿基插入中的應用。
[0063]本發(fā)明的有益效果如下:
[0064]本發(fā)明提供了一種芯片表面toehold協(xié)助下的增強單堿基突變檢測的方法。首次將雙鏈DNA“ toehold交換探針”接枝到芯片表面，利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)，借助toehold協(xié)助下的DNA鏈替換反應原理實現(xiàn)了在芯片表面實時定量的研究單堿基突變進程。一方面，該發(fā)明不僅檢測種類全面的堿基突變，包括了所有的堿基突變形式:堿基錯配、堿基缺失以及堿基插入，并且待檢測目標鏈DNA存在突變位置可以在任意位置。另一方面，克服了溶液中正確的目標鏈DNA替換效率低的缺點，大幅度提高了正確的目標單鏈DNA的替換效率(達到86.1% )同時又能很好的抑制有突變的目標單鏈DNA的替換效率(約14% )，大大提高了單堿基突變檢測信號。同時，我們設(shè)計了一種簡單實用的DNA微陣列芯片，借助普通熒光顯微鏡，在玻璃芯片表面實現(xiàn)了高通量的單堿基突變檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1生物素修飾的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子結(jié)構(gòu)圖。
[0066]圖2DNA微陣列芯片結(jié)構(gòu)圖。
[0067]圖3 (a) DPI技術(shù)實時定量研究toehold協(xié)助下的芯片表面單堿基突變進程的原理圖；(b)DNA微陣列技術(shù)實現(xiàn)在toehold協(xié)助下的芯片表面高通量單堿基基突變檢測的原理圖。
[0068]圖4DPI技術(shù)實時定量的研究toehold協(xié)助下的芯片表面單堿基突變進程(曲線表示質(zhì)量mass隨時間t的變化圖)。其中和“i”分別表示堿基錯配、堿基缺失以及堿基插入等不同突變類型，比如mlT表示目標單鏈DNA分子I號位置發(fā)生堿基錯配，錯配成T堿基。illT表示目標單鏈DNA分子11號位置發(fā)生堿基插入，插入的是T堿基，以及dl9表示目標單鏈DNA分子19號位置發(fā)生堿基缺失(其它以此類推)。a)表示芯片表面toehold協(xié)助下不同位置(mlT~ml9T)的單堿基突變進程的定量研究；b)表示芯片表面toehold協(xié)助下11號位置不同突變類型(錯配，缺失和插入)的單堿基突變進程定量研究；c)表示芯片表面toehold協(xié)助下19號位置不同突變類型的單堿基突變進程定量研究；d)另一種toehold方案(6/6方案)下的單堿基突變檢測研究。
[0069]圖OTNA微陣列技術(shù)實現(xiàn)在toehold協(xié)助下的芯片表面高通量單堿基突變檢測的結(jié)果。

【具體實施方式】
[0070]以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的具體技術(shù)方案進行具體說明。
[0071]本實例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了比較詳細的實施方式和過程。應理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于本發(fā)明保護的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)需要做進一步的調(diào)整，未注明的實驗條件通常按照常規(guī)實驗中的條件。
[0072]本實施例主要通過實驗驗證基于芯片表面toehold協(xié)助下的增強單堿基突變檢測的可行性，并進一步在自行設(shè)計的簡易實用DNA微陣列上實現(xiàn)高通量單堿基突變檢測。以下實例進一步驗證基于芯片表面toehold協(xié)助下的增強單堿基突變檢測的可行性。
[0073]實施例1:
[0074]利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)，在toehold協(xié)助下實時定量研究不同位置的單堿基突變進程。
[0075]第一步，氨基芯片表面醒基化以及將NeutrAvidin蛋白(31000，Thermo FisherScientific, Massachusetts, USA)接枝到醒基表面:
[0076]在DPI 實驗中，氨基芯片(FBlOOAmine, FarfieldGroup, Ltd., Stockholm, Sweden)表面以25 μ L miiT1流速通入戊二醛溶液(4mg mL—1溶于PBS緩沖液)6分鐘，利用氨基與醛基的共價結(jié)合反應完成芯片表面醛基化過程。
[0077]將NeutrAvidin蛋白溶液(0.5mg ml/1溶于PBS緩沖液)以25 μ L mirf1流速通入到醛基化芯片表面6分鐘，利用NeutrAvidin蛋白上的氨基與醛基發(fā)生共價結(jié)合反應，從而將NeutrAvidin蛋白到固定醒基表面上。
[0078]第二步，將退火后的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的芯片表面:
[0079]2 μ Μ5’生物素修飾的固定鏈DNA⑵與3 μ M互補鏈DNA(C)等體積混合得到600 μ L溶液后退火使其雜交，退火條件為95°C下保持10分鐘然后緩慢降溫到室溫，整個退火過程持續(xù)2.5-3小時，雜交過程中使用到的緩沖液為TE緩沖液(1mM Tris-HCl, 12.5mMMgC12, pH = 8)，雜交后得到的雙鏈DNA溶液濃度為I μ Μ。
[0080]a.將退火后的生物素修飾的雙鏈DNA溶液以1yL mirT1流速通入到接枝了NeutrAvidin蛋白的芯片表面室溫下孵育15分鐘,利用生物素與NeutrAvidin蛋白的特異性相互作用將雙鏈DNA固定到芯片表面。
[0081]b.以50 μ L mirT1流速通入TE緩沖液10分鐘，清洗掉未接枝到表面的多余雙鏈DNA分子。
[0082]第三步，通入待檢測目標鏈DNA溶液，實現(xiàn)在DPI上實時定量的研究單堿基突變進程:
[0083]I μ M的待檢測目標鏈以10 μ L mirT1流速通入到固定了雙鏈DNA分子的芯片表面15分鐘,在toehold協(xié)助下,與雙鏈DNA分子發(fā)生鏈替換反應,替換掉大部分或極少量的保護鏈DNA (C)，在DPI上實現(xiàn)了實時定量的研究單堿基突變進程，其中待檢測目標鏈為正確目標鏈DNA或突變目標鏈DNA。
[0084]以50 μ L mirT1流速通入TE緩沖液10分鐘，清洗掉多余的待檢測目標鏈DNA。
[0085]用Farfield軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理。
[0086]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0087]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0088]互補鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0089]ACXiTACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0090]正確目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0091]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0092]存在單堿基突變目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0093]mlT: T ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:4)
[0094]m6T: CACTC T TTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO: 5)
[0095]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0096]ml6T: CACTCATTCAATACC T TACGT (SEQ ID NO:7)
[0097]m!9T:CACTCATTCAATACCCTA -T' GT(SEQ ID NO:8)
[0098]其中斜體并下劃線的部分為形成雙鏈DNA后的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發(fā)生單堿基突變。通過Farfield軟件和originlab軟件數(shù)據(jù)處理可以得到驗證。如圖4a所示,通過本發(fā)明的方法可以清楚的區(qū)分待檢測目標單鏈是否發(fā)生了單堿基突變，從而實現(xiàn)單堿基突變檢測。
[0099]實施例2:
[0100]利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)，在toehold協(xié)助下實時定量研究分支遷移端不同類型的單堿基突變進程。
[0101]采用同實施例1相同的操作步驟，只是突變目標鏈DNA為分支遷移端11號位置存在堿基突變(從左到右為5’ 一3’)，同時考慮各種不同突變類型，包括堿基錯配、堿基缺失以及堿基插入.
[0102]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5’ 一3’ )
[0103]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0104]互補鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0105]ACGTAG GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0106]正確目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0107]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0108]存在單堿基突變目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0109]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0110]mlIG:CACTCATTCA G TACCCTACGT(SEQ ID NO:9)
[0111]mlIC:CACTCATTCA C TACCCTACGT(SEQ ID NO:10)
[0112]iIIA:CACTCATTCA A ATACCCTACGT(SEQ ID NO:11)
[0113]iIIT:CACTCATTCA T ATACCCTACGT(SEQ ID NO:12)
[0114]iIIG:CACTCATTCA G ATACCCTACGT(SEQ ID NO:13)
[0115]iIIC:CACTCATTCA C ATACCCTACGT(SEQ ID NO:14)
[0116]dll:CACTCATTCATACCCTACGT(SEQ ID NO:15)
[0117]其中斜體并下劃線的部分為形成雙鏈DNA后的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發(fā)生單堿基突變。通過Farfield軟件和originlab軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。如圖4b所示,可以清楚的區(qū)分待檢測目標鏈11號位置是否發(fā)生了單堿基突變，從而實現(xiàn)單堿基突變檢測。
[0118]實施例3:
[0119]利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI),在toehold協(xié)助下實時定量研究目標DNA的toehold末端反應的部分存在不同類型的單堿基突變進程。
[0120]采用同實施例1相同的操作步驟，只是的19號位置存在堿基突變(從左到右為5’ 一3’)，同時考慮各種不同突變類型，包括堿基錯配、堿基缺失以及堿基插入。
[0121]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5’ 一3’ )
[0122]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0123]互補鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0124]ACCiTACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0125]正確目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0126]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0127]存在單堿基突變目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’ )
[0128]ml9T:CACTCATTCAATACCCTA T GT(SEQ ID NO:8)
[0129]ml9A:CACTCATTCAATACCCTA A GT(SEQ ID NO:16)
[0130]ml9G:CACTCATTCAATACCCTA G GT(SEQ ID NO:17)
[0131]?19Α:CACTCATTCAATACCCTA Al CGT (SEQ ID NO: 18)
[0132]i19T:CACTCATTCAATACCCTA T CGT(SEQ ID NO:19)
[0133]i19G:CACTCATTCAATACCCTA C CGT(SEQ ID NO:20)
[0134]i19C:CACTCATTCAATACCCTA G CGT(SEQ ID NO:21)
[0135]dl9:CACTCATTCAATACCCTAGT(SEQ ID NO:22)
[0136]其中斜體并下劃線的部分為形成雙鏈DNA后的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發(fā)生單堿基突變。通過Farfield軟件和originlab軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。如圖4c所示,可以清楚的區(qū)分待檢測目標鏈19號位置是否發(fā)生了單堿基突變，從而實現(xiàn)單堿基突變檢測。
[0137]實施例4:
[0138]利用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)，在toehold協(xié)助下實時定量研究正確目標鏈5’端減少一個堿基以及待檢測的突變目標鏈I號位置發(fā)生單堿基突變進程。
[0139]采用同實施例1相同的操作步驟，只是將待檢測正確目標鏈5’端減少一個堿基以及待檢測的突變目標單鏈I號位置發(fā)生突變，從而自發(fā)解離端變?yōu)?個堿基，可稱為6/6toehold方案。研究不同toehold方案對單堿基突變檢測的影響。
[0140]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5’ 一3’ )
[0141] B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0142]互補鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0143]ACGl'ACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO:2)
[0144]正確目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0145]Correct:ACTCATTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO:23)
[0146]存在單堿基突變目標鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0147]mlT: Ti CTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:24)
[0148]其中斜體并下劃線的部分為形成雙鏈DNA后的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發(fā)生單堿基突變。通過Farfield軟件和originlab軟件進行數(shù)據(jù)處理分析。如圖4d所示,不同的toehold方案下仍然可以清楚的區(qū)分待檢測目標鏈是否發(fā)生了單堿基突變，從而實現(xiàn)單堿基突變檢測。
[0149]實施例5:
[0150]利用熒光分光光度計分別研究溶液中單堿基突變檢測的替換效率。
[0151]溶液中單堿基突變檢測的研究，只是將固定鏈DNA⑵分子從5’端開始第5個堿基T上修飾上淬滅基團BHQ-2，互補鏈DNA(C)分子3’端修飾上熒光基團R0X。
[0152]淬滅基團修飾固定鏈的序列(從左到右為5’一3’)
[0153]TTTTT-BHQ-2- GCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:25)
[0154]熒光基團修飾互補鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0155]A( X Π? (l.GGTATTGAATGAGTGGATGC-ROX (SEQ ID NO:26)
[0156]正確目標單鏈的序列(從左到右為5’ 一3’)
[0157]Correct:ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0158]存在單堿基突變目標單鏈的序列(從左到右為5’ 一3’ )
[0159]mlT: T ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:4)
[0160]m6T: CACTC T TTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO:5)
[0161]ml6T: CACTCATTCAATACC T TACGT (SEQ ID NO:7)
[0162]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0163]iIIA: CACTCATTCA A ATACCCTACGT (SEQ ID NO: 11)
[0164]dll:CACTCATTCATACCCTACGT(SEQ ID NO:15)
[0165]ml9T:CACTCATTCAATACCCTA T GT(SEQ ID NO:8)
[0166]i19A:CACTCATTCAATACCCTA A CGT(SEQ ID NO:18)
[0167]dl9:CACTCATTCAATACCCTAGT(SEQ ID NO:22)
[0168]其中斜體并下劃線的部分為形成雙鏈DNA后的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發(fā)生單堿基突變。利用originlab數(shù)據(jù)處理，得到界面和溶液中單堿基突變檢測的效率對比圖，結(jié)果見下表。其中Φ表示界面或溶液的單堿基突變替換效率，Λ Φ表示正確目標鏈與突變鏈替換效率的差值。分析可知界面單堿基突變替換效率遠遠高于溶液中單堿基突變，采用界面單堿基突變檢測方法可以大大提高檢測信號。
[0169]

【權(quán)利要求】
1.一種配體修飾的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子，其特征在于:所述分子由N端帶有配體的固定鏈和C端與固定鏈C端互補的互補鏈退火得到，從而固定鏈和互補鏈的互補區(qū)形成雙鏈DNA剛性端，所述雙鏈DNA剛性端靠近配體側(cè)具有自發(fā)解離端，互補鏈的N端非互補部分形成粘性toehold末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子，其中所述配體選自由生物素，抗體，抗原組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子，其中所述雙鏈DNA剛性端為10-50個堿基對，優(yōu)選20個堿基對。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子，所述自發(fā)解離端為2_20個堿基對，優(yōu)選5個堿基對。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子，所述粘性toehold末端為2-20個堿基，優(yōu)選6個堿基。
6.—種DNA芯片，其特征在于:所述芯片由權(quán)利要求1-5任一項所述的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子通過芯片表面的受體接枝于芯片表面形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA芯片,其中，所述受體選自由NeutrAvidin蛋白，抗原,抗體組成的組，所述芯片為微陣列芯片，其可以包含任意數(shù)量的反應池。
8.權(quán)利要求1-5任一項所述的雙鏈DNA“toehold交換探針”分子和/或權(quán)利要求6_7任一項所述的芯片用于 檢測單堿基突變的用途。
9.一種檢測單堿基突變的方法，其中包括以下步驟: 1)將不同種類待檢測目標鏈DNA，與如權(quán)利要求1-5任一項所述的或如權(quán)利要求6或7中所述的芯片上接枝的雙鏈DNA “toehold交換探針”分子發(fā)生鏈替換反應； 2)進行定性和/或定量檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述定性和/或定量檢測包括: 1)加入熒光基團標記的報告鏈DNA，用熒光顯微鏡定性檢測；其中所述熒光基團優(yōu)選FAM ； 2)使用雙偏振干涉技術(shù)(DPI)實時定量檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK104164487SQ201410313153
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月2日
【發(fā)明者】梁好均, 徐華國, 黃福建 申請人:中國科學技術(shù)大學