專利名稱：基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測hbv dna及單堿基突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬耙DNA或單堿基突變的檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn) 移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)引起的世界性疾病，全世界將 近有3.5億HBV慢性攜帶者，我國有1.2億HBV病毒攜帶者，并呈上升趨勢。HBV的感染可 以引起多種疾病，比如慢性肝炎，肝硬化和原發(fā)性肝癌。因此，乙肝病毒的感染是一個 全球性的健康問題。在HBV的治療方面，通過抗HBV藥物來抑制病毒復(fù)制是目前治療慢性 乙型肝炎(CHB)最重要和有效的方法。諸如拉米呋啶和阿德福韋等藥物己廣泛用于抗HBV 的治療。但藥物長期應(yīng)用后，病毒產(chǎn)生基因突變，進(jìn)而引發(fā)的變異和耐藥性問題已成為臨 床中的棘手問題。因此，定量檢湖UHBVDNA及堿基突變在HBV基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐中具 有重要意義。目前最常見的檢測HBV感染及單堿基突變的方法包括凝膠電泳聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、分支DNA信號擴(kuò)增法(branched DNA signal ampli -fication assay)等位特異的DNA雜交方法(allele-specific DNA hybridization),連接或引物 延伸法(ligation or primer extension)、基于分子信標(biāo)的熒光能量共振轉(zhuǎn)移方法(molecular -beacon-based fluorescence resonance energy transfer)， 電化學(xué)檢測(eleetroche mical detect -ing)等。但這些方法普遍存在一些缺陷，或者操作過程復(fù)雜，或者靈敏度不高，或者缺 乏多靶標(biāo)高通量檢測能力，比較費(fèi)時。因此建立簡單、特異、快速和高通量的靶DNA及 單堿基突變檢測方法是解決臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題。
量子點(diǎn)(quantumdots， QDs)，是一種新型的熒光探針。自從第一批報道使用修飾的 CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物標(biāo)定生物樣品以來，QDs近年來已在眾多的生物 分析和生理過程研究中引起廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。量子點(diǎn)具有許多獨(dú)特的光物理性質(zhì)，如寬 廣的吸收光譜和狹窄的發(fā)射光譜，這使得它們可以作為良好的能量供體應(yīng)用于基于熒光共 振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的傳感器中。這是因?yàn)檫@些熒光特性允許我們能夠在QDs寬廣的吸收 光譜中選擇某個激發(fā)波長進(jìn)行激發(fā)，從而避免對染料(受體)的直接激發(fā)；并可以選擇適 當(dāng)?shù)臑V光片對供體和受體發(fā)射的熒光進(jìn)行有效的分離。迄今為止，研究者們已構(gòu)建了多種 以FRET為基礎(chǔ)的QDs納米傳感器。這些傳感器已被成功用于多種分析物的檢測，包括營養(yǎng) 物質(zhì)、爆炸物、蛋白質(zhì)、酶以及pH值的變化等。與此同時，也有研究集中在基于FRET的 QDs-DNA的納米傳感器應(yīng)用于寡核苷酸(DNA)的識別，通過寡核苷酸雜交后引起的FRET熒光發(fā)射信號的變化從而達(dá)到對寡核苷酸DNA的識別和檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單 堿基突變的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。
本發(fā)明的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，包括 (一)檢測探針的制備
(1) 巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的制備
取0.5 mL熒光發(fā)射峰為575 ~ 615 nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/殼 結(jié)構(gòu)QDs的甲苯溶液，加入2 4mL氯仿，再逐滴加入2 ~4mL的巰基丙酸MPA溶液，室 溫攪拌30 60分鐘，加入5 8mL水，反復(fù)震蕩，分去有機(jī)層，在水層中加入丙酮，離心 沉淀后，將得到的QDs溶于Milli-Q超純水中，制備得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs;
(2) HBVDNA檢測探針的設(shè)計及合成
HBV多聚酶位點(diǎn)rtM204I/V (YMDD)的變異與血清中HBV DNA的反彈及轉(zhuǎn)氨酶水平 有關(guān)。當(dāng)M變?yōu)镮或V時可導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈的柔性減低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三 磷酸鹽之間形成空間位阻，與拉米夫定三磷酸的結(jié)合力下降，導(dǎo)致病毒對拉米夫定的耐藥。 本發(fā)明根據(jù)YMDD( rtM204M)及變異型YVDD( rtM204V)的DNA序列設(shè)計檢測探針，其 中每個位點(diǎn)設(shè)計兩個相連接的探針，兩個探針的長度都是15個堿基，單堿基多態(tài)位點(diǎn)設(shè) 計在第一個探針的3'端，并在5'端修飾Cy5 (為信號探針)，另一個探針將用作QDs-DNA 共聚探針，探針的3'未端經(jīng)過氨基的功能化修飾，以便與修飾了羧基的量子點(diǎn)結(jié)合，序列 見表l，探針的合成由大連寶生物有限公司(TAKARA公司)完成；
表l.HBVDNA靶序列及探針
探針及耙序列名稱序列
-NH2修飾的DNA探針5'-TGG ATG ATG TGG TAT (T)1() (CH2)3 _(NH2)-3'
-Cy5標(biāo)記的信號探針5'-Cy5-TGG CTT TCA GTT ATA-3'
互補(bǔ)的靶HBVDNA(YMDD)5 ， ATACC ACATC ATCC ATATA ACTGAA AGCC A-3'
單堿基變異HBV DNA(YVDD)5 ， -ATACCAC ATC ATCC ACATAACTG A AAGCC A-3'
(3) QDs-DNA探針交聯(lián)物的制備
將0.5 g/L的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺EDC、 0.5 g/LN-羥基琥珀酰亞胺 NHS和0.05 nM的MPA-QDs按體積比1~2: 1~2: 2~6比例混合，活化0.5 ~2 h，加入上 述-NH2功能化修飾過的單鏈探針DNA，于37eC孵化lh，制備得到QDs-DNA探針交聯(lián)物；
(二)互補(bǔ)靶HBVDNA及單堿基突變的檢測
(1) 基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的HBV靶DNA高通量檢測
向lOO[iL雜交液中加入80 QDs-探針DNA、 10 nL10 的Cy5標(biāo)記的信號DNA 探針和10 pL 40~500 nM互補(bǔ)的靶HBV DNA，然后將該混合液于42 ~50°C反應(yīng)15-30min， 雜交得到"三明治"結(jié)構(gòu)雜交結(jié)合體，冷卻至室溫，將互補(bǔ)的靶HBV DNA的雜交反應(yīng)液轉(zhuǎn) 移至96孔板中，用Wallac 1420酶標(biāo)儀檢測雜交反應(yīng)液670 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，從而 實(shí)現(xiàn)對互補(bǔ)的耙DNA檢測和定量；
(2) 基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的HBV DNA單堿基突變的檢測
將70QDs-探針DNA、 10 pLIO 的Cy5標(biāo)記的信號DNA、 10 pL10 單堿基 錯配的靶DNA、 5 unit Taq DNA聯(lián)接酶以及115 20 mM的Taq聯(lián)接緩沖液的混合液于 42 50。C反應(yīng)15-30分鐘；在聯(lián)接反應(yīng)完成后，將該反應(yīng)混合液于85-100 °C下加熱變性 5 min,使雙鏈解離變?yōu)閱捂?，立即將反?yīng)混合液置于冰水中冰浴3 ~5 min，然后將反應(yīng)混合 液迅速轉(zhuǎn)移至96孔板中，用Wallac 1420酶標(biāo)儀檢測各個雜交反應(yīng)液670 nm處的熒光發(fā) 射強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)或多個樣品中靶DNA突變的檢測。
所述步驟(一)/ (1)中的巰基丙酸MPA溶液為溶于巰基丙酸的甲醇溶液，濃度30 mmol/L，用四甲基氫氧化銨調(diào)pH值為10;
所述步驟(一)/ (3)中的-NH2功能化修飾過的單鏈探針DNA的濃度為10 pM，單 鏈探針DNA與MPA-QDs的摩爾比為50: 1;
所述步驟(4)中的雜交液為100 mmol/LTris-HCl、 10 mmol/L (NH4)2S04及3 mmol/LpH 8.0 MgCl2的混合液；
所述步驟(二) / (1 )和(2)中的QDs- DNA探針與Cy5標(biāo)記的信號DNA的摩爾比 為l:h
所述步驟(二) / (1)中的互補(bǔ)的靶HBVDNA與QDs-探針DNA的摩爾比為4 50;
所述步驟(二) / (1)中的"三明治"結(jié)構(gòu)雜交結(jié)合體是指以靶HBV DNA作為雜交模 板，Cy5標(biāo)記的信號DNA、互補(bǔ)(野生)或單堿基錯配的QDs- DNA探針在Taq連接酶的 作用下與耙HBVDNA進(jìn)行三明治雜交見附圖1。
本發(fā)明根據(jù)熒光量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征，以熒光量子點(diǎn)為巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/ 殼結(jié)構(gòu)作為能量供體，其熒光發(fā)射峰為605nm，量子產(chǎn)率大于20%，其表面修飾有多個羧 基基團(tuán)，可以和氨基修飾的探針DNA通過酰胺鍵共價聯(lián)接；以Cy5作為能量受體的共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)QDs-DNA探針、Cy5標(biāo)記的信號DNA和待 測HBV耙DNA三者之間的"三明治"結(jié)構(gòu)雜交結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的檢測方法由熒光量子點(diǎn)和能量受體熒光染料Cy5組成。外表修飾了羧基的熒 光量子點(diǎn)與氨基化的DNA結(jié)合成量子點(diǎn)共聚探針，修飾了 Cy5的另一 DNA探針末端可 設(shè)計成野生和突變的堿基，在Taq DNA連接酶以及HBV DNA靶序列存在的條件下與熒光 量子點(diǎn)探針結(jié)合，當(dāng)探針的序列與靶序列完全匹配時候，熒光量子點(diǎn)探針在T叫連接酶作 用下與Cy5探針連接，發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，可以通過檢測熒光強(qiáng)度，達(dá)到定量檢測HBV DNA及單堿基突變的目的。 有益效果
該方法操作簡單，可以與多種儀器兼容，不需要對雜交體系中未聯(lián)接的DNA進(jìn)行分離； 由于Cy5在485 nm光激發(fā)下不會直接產(chǎn)生熒光信號，因此背景干擾小，信號強(qiáng)；該方法 還具有特異、快速、高分辨率、高靈敏度和高通量的特點(diǎn)，可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中HBV靶 DNA及單堿基突變的檢測。


圖1為互補(bǔ)的HBV靶DNA (線路1)和單堿基變異的HBV靶DNA (線路2)的檢測流 程；(其中，圖A為"三明治"雜交體的能量傳遞過程原理示意圖，當(dāng)QDs用485nm的光 進(jìn)行激發(fā)時，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，能量從給體QDs傳遞給受體Cy5，從而引起Cy5的熒光發(fā)射)； 圖2為單獨(dú)的QDs、單獨(dú)的Cy5和"三明治"雜交體的熒光發(fā)射光譜區(qū)別示意圖(其中，激 發(fā)光的波長采用485nm);
圖3為量子點(diǎn)能量共振轉(zhuǎn)移發(fā)射光譜隨不同比率DNA/QD的變化關(guān)系。485nm的激發(fā)光被 使用，NH2功能化修飾過的單鏈探針DNA的濃度為10nM，單鏈探針DNA與MPA-QDs的摩 爾比為50: 1;
圖4為用Wallac 1420酶標(biāo)儀檢測QDs-DNA雜交結(jié)合體所產(chǎn)生的Cy5熒光發(fā)射強(qiáng)度隨 DNA/QDs比率的變化關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1
(1)制備巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)
首先按照Yang等人的方法(Yang Y A, Wu H M, Williams K R, Cao Y C. Synthesis of CdSe and CdTe nanocrystals without precursor injection. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44: 6712-6715)合成三辛基氧化磷(TOPO)包裹的熒光發(fā)射峰為605 nm的CdSe/ZnS核/殼量 子點(diǎn)，然后取0.5mL上述合成好的TOPO-QDs的甲苯溶液，向其中加入氯仿，再逐滴加 入巰基丙酸(MPA)溶液(溶于甲醇中，事先用四甲基氫氧化銨調(diào)pH值 10);將該混合 物在室溫下攪拌30分鐘，然后向其中加入5mL水，反復(fù)震蕩后，將水層從有機(jī)層分離后， 向其中加入丙酮，使水層中的QDs沉淀下來，將該混合溶液離心后，再將沉淀的QDs溶 于Milli-Q超純水中，制備得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs;將得到的QDs水溶液 超聲后，經(jīng)注射器過濾，最終得到粒徑較均勻的MPA-QDs; (2) HBVDNA檢測探針的設(shè)計及合成
HBV多聚酶位點(diǎn)rtM204I/V (YMDD)的變異與血清中HBV DNA的反彈及轉(zhuǎn)氨酶水平 有關(guān)。當(dāng)M變?yōu)镮或V時可導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈的柔性減低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三 磷酸鹽之間形成空間位阻，與拉米夫定三磷酸的結(jié)合力下降，導(dǎo)致病毒對拉米夫定的耐藥。 本發(fā)明根據(jù)YMDD rtM204及變異型rtV204YVDD的DNA序列設(shè)計檢測探針，其中每個 位點(diǎn)設(shè)計兩個相連接的探針，兩個探針的長度都是15個堿基，單堿基多態(tài)位點(diǎn)設(shè)計在第 一個探針的3'端，并在5'端修飾Cy5 (為信號探針)，另一個探針將用作QDs-DNA共聚 探針，探針的3'未端經(jīng)過氨基的功能化修飾，以便與修飾了羧基的量子點(diǎn)結(jié)合，序列見表 1，探針的合成由大連寶生物有限公司(TAKARA公司)完成。
Table 1. HBV DNA耙序列及探針
探針及靶序列名稱序列
-NH2修飾的DNA探針5'國TGG ATG ATG TGG TAT (T)10 (CH2)3 _(NH2)-3'
-Cy5標(biāo)記的信號探針5'-Cy5隱TGG CTT TCA GTT ATA-3'
互補(bǔ)的靶HBVDNA(YMDD)5 ， ATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCC A-3'
單堿基變異HBV DNA(YVDD)5，-ATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCA-3'
(3) QDs-DNA探針交聯(lián)物的制備
將l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺EDC (0.5 g/L) 、 N-羥基琥珀酰亞胺NHS (0.5 g/L)和MPA-QDs (0.05 pM)按體積比l: 1: 2比例混合，活化0.5 ~2 h，隨后向該活化后的量子點(diǎn)水溶液中加入-NH2功能化修飾過的單鏈DNA (探針DNA/QDs的摩爾比 =50:1);上述溶液在37 °C下孵化1 h，通過QDs上-COOH與探針DNA ±-NH2之間的酰 胺共價鍵的生成，從而使探針DNA連接到QDs表面，制備得到QDs-DNA探針交聯(lián)物； (4)基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的HBV靶DNA高通量檢測
取100^iL雜交液(lOOmMTris-HCl、 10 mM (NH4)2S04、 3 mM MgCl2 (pH8.0)向其 中加入80 的QDs- DNA探針、10 的Cy5標(biāo)記的信號DNA( 10 pM)和10 的40~500 nM互補(bǔ)靶HBV DNA;然后該混合液于42 °C下反應(yīng)15-30分鐘(探針DNA和信號DNA 的摩爾比固定為l:l)，雜交得到"三明治"結(jié)構(gòu)結(jié)合體；冷卻至室溫后，將含有不同濃度互 補(bǔ)HBV DNA的一系列雜交反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上采用485 nm 光激發(fā)，檢測各個雜交反應(yīng)液670nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對互補(bǔ)的HBV DNA 的檢測。
實(shí)施例2
(1) 制備巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn) 方法如實(shí)例1所述。
(2) QDs-DNA探針交聯(lián)物的制備 方法如實(shí)例1所述。
(3) HBV DNA檢測探針的設(shè)計及合成 方法如實(shí)例1所述。
(4) 基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的HBV DNA單堿基突變的檢測
將70 的QDs- DNA探針、10 的信號DNA( 10 pM)、 10 的rtM204I/V (YMDD) 或單堿基突變的rtV204(YVDD)靶DNA (10 pM)、 5個單位Taq DNA聯(lián)接酶和Taq聯(lián)接緩 沖液(115nL， 20 mM)的210 混合液于42 °C下反應(yīng)15-30分鐘。在聯(lián)接反應(yīng)完成后， 將該反應(yīng)混合液于Eppendorf PCR儀上在85 °C下加熱變性5 min，使雙鏈解離變?yōu)閱捂?。?性后，立即將反應(yīng)混合液置于冰水中冰浴5min。冰浴后將反應(yīng)混合液迅速轉(zhuǎn)移至96孔板 中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上采用485 nm光激發(fā)，檢測雜交反應(yīng)液670 nm處的熒光發(fā)射 強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對單堿基突變的HBVDNA的檢測。
權(quán)利要求
1.一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，包括(一)檢測探針的制備(1)巰基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的制備取0.5mL熒光發(fā)射峰為575～615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)QDs的甲苯溶液，加入2～4mL氯仿，再逐滴加入2～4mL的巰基丙酸MPA溶液，室溫攪拌30～60分鐘，加入5～8mL水，反復(fù)震蕩，分去有機(jī)層，在水層中加入丙酮，離心沉淀后，將得到的QDs溶于Milli-Q超純水中，制備得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS QDs；(2)HBV DNA檢測探針的設(shè)計及合成-NH2修飾過的單鏈探針DNA5′-TGG ATG ATG TGG TAT(T)10(CH2)3-(NH2)-3′；-Cy5標(biāo)記的信號DNA探針5′-Cy5-TGG CTT TCA GTT ATA-3′；互補(bǔ)的靶HBV DNA5’ATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCA-3’；單堿基變異HBV DNA5’-ATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCA-3’；(3)QDs-DNA探針交聯(lián)物的制備將0.5g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺EDC、0.5g/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS和0.05μM的MPA-QDs按體積比1～2∶1～2∶2～6比例混合，活化0.5～2h，加入上述-NH2功能化修飾過的單鏈探針DNA，于37℃孵化1h，制備得到QDs-DNA探針交聯(lián)物；(二)互補(bǔ)靶HBV DNA及單堿基突變的檢測(1)基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的HBV靶DNA高通量檢測向100μL雜交液中加入80μL QDs-DNA探針、10μL 10μM的Cy5標(biāo)記的信號DNA探針和10μL 40～500nM互補(bǔ)的靶HBV DNA，然后將該混合液于42～50℃反應(yīng)15-30min，雜交得到“三明治”結(jié)構(gòu)雜交結(jié)合體，冷卻至室溫，將互補(bǔ)的靶HBV DNA的雜交反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用Wallac 1420酶標(biāo)儀檢測雜交反應(yīng)液670nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對互補(bǔ)的靶DNA檢測和定量；(2)基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的HBV DNA單堿基突變的檢測將70μL QDs-DNA探針、10μL 10μM的Cy5標(biāo)記的信號DNA、10μL 10μM單堿基錯配的靶DNA、5unit Taq DNA聯(lián)接酶以及115μL 20mM的Taq聯(lián)接緩沖液的混合液于42～50℃反應(yīng)15-30分鐘；在聯(lián)接反應(yīng)完成后，將該反應(yīng)混合液于85～100℃下加熱變性5min，使雙鏈解離變?yōu)閱捂?，立即將反?yīng)混合液置于冰水中冰浴3～5min，然后將反應(yīng)混合液迅速轉(zhuǎn)移至96孔板中，用Wallac 1420酶標(biāo)儀檢測各個雜交反應(yīng)液670nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)或多個樣品中靶DNA突變的檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBVDNA及單堿基突變的方 法，其特征在于所述步驟(1)中的巰基丙酸MPA溶液為溶于巰基丙酸的甲醇溶液，濃 度30mmol/L，用四甲基氫氧化銨調(diào)pH值為10。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方 法，其特征在于所述步驟(3)中的-NH2功能化修飾過的單鏈探針DNA的濃度為10 ^M， 單鏈探針DNA與MPA-QDs的摩爾比為50: 1 。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方 法，其特征在于所述步驟(4)中的雜交液為100mmol/LTris-HCl、 10mmol/L(NH4)2S04 及3 mmol/LpH 8.0 MgCl2的混合液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBVDNA及單堿基突變的方 法，其特征在于所述步驟(4)中的QDs-DNA探針與Cy5標(biāo)記的信號DNA的摩爾比為 1:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方 法，其特征在于所述步驟(4)中的互補(bǔ)的靶HBVDNA與QDs-DNA探針的摩爾比為 4~50。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方 法，其特征在于所述步驟(4)中的"三明治"結(jié)構(gòu)雜交結(jié)合體是指以靶HBVDNA作為雜 交模板，Cy5標(biāo)記的信號DNA、互補(bǔ)的或單堿基錯配的QDs- DNA探針在Taq連接酶的作 用下與耙HBV DNA進(jìn)行三明治雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移檢測HBV DNA及單堿基突變的方法，包括MPA包裹的CdSe/ZnS核/殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的制備；HBV DNA檢測探針的設(shè)計及合成；QDs-DNA探針交聯(lián)物的制備；互補(bǔ)的靶HBV DNA及單堿基突變的高通量檢測。該方法操作簡單，可以與多種儀器兼容，不需要對雜交體系中未聯(lián)接的DNA進(jìn)行分離；由于Cy5在485nm光激發(fā)下不會直接產(chǎn)生熒光信號，因此背景干擾小，信號強(qiáng)；該方法還具有特異、快速、高分辨率、高靈敏度和高通量的特點(diǎn)，可應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中HBV靶DNA及單堿基突變的檢測。
文檔編號C12Q1/70GK101654715SQ200910195689
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者毛紅菊, 祥 王, 趙建龍, 鐘新華 申請人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所