專利名稱：基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的mgmt活性檢測(cè)試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的MGMT活性檢測(cè)試劑盒及方法。背景技術(shù)：
烷化劑是最大一類抗腫瘤藥物，臨床上常用的例子有環(huán)磷酰胺、尼莫司汀、卡巴嗪、硝卡芥、氮芥和替莫唑胺等，廣泛用于治療腦、頭頸、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等惡性腫瘤。烷化劑藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷主要是通過(guò)對(duì)DNA分子的鳥嘌呤O6位上的烷基化而實(shí)現(xiàn)的，而 O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase, MGMT)的存在能夠去除這種烷基加合物，使腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞得以生存而產(chǎn)生所謂的耐藥性，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞修復(fù)烷化劑所造成DNA損傷的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。如果腫瘤細(xì)胞中的 MGMT水平過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致耐藥，而對(duì)于正常細(xì)胞卻可能減少其化療的毒副作用。如何控制 MGMT水平以達(dá)到最佳的化療效果是如今MGMT研究的熱點(diǎn)。而且，MGMT在預(yù)測(cè)腫瘤化療的效果以及制訂個(gè)體化治療方案的潛在價(jià)值也已被大量實(shí)例研究所證實(shí)并被醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可。因此，如何靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)MGMT在細(xì)胞中的活性，對(duì)提高化療效果以及減少藥物毒副作用有著重要的意義。
不幸的是，目前還沒有一種簡(jiǎn)易可靠、可應(yīng)用于常規(guī)臨床檢驗(yàn)的方法來(lái)測(cè)定具有重要腫瘤學(xué)價(jià)值的MGMT活性。已有大量文獻(xiàn)描述MGMT基因啟動(dòng)子甲基化以及MGMT蛋白表達(dá)的免疫測(cè)定并試圖建立這些分子生物學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)與腫瘤耐藥性、生存率以及個(gè)體化治療方案的相關(guān)性，但這些煩瑣而且不穩(wěn)定的檢測(cè)方法不適合在臨床上常規(guī)使用，也因?yàn)樗鼈儾恢苯訙y(cè)定MGMT的酶學(xué)活性而可能引入各種與腫瘤耐藥機(jī)制無(wú)關(guān)的干擾因素?；谕凰貥?biāo)記底物的MGMT活性測(cè)定法只適用于實(shí)驗(yàn)室研究而難以被用于常規(guī)臨床檢驗(yàn)中； 此外，這種方法所用的蛋白沉淀步驟容易引入諸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特異結(jié)合， 引起假陽(yáng)性。雖然有人用非同位素標(biāo)記的底物和酶聯(lián)免疫分析方法來(lái)測(cè)定MGMT活性，但這個(gè)方法需要多步而費(fèi)時(shí)的固相分離和反應(yīng)。從臨床應(yīng)用和檢測(cè)效率(靈敏度)的角度來(lái)看， 這是個(gè)明顯的缺點(diǎn)。
很明顯，無(wú)論在腫瘤生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中還是在腫瘤治療的臨床實(shí)踐中，都急需發(fā)展一種簡(jiǎn)單可靠的方法來(lái)特異、靈敏地測(cè)定各種腫瘤組織和血樣中的MGMT活性。
能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即為內(nèi)源性發(fā)色基團(tuán)發(fā)生熒光淬滅和外源發(fā)色基團(tuán)發(fā)生熒光敏化的現(xiàn)象。當(dāng)兩種物質(zhì)分子的吸收峰和發(fā)射峰重疊或部分重疊時(shí)，通過(guò)分子之間的偶極一偶極的共振偶合可以使能量從供給體轉(zhuǎn)移至受體。其中吸收能量的基團(tuán)或物質(zhì)成為能量受體，反之為能量供體。而突光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence energy transfer, FRET)是指電子激發(fā)能在適當(dāng)?shù)哪芰拷o體和受體之間傳遞，通過(guò)能量接受體的熒光增強(qiáng)可以簡(jiǎn)單地對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量分析，但是目前分析中所用的有機(jī)熒光染料存在吸收光譜窄、發(fā)射光拖尾等諸多問(wèn)題，從而影響供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，并且供、受體發(fā)射光譜易產(chǎn)生相互干擾。最近報(bào)道的將發(fā)光量子點(diǎn)用于共振能量轉(zhuǎn)移，可克服有機(jī)染料的不足之處，相對(duì)傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料分子，量子點(diǎn)的發(fā)射光譜窄并且不拖尾，并有較寬的光譜激發(fā)范圍，將它作為能量供體時(shí)，可以更自由地選擇激發(fā)波長(zhǎng)，以最大限度地避免對(duì)能量受體的直接激發(fā)。因此，將熒光量子點(diǎn)用于MGMT的活性檢測(cè)，可降低假陽(yáng)性的發(fā)生率，并且具有較高的靈敏度，可以檢測(cè)同等反應(yīng)下相對(duì)常規(guī)濃度較低的被測(cè)物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種基于FRET的MGMT活性檢測(cè)的新方法，克服現(xiàn)有方法的不足。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的MGMT活性檢測(cè)試劑盒，主要包括
( I)鏈霉未和素修飾的磁性量子點(diǎn)；
(2 )四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物；
(3)生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤；
(4)緩沖液A，其終濃度組成如下20mM DTT, 2mM EDTA, 20%
(v/v)丙三醇，溶劑為 IOOmM Tris-HCl, pH 7. 6 ；
(5) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明試劑盒原理如下
(I)待測(cè)MGMT樣品(a)與其底物即生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤(b)反應(yīng)， 在芐基轉(zhuǎn)移到酶蛋白后形成生物素標(biāo)記的MGMT (c) ;(2)加入表面修飾鏈霉親和素的磁性量子點(diǎn)(Mag-QDs-SA) Cd)以及熒光染料四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物 (tetramethylrhodamine-labeled anti-MGMT,TMR-anti-MGMT) (e)分別與 MGMT 結(jié)合，結(jié)果以MGMT為橋梁把量子點(diǎn)和羅丹明拉近到有效距離內(nèi)；(3)在外界激發(fā)光激發(fā)下，量子點(diǎn)發(fā)光以及到羅丹明的共振能量轉(zhuǎn)移。無(wú)MGMT活性的樣本在檢測(cè)中無(wú)法與生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤反應(yīng)，進(jìn)而無(wú)法使Mag-QDs-SA和TMR_anti_MGMT通過(guò)MGMT的橋聯(lián)作用結(jié)合在一起，QDs與TMR之間無(wú)法發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，也就不能檢測(cè)到TMR的熒光發(fā)射峰增強(qiáng)。因此可以通過(guò)測(cè)量能量轉(zhuǎn)移下羅丹明發(fā)射光的增強(qiáng)程度就可以得到與MGMT活性相關(guān)的定量指標(biāo)，由此建立MGMT活性和能量轉(zhuǎn)移關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線并應(yīng)用到各種檢測(cè)場(chǎng)合。其原理圖如圖 I所示。
本發(fā)明還涉及一種利用所述試劑盒檢測(cè)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法包括
(I)提取待測(cè)樣品的總蛋白質(zhì)；
(2)取10 μ L上述提取的總蛋白質(zhì)，溶于50 μ L的緩沖液A中，然后加入50pmol 的生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤，用純水補(bǔ)足至300 μ L，經(jīng)震蕩混勻后，室溫下反應(yīng)90min， 然后加入50pmol鏈霉親和素修飾的磁性量子點(diǎn)，用緩沖液A補(bǔ)足至300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，加入50pmol四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物，用含1%BSA的緩沖液A補(bǔ)足至300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)30min，在磁力作用下除去上清液，并用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，最后加入緩沖液A 300 μ L，移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下、在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)；
(3)取不同量的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶溶于50 μ L緩沖液A中，配制梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別按照步驟(2)的方法，進(jìn)行反應(yīng)，最后在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下、在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)，繪制TMR熒光增強(qiáng)程度-MGMT濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；
TMR熒光增強(qiáng)強(qiáng)度可通過(guò)下式計(jì)算得到
TMR熒光增強(qiáng)程度(％)= (FRET后TMR熒光強(qiáng)度一FRET前TMR熒光強(qiáng)度)/FRET前 TMR熒光強(qiáng)度
FRET后TMR熒光強(qiáng)度即加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后反應(yīng)溶液在400nm的激發(fā)光下、在 585nm處測(cè)得 的發(fā)射光強(qiáng)度，F(xiàn)RET前TMR熒光強(qiáng)度即MGMT濃度為O (即未添加樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)時(shí)反應(yīng)溶液在585nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度；
(4)根據(jù)樣品測(cè)得的熒光強(qiáng)度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品中的MGMT濃度數(shù)據(jù)。
所述待測(cè)樣品為臨床組織樣品或臨床細(xì)胞株樣品。
待測(cè)樣品為腫瘤細(xì)胞株樣品時(shí)，總蛋白提取步驟如下
I.裂解液制備每500uL冷的緩沖液A (20mM DTT,2mM EDTA, 20% (v/v)丙三醇， 溶劑為IOOmM Tris-HCl,pH 7. 6)中加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/mL抑肽酶，10 μ M 抑氨肽酶素b，10 μ M亮抑酶肽，I μ M胰肽素，O. ImM苯甲基磺酰氟，溶劑為前述緩沖液Α)，混勻后置冰上備用；
2.取5 10 X IO6個(gè)細(xì)胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5 10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞；
3.用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清；
4.每5X IO6個(gè)細(xì)胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘；
5.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘；
6.快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
待測(cè)樣品為臨床組織樣品時(shí)，總蛋白提取步驟如下
I.裂解液制備每500uL冷的緩沖液A中加入2uL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用；
2.取IOOmg組織樣本剪碎，加入上述裂解液中，并用組織勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見固體；
3.將組織勻漿吸入另一預(yù)冷的干凈離心管中，在4°C，IOOOOrpm條件下離心5分鐘；
4.將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
上述蛋白提取物分裝后于_80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在
( I)利用量子點(diǎn)與羅丹明之間的共振能量轉(zhuǎn)移原理進(jìn)行MGMT的活性檢測(cè)，以最大限度地避免對(duì)TMR的直接激發(fā)，降低假陽(yáng)性的發(fā)生率。
(2)使用Biotin-BG和anti_MGMT兩種特異探針，通過(guò)酶催化和抗原-抗體的雙重特異反應(yīng)，保證了反應(yīng)結(jié)果具有高度的特異性。
(3)使用磁分離技術(shù)，簡(jiǎn)化了分離步驟，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

圖I為基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的MGMT活性檢測(cè)原理示意圖2為TMR-anti-MGMT的熒光發(fā)射譜圖3為不同MGMT濃度下熒光發(fā)射光譜圖(激發(fā)波長(zhǎng)nm):a =MGMT濃度為5. Opmol ； b =MGMT 濃度為 7. 5pmol ；c -MGMT 濃度為 10. Opmol ；d MGMT 濃度為 15. Opmol ；
圖4為基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的MGMT活性檢測(cè)的工作曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例I :利用本發(fā)明的MGMT活性檢測(cè)方法測(cè)定細(xì)胞株HeLa S3中MGMT活性。
(I) Mag-QDs-SA 的制備
a)水溶性量子點(diǎn)的制備在250mL三頸瓶中，加入CdCl2水溶液，攪拌下再加入用高純水稀釋的巰基乙酸溶液，并用lmol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH為10，然后在適當(dāng)攪拌速度下加入NaHTe水溶液。將此反應(yīng)液加熱至沸騰，開始記時(shí)取樣，回流，在不同的時(shí)間段取樣，獲得不同粒徑的量子點(diǎn)，(反應(yīng)O. 5h，2h，4h，可分別得到發(fā)綠色，黃色，橙色熒光的CdTe 量子點(diǎn)，本發(fā)明優(yōu)選粒徑為2. 9nm，發(fā)綠色熒光的量子點(diǎn)用于磁性Mag-QDs-SA的制備)。在反應(yīng)O. 5h獲得的量子點(diǎn)溶液中加入乙醇沉淀后并干燥,加入純水分散獲得濃度為O. Olmg/ mL的量子點(diǎn)分散液。
b)磁性Mag-QDs-SA的制備將IOmL濃度為O. 2g/mL朽1檬酸鈉穩(wěn)定的Fe3O4納米粒子分散液加入含有30mL乙醇和ImL 25% (w/w)氨水的混合溶液中在5°C超聲分散30min， 然后加入ImL正硅酸乙酯，在40°C下機(jī)械攪拌過(guò)夜后，將產(chǎn)物用乙醇和純水在磁力作用下多次洗滌后放入60°C的真空烘箱干燥得到棕紅色粉末，即二氧化硅磁性微球。取2g的二氧化硅磁性微球與2mL步驟a)制備的量子點(diǎn)分散液混合，加入O. 5mLCdCl2 (4mg/mL)水溶液，二者迅速沉淀，然后在外加磁力的作用下除去過(guò)量的Cd2+，然后將上述共沉淀物分散于含有5mL環(huán)己烷、O. 5mL氨水(25%)和O. 7mL的壬基酚聚氧乙烯醚乳化劑(NP-40)的混合溶液中，攪拌均勻后加入30 μ L 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，密封反應(yīng)24h后，在磁力作用下得到表面氨基化的磁性量子點(diǎn)，用乙醇和水反復(fù)洗滌后，分散于PBS緩沖溶液中待用；
c)鏈霉親和素在氨基化的磁性量子點(diǎn)表面的偶聯(lián)在磷酸緩沖液(PBS O. Imol/ L，pH=8. 5)中，將氨基化的磁性量子點(diǎn)子0.6mg和250yL8. 7g/L EDC混合，并向其加入O.12mg的鏈霉親和素(SA)，室溫下攪拌反應(yīng)3h后，在磁力作用下，得到沉淀聚集物，并用 PBS (O. lmol/L,pH=7. 4)洗滌，純化得到表面修飾鏈霉親和素的磁性量子點(diǎn)(Mag-QDs-SA)。
(2)四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物TMR_anti_MGMT的制備
量取IOml濃度為6mg/ml的anti-MGMT，加在濃度為O. lmol/L pH9. 5的碳酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜；將300μ g四甲基異硫氰酸羅丹明溶于濃度為lmg/mL的二甲基亞砜中， 取此溶液300 μ L，逐滴加入抗體溶液中，在室溫中避光攪拌2h ;把結(jié)合物移入直徑3cm，高 30cm的Bio-Gel P-6層析柱，此層析柱已用O. 01mol/L ρΗ8· O的PBS平衡過(guò)，流速為I. 5mL/ min ;收集到的先流出的紅色結(jié)合物即為標(biāo)記抗體，分裝后于4°C保存?zhèn)溆谩?br> (3)生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤(B-BG)的制備
將O6-芐基鳥嘌呤用O. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. O)稀釋至lmg/mL，用ImL DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB) Img ；向ImLO6-芐基鳥嘌呤溶液加入120 μ L NHSB溶液(即含NHSB 120 μ g);在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2 4小時(shí)；加入9. 6 μ L lmol/L NH4Cl(每25 μ gNHSB加I μ L)，在室溫下攪拌10分鐘；在4°C，對(duì)PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上ImL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集ImL/管，蛋白質(zhì)在I 3mL之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉(終濃度O. 2g/L)及I. Og/L BSA，濃度為5 μ g/mL。將結(jié)合產(chǎn)物置4°C，避光保存。
(4)細(xì)胞樣本制備
I.裂解液制備■ 每500uL冷的緩沖液A中加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/ mL抑肽酶，10 μ M抑氨肽酶素b，10 μ M亮抑酶肽，I μ M胰肽素，O. ImM苯甲基磺酰氟)，混勻后置冰上備用。
2.取5 10 X IO6個(gè)細(xì)胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5_10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞
3.用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4.每5X IO6個(gè)細(xì)胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘。
5.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘。
6.快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
7.通過(guò)Bradford法，測(cè)定上清中溶液中的總蛋白含量。
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
取2. Opmol>5. Opmol>7. 5pmol、10. Opmol> 15. Opmol 的 MGMT 溶于 50 μ L 的緩沖液 A中，然后加入50pmol的B-BG以及純水使反應(yīng)溶液總體積為300 μ L,經(jīng)震蕩混勻后，室溫下反應(yīng)90min，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及緩沖液A，使反應(yīng)總體積為300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，加入 50pmol TMR-anti-MGMT以及含1%BSA的緩沖液A，反應(yīng)總體積為300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng) 30min，在磁力作用下除去上清液，并用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，最后加入緩沖液A 300 μ L， 移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下，在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)，繪制TMR熒光增強(qiáng)程度-MGMT濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。
(6) MGMT活性檢測(cè)在上述10 μ L濃度為9. 8mg/mL HeLa S3的提取物中加入 50 μ L的緩沖液A中，然后加入50pmol的B-BG以及純水使反應(yīng)溶液總體積為300 μ L，經(jīng)震蕩混勻后，室溫下反應(yīng)90min,再磁力作用下，除去上清液,然后加入50pmol的Mag-QDs-SA 以及緩沖液A，使反應(yīng)總體積為300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，加入50pmoITMR-anti-MGMT以及1%BSA的緩沖液A， 反應(yīng)總體積為300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)30min，在磁力作用下除去上清液，并用緩沖液A 反復(fù)洗滌多次，最后加入緩沖液A 300 μ L，移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下，在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后，其MGMT表達(dá)活性為 738fmol/mg 蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2 :利用本發(fā)明的MGMT活性檢測(cè)方法測(cè)定細(xì)胞株HeLa MR中MGMT活性。
(I)表面修飾鏈霉親和素的磁性量子點(diǎn)(Quantum Dots-Streptavidin,Mag-QDs-SA)的制備同實(shí)施例I。
(2)四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物TMR — anti-MGMT的制備
同實(shí)施例I。
(3)生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤(B-BG)的制備
同實(shí)施例I。
(4)細(xì)胞樣本的制備
I.裂解液制備每500uL冷的緩沖液A中加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/ mL抑肽酶，10 μ M抑氨肽酶素b，10 μ M亮抑酶肽，I μ M胰肽素，O. ImM苯甲基磺酰氟)，混勻后置冰上備用。
2.取5 10 X IO6個(gè)HeLa MR細(xì)胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5 10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞
3.用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4.每5X IO6個(gè)細(xì)胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘。
5.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘。
6.快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
7.通過(guò)Bradford法，測(cè)定上清中溶液中的總蛋白含量。
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
同實(shí)施例I。
(6)MGMT活性檢在上述10 μ L濃度為9. 5mg/mL HeLa MR的提取物中加入50 μ L 的緩沖液 A(100mM Tris-HCl,pH 7. 6, 20mMDTT, 2mM EDTA，20% 丙三醇)中，然后加入 50pmol 的B-BG以及純水使反應(yīng)溶液總體積為300 μ I,經(jīng)震蕩混勻后,室溫下反應(yīng)90min，再磁力作用下，除去上清液，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及緩沖液A，使反應(yīng)總體積為300 μ L， 充分振蕩混勻反應(yīng)5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用緩沖液A反復(fù)洗滌多次， 加入50pmolTMR—anti_MGMT以及1%BSA的緩沖液A，反應(yīng)總體積為300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)30min，在磁力作用下除去上清液，并用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，最后加入緩沖液A 300 μ L，移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下，在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后，其MGMT表達(dá)活性為82fmol/mg蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3 :利用本發(fā)明的MGMT活性檢測(cè)方法測(cè)定組織樣本星型膠質(zhì)瘤中MGMT活性。
(I)表面修飾鏈霉親和素的磁性量子點(diǎn)(Quantum Dots-Streptavidin, Mag-QDs-SA)的制備
同實(shí)施例I。
(2)四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物TMR — anti-MGMT的制備同實(shí)施例I。
(3)生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤(B-BG)的制備同實(shí)施例I。
(4)組織樣本的制備
I.裂解液制備每500uL冷的緩沖液A中加入2uL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2.取IOOmg膠質(zhì)瘤組織樣本剪碎，加入上述裂解液中，并用組織勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見固體。
3.將組織勻漿吸入另一預(yù)冷的干凈離心管中，在4°C，IOOOOrpm條件下離心5分鐘。
4.將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
5.通過(guò)Bradford法,測(cè)定上清中溶液中的總蛋白含量。
(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
同實(shí)施例I。
(6)MGMT活性檢在上述10 μ L濃度為10. lmg/mL膠質(zhì)瘤的提取物中加入50 μ L的緩沖液 A (IOOmM Tris-HCl，pH 7. 6,20mM DTT,2mM EDTA，20% 丙三醇)中，然后加入 50pmol 的B-BG以及純水使反應(yīng)溶液總體積為300 μ I,經(jīng)震蕩混勻后,室溫下反應(yīng)90min，再磁力作用下，除去上清液，然后加入50pmol的Mag-QDs-SA以及緩沖液A，使反應(yīng)總體積為300 μ L， 充分振蕩混勻反應(yīng)5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，加入50pmo I TMR-anti-MGMT以及1%BSA的緩沖液A，反應(yīng)總體積為300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng) 30min，在磁力作用下除去上清液，并用緩沖液A反復(fù)洗滌多次，最后加入緩沖液A 300 μ L, 移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下，在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后，其MGMT表達(dá)活性為821fmol/mg蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的MGMT活性檢測(cè)試劑盒，主要包括(1)鏈霉親和素修飾的磁性量子點(diǎn)；(2)四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物；(3)生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤；(4)緩沖液A，其終濃度組成如下20mMDTT, 2mM EDTA，20%丙三醇，溶劑為IOOmM Tris-HCl，pH 7. 6 ；(5)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品。
2.利用權(quán)利要求I所述試劑盒檢測(cè)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法包括(1)提取待測(cè)樣品的總蛋白質(zhì)；(2)取10μ L上述提取的總蛋白質(zhì)，溶于50 μ L的緩沖液A中，然后加入50pmol的生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤，用純水補(bǔ)足至300 μ L，經(jīng)震蕩混勻后，室溫下反應(yīng)90min，然后加入50pmol鏈霉親和素修飾的磁性量子點(diǎn)，用緩沖液A補(bǔ)足至300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng) 5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用緩沖溶液A反復(fù)洗滌多次，加入50pmol四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物，用含1%BSA的緩沖液A補(bǔ)足至300 μ L，充分振蕩混勻反應(yīng)30min，在磁力作用下除去上清液，并用緩沖溶液A反復(fù)洗滌多次，最后加入緩沖溶液A 300 μ L，移至96孔板中，在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下、在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)；(3)取不同量的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶溶于50μ L緩沖液A中，配制梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別按照步驟(2)的方法，進(jìn)行反應(yīng)，最后在Wallac 1420酶標(biāo)儀上測(cè)定其在400nm的激發(fā)光下、在585nm處的發(fā)射光強(qiáng)，繪制TMR熒光增強(qiáng)程度-MGMT濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.(4 )根據(jù)樣品測(cè)得的熒光強(qiáng)度值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得樣品中的MGMT濃度數(shù)據(jù)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述待測(cè)樣品為臨床組織樣品或臨床細(xì)胞株樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移的MGMT活性檢測(cè)試劑盒及方法。所述試劑盒主要包括(1)鏈霉親和素修飾的磁性量子點(diǎn)；(2)四甲基羅丹明標(biāo)記的抗MGMT抗體耦合物；(3)生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤；(4)緩沖液A；(5)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明利用量子點(diǎn)與羅丹明之間的共振能量轉(zhuǎn)移原理進(jìn)行MGMT的活性檢測(cè)，以最大限度地避免對(duì)TMR的直接激發(fā)，降低假陽(yáng)性的發(fā)生率；使用Biotin-BG和anti-MGMT兩種特異探針，通過(guò)酶催化和抗原-抗體的雙重特異反應(yīng)，保證了反應(yīng)結(jié)果具有高度的特異性；本發(fā)明使用磁分離技術(shù)，簡(jiǎn)化了分離步驟，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102944539SQ20121035790
公開日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者梁媛媛, 陳燦玉, 焦艷華, 張現(xiàn)俠, 郭衛(wèi)強(qiáng), 章鵬飛 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)