專利名稱：重組人源hgf激活因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種重組人源性HGF激活因子 (rhHGFA)，及其rhHGFA在制備治療急性或亞急性重癥肝炎肝細(xì)胞壞死 的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長因子激活因子(HGFA)是一種肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白，Gene ID: 3083，活化的HGFA是一條33Kd多肽，僅分布于受損的組織器官， 可以在受損局部將肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的單體肝細(xì)胞生長因子(pro-HGF) 活化為HGF，在受損組織器官局部發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和組織修復(fù)作用(參見文 獻(xiàn)Shia S, Stamos J, Kirchhofer D， et al. Conformational lability in serine protease active sites: structures of hepatocyte growth factor activator (HGFA) alone and with the inhibitory domain from HGFA inhibitor-IB. J Mol Biol. 2005 Mar 11 ;346(5》1335-49. ; Miyazawa K， Shimomura T and Kitamura N. Activation of hepatocyte growth factor in the injured tissues is mediated by hepatocyte growth factor activator. J Biol Chem 1996; 271:3615-8.)。動物研究 發(fā)現(xiàn)，HGFA基因敲除小鼠的炎性腸病模型中，動物的死亡率高達(dá)72%， 而同期野生對照組的死亡率僅為25% (參見文獻(xiàn)Itoh H, Naganuma S, Takeda N et al. Regeneration of injured intestinal mucosa is impaired in hepatocyte growth factor activator-deficient mice. Gastroenterology 2004; 127:1423-35.)，提示HGFA在pro-HGF活化、組織器官修復(fù)保護(hù)中發(fā)揮了 至關(guān)重要的作用。
急、慢性肝功能衰竭以大面積肝細(xì)胞凋亡壞死、肝細(xì)胞再生功能抑制 為主要病理特征。臨床表現(xiàn)為重度黃疸、腹水、凝血障礙、肝性腦病，病 勢兇險(xiǎn)，但內(nèi)科只能采用保肝、對癥處理治療，由于缺乏有效的救治手段， 患者死亡率高達(dá)70-90%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組人源性HGF激活因子(rhHGFA)，本 發(fā)明的另一目的是提供該rhHGFA在制備治療急性或亞急性重癥肝炎肝細(xì) 胞壞死的藥物中的應(yīng)用。
在急性、亞急性重癥肝炎病程中，壞死的肝細(xì)胞可以刺激肝臟非實(shí)質(zhì) 細(xì)胞分泌大量的肝細(xì)胞生長因子前體(pro-HGF)，因此患者血清中往往含 有高值pro-HGF，特別是急性肝衰時，其血中含量可以達(dá)到正常值的10倍。 pro-HGF只有被激活為HGF才能發(fā)揮其抗細(xì)胞壞死、凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞再 生的功能，體內(nèi)80M的pro-HGF被肝細(xì)胞合成的HGFA激活。但在急性肝 衰大面積肝細(xì)胞壞死或由于肝硬化等因素抑制肝細(xì)胞合成HGFA情況下， 機(jī)體產(chǎn)生的pro-HGF無法有效地轉(zhuǎn)型為HGF發(fā)揮其肝細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)功 能。因此本發(fā)明人推斷補(bǔ)充體內(nèi)減少的HGFA促進(jìn)pro-HGF轉(zhuǎn)型為HGF， 就可以使肝臟利用其自身產(chǎn)生的HGF進(jìn)行抗凋亡及再生修復(fù)，預(yù)防和阻止 大面積肝細(xì)胞壞死造成的急性肝功能衰竭的發(fā)生及進(jìn)展，為肝臟修復(fù)及進(jìn) 一步治療創(chuàng)造條件。
由于HGFA成熟肽段在體內(nèi)消除較快，加之基因重組蛋白本身在體內(nèi) 的穩(wěn)定性較差，故本發(fā)明是在人源成熟肽段HGFA的基礎(chǔ)上，與人免疫球 蛋白IgGFc片斷重組成為融合蛋白(rhHGFA-Fc)增加在動物/人體內(nèi)的蛋 白穩(wěn)定性，并將該融合蛋白應(yīng)用于制備治療急性或亞急性重癥肝炎肝細(xì)胞 壞死的藥物。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案是將HGFA成熟肽段基因(858bp，見SEQ ID NO:l)以及人免疫球蛋白(IgG)的Fc片斷基因(693bp，見SEQ ID NO:2)。 采用重疊延伸剪切技術(shù)經(jīng)兩次PCR獲得重組基因片段HGFA-Fc (1575bp， 見SEQ ID NO:3)。
本發(fā)明提供的一種重組人源性肝細(xì)胞生長因子激活因子，其核苷酸序 列及其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。核苷酸序列具體為
atg+HGFA成熟肽段基因(SEQ ID NO:l ) +中間接頭序列 (ggatccgcaggagtcgcaacc) + Fc片斷基因(SEQ ID NO:2)。
上述核苷酸序列編碼的氨基酸共計(jì)525aa，具體序列如下
PWLAAIYIGDSFCAGSLVHTCWVVSAAHCFSHSPPRDSVSVVLGQHFFNICLPEPGSTFPAGHKCQIAGWGHLDENVSGYSSSLREALVPLVADHKCSS
PEVYGADISP麗LCAGYFDCKSDACQGDSGGPLACEKNGVAYLYGIISW
GDGCGRLHKPGVYTRVANYVDWINDRIRPPRRLVAPSGSAGVATPKSCD
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
上述氨基酸序列中劃線部分為中間接頭序列，劃線之前部分為HGFA 序列，劃線之后部分為Fc序列，見SEQIDNO:3或4。
本發(fā)明將HGFA-Fc基因片段連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建 pMD18-HGFA-Fc載體。PCR法篩選陽性克隆，并進(jìn)行陽性克隆的DNA測 序。隨后，將HGFA-Fc克隆到pcDNA3.1表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化Eco.li Top 10 菌株，進(jìn)行重組質(zhì)粒制備、純化，并轉(zhuǎn)染人腎細(xì)胞293株進(jìn)行重組融合蛋 白(rhHGFA-Fc)表達(dá)。重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳確定其分子量為63Kd, 分別采用抗HGFA和抗人IgG Fc抗體證實(shí)rhHGFA-Fc重組蛋白的特異性。
經(jīng)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白可以激活人源pro-HGF單體成為具有生 物學(xué)活性的HGF二聚體(HGF)，半數(shù)激活濃度(IC5。)為20nM。
本研究構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)載體，將HGFA活性區(qū)域和人免疫球蛋白 IgG鉸鏈區(qū)融合表達(dá)，理論上HGFA-Fc既具有肝細(xì)胞生長因子激活因子的 功能，又可以通過Fc片段增強(qiáng)融合蛋白的穩(wěn)定性。將純化的HGFA-Fc融 合蛋白與pro-HGF溫育反應(yīng)，用HGF多克隆抗體Western blot檢測顯示 pro-HGF被酶解為a鏈和(3鏈，且隨著HGFA-Fc濃度增加酶切活性增強(qiáng)， HGFA-Fc的酶切活性呈劑量依賴效應(yīng)。顯示重組表達(dá)的HGFA-Fc具有較強(qiáng) 的激活pro-HGF功能。HAI-1是HGFA特異性抑制因子，因此將純化的 HGFA-Fc與pro-HGF、 HAI-1共同溫育反應(yīng)，會抑制HGFA-Fc的酶切活性。 HGF多克隆抗體Western blot檢測表明當(dāng)HAI-1反應(yīng)濃度為2uM以上時， HGFA-Fc的酶切活性被很好的抑制，從另外一個側(cè)面證實(shí)融合HGFA-Fc具 有較強(qiáng)的生物學(xué)特異性。
經(jīng)rhHGFA-Fc激活的HGF在體外試驗(yàn)中顯示出顯著的肝細(xì)胞凋亡抑制 作用(4.8% 25.1%);在動物肝纖維化肝細(xì)胞損傷模型中，rhHGFA-Fc治療組可以明顯減少肝細(xì)胞凋亡。因此，rhHGFA-Fc重組蛋白可以作為急 性、亞急性重癥肝炎肝細(xì)胞凋亡壞死的治療藥物。


圖1是表達(dá)載體pcDNA3.1-HGFA-Fc的酶切鑒定結(jié)果
其中M為DL 2000 DNA分子量標(biāo)記；1為pcDNA3.1(+)用Xho I/Hind III雙酶切；2、 3為pcDNA3.1-HGFA-Fc用Xho I/Hind III雙酶切。 圖2是10% SDS-PAGE鑒定rhHGFA-Fc重組蛋白的分子量結(jié)果
其中1為從轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HGFA-Fc質(zhì)粒的293細(xì)胞總蛋白中純化的 rHGFA-Fc重組融合蛋白；2為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空白質(zhì)粒的293細(xì)胞蛋白 純化產(chǎn)物。
圖3是rhHGFA-Fc重組蛋白western blot鑒定結(jié)果
其中M為預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1、 2為從轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HGFA-Fc 質(zhì)粒的293細(xì)胞總蛋白中純化的rHGFA-Fc重組融合蛋白；3為轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)空白質(zhì)粒的293細(xì)胞蛋白純化產(chǎn)物。 圖4是Western Blot檢測HGFA-Fc的酶切活性結(jié)果
其中O為零反應(yīng)時間的樣品；Ctrl為未加入HGFA-Fc的樣品；1 6為 HGFA-Fc濃度梯度4.8ug/ml 0.15ug/ml。
圖5是HAI-1抑制HGFA-Fc激活pro-HGF的試驗(yàn)結(jié)果。
其中0表示終濃度為50ug/ml的pro-HGF溶液；Ctrl: 50ug/ml的pro-HGF 溶液中加入終濃度為2.4ug/ml的HGFA-Fc; 1:在ctri反應(yīng)體系中加入0.5uM HAI-1; 2:在Ctrl反應(yīng)體系中加入2uM HAI-1; 3:在ctrl反應(yīng)體系中加入 8uMHAI曙l。
圖6是流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測AHGFA-Fc蛋白介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡抑制作用結(jié) 果
其中A為空白細(xì)胞對照組；B為單獨(dú)加入pro-HGF組；C為加入 HGFA-Fc和pro-HGF實(shí)驗(yàn)組。
圖7是HGFA-Fc融合蛋白抗動物肝細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 其中A為對照組，B為實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞免疫組化結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實(shí)施并不僅于此。
材料與主要試劑
1. 細(xì)胞株、菌種和質(zhì)粒293細(xì)胞購自上海麥沙生物科技有限公司、大
腸桿菌DH5oc購自北京天根生化科技公司，pMD18-T購自TakaRa公司， pcDNA3.1購自Invitrogen公司。
2. 試齊U:抗人HGFA單抗、抗人HGF單抗購自R&D公司；抗His單 抗購自Chemicon公司；抗人Fc單抗購自Sigma公司；pro-HGF蛋白制品 和Recombinant Human HAI-1購自R&D公司；Lipofectamine 2000、 FBS和 DMEM為Invitrogen公司產(chǎn)品；N產(chǎn)層析樹脂購自Qiagen公司；PVDF硝 酸纖維素膜和Ap顯色試劑盒購自Bio-Rad公司；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺和 TEMED購自Sigma公司；9cm細(xì)胞培養(yǎng)皿購自Corning公司；Xho I和Hind III內(nèi)切酶為TakaRa公司產(chǎn)品；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche公司；其它 試劑均為分析純試劑。
實(shí)施例1:重組人源HGFA-Fc融合蛋白的制備
用RT-PCR從肝組織cDNA文庫釣取HGFA活性區(qū)域DNA片段(Gene ID:3083， 1104bp 1962bp)大小為858bp，通過Overlap重疊PCR (參見 曹陽等，《河北醫(yī)藥》2005第27巻第11期)與人免疫球蛋白Fc (Gene ID:2209) 693bp片段融合，獲得1575bp HGFA-Fc片段，Xho I/Hind III雙 酶切克隆到pcDNA3.1(+)載體。酶切鑒定正確后大量抽提、純化、測定濃度 后備用。具體步驟如下 一、重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HGFA-Fc的構(gòu)建
1. 擴(kuò)增HGFA-Fc嵌合基因的引物合成
根據(jù)基因文庫確定人源HGFA基因(ID: 3083)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增其中人 源HGFA基因1102bp 1965bp范圍，相應(yīng)的氨基酸起止序列為368-655。 Up5, :GC4 GC7TCTCACCAGAGTCCAACTGT3,
中間引物
Mup: ggagggagccacaagaaaactcacacatgc Mdown: cctccctcggtgttcttttgagtgtgtacg Down 5，-ATC7Ua4G TATTATCATT TACCCGGA-3'
2. RNA提取和檢測取人的新鮮肝組織(可以是血管瘤的肝切標(biāo)本)50-100mg，采用 Invitrogen Fast Track Kit (Invitrogen公司)提取RNA ，采用1.0%-1.5%甲醛 變性Agarose膠電泳，檢測RNA質(zhì)量。
3. RT-PCR擴(kuò)增目的基因
3.1 采用TaKaRaRT-PCR試劑盒合成cDNA文庫，反應(yīng)結(jié)束后于95"C 加熱5min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。
3.2 PCR擴(kuò)增靶基因片斷
采用重疊延伸剪切技術(shù)經(jīng)兩次PCR獲得嵌合基因片段HGFA-Fc。
(1) 第一次PCR擴(kuò)增用引物Up與中間引物Mup，以cDNA為摸板 擴(kuò)增HGFA成熟肽858bp，以Mdown 、 Down為引物，以含有人Fc片段 基因的pCMVsFc質(zhì)粒(pCMVsFc質(zhì)粒由休斯頓Baylor大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞和 基因治療中心副教授陳思毅博士惠贈)為摸板擴(kuò)增。
(2) 第二次PCR擴(kuò)增分別以第一次PCR產(chǎn)物為摸板，以引物Up， Mdown為引物擴(kuò)增嵌合基因片段HGFA-Fc片段。
4. pMD18-HGFA-Fc載體的構(gòu)建及測序
4.1采用Takara T4 DNA ligase于16度連接過夜，將HGFA-Fc嵌合片 段連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建pMD18-HGFA-Fc載體。
4.2將連接液涂布于氨芐抗性LB固體培養(yǎng)基平板，置于37度培養(yǎng) 12-16h。
4.3挑取轉(zhuǎn)化子用PCR法鑒定，陽性克隆會有1576bp大小片斷擴(kuò)增 出；鑒定后再挑取同一菌斑置于液體LB培養(yǎng)基過夜，收集菌液并抽取質(zhì)粒， 即為pMD18-HGFA-Fc。
4.4重組質(zhì)粒酶切鑒定用Takara Xho I/Hind III雙酶切，陽性克隆會 有1576bp大小片斷被切下；陰性克隆無此片斷放出。
4.5將陽性克隆進(jìn)行DNA測序(上海生工生物工程技術(shù)公司測序)， 確定其沒有堿基突變或者堿基缺失。測序結(jié)果，如SEQIDNO:3所示。
5. 真核表達(dá)載體pcDNA3.1 -HGFA-Fc的構(gòu)建及鑒定
將HGFA-Fc克隆到pcDNA3.1表達(dá)載體上采用Takara Xho I/Hind III 雙酶切，Qiagen Gel Extraction kit (Qiagen公司)割膠回收，Takara T4 DNA ligase連接，連接液涂布于氨芐抗性LB固體培養(yǎng)基平板，PCR法篩選陽性 重組子并酶切鑒定。構(gòu)建的表達(dá)載體pcDNA3.1-HGFA-Fc酶切鑒定結(jié)果見圖1。 Xho I/Hind III雙酶切可獲得1.6kb DNA片段，表明1575bp HGFA-Fc片段已經(jīng)克隆進(jìn) 入pcDNA3.1(+)載體。
6.真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HGFA-Fc制備
將pcDNA3.1-HGFA-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)化五co.// Top 10，接種于10ml試管培養(yǎng) 過夜，再轉(zhuǎn)接于500ml三角搖瓶中，37度培養(yǎng)8h，收集菌液。采用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit ( Qiagen公司)純化pcDNA3.1 -HGFA-Fc ，去除
內(nèi)毒素等雜質(zhì)，用于下步細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
二、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
人腎293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37"C、 5%(302,飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 將上述構(gòu)建好的pcDNA3.1-HGFA-Fc禾n pcDNA3.1(+)空載體按照 Lipofectamine 2000試劑說明轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。
三、 HGFA-Fc表達(dá)產(chǎn)物的純化
轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)36h，待細(xì)胞密度為80% 90%時用預(yù)冷的PBS洗兩 次，細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，4'C離心5min，冰浴下于RIPA緩沖液(50mM Tris.HCl， pH7.4， l%NP-40， 0.25%脫氧膽酸鈉，150mMNaCl， lmMEDTA， 0.5%蛋白酶抑制劑Cocktail)中裂解，4°C 12000g離心15min，收集上清液。 上清液上樣于平衡好的N產(chǎn)柱，用含有100 mM咪唑的緩沖液洗脫收集目的 蛋白質(zhì)，將純化好的HGFA-Fc融合蛋白在20mM Hepes pH7.5、 150mM NaCl、 5mMCaCl2中4"C透析過夜，分裝成小份用于Western blot檢測、酶 活性以及抗肝細(xì)胞凋亡測定。
四、 HGFA-Fc表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)活性的鑒定 BCA蛋白定量試劑盒(購自上海業(yè)力生物科技公司)進(jìn)行蛋白濃度測
定，取20ug總蛋白上樣于10% SDS-PAGE，濕法在110mA恒流條件將蛋白 質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將膜在PBST(含0.1% Tween 20的PBS)5。/。脫脂 奶粉中4。C封閉過夜，室溫一抗結(jié)合1.5h,用PBST洗膜三次，每次10min, 室溫二抗結(jié)合lh,再用PBST洗膜三次，每次10min,加入Ap顯色試劑盒反 應(yīng)1 3min。
將pcDNA3.1-HGFA-Fc轉(zhuǎn)染人的293細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)36h，收集細(xì)胞 提取總蛋白。經(jīng)N產(chǎn)柱層析法純化重組HGFA-Fc片段，純化蛋白產(chǎn)物經(jīng)10%
9SDS-PAGE電泳鑒定，主要在62kD處顯單一蛋白條帶，見圖2。
上述純化蛋白用Western blot法(WB)鑒定HGFA-Fc的特異表達(dá)。結(jié) 果顯示，從轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-HGFA-Fc質(zhì)粒的293細(xì)胞中提取的蛋白，經(jīng) 蛋白純化后，其62kD的重組蛋白可以與抗人HGFA抗體及抗人IgG抗體 發(fā)生特異性反應(yīng)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空白載體的細(xì)胞中無rhHGFA-Fc重 組蛋白表達(dá)，見圖3。
實(shí)施例2: rhHGFA-Fc重組融合蛋白的酶切活性及抗肝細(xì)胞凋亡作用
一、 HGFA-Fc激活pro-HGF酶活性的檢測
在終濃度為50ug/ml的pro-HGF反應(yīng)緩沖液中，分別加入HGFA-Fc濃 度梯度為0,15ug/ml， 0.3ug/ml， 0.6ug/ml， 0.12ug/ml， 0.24ug/ml， 4.8ug/ml， 反應(yīng)lh后Western blot檢測各反應(yīng)體系中proHGF(92kD)和HGF(62kD)表達(dá) 情況。結(jié)果顯示，rhHGFA-Fc重組蛋白可以將pro-HGF酶切為a鏈和P鏈， 且酶活性隨rhHGFA-Fc濃度增加而增強(qiáng)，結(jié)果見圖4。經(jīng)計(jì)算，該重組蛋 白的IC50酶活性值為20nM。
在濃度為50ug/ml的pro-HGF溶液中，加入終濃度為2.4ug/ml的 HGFA-Fc融合蛋白，和終濃度分別為0.5uM、 2uM和8uM的HAI-1共同 孵育lh。 Western blot檢測顯示2uM以上的HAI-1可以完全抑制HGFA-Fc 的酶切活性，進(jìn)一步證實(shí)融合HGFA-Fc具有較強(qiáng)的生物學(xué)特異性。見圖5。
二、 HGFA-Fc蛋白介導(dǎo)的抗肝細(xì)胞凋亡
人源肝細(xì)胞株HL-7702 (來源于美國ATCC,購自上海中科院細(xì)胞所) 培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照5><105個/孔接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37°C、 5%C02, 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度2.4ug/ml的HGFA-Fc、 50ug/ml的pro-HGF;陰性對照組只加入50ug/ml的pro-HGF;空白對照組 不加入任何蛋白制品。繼續(xù)培養(yǎng)12h，實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組分別加入終濃度 60uM的順鉑，培養(yǎng)24h收集細(xì)胞，固定并進(jìn)行Annexin V/PI雙染色，進(jìn)行 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞早期凋亡率4.8% (Annexin V+/ PI-)，陰性對照組細(xì)胞早期凋亡率為25.1%，空白對照組細(xì)胞早期凋亡率 3.3%。表明rhHGFA-Fc通過激活pro-HGF為HGF，發(fā)揮其抗肝細(xì)胞凋亡作 用見圖6。
四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化肝損模型(5y。四氯化碳/橄欖油(v/v)， 3次/
10周灌胃，共8周，劑量為20ml/kg體重)，模型鼠隨機(jī)分為對照組(尾靜脈注射0.5ml生理鹽水，1次/天，共7天)和實(shí)驗(yàn)組(尾靜脈注射0.2ug/0.5mlHGFA-Fc蛋白，l次/天，共7天)， 一周后處死小鼠取全血和肝臟。肝組織浸泡于福爾馬林液中，制備石蠟切片進(jìn)行細(xì)胞凋亡的免疫組化檢測(TUNEL試劑盒購于美國Chemicon公司)DAB顯色。結(jié)果顯示rhHGFA-Fc治療組肝細(xì)胞凋亡明顯少于對照組，表明rhHGFA-Fc可以介導(dǎo)抗肝細(xì)胞凋亡作用見圖7。SEQUENCE LISTING
〈110〉上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院〈120〉重組人源HGF激活因子及其應(yīng)用〈130〉說明書，權(quán)利要求書〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211〉 858
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈400〉 1
ctcaccagag tccaactgtc accggatctc ctggcgacccgggcgccagg cctgcggc已g gaggcac犯g a卿gg已cgtggcggctcct cctcgctgcc cggctcgcac ccctggctggagcttctgcg ccgggagcct ggtccacacc tgctgggtggtcccacagcc cccccaggga cagcgtctcc gtggtgctggacgacgg已cg tgacgcagac cttcggcatc gagaagtacagtgttcaacc ccagcgacca cgacctcgtc ctgatccggctgtgccacac gctcgcagtt cgtgcagccc atctgcctgccccgcaggac acaagtgcca gattgcgggc tggggccacttactccagct ccctgcggga ggccctggtc cccctggtcgcctgaggtct acggcgccga catcagcccc aacatgctctaagtccgacg cctgccaggg ggactc鄉(xiāng)g gggcccctgg
tgcctgagcc agcctccccg 60
tcctgcggcc acgtatcatc 120
ccgccatcta catcggggac 180
tgtcggccgc ccactgcttc 240
gccagcactt cttcaaccgc 300
tcccgtacac cctgtactcg 360
tg已a(bǔ)gaaga已a(bǔ)ggggaccgc 420
ccgagcccgg cagcaccttc 480
tggatgagaa cgtgagcggc 540
CCg￡LCCetC￡L￡L gtgCElgCELgC 600
gtgccggcta cttcgactgc 660
cctgcgagaa gaacggcgtg 720
12gcttacctct acggcatcat
gtctacaccc gcgtggccaa
cggcttgtgg ctccctcc
〈210〉 2〈211〉 693〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 2ccca犯tctt gtgacaa犯c
ggaccgtcag tcttcctctt
cctgaggtca certgcgtggt
tggtacgtgg acggcgtgga
aacagcacgt accgtgtggt
aagg3gtaca agtgc犯ggt
tccaaagcca aagggcagcc
gagctgacca agaaccaggt
atcgccgtgg agtggg卿g
gtgctggact ccgacggctc
tggcagcagg gg咖gtctt
acgcagaaga gcctctccct
cagctggggt gacggctgcg ggcggctcca caagccgggg 780ctatgtggac tggatc犯cg accggatacg gcctcccagg 840
858
tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 60
ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 120
ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 180
ggtgcataat gccaag已caa agccgcggga ggagcagtsc 240
cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 300
ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 360
ccgagaacca csggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 420
cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 480
caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 540
cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660
gtctccgggt aaa
693
13〈210〉 3〈211> 1575〈212〉 DNA〈213> 人工序列<220〉
〈221〉 CDS
〈222> (1)..(1575)
〈223〉
<400〉 3
atg etc acc aga gtc caa ctg tea ccg gat etc ctg gcg ace ctg cct 48Met Leu Thr Arg Val Gin Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro15 10 15
gag cca gccGlu Pro Ala
tec ccgSer Pro20
gggGly
cgc
cagGin
gccAla25
tgcCys
ggcGly
aggArg
鄉(xiāng)Arg
cacHis30
幼gLys
卿Lys
96
agg acg ttc ctg egg cca cgt ate ate ggc ggc tec tec teg ctg ccc 144Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg lie lie Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro35 40 45
ggc teg cac ccc tgg ctg gcc gcc ate tac ate ggg gac age ttc tgc 192Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala lie Tyr lie Gly Asp Ser Phe Cys50 55 60
gcc ggg age ctg gtc cac acc tgc tgg gtg gtg teg gcc gcc cac tgc 240Ala Gly Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys65 70 75 80
ttc tec cac age ccc ccc agg gac age gtc tec gtg gtg ctg ggc cag 288Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gin85 90 95
cac ttc ttc aac cgc acg acg gac gtg acg cag acc ttc ggc ate gag 336His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gin Thr Phe Gly lie Glu100 105 110aag tacLys Tyr
atelie115
ccgPro
tacTyr
a_ccThr
ctgLeu
tacTyr120
tegSer
gtgVal
ttcPhe
Asn
cccPro125
ageSer
gacAsp
cacHis
384
gac etcAsp Leu130
gtcVal
ctgLeu
atelie
eggArg
ctgLeu135
肪gLys
sagLys
Lys
gggGly
gacAsp140
cgcArg
tgtCys
gccAla
Thr
432
cgc tegArg Ser145
cagGin
ttcPhe
gtgVal
cagGin150
cccPro
atelie
tgcCys
ctgLeu
cccPro155
g3g
Glu
cccPro
ggcGly
ageSer
3CC
Thr160
480
ttc cccPhe Pro
gC3
Ala
Gly
C3C
His165
肪gLys
tgcCys
C8g
Gin
attlie
gcgAla170
ggcGly
tggTrp
ggcGly
C3C
His
ttgLeu175
g3tAsp
528
g觀朋cGlu Asn
gtgVal
3gC
Ser180
ggcGly
tacTyr
tecSer
3gC
Ser
tecSer185
ctgLeu
eggArg
gagGlu
gccAla
ctgLeu190
gtcVal
cccPro
576
ctg gtcLeu Val
gccAla195
gacAsp
cacHis
肪gLys
tgcCys
ageSer200
Ser
cctPro
g恥Glu
gtcVal
tacTyr205
ggcGly
gccAla
g3C
Asp
624
ate agelie Ser210
cccPro
Asn
atgMet
etcLeu
tgtCys215
gccAla
ggcGly
tacTyr
ttcPhe
gacAsp220
tgcCys
aa_gLys
tecSer
g3C
Asp
672
gcc tgcAls Cys225
C3g
Gin
gggGly
gacAsp
teaSer230
gggGly
gggGly
cccPro
ctgLeu
gccAla235
tgcCys
gagGlu
肪gLys
sacAsn
ggcGly240
720
gtg getVal Ala
tacTyr
etcLeu
t￡LC
Tyr245
ggcGly
atelie
atelie
ageSer
tggTrp250
Gly
gacAsp
ggcGly
tgcCys
gggGly255
eggArg
768
15etc cac aag ccg ggg gtc tac acc cgc gtg gcc aac tat gtg gac tgg 816Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp260 265 270
ate aac gac egg ata egg cct ccc agg egg ctt gtg get ccc tec gga 864lie Asn Asp Arg lie Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser Gly275 280 285
tec gca gga gtc gca acc ccc aaa tct tgt gac aeta act cac aca tgc 912Ser Ala Gly Val Ala Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys290 295 300
cca ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg tea gtc ttc ctc 960Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu305 310 315 320
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tec egg acc cct gag 1008Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu325 330 335
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag 1056Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys340 345 350
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg c已t aat gcc aag aca犯g 1104Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys355 360 365
ccg egg gag gag cag tac犯c age acg tac cgt gtg gtc age gtc etc 1152Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu370 375 380
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 1200Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys385 390 395 400
16gtc tec aac aaa gcc etc cca gcc ccc ate gag aaa acc ate tec aaa 1248
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys
405 410 415
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac ace ctg ccc cca tec 12%
Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 420 425 430
egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 1344
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 435 440 445
ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gsg age aat ggg cag 1392
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 450 455 460
ccg gag aac aac t已c已a(bǔ)g acc已cg cct ccc gtg ctg gac tec gac ggc 1440
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
465 470 475 480
tec ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag age agg tgg cag 1488
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin
485 490 495
cag ggg aac gtc ttc tea tgc tec gtg atg cat gag get ctg cac aac 1536
Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 500 505 510
cac tac acg cag aag age etc tec ctg tct ccg ggt aaa 1575
His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 520 525
〈210〉 4 〈211〉 525 〈212〉 PRT〈213>人工序列 〈400> 4
Met Leu Thr Arg Val Gin Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Pro Gly Arg Gin Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys 20 25 30
Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg lie lie Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro 35 40 45
Gly Ser His Pro Trp Leu Ala Ala lie Tyr lie Gly Asp Ser Phe Cys 50 55 60
Ala Gly Ser Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys 65 70 75 80
Phe Ser His Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gin 85 90 95
His Phe Phe Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gin Thr Phe Gly lie Glu 100 105 110
Lys Tyr lie Pro Tyr Thr Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His 115 120 125
Asp Leu Val Leu lie Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asp Arg Cys Ala Thr 130 135 140
Arg Ser Gin Phe Val Gin Pro lie Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr 145 150 155 160
Phe Pro Ala Gly His Lys Cys Gin lie Ala Gly Trp Gly His Leu Asp 165 170 175
18Leu Val Ala Asp His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp 195 200 205
lie Ser Pro Asn Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp 210 215 220
Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly 225 230 235 240
Val Ala Tyr Leu Tyr Gly lie lie Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg 245 250 255
Leu His Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp 260 265 270
lie Asn Asp Arg lie Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser Gly 275 280 285
Ser Ala Gly Val Ala Thr Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 290 295 300
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 305 310 315 320
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 325 330 335
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 340 345 350
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 355 360 365Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 370 375 380
Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 385 390 395 400
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys 405 410 415
Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 420 425 430
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 435 440 445
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 450 455 460
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 465 470 475 480
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 485 490 495
Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 500 505 510
His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 515 520 525
20
權(quán)利要求
1、一種重組人源性肝細(xì)胞生長因子激活因子，其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
2、 一種如權(quán)利要求1所述的重組人源性肝細(xì)胞生長因子激活因子在制備治 療急性或亞急性重癥肝炎肝細(xì)胞壞死的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。肝細(xì)胞生長因子激活因子是一種肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白，活化的HGFA是一條33Kd多肽，僅分布于受損的組織器官，可以在受損局部將肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的單體肝細(xì)胞生長因子活化為HGF，在受損組織器官局部發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)和組織修復(fù)作用。急、慢性肝功能衰竭以大面積肝細(xì)胞凋亡壞死、肝細(xì)胞再生功能抑制為主要病理特征。臨床表現(xiàn)兇險(xiǎn)，由于缺乏有效的救治手段，患者死亡率高達(dá)70-90％。本發(fā)明提供了一種重組人源性HGF激活因子，其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，可用于制備治療急性或亞急性重癥肝炎肝細(xì)胞壞死的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/12GK101649320SQ200910195670
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者強(qiáng) 夏, 峰 薛 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院