一管式檢測突變位點的不同突變類型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基于我公司的發(fā)明德歌等溫擴增技術(shù)（專利申請?zhí)枺?01210474669.5）實現(xiàn)一管式檢測不同突變位點的不同突變類型（也包括同一突變位點的不同突變類型）的方法或理論，檢測基因突變就要將覆蓋突變點的引物設(shè)計到結(jié)構(gòu)上的必要引物片段上，從而實現(xiàn)一管式檢測不同突變位點的不同突變類型（也包括同一突變位點的不同突變類型）。
【專利說明】一管式檢測突變位點的不同突變類型
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一管式共用引物法檢測不同突變位點不同突變類型(也包括同一突變位點的不同突變類型)，此發(fā)明可以應(yīng)用于等溫擴增檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，也可以應(yīng)用于PCR檢測等領(lǐng)域，檢測結(jié)核桿菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒等基因突變或耐藥檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]目前在行業(yè)應(yīng)用最廣范的耐藥檢測是藥敏實驗和基因芯片技術(shù)，藥敏實驗耗時太長，基因芯片雖然能實現(xiàn)高通量檢測但是制備成本及檢測費用均較昂貴，靈敏度低，不宜大面積推廣。因此急需一種檢測成本低、靈敏度高切實可行的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種同時一管式檢測不同突變位點不同突變類型(也包括同一突變位點的不同突變類型)的核酸擴增檢測方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:依據(jù)我們公司的德歌等溫擴增核心反應(yīng)結(jié)構(gòu)(見附圖1)，引物Ftl為變值，兩個Ftl可以是同值也可以是不同值，但不能產(chǎn)生二聚體的任何引物片段(當(dāng)然也可以是O值，即沒有F。)，為提高反應(yīng)效率F?？梢栽O(shè)為目標(biāo)DNA擴增區(qū)段內(nèi)片段。
[0005]1、一管式共用引物法檢測同一突變位點的不同突變類型:
突變點可以設(shè)計到引 物B或A上，如果設(shè)計到引物B上，為提高反應(yīng)效率只能在Ac區(qū)兩端加入其它引物(見附圖2)，當(dāng)然為了加快反應(yīng)可以加入更多的引物，前提是不能引起二聚體，而不能在DNA的B。區(qū)再加入其它引物結(jié)構(gòu)，要保證引物B是反應(yīng)的必要引物片段(也就是沒有引物B，擴增反應(yīng)不可能發(fā)生)。為了加快反應(yīng)H)可以取反應(yīng)區(qū)段的DNA片段，如A片斷。當(dāng)然也可以個別取A值，個別取O值。
[0006]如果DNA片斷B兩側(cè)仍有其它突變位點，而且相距很近，無法保證引物B的特異性，就如同我們權(quán)利要求5中的情況，要保證引物A及為加快反應(yīng)另外加入的引物的特異性，通過聯(lián)合保證特異性的方法保證特異性。也就是引物B的對向引物特異性保證了，此結(jié)構(gòu)只能和目標(biāo)DNA擴增，前提是引物B不能和反應(yīng)區(qū)段內(nèi)的其它DNA位點吻合，而和目標(biāo)DNA以外的DNA片段吻合卻不會引發(fā)擴增反應(yīng)。以上就是我們檢測同一突變位點的不同突變類型及聯(lián)合保證特異性的核心理念。
[0007]具體的引物設(shè)計可以參考我們的另一個專利(申請?zhí)?201210474669.5):一管式共用引物法檢測同一突變位點的不同突變類型，此處共用引物就是非覆蓋突變位點的引物。
[0008]2、一管式檢測不同突變點位點的不同突變類型:
我們假定同時檢測結(jié)核分枝桿菌516、526、531三個突變位點，突變類型如下:D516V (A — T)、D516G(A — C)、H526Y(C — T)、H526D (C — G)、S531L(C — T)、S531W(C — G)，這幾種突變都會導(dǎo)致利福平耐藥，我們無須確定基因突變是以上哪種類型，只要檢測出以上一種突變存在即可檢測出利福平耐藥，那么引物結(jié)構(gòu)設(shè)計(見附圖3)，其中BI為覆蓋531突變位點引物，B2為覆蓋526突變位點引物，B3為覆蓋516突變位點引物，如圖的引物結(jié)構(gòu)，如果516、526、531均未突變，這個結(jié)構(gòu)就不會發(fā)生擴增反應(yīng)，如果有一點突變和設(shè)計引物吻合，就會發(fā)生擴增反應(yīng)，就可以判斷有基因突變，利福平耐藥，這樣一管就可以實現(xiàn)是否有基因突變的檢測，當(dāng)然為了加速反應(yīng)，還可以在3’ -5’ AC側(cè)加入對應(yīng)引物(見附圖4)，以加快解鏈和合成鏈的作用，原理同上，應(yīng)不能在覆蓋突變位點側(cè)加入其它引物，以保證此側(cè)為必要反應(yīng)條件。
[0009]本發(fā)明以我們公司發(fā)明的德歌等溫擴增系列新方法(專利申請?zhí)?201210474669.5)為基礎(chǔ)，單獨針對一個突變點而言，主要目的是保證覆蓋突變點引物為必要反應(yīng)條件為原理，從而實現(xiàn)了一管式同時檢測不同突變位點的不同突變類型，所有的引物結(jié)構(gòu)仍依托于德歌等溫擴增的核心反應(yīng)結(jié)構(gòu)，只是在核心反應(yīng)結(jié)構(gòu)上的變通，專業(yè)人士應(yīng)該明白，任何其它的變通形式均在我們核心結(jié)構(gòu)的保護范圍。
[0010]3、引物設(shè)計實例
將覆蓋突變點的引物和對向引物中的H)均設(shè)計成引物A為保證C和G的含量并在5’端加入了兩個T
D516V (A — T)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGAGCCAATTCATGGT
D516G (A — C)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGAGCCAATTCATGGC
H526Y (C — T)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGTCGGGGTTGACCT
H526D (C — G)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGTCGGGGTTGACCG
S531L(C — T)引物:TTCACGCTCACGTGACAGA`CCAAGCGCCGACTGTT
S531ff(C — G)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACCAAGCGCCGACTGTG
共用引物 A-A:TTCACGCTCACGTGACAGACCACGCTCACGTGACAGAC
用我公司專利(專利號201210380093.6)中的2號指示劑反應(yīng)陽性和陰性見附圖5。
[0011]4、本發(fā)明的有益的積極效果:
WHO 2009年報告全球新發(fā)結(jié)核病440萬，其中多耐藥結(jié)核為42萬，廣泛耐藥結(jié)核占多耐藥結(jié)核的10% ;我國調(diào)查顯示初治結(jié)核耐藥率為10%左右，復(fù)治結(jié)核患者耐藥率高達35%以上。耐藥結(jié)核已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。南非一組53名艾滋病合并耐藥結(jié)核患者，死亡52名，其中70%在30天內(nèi)死亡；耐藥結(jié)核治療與患者管理十分困難，治療費用遠遠高于普通結(jié)核，同時由于人口流動，耐藥結(jié)核患者難于發(fā)現(xiàn)，管理存在盲區(qū)，對社會人群造成嚴(yán)重威脅。不僅在肺結(jié)核領(lǐng)域，在乙肝治療中，也出現(xiàn)耐藥，乙肝(乙型病毒性肝炎)耐藥性主要是指體內(nèi)乙肝(乙型病毒性肝炎)病毒發(fā)生變異，導(dǎo)致起初選擇的乙肝(乙型病毒性肝炎)治療藥物不再發(fā)揮任何的治療功效。還有艾滋病領(lǐng)域都出現(xiàn)了類似問題。那么開發(fā)一種簡單快速、靈敏度高的檢測方法迫在眉睫，本技術(shù)為檢測耐藥找到了一種切實可行的方法。
[0012]本發(fā)明專利內(nèi)容采用我公司發(fā)明的等溫擴增技術(shù)對不同突變點不同突變類型進行檢測(也包括同一突變位點的不同突變類型)，檢測敏度更高，檢測時間短、操作簡便、同時又可以實現(xiàn)高通量檢測，不但適合大醫(yī)院使用也可以在中小醫(yī)院使用，對肺結(jié)核感染提供了快速的分子診斷。同時，它也可以對多種在耐多種藥物型結(jié)核病、乙肝病、艾滋病等患者中最為常見的基因突變進行檢測，疾病耐藥的早期診斷有助于即時對患者實施高強度的治療方案，從而有助于控制疾病的傳播。[0013]最后應(yīng)說明的是:以上實施例僅用于說明而非限制本發(fā)明的應(yīng)用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:本發(fā)明也可用于其他的核酸等溫擴增及產(chǎn)物檢測，包括但不限于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、PCR、滾環(huán)擴增、依賴解旋酶的等溫擴增、鏈替代擴增、切刻內(nèi)切酶核酸等溫擴增；同時，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解:可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求保護范圍中。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為設(shè)計核心結(jié)構(gòu)；
圖2為提高反應(yīng)效率增加其它引物結(jié)構(gòu)；
圖3為一管式檢測不同突變位點的不同突變類型引物設(shè)計結(jié)構(gòu)舉例；
圖4為提高反應(yīng)效率增加其它引物結(jié)構(gòu)；
圖5為 可視化指示劑陽性及陰性顏色對比結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.基于我公司德歌等溫擴增技術(shù)(專利申請?zhí)?201210474669.5)的核心反應(yīng)結(jié)構(gòu)三(見說明書)，實現(xiàn)一管式檢測同一突變位點的不同突變類型，將突變點設(shè)計到結(jié)構(gòu)中必要的引物片段上，同時根據(jù)結(jié)構(gòu)三的變通形式實現(xiàn)一管式檢測不同突變位點的不同突變類型。
2.根據(jù)權(quán)利I要求我們保護的是我們檢測突變的引物設(shè)計結(jié)構(gòu)(見說明書)，包括在此結(jié)構(gòu)上的任何變通形式，無論在非覆蓋突變引物側(cè)加入幾個引物或加入任何引物結(jié)構(gòu)，這些都是我們專利的保護范圍，當(dāng)然這些所有的結(jié)構(gòu)在我們(專利申請?zhí)?201210474669.5)中已經(jīng)提請保護，在此我們只是公開檢測突變的應(yīng)用方法。
3.本專利的核心是覆蓋突變點的引物側(cè)所有的引物都是必要引物，而不能加入其它引物結(jié)構(gòu)，如果DNA中不存在設(shè)計突變位點的突變類型對應(yīng)此種突變類型的擴增反應(yīng)不會發(fā)生，只要目標(biāo)DNA中只要有與設(shè)計的突變類型吻合的突變位點那么理論上將發(fā)生擴增反應(yīng)，我們一管式檢測不同突變類型不是要確定其中存在哪種突變類型，而是要確定只要存在設(shè)計突變類型當(dāng)中的一種，即證明一種或幾種藥耐藥。
4.針對幾個基因突變位點過近導(dǎo)致引物長度無法保證情況下的引物設(shè)計，覆蓋突變點的引物可以適當(dāng)縮短，可以短到失去特異性，但覆蓋突變點引物設(shè)計不能短到和目標(biāo)DNA反應(yīng)區(qū)段其它位點堿基吻合，那么可以通過聯(lián)合保證特異性的方法，覆蓋突變的引物可以不具有特異性，非覆蓋突變點的對向引物特異性必須保證，那么非覆蓋突變點的對向引物只有聯(lián)合覆蓋突變點的引物才能發(fā)生擴增反應(yīng)，因為具有特異的非覆蓋突變點引物只能和目標(biāo)DNA發(fā)生擴增反應(yīng)，從而保證了整個反應(yīng)的特異性，也就是說如果引物設(shè)計中有一條引物失去了特異性，但聯(lián)合卻具備特異性也在本專利的保護范圍(不限于檢測基因突變)。
5.此類結(jié)構(gòu)也可以應(yīng)用于其它方式的核酸擴增均在本專利保護范圍。
6.此方法 主要應(yīng)用于各種突變耐藥基因(如肺結(jié)核、乙肝、艾滋病等)的檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK103865982SQ201210532462
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月12日
【發(fā)明者】曲海濤, 王德國, 張文超 申請人:哈爾濱德歌生物科技有限公司