一種預(yù)測(cè)他汀類藥物療效和安全性的基因突變檢測(cè)芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種預(yù)測(cè)他汀類藥物療效和安全性相關(guān)基 因突變檢測(cè)芯片。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物是一種羥甲戊二酰輔酶A (HMG-CoA)還原酶抑制劑，廣泛用于心血管 疾病的降脂治療。具有調(diào)脂作用強(qiáng)、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)。但是，他汀類藥物無(wú)論是在控制血脂 水平還是不良反應(yīng)方面，不同個(gè)體之間存在著顯著差異。當(dāng)他汀類藥物與貝特類降脂藥合 用時(shí)可造成個(gè)別患者的橫紋肌溶解而導(dǎo)致死亡。目前，臨床上對(duì)他汀類藥效和安全性的評(píng) 估主要還是依靠經(jīng)驗(yàn)，即在患者服藥后再進(jìn)行評(píng)估。因此，找出這些差異以及改變目前傳統(tǒng) 的用藥方案，不但可以安全有效的用藥，而且具有極大的經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值。
[0003] 生物芯片是通過(guò)縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域 中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì) 胞、蛋白質(zhì)、基因及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。
[0004] 目前用于突變檢測(cè)的大多是序列特異性探針雜交法（SSOP)基因芯片技術(shù)，該種 技術(shù)利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特點(diǎn)，對(duì)發(fā)生突變的眾多基因設(shè)計(jì)序 列特異性的寡核苷酸探針，將這些探針固定于同一張基片上，將待測(cè)的包含突變位點(diǎn)的基 因片段進(jìn)行體外擴(kuò)增后與芯片雜交，根據(jù)雜交的信號(hào)判斷突變位點(diǎn)的基因型。這種方法的 基本原理是與基因特定序列互補(bǔ)的一段序列特異性寡核苷酸探針對(duì)基因序列的特異性識(shí) 另Ij。當(dāng)探針的序列與基因序列完全匹配時(shí)所形成的雜交體熱穩(wěn)定性高于含有錯(cuò)配堿基的雜 交體，據(jù)此通過(guò)控制雜交溫度和其他雜交條件可以使完全匹配的雜交體與含有錯(cuò)配堿基的 雜交體區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而達(dá)到基因分型的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在為服用他汀類藥物的患者中進(jìn)行療效和安全性個(gè)體化差異的預(yù)測(cè)。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0007] -種預(yù)測(cè)他汀類藥物療效和安全性相關(guān)的基因突變檢測(cè)芯片，包括固相基片和 點(diǎn)載在固相基片上的基因探針陣列；所述基因探針是與他汀類藥物療效和安全性相關(guān) 的寡核苷酸序列；所述藥物療效和安全相關(guān)的基因突變位點(diǎn)是CYP3A4*lG(rs2242480)、 CYP3A5*3C(rs776746)、CYP3APl*3(rs2177180)和 SLC01Bl*5(rs4149056)。所述 CYP3A4、 CYP3A5、CYP3AP1 和 SLC01B1 的序列如 SEQ ID NO. 1-4 所示。
[0008] 其中，所述基因探針包括野生型基因探針和突變型基因探針，基因探針長(zhǎng)度為 18-22bp,所述基因探針包括：
[0009] CYP3A4*lGrs2242480 野生型探針 5 ' -tggtacatggagaaggagg-3 '
[0010] (SEQ ID NO. 5)
[0011] CYP3A4*lGrs2242480 突變型探針 5 ' -cctccttctccatgtatcatcc-3 '
[0012] (SEQ ID NO. 6)
[0013] CYP3A5*3Crs776746 野生型探針 5 ' -agtatctcttccctgtttg-3 '
[0014] (SEQ ID NO. 7)
[0015] CYP3A5^3Crs7767A6 突變型探針 5 ' -ccaaacagggaagagatattga-3 '
[0016] (SEQ ID NO. 8)
[0017] CYP3APl*3rs2177180 野生型探針 5 ' -cagccccgcctccttctc-3 '
[0018] (SEQID NO. 9)
[0019] CYP3APl*3rs2177180 突變型探針 5 ' -ctggagaaggaggtggggctgc-3 '
[0020] (SEQ ID NO. 10)
[0021] SLC01Bl*5rs4149056 野生型探針 5 ' -gcatattacccatgaacac-3'
[0022] (SEQ ID NO. 11)
[0023] SLC01Bl*5rs4149056 突變型探針 5 ' -gcgttcatgggtaatatgc-3 '
[0024] (SEQ ID NO. 12)
[0025] 所述基因探針還包括：
[0026] 陽(yáng)性參照探針：5' -atatgcttcgtggaatagggga-3' （SEQ ID NO. 13)
[0027] 陰性參照探針：5' -gagcatgcctttattgtaaccc-3' （SEQ ID NO. 14)
[0028] 所述固相基片可采用硅片、玻璃片、塑料片、尼龍膜等固相介質(zhì)中的一種或他們的 任意組合。
[0029] 為提1?探針與基片結(jié)合的效率和檢測(cè)靈敏度，所述探針和基片可作進(jìn)一步修飾和 包被。如其基片表面處理方式可為多聚賴氨酸包被、瓊脂糖包被、氨基或醛基化修飾。
[0030] 本發(fā)明的芯片包括承載基片和在基片上呈陣列式分布的多種基因探針，基因探針 含有預(yù)測(cè)他汀類藥物療效和安全性相關(guān)基因突變位點(diǎn)的互補(bǔ)寡核苷酸序列。目前的研究結(jié) 果顯示這些突變位點(diǎn)在人群中的發(fā)生頻率較高，且對(duì)他汀類藥物反應(yīng)有明顯影響。此外，出 于芯片質(zhì)量控制的要求，芯片上基因探針可設(shè)置陽(yáng)性和陰性參照探針。每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)野生 型和突變型兩種探針，其長(zhǎng)度為18-22bp。
[0031] 本發(fā)明的芯片制造方法是：根據(jù)所需檢測(cè)的基因位點(diǎn)附近的堿基序列，每個(gè)突變 位點(diǎn)設(shè)計(jì)野生型和突變型兩種探針，并設(shè)置陽(yáng)性和陰性參照探針，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度范圍18_22bp， 使用DNA序列合成儀合成探針，用點(diǎn)樣裝置將探針按一定的間距點(diǎn)在基片上，點(diǎn)樣面積可 根據(jù)探針數(shù)量、探針間距、點(diǎn)的大小等因素進(jìn)行調(diào)整，點(diǎn)樣后將芯片按探針與基片結(jié)合方式 的不同，采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行固化。然后立即使用或貯存于4°C備用。
[0032] 本發(fā)明芯片的使用方法
[0033] (1)采樣
[0034] 從病人身上采血Iml ;
[0035] (2)樣本處理
[0036] 使用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA ;
[0037] 以下涉及到熒光標(biāo)記引物及其產(chǎn)物的操作步驟均在避光條件下（有紅燈的暗室 內(nèi)）進(jìn)行；
[0038] (3) PCR反應(yīng)擴(kuò)增
[0039] 使用基因突變位點(diǎn)特異性引物通過(guò)PCR反應(yīng)對(duì)DNA標(biāo)本擴(kuò)增，使用熒光物質(zhì)或同 位素對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記；
[0040] (4)雜交
[0041] 取PCR產(chǎn)物混合液，加陽(yáng)性參照溶液及預(yù)熱的雜交液，混勻，變性3min后置冰上， 全部轉(zhuǎn)移到芯片的點(diǎn)樣區(qū)域（對(duì)照點(diǎn)樣矩陣定位芯片），加蓋玻片（注意不要有氣泡）；雜 交艙里加幾滴水，以保持濕度；將芯片放入雜交艙，密封雜交艙，然后放進(jìn)恒溫箱或水浴保 溫Ih ;
[0042] (5)洗片
[0043] 打開(kāi)雜交艙，取出芯片，用洗脫液沖掉蓋玻片，然后把芯片放入洗脫液中，室溫 (25°C ±10°C )放置5min，用滅菌雙蒸水沖洗二遍，室溫下干燥；
[0044] (6)讀片
[0045] 推薦使用ScanArray4000掃描儀在60-85掃描強(qiáng)度下掃描；
[0046] (7)結(jié)果分析
[0047] 采用人工判讀或使用配套軟件分析。根據(jù)基因型分析結(jié)果判斷他汀類藥物的療效 和安全性。
[0048] 利用本發(fā)明的芯片，只需病人Iml血液，便能夠再3_4h內(nèi)迅速得到結(jié)果，并配合專 用軟件，向臨床醫(yī)生提供明確的建議。采用這一新的檢測(cè)芯片，醫(yī)生可以在患者服藥前對(duì)用 藥方案進(jìn)行調(diào)整，大大減少了病人不必要的痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。并且，采用基因芯片技術(shù)，可 以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)變異位點(diǎn)，一次判斷患者用藥的療效和安全性，檢測(cè)結(jié)果可以終生指導(dǎo)其 治療。
[0049] 本發(fā)明采用生物芯片技術(shù)檢測(cè)與他汀類藥物療效和安全性相關(guān)的基因突變位點(diǎn)， 提前預(yù)測(cè)藥物的療效和毒性，輔助臨床醫(yī)師制定個(gè)體化用藥方案，使患者治療利益最大化。
【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1為本發(fā)明所述芯片整體結(jié)構(gòu)示意圖；
[0051] 圖2為本發(fā)明所述基因探針陣列示意圖。
[0052] 圖注如下：1.承載基片2點(diǎn)樣區(qū)3基因探針陣列4貼標(biāo)簽處
【具體實(shí)施方式】
[0053] 以下對(duì)本發(fā)明制造的基因突變芯片做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0054] 通過(guò)臨床觀察以及文獻(xiàn)挖掘，選出和他汀類藥物療效和安全性密切相關(guān)的 4個(gè)基因突變位點(diǎn)制作基因突變檢測(cè)芯片。這4個(gè)位點(diǎn)是CYP3A4*1G (rs2242480)、 CYP3A5*3C(rs776746)、CYP3AP1*3(rs2177180)和 SLC01B1*5(rs4149056)。
[0055] 基片處理：基片采用玻璃介質(zhì)，其表面處理方式采用氨基化修飾。具體步驟如下：
[0056] (1)在2mol/lNa0H-70%乙醇溶液中清洗玻片2h后，用蒸餾水沖洗5遍，IKTC烤 干并冷卻至室溫；
[0057] ⑵將玻片置于1%的3-氨丙基三甲基硅烷-95%丙酮溶液中浸泡2min ;
[0058] (3)取出后用丙酮沖洗10次，每次5min ;
[0059] (4) IlCTC干燥 45min ;
[0060] (5)在lg/L的1,4-苯二異硫氰酸鹽溶液中處理2h ;
[0061] (6)用甲醇清洗5min，丙酮沖洗5min，室溫干燥。
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