一種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)egfr/kras/braf基因突變位點(diǎn)的多重pcr引物和方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢EGFR/KRAS/BRAF基因突變位點(diǎn)的多重PCR引物和方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是位于 7 號(hào)染色 體短臂上的原癌基因C-erbB-1 (肥R-1)的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族（肥R)中的 4個(gè)成員之一，肥R家族在細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的 突變主要發(fā)生在18~21號(hào)外顯子，其中19和21號(hào)外顯子突變占總突變的90%。EGFR信 號(hào)傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生的原因。研究表明，EGFR在多種腫瘤中都有表達(dá)，如結(jié) 直腸癌、乳腺癌、膜腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等。
[0003]K-ras基因是一種原癌基因，長(zhǎng)約35化，位于12號(hào)染色體短臂上，是ras基因家族 成員之一，編碼KRAS蛋白。K-ras基因常見(jiàn)的突變位點(diǎn)位于2號(hào)外顯子的12號(hào)密碼子和 13號(hào)密碼子上、3號(hào)外顯子的61號(hào)密碼子，其中有7個(gè)突變熱點(diǎn)：G12C、G12R、G12S、G12V、 G12D、G12A、G13V/D，占K-ras基因總突變的98%W上。研究表明體細(xì)胞K-ras基因突變與 多種人類惡性腫瘤，如肺癌、白血病、黏蛋白腺癌、膜腺癌、結(jié)直腸癌有關(guān)，而生殖細(xì)胞K-ras 基因突變與努南綜合征和屯、臟-面部-皮膚（cardio-化ci〇-cutaneous，CFC)綜合征相關(guān)。
[0004]BRAF基因是一種原癌基因，定位于7號(hào)染色體上，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。約 90%的BRAF基因突變發(fā)生在外顯子15的1799位核巧酸上，T突變?yōu)锳，導(dǎo)致鄉(xiāng)氨酸被谷氨 酸取代（V600E)。BRAF基因突變?cè)诤谏亓?、結(jié)直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、卵巢癌、乳腺癌 W及肺癌等腫瘤細(xì)胞系中的發(fā)生率依次為59%、18%、11%、9%、14%、2%、3% ;此外，BRAF V600E在甲狀腺乳頭狀癌中的發(fā)生率高達(dá)35. 8%。BRAF基因突變是晚期及復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌 最重要的預(yù)后指標(biāo)之一，與患者較差的總體生存期密切相關(guān)。
[0005] 目前常見(jiàn)的檢測(cè)運(yùn)Ξ個(gè)基因突變的方法有Sanger測(cè)序法和巧光定量PCR法。 Sanger測(cè)序法中，單對(duì)引物可檢測(cè)多個(gè)突變，但對(duì)多個(gè)基因、或同一基因的不同外顯子上的 突變位點(diǎn)就需分別進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，操作繁瑣，并且靈敏度較低約20%，假陰性率較高。巧光 定量PCR法雖然靈敏度高，但每對(duì)引物只能檢測(cè)一種突變，且每種突變需單獨(dú)建立一個(gè)PCR 反應(yīng)體系，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本多個(gè)突變位點(diǎn)操作繁瑣。運(yùn)兩種方法對(duì)樣本的需要量都較大， 不適合同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因突變位點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR/KRAS/BRAF基因突變 位點(diǎn)的多重PCR引物和方法及應(yīng)用。
[0007]第一方面，本發(fā)明提供了一種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR/KRAS/BRAF基因突 變位點(diǎn)的多重PCR引物，包括如下a)-f)引物對(duì)中的至少兩對(duì)：
[0008] a)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:1和沈QIDN0:2 所示引物對(duì)和/或SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物對(duì)；
[0009] b)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:5和沈QIDN0:6 所示引物對(duì)和/或SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物對(duì)；
[0010] c)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:9和SEQIDNO: 10 所示引物對(duì)、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所示引物對(duì)和沈QIDNO: 13和沈QIDNO: 14 所示引物對(duì)中的一種或多種；
[0011] d)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDNO: 15和SEQID NO: 16所示引物對(duì)、SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18所示引物對(duì)和沈QIDNO: 19和沈QID N0:20所示引物對(duì)中的一種或多種；
[001引 e)用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:21和沈QIDN0:22 所示引物對(duì)和/或SEQIDN0:23和SEQIDN0:24所示引物對(duì)；
[001引f)用于擴(kuò)增BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:25和SEQID NO:26所示引物對(duì)和/或SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物對(duì)。
[0014] 優(yōu)選地，所述多重PCR引物中，至少包括擴(kuò)增EGFR、KRAS和BRAF基因中任意兩個(gè) 或Ξ個(gè)基因的引物對(duì)，其中，每個(gè)基因擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)外顯子的區(qū)域，每個(gè)外顯子區(qū)域采用 一對(duì)或多對(duì)引物對(duì)。
[001引 優(yōu)選地，多重PCR引物為如下引物對(duì)中的兩對(duì)或多對(duì)：SEQIDN0:1和SEQIDN0:2 所示引物對(duì)、569 10^:5和沈010^:6所示引物對(duì)、569 10^:9和沈010^:10所示 引物對(duì)、SEQIDNO: 13和沈QIDNO: 14所示引物對(duì)、SEQIDNO: 15和沈QIDNO: 16所示 引物對(duì)、SEQIDNO:21和沈QIDNO:22、沈QIDNO:25和沈QIDNO:26所示引物對(duì)。
[0016] 優(yōu)選地，多重PCR引物為如下引物對(duì)中的兩對(duì)或多對(duì)：SEQIDN0:3和SEQIDN0:4 所示引物對(duì)、SEQIDN0:7和沈QIDN0:8所示引物對(duì)、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所 示引物對(duì)、SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18所示引物對(duì)、SEQIDNO: 19和沈QIDNO:20所 示引物對(duì)、SEQIDNO: 23和沈QIDNO: 24所示引物對(duì)、SEQIDNO: 27和沈QIDNO: 28所 示引物對(duì)。
[0017] 優(yōu)選地，多重PCR引物為SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 27所示的核巧酸序列組成的 引物組。
[001引本領(lǐng)域技術(shù)人員可W理解的，若摸索的多重PCR引物組（比如，SEQIDN0:1~SEQ IDN0:27所示的核巧酸序列組成的引物組）獲得了較佳的擴(kuò)增效果，一般情況下，設(shè)計(jì)引 物的時(shí)候，適當(dāng)?shù)膶⒍嘀豍CR引物組中任一一條引物的長(zhǎng)度延長(zhǎng)或截短0~3個(gè)堿基，也可 W獲得不錯(cuò)的多重PCR擴(kuò)增效果，也應(yīng)納入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0019] 第二方面，本發(fā)明提供了一種基于下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR/KRAS/BRAF基因突 變位點(diǎn)的多重PCR方法，包括如下步驟：
[0020] 取待測(cè)樣品；
[0021] 采用多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增待測(cè)樣品獲得多重PCR產(chǎn)物，其中，多重PCR反應(yīng)采用的引 物組包括如下a)-f)引物對(duì)中的至少兩對(duì)：
[002引 a)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子18的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDNO: 1和沈QIDN0:2 所示引物對(duì)和/或SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物對(duì)；
[0023]b)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子19的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:5和沈QIDN0:6 所示引物對(duì)和/或SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物對(duì)；
[0024]c)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子20的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:9和沈QIDNO: 10 所示引物對(duì)、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所示引物對(duì)和沈QIDNO: 13和沈QIDNO: 14 所示引物對(duì)中的一種或多種；
[00巧]d)用于擴(kuò)增EGFR基因的外顯子21的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDNO: 15和SEQID NO: 16所示引物對(duì)、SEQIDNO: 17和沈QIDNO: 18所示引物對(duì)和沈QIDNO: 19和沈QID N0:20所示引物對(duì)中的一種或多種；
[0026]e)用于擴(kuò)增KRAS基因的外顯子2的區(qū)域的引物對(duì)：SEQID N0:21和沈Q ID N0:22 所示引物對(duì)和/或SEQID N0:23和SEQID N0:24所示引物對(duì)；
[0027]f)用于擴(kuò)增BRAF基因的外顯子15的區(qū)域的引物對(duì)：SEQIDN0:25和SEQID NO:26所示引物對(duì)和/或SEQIDNO:27和SEQIDNO:28所示引物對(duì)。
[002引優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品為DM樣品或RNA樣品。
[0029] 當(dāng)所述取待測(cè)樣品為DNA樣品時(shí)，進(jìn)行多重PCR的體系參照普通PCR體系進(jìn)行配 置；當(dāng)所述取待測(cè)樣品為RNA樣品時(shí)，要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再合成第二鏈DNA，此時(shí)， 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的步驟相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR(只采用上游引物組或下游引物組），合 成第二鏈DNA的步驟也相當(dāng)于一個(gè)循環(huán)的多重PCR(只采用下游引物組或上游引物組）。
[0030] 如本發(fā)明所述的，所述的上游引物組選自SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 28中奇數(shù)編 號(hào)所示的核巧酸序列的至少一種。
[0031] 優(yōu)選地，所述的上游引物組選自沈QIDN0:l、5、9、13、15、21、25所示的核巧酸序 列中的至少一種或沈QIDN0:3、7、ll、17、19、23、27所示的核巧酸序列中的至少一種。 [003引如本發(fā)明所述的，所述的下游引物組選自SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 28中偶數(shù)編 號(hào)所示的核巧酸序列的至少一種。
[003引優(yōu)選地，所述的下游引物組選自SEQID^:2、6、10、14、16、22、26所示的核巧酸序 列中的至少一種或沈QID^:4、8、12、18、20、24、28所示的核巧酸序列中的至少一種。 [0034] 優(yōu)選地，所述待測(cè)RNA樣品為（優(yōu)選采用RNA試