利用解鏈溫度和通用堿基的突變分析的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了用于確定基因組基因座中存在或不存在突變體等位基因的方法和寡核苷酸探針。所述探針以不同的解鏈溫度(Tm)結(jié)合靶序列的不同等位基因。所述方法確定所述探針與靶序列雜交時(shí)的Tm，從而確定在所述靶序列中存在或不存在變體核酸，如突變體等位基因。在靶序列中可能存在不感興趣的變體，例如，表型沉默的突變。為了確保這些變體不影響探針的Tm，所述探針包含發(fā)生此類(lèi)不感興趣的變體的通用堿基位點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用解鏈溫度和通用堿基的突變分析 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于基因組分析的方法和組合物，并且特別是用于確定基因組基因座 中存在或不存在突變體等位基因的方法和組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 核酸探針經(jīng)常用于鑒定基因組或擴(kuò)增的DNA中特異性靶序列的存在。探針與靶標(biāo) 的退火或解鏈溫度受所述探針與所述靶標(biāo)共有的互補(bǔ)區(qū)長(zhǎng)度和另外在互補(bǔ)堿基對(duì)之間存 在任何錯(cuò)配的影響。這可以用來(lái)檢測(cè)變體(例如，SNPs或多個(gè)重復(fù))的存在?？梢栽O(shè)計(jì)探針具 有針對(duì)野生型序列的第一解鏈溫度(Tm)，并且所述探針與所述靶標(biāo)的退火，例如，通過(guò)在退 火時(shí)的熒光顯現(xiàn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如果Tm不同于預(yù)期的值，那么該靶序列包含變體。
[0004] 國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W02012/093262記述了使用寡核苷酸探針檢測(cè)和分析單核苷酸多態(tài) 性(SNPs)的方法，所述寡核苷酸探針與變體等位基因以比其與野生型等位基因雜交的Tm低 的Tm雜交。所述方法使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在介于第一和第二Tm之間的溫度擴(kuò)增包括 靶序列的基因組片段。如果所述靶序列是野生型的，那么所述探針保持與所述靶標(biāo)結(jié)合，并 且防止擴(kuò)增；如果所述靶序列是變體，那么所述探針不與所述靶標(biāo)結(jié)合，并且擴(kuò)增發(fā)生。以 這種方式，可以確定變體的存在，并且在樣品中選擇性富集所述變體等位基因。
[0005] 國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W02013/041853描述了用于確定包括SNPs和短的串聯(lián)重復(fù)(STRs)的 多態(tài)性的探針。所述探針包括由接頭核酸序列連接的第一和第二區(qū)域，以使所述第一和第 二區(qū)域具有獨(dú)立的Tm。取決于變體或野生型等位基因存在于第一靶標(biāo)區(qū)域還是第二靶標(biāo)區(qū) 域，可以設(shè)計(jì)所述探針序列，以具有不同的Tm。使用該接頭探針允許使用單一的寡核苷酸探 針來(lái)檢測(cè)比利用常規(guī)探針可能檢測(cè)的序列更長(zhǎng)的序列中的變體。
[0006] 然而，并不是所有的變體都有臨床重要性。特別地，盡管一些突變可能與表型變化 (例如，對(duì)特定藥物的敏感性)相關(guān)，但是其他的可能是表型中性的，或者甚至是沉默的。尤 其是，沉默突變是這樣的突變:其中在核苷酸序列中的突變?cè)诰幋a的多肽序列中不產(chǎn)生相 對(duì)應(yīng)的突變。這典型地是在特定密碼子的第三個(gè)堿基中存在突變的情形。
[0007] 下表摘自 http: //en .wikipedia .org/w/index. php?ti tie = Genetic_code&oldid = 567109686,顯示了遺傳密碼，并且舉例說(shuō)明了密碼的簡(jiǎn)并性，并且顯示了哪些突變可能 是表型沉默的。例如，由UUU到UUC的突變?nèi)匀痪幋a苯丙氨酸，因此，對(duì)表達(dá)的蛋白沒(méi)有影響。
[0008] 標(biāo)準(zhǔn)的遺傳密碼
[0009]
[0010] 其他的突變可能對(duì)所表達(dá)的蛋白序列有一些影響，但是仍然沒(méi)有臨床影響，例如， 用功能相似的氨基酸取代一種氨基酸。
[0011]目前的檢測(cè)方法要么特異性針對(duì)一種具體的突變，因此不能更普遍地(可能存在 多種突變的情形)使用，要么對(duì)任意的突變都敏感，因此將鑒定沒(méi)有意義的突變和有臨床意 義的突變。
[0012]擁有借以不檢測(cè)沒(méi)有意義的突變而仍然足夠靈敏以鑒定一定范圍的其他突變的 方法將是合乎需要的。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 按照本發(fā)明的第一方面，提供用于檢測(cè)多態(tài)性靶核酸序列（所述靶序列存在于給 定群體內(nèi)的多種等位基因中）中變體核酸序列的存在的方法，所述方法包括：
[0015] a)提供包含寡核苷酸探針和靶核酸序列的反應(yīng)混合物，所述寡核苷酸探針在與靶 序列的第一等位基因雜交時(shí)具有第一解鏈溫度(Tm)，并且在與靶序列的第二等位基因雜交 時(shí)具有第二較低的Tm，其中所述探針在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含至少一個(gè)通用堿基；
[0016] b)允許所述探針與靶核酸序列雜交;并且
[0017] c)當(dāng)所述探針與所述靶核酸序列雜交時(shí)，確定所述探針的Tm;
[0018] 由此確定是否存在變體核酸序列。
[0019] 通用堿基是能夠與四種典型核酸堿基(A，C，G，T)中的任一種形成沃森-克里克堿 基對(duì)的堿基。通用堿基的實(shí)例包括2'-脫氧肌苷(次黃嘌呤脫氧核苷酸)衍生物、硝基吡咯 (nitroazole)類(lèi)似物和疏水芳族無(wú)氫鍵合的堿基。用于本發(fā)明的優(yōu)選通用堿基包括d-肌苷 和5-硝基吲哚。
[0020] 不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)優(yōu)選是這樣的殘基:該處的突變是表型沉默突變(例如， 典型地，密碼子中的第三個(gè)堿基，該處的突變不改變所表達(dá)的氨基酸）；或者其可以是這樣 的殘基:該處的突變確實(shí)改變肽序列，但是產(chǎn)生的是不改變所表達(dá)的肽的特性的保守替換。 當(dāng)然，也可以使用本發(fā)明的方法來(lái)阻止任意需要的突變的檢測(cè);其不必是沉默突變。
[0021] 以這種方式，所述探針將以相同的Tm與僅在與所述通用堿基相對(duì)應(yīng)的殘基處不同 的等位基因雜交。僅當(dāng)所述等位基因在不存在通用堿基的殘基處不同時(shí)，才觀察到改變的 Tm;以這種方式，可以妨礙某些突變的存在的檢測(cè)，而不改變所述探針檢測(cè)一定范圍的不同 的突變的能力。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，所述探針可以在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含多于一個(gè)通用 堿基。多于一個(gè)這樣的位點(diǎn)也可以或作為替代存在于所述探針中。
[0023] 第一等位基因可以指定為野生型的；并且第二等位基因可以包括多種變體(例如， 多個(gè)不同的SNPs，以及在單一變體等位基因中的多個(gè)SNPs)，條件是所述探針與第一和第二 等位基因雜交時(shí)的相對(duì)Tm如上文所述。
[0024] 優(yōu)選地，所述探針是DNA。
[0025]第一和第二等位基因之間的序列差異優(yōu)選在所述探針結(jié)合的區(qū)域內(nèi)部；即，在所 述探針與第一等位基因之間的任何錯(cuò)配都不在所述探針的末端。
[0026]所述探針的長(zhǎng)度可以是多至10、20、30、40或50個(gè)核苷酸。更長(zhǎng)或更短的探針也可 以，盡管其可能難以獲得針對(duì)不同等位基因的Tm之間的適當(dāng)?shù)膮^(qū)分或者具有引物與更短的 探針的Tm。
[0027] 確定探針的Tm的步驟可以進(jìn)一步包括將所述探針的Tm與預(yù)期的Tm比較，以確定所 述等位基因是否是變體等位基因。
[0028] 步驟c)，確定所述探針與所述靶核酸序列雜交時(shí)的Tm，可以包括下述步驟:在等于 或低于第二Tm的第一溫度檢測(cè)所述探針與所述靶標(biāo)的雜交，和在等于或低于第一 Tm而高于 第二Tm的第二溫度檢測(cè)雜交。
[0029] 所述探針可以被標(biāo)記。例如，所述探針可以包含熒光或放射性標(biāo)記，或者可以用第 二探針可以結(jié)合的配體標(biāo)記。優(yōu)選地，用熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述探針，并且優(yōu)選地，取決于所 述探針是已經(jīng)與靶標(biāo)鏈雜交（即，所述探針是雙鏈核酸的一部分)還是沒(méi)有雜交(所述探針 是單鏈的），所述標(biāo)記還產(chǎn)生差異性的信號(hào)。優(yōu)選的探針是HyBeacon?探針（例如，參見(jiàn) Mol Cell Probes(分子細(xì)胞探針）.2002年 10月；16(5) :319-26, "Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon Probes and direct PCR amplification from saliva(使用 HyBeacon探針和對(duì)唾液的直接PCR擴(kuò)增進(jìn)行的超快速DNA分析)"，F(xiàn)rench DJ，Archard CL, Andersen MT，McDowell DG)。差異性信號(hào)的產(chǎn)生允許容易且快速地分析所述探針是否已經(jīng) 與靶標(biāo)結(jié)合。
[0030]所述方法還包括優(yōu)先擴(kuò)增靶序列的第二等位基因的步驟。這可以在步驟c)之前包 括下述步驟：
[0031] b2)向反應(yīng)混合物提供一對(duì)用于核酸擴(kuò)增的寡核苷酸引物，所述引物與側(cè)連寡核 苷酸探針結(jié)合位點(diǎn)的第一和第二位點(diǎn)處的核酸雜交;其中引物:樣品的Tm高于探針:第二等 位基因的Tm;
[0032] b3)將反應(yīng)混合物維持在介于探針:第一等位基因的Tm與探針:第二等位基因的Tm 之間的溫度，以使所述探針優(yōu)先與第一等位基因雜交；
[0033] b4)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增，所述擴(kuò)增包括解鏈階段、退火階段和延伸階 段，其中延伸和退火階段的溫度介于探針:第一等位基因的Tm與探針:第二等位基因的Tm之 間，以使所述探針在這這些階段與第一等位基因雜交；由此擴(kuò)增第二等位基因；并且
[0034] 其中步驟c)包括在等于或低于探針:第二等位基因的Tm的溫度檢測(cè)所述探針與樣 品的雜交;在等于或低于探針:第一等位基因的Tm的較高的溫度檢測(cè)所述探針與樣品的雜 交;并且比較這兩個(gè)雜交；由此檢測(cè)擴(kuò)增的第二等位基因。
[0035]這允許在檢測(cè)和確定Tm之前使用通用堿基探針選擇性地?cái)U(kuò)增等位基因。這可以用 來(lái)富集可能僅有少許第二等位基因拷貝的樣品。所述探針最初通過(guò)在延伸階段保持與第一 等位基因結(jié)合而用來(lái)阻斷第一等位基因的擴(kuò)增，然后在擴(kuò)增后檢測(cè)所述等位基因。在延伸 階段，所述寡核苷酸探針保持與第一等位基因雜交。這防止與相同核酸雜交的引物的鏈延 伸，而由于所述探針不與所述等位基因雜交，因此與第二等位基因雜交的引物自由進(jìn)行鏈 延伸。以這種方式，第二等位基因?qū)?yōu)先被擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，引物中的一條或兩條 可以與探針結(jié)合位點(diǎn)重合，以使所述探針與所述引物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合;這可以防止引物的結(jié)合，并 且因此防止鏈延伸。在其他實(shí)施方案中，引物和探針不重合，但是引物防止進(jìn)一步的鏈延 伸。
[0036]檢測(cè)雜交的探針?lè)肿拥牟襟E可以進(jìn)一步包括定量擴(kuò)增混合物中第一和第二等位 基因的相對(duì)量。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，檢測(cè)步驟可以在擴(kuò)增步驟之前以及之后進(jìn)行。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二等位基因的比率可以通過(guò)下述測(cè)定:將所述反應(yīng)混合物 維持在等于或低于探針:第二等位基因的Tm的第一溫度;檢測(cè)雜交的探針?lè)肿?將所述反應(yīng) 混合物升溫至高于探針：第二等位基因的Tm但是等于或低于探針:第一等位基因的Tm的第 二溫度;并且檢測(cè)雜交的探針?lè)肿?。在第一較低的溫度，探針將與第一和第二等位基因都雜 交，而在第二較高的溫度，探針將僅與所述第一等位基因雜交。
[0037]引物優(yōu)選地在探針結(jié)合的區(qū)域之外的區(qū)域結(jié)合;即，第一引物結(jié)合探針靶標(biāo)的3'_ 方向，而第二引物結(jié)合探針靶標(biāo)的5'-方向（記住：引物將結(jié)合在雙鏈DNA的不同鏈上）。當(dāng)引 物進(jìn)行鏈延伸時(shí)，這被結(jié)合的探針?biāo)钄?，使得該鏈不能被擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，引物 可以結(jié)合在探針結(jié)合的區(qū)域的附近，或者甚至可以與探針重合一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)核 苷酸，盡管這不是優(yōu)選的。當(dāng)然，兩個(gè)引物可以與探針靶標(biāo)不同程度地重合，或者一個(gè)引物 可以重合，而另一個(gè)引物不重合。在探針與引物重合的情形中，則所述探針可以?xún)?yōu)選在所述 引物的3'端與引物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，并且以這種方式防止延伸。
[0038]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在某些實(shí)施方 案中，引物可以以不同的濃度提供;優(yōu)選地，引物中的一個(gè)以限速量提供，并且所述擴(kuò)增反 應(yīng)是不對(duì)稱(chēng)PCR。在不對(duì)稱(chēng)PCR中，兩個(gè)靶標(biāo)DNA鏈中的一個(gè)被優(yōu)先擴(kuò)增，由于使用限速引物， 因此只有另一個(gè)引物可用于起始鏈延伸。正義鏈或反義鏈之一可以是被靶向用于優(yōu)先擴(kuò)增 的鏈;優(yōu)選地，優(yōu)先擴(kuò)增的鏈?zhǔn)桥c所述探針互補(bǔ)的鏈。
[0039] 所述探針可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)通用堿基。
[0040] 在某些實(shí)施方案中，所述探針可以包含與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一核酸序列； 與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列；和連接所述第一和第二核酸序列的接頭核酸序 列；其中所述接頭隔開(kāi)第一和第二兩個(gè)序列，使得與第一靶核酸序列退火的第一序列的解 鏈溫度和與第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度不相關(guān)。
[0041] 接頭區(qū)的存在允許探針被分成具有不同雜交特征的功能元件。包含這些接頭產(chǎn)生 "泡狀"結(jié)構(gòu)，從熱動(dòng)力學(xué)角度上將所述探針的各個(gè)元件分開(kāi)，從而提供具有不同結(jié)合特征 的區(qū)域。此外，接頭核酸序列的存在允許整個(gè)探針具有單個(gè)多核苷酸分子的特征，但是作用 上如同由分開(kāi)的較短核酸探針構(gòu)成。當(dāng)?shù)谝缓偷诙蛄信c它們各自的靶序列雜交時(shí)，結(jié)構(gòu) 區(qū)可以折疊形成環(huán)。
[0042] 所述探針結(jié)構(gòu)允許探測(cè)相鄰的區(qū)域，而較長(zhǎng)的探針(例如，跨越第一和第二靶標(biāo)區(qū) 域的單一探針)不能通過(guò)Tm分析提供充分的區(qū)分變體的報(bào)告。因此，優(yōu)選地，第一和第二靶 核酸序列是相鄰的。
[0043] 優(yōu)選地，所述接頭是核苷接頭;更優(yōu)選地，所述接頭包含多聚脫氧核糖核苷酸；最 優(yōu)選地，所述接頭包含或由多聚脫氧肌苷組成。相對(duì)于天然堿基，脫氧肌苷由于較弱的氫鍵 鍵合而具有低解鏈溫度?？梢允褂闷渌暮塑?。
[0044] 優(yōu)選地，所述接頭長(zhǎng)度多至5、10、15、20、30、40、50個(gè)核苷酸。
[0045]第一和第二核酸序列中的至少一個(gè)是報(bào)告子區(qū)。報(bào)告子區(qū)包括標(biāo)記的結(jié)構(gòu)部分； 優(yōu)選熒光標(biāo)記。這允許在與靶序列結(jié)合時(shí)檢測(cè)探針，并且監(jiān)測(cè)某一溫度范圍內(nèi)的退火，從而 確定任何變體靶序列的存在。探針優(yōu)選地不包含猝滅劑結(jié)構(gòu)部分，也不包含要與猝滅劑一 起使用的標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括FAM、TET、HEX、R0X、TAMRA、Cy3和Cy5。其他適當(dāng)?shù)臉?biāo)記是技 術(shù)人員已知的。優(yōu)選地，所述標(biāo)記結(jié)合在T核苷酸上，盡管也可以使用任意適當(dāng)?shù)暮塑账帷?[0046] 報(bào)告子區(qū)長(zhǎng)度優(yōu)選為15-200個(gè)nt，更優(yōu)選為15-150個(gè)，長(zhǎng)度更優(yōu)選為15-100個(gè)或 20-100個(gè)、30-80個(gè)、40-60個(gè)或約 50 個(gè) nt。
[0047] 報(bào)告子區(qū)可以進(jìn)一步包含阻斷區(qū)；即，用于阻斷DNA聚合酶導(dǎo)致的核酸鏈延伸的部 分，由此在例如PCR過(guò)程中防止鏈延伸。聚合酶阻斷基團(tuán)是應(yīng)該具有阻斷聚合物的進(jìn)一步延 伸的功能特性的基團(tuán)。阻斷基團(tuán)可以是能夠連接到核苷酸上的任意化學(xué)基團(tuán)，其允許修飾 的核苷酸的5'端連接到DNA鏈中另一個(gè)核苷酸的3'端而不允許核苷酸連接到修飾的核苷酸 的3'羥基基團(tuán)。適當(dāng)?shù)兀?'位置不存在0H基團(tuán)防止聚合酶活性導(dǎo)致的進(jìn)一步延伸。在特別優(yōu) 選的實(shí)施方案中，阻斷基團(tuán)選自乙酰基、CH 3、甘氨酰基、亮氨?；捅滨；鶊F(tuán)。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，阻斷基團(tuán)可以是二肽或三肽的形式。
[0048] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二核酸序列是報(bào)告子區(qū)。它們可以包含不 同的標(biāo)記。所述探針可以用作多路報(bào)告子，允許使用單一探針在擴(kuò)展范圍內(nèi)檢測(cè)靶序列。
[0049] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以提供多種寡核苷酸探針，優(yōu)選兩種。所述探針中 的一個(gè)或兩者都可以包含至少一個(gè)通用堿基;優(yōu)選二者都包含至少一個(gè)通用堿基。優(yōu)選地 選擇與靶序列的相鄰部分雜交的探針。這允許更大的有效的靶標(biāo)"讀取長(zhǎng)度"，而沒(méi)有必須 提供單一的長(zhǎng)探針的限制。此外，由于技術(shù)人員可能預(yù)期到兩個(gè)相鄰的探針可能彼此干擾， 特別是探針的3'和/或5'端存在化學(xué)修飾(諸如延伸阻斷劑或標(biāo)記)的情形中，因此，有效檢 測(cè)靶序列相鄰的部分的能力是出乎意料的。
[0050] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)提供多種寡核苷酸探針時(shí)，全部(優(yōu)選兩種)都是 上文所述的"接頭探針"；即，包含通過(guò)接頭核酸序列連接的與第一和第二靶序列互補(bǔ)的第 一和第二核酸序列。這樣的排列提供對(duì)靶標(biāo)相對(duì)長(zhǎng)的部分的變體序列的檢測(cè)，并且針對(duì)靶 標(biāo)的尺寸而平衡探針的尺寸。
[0051] 靶序列可以是微生物藥物抗性基因的一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶序列是結(jié) 核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculos i s )基因，優(yōu)選rpoB。該基因造成利福平 (rifampin)抗性。在其他實(shí)施方案中，革E1序列可以是患者自身的基因，例如，以確定對(duì)某些 藥物和其他治療的易感性，或診斷遺傳病癥。
[0052]按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種寡核苷酸探針，其在與靶序列的第一等位基 因雜交時(shí)具有第一解鏈溫度(Tm)，并且在與靶序列的第二等位基因雜交時(shí)具有第二較低的 Tm，其中所述探針在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)上包含至少一個(gè)通用堿基。
[0053]通用堿基的實(shí)例包括2'-脫氧肌苷(次黃嘌呤脫氧核苷酸)衍生物、硝基吡咯類(lèi)似 物和疏水芳族無(wú)氫鍵合的堿基。用于本發(fā)明的優(yōu)選通用堿基包括d-肌苷和5-硝基吲哚。 [0054]不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)優(yōu)選是這樣的殘基:該處的突變是表型沉默突變(例如， 典型地，密碼子中的第三個(gè)堿基，在該處的突變不改變所表達(dá)的氨基酸）；或者其可以是這 樣的殘基:該處的突變確實(shí)改變肽序列，但是產(chǎn)生的是不改變所表達(dá)的肽的特性的保守替 換。
[0055]在一些實(shí)施方案中，探針可以在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含多于一個(gè)的通用堿 基。多于一個(gè)這樣的位點(diǎn)也可以或作為替代存在于所述探針中。
[0056] 優(yōu)選地，所述探針是DNA。
[0057] 所述探針可以被標(biāo)記。例如，所述探針可以包含熒光或放射性標(biāo)記，或者可以用第 二探針可以結(jié)合的配體標(biāo)記。優(yōu)選地，用熒光標(biāo)記來(lái)標(biāo)記所述探針，并且優(yōu)選地，取決于所 述探針是已經(jīng)與靶標(biāo)鏈雜交（即，所述探針是雙鏈核酸的一部分)還是沒(méi)有雜交(所述探針 是單鏈的），所述標(biāo)記還產(chǎn)生差異性的信號(hào)。優(yōu)選的探針是HyBeacon?探針（例如，參見(jiàn) Mol Cell Probes(分子細(xì)胞探針）.2002年 10月；16(5) :319-26, "Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon Probes and direct PCR amplification from saliva(使用 HyBeacon探針和對(duì)唾液的直接PCR擴(kuò)增進(jìn)行的超快速DNA分析)"，F(xiàn)rench DJ，Archard CL, Andersen MT,McDowell DG)〇
[0058] 所述探針可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)通用堿基。
[0059]在某些實(shí)施方案中，所述探針可以包含與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一核酸序列； 與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列；和連接所述第一和第二核酸序列的接頭核酸序 列；其中所述接頭隔開(kāi)第一和第二兩個(gè)序列，使得與第一靶核酸序列退火的第一序列的解 鏈溫度和與第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度不相關(guān)。
[0060]優(yōu)選地，所述接頭是核苷接頭；更優(yōu)選地，所述接頭包含多聚脫氧核糖核苷酸；最 優(yōu)選地，所述接頭包含多聚脫氧肌苷或由多聚脫氧肌苷組成。相對(duì)于天然堿基，脫氧肌苷由 于較弱的氫鍵鍵合而具有低解鏈溫度?？梢允褂闷渌暮塑?。
[0061 ] 優(yōu)選地，所述接頭長(zhǎng)度多至5、10、15、20、30、40、50個(gè)核苷酸。
[0062]第一和第二核酸序列中的至少一個(gè)是報(bào)告子區(qū)。報(bào)告子區(qū)包括標(biāo)記的結(jié)構(gòu)部分； 優(yōu)選熒光標(biāo)記。這允許在與靶序列結(jié)合時(shí)檢測(cè)探針，并且監(jiān)測(cè)某一溫度范圍內(nèi)的退火，從而 確定任何變體靶序列的存在。探針優(yōu)選不包含猝滅劑結(jié)構(gòu)部分，也不包含要與猝滅劑一起 使用的標(biāo)記。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記包括FAM、TET、HEX、R0X、TAMRA、Cy3和Cy5。其他適當(dāng)?shù)臉?biāo)記是技術(shù) 人員已知的。優(yōu)選地，所述標(biāo)記結(jié)合在T核苷酸上，盡管也可以使用任意適當(dāng)?shù)暮塑账帷?[0063] 報(bào)告子區(qū)長(zhǎng)度優(yōu)選為15-200個(gè)nt，更優(yōu)選為15-150個(gè)，長(zhǎng)度更優(yōu)選為15-100個(gè)或 20-100個(gè)、30-80個(gè)、40-60個(gè)或約 50 個(gè) nt。
[0064] 報(bào)告子區(qū)可以進(jìn)一步包含阻斷區(qū)；即，用作阻斷DNA聚合酶導(dǎo)致的核酸鏈延伸的部 分，由此在例如PCR過(guò)程中防止鏈延伸。聚合酶阻斷基團(tuán)是應(yīng)該具有阻斷聚合物的進(jìn)一步延 伸的功能特性的基團(tuán)。阻斷基團(tuán)可以是能夠連接到核苷酸上的任意化學(xué)基團(tuán)，其將允許修 飾的核苷酸的5'端連接到DNA鏈中另一個(gè)核苷酸的3'端而不允許核苷酸連接到修飾的核苷 酸的3'羥基基團(tuán)。適當(dāng)?shù)兀?'位置不存在0H基團(tuán)防止聚合酶活性導(dǎo)致的進(jìn)一步延伸。在特別 優(yōu)選的實(shí)施方案中，阻斷基團(tuán)選自乙酰基、CH 3、甘氨酰基、亮氨?；捅滨；鶊F(tuán)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷基團(tuán)可以是二肽或三肽的形式。
[0065] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二核酸序列是報(bào)告子區(qū)。它們可以包含不 同的標(biāo)記。所述探針可以用作多路報(bào)告子，允許使用單一探針在擴(kuò)展范圍內(nèi)檢測(cè)靶序列。
[0066] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以提供多種寡核苷酸探針，優(yōu)選兩種。所述探針中 的一個(gè)或兩者都可以包含至少一個(gè)通用堿基;優(yōu)選二者都包含至少一個(gè)通用堿基。優(yōu)選地 選擇與靶序列的相鄰部分雜交的探針。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)提供多種寡核苷酸 探針時(shí)，全部(優(yōu)選兩種)都是上文所述的"接頭探針"；即，包含通過(guò)接頭核酸序列連接的與 第一和第二靶序列互補(bǔ)的第一和第二核酸序列。
[0067] 靶序列可以是微生物藥物抗性基因的一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶序列是結(jié) 核分枝桿菌基因，優(yōu)選rpoB。該基因造成利福平抗性。在其他實(shí)施方案中，靶序列可以是患 者自身的基因，例如，以確定對(duì)某些藥物和其他治療的易感性，或診斷遺傳病癥。
[0068] 在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，所述探針可以包含選自SEQ ID N0 5至SEQ ID N0 10的序列，或可以包含所述序列的修飾版本或選自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 4的序列的修 飾版本。"修飾版本"意指這樣的序列：其通過(guò)缺失或添加一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸而不同； 或通過(guò)取代一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)核苷酸(包括用非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸取 代標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，例如，用通用堿基或備用堿基取代)而不同；或二者。修飾版本還可以或作為 替代包括不同長(zhǎng)度和/或組成的接頭序列;備用的熒光標(biāo)記;或備用的通用堿基。
[0069] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供多種寡核苷酸探針，如前文所述。
[0070] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種試劑盒，所述試劑盒包含一種或多種上文所述的寡 核苷酸探針和側(cè)連探針與其雜交的靶核酸位點(diǎn)的引物對(duì)。
[0071] 附圖簡(jiǎn)述
[0072] 圖1顯示探針構(gòu)建的示意圖（摘自W02013/041853)。
[0073]圖2顯示rpoB基因從密碼子505到533的核心的共有序列以及單個(gè)突變體。
[0074] 圖3顯示用在本實(shí)施例中跨越密碼子507-520和521-533的兩個(gè)接頭探針的rpoB基 因的核心上的位置。
[0075] 圖4顯示通用堿基5-硝基吲哚-CE亞磷酰胺的結(jié)構(gòu)。
[0076] 圖5顯示用于本實(shí)施例中的接頭探針的序列。
[0077] 圖6顯示當(dāng)針對(duì)具有突變的模板rpoB序列使用時(shí)，接頭探針解鏈溫度的變化的檢 測(cè)。
[0078]圖7顯示來(lái)自圖6的反應(yīng)的代表性解鏈曲線。
[0079]圖8顯示使用組合的兩種接頭探針針對(duì)密碼子507-533中的突變觀察到的解鏈溫 度的變化。
[0080] 圖9顯示低拷貝數(shù)樣品的結(jié)果的檢測(cè)。
[0081] 發(fā)明詳述
[0082]首先參考圖1，這顯示用于本發(fā)明的探針的一般結(jié)構(gòu)。探針由三個(gè)區(qū)域組成:第一 報(bào)告子序列，其與第一靶序列具有同源性;接頭序列，在該情形中，其包含五個(gè)肌苷核堿基； 和第二報(bào)告子序列，其與第二靶序列具有同源性。第二報(bào)告子在3'端還包含阻斷序列，其在 聚合反應(yīng)中防止鏈延伸。每個(gè)報(bào)告子區(qū)具有不同的退火溫度，并且具有一個(gè)或多個(gè)熒光核 苷酸，優(yōu)選FAM-T，或不同的/多種顏色。所述報(bào)告子用于報(bào)道特定序列或序列變體(例如， SNPs、插入、缺失等)的存在。這允許用單一的探針檢測(cè)擴(kuò)大范圍的多個(gè)序列。調(diào)整每個(gè)區(qū)域 以在野生型序列的情形中具有相似的（或相同的）Tm，而在突變的情形中具有改變的Tm，使 得使用者只需要檢測(cè)變化的Tm就能獲知變體的存在。"相似的"意指Tm相差至多2、1.5、1、 0.5Γ。
[0083] 現(xiàn)在提供使用多路報(bào)告子探針檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rP〇B基因中的變體的實(shí)例。結(jié)核 分枝桿菌(M. tuberculosis)中的多藥耐藥性是復(fù)雜的。利福平是一線結(jié)核分枝桿菌藥物， 并且是在治療前在領(lǐng)域中鑒定的主要靶標(biāo)。利福平抗性分支結(jié)核桿菌在rpoB基因的81-bp 核心區(qū)中具有突變，其編碼RNA聚合酶的β-亞基。96 %的結(jié)核分枝桿菌利福平抗性臨床分離 株在該基因中具有突變。密碼子516、526或531中的突變導(dǎo)致高水平的利福平抗性。然而，檢 測(cè)在81-bp基因區(qū)域中的突變典型地需要多種常規(guī)的探針，它們中的一些需要是重合的，由 此需要多個(gè)檢測(cè)步驟。
[0084] 使用所述的接頭探針以某種方式解決這一問(wèn)題，但是仍然留下問(wèn)題沒(méi)有解決:一 些突變是表型沉默的，對(duì)藥物抗性沒(méi)有影響。因此，本發(fā)明利用摻有通用堿基的接頭探針以 防止檢測(cè)此類(lèi)沉默突變，同時(shí)仍然能夠以高靈敏性檢測(cè)需要的突變。
[0085] 圖2顯示rpoB基因從密碼子505到533的野生型共有序列以及該區(qū)域內(nèi)已知的突變 (沉默的和不沉默的）。明顯的是，存在大量已知的突變，并且沉默突變的靈敏性檢測(cè)將冒著 對(duì)于重要突變的診斷檢測(cè)的選擇性(和有用性)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0086]為了證明本發(fā)明的原理，合成兩個(gè)接頭探針，其覆蓋跨越MTB rpoB基因的密碼子 507-520和520-533的90bp區(qū)域。使用氰基乙基亞磷酰胺法制備寡核苷酸。圖3顯示探針針對(duì) 基因組序列的位置。探針的兩個(gè)報(bào)告子結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為Z1和Z2;在每個(gè)探針中這些通過(guò)接頭 (圖3中未顯示)連接。每個(gè)探針的3'端包含阻斷劑基團(tuán)。注意，兩個(gè)接頭探針覆蓋基因組序 列的相鄰區(qū)域。
[0087]使用具有圖3所示的序列的未修飾的探針，可以利用由探針序列與靶序列之間的 錯(cuò)配所導(dǎo)致的解鏈溫度變化來(lái)檢測(cè)所述靶序列中突變的存在?？梢砸愿哽`敏性檢測(cè)單個(gè)堿 基錯(cuò)配。例如，參見(jiàn)國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W02013/041853,其描述了使用相似的探針(盡管只有單個(gè) 探針，不是相鄰的探針對(duì))檢測(cè)rpoB基因中的SNP突變。
[0088]本文所述的實(shí)驗(yàn)的目的是研究在所選位置處阻礙突變的檢測(cè)的可能性。為了這一 目的，從防止表型沉默突變被檢測(cè)的角度，使用通用堿基5-硝基吲哚-CE亞磷酰胺(Glen Research;圖4)取消突變對(duì)解鏈曲線去穩(wěn)定作用的影響。在密碼子507>520中共有4個(gè)密碼 子鑒定為具有不可知的第三堿基，并且用5-硝基吲哚或d-肌苷置換這些堿基，以研究該堿 基對(duì)中和去穩(wěn)定作用的影響。
[0089]圖5提供了探針的序列。在該圖中，標(biāo)準(zhǔn)DNA堿基具有常用的符號(hào)(A，C，G，T)，非標(biāo) 準(zhǔn)堿基或修飾用數(shù)字表示：1 =熒光素 dT; 2 =磷酸酯單元；3 =三甲氧基芪；4 = 5-硝基吲 哚;* =肌苷殘基(5個(gè)/探針）。不同的探針如下所述：
[0090] rpoB(507>520)連接的-探針（SEQ ID NO 1)-標(biāo)記的探針，其包括接頭、熒光殘基 和阻斷劑，覆蓋密碼子507-520。
[0091] rpoB(507>520)(SEQ ID N0 2)-標(biāo)記的核苷酸探針，其跨越密碼子507-520,沒(méi)有 接頭或阻斷劑。
[0092] rpoB(520>533)連接的-探針（SEQ ID N0 3)-標(biāo)記的探針，其包括接頭、熒光殘基 和阻斷劑，覆蓋密碼子521-533
[0093] rpoB(520>533)(SEQ ID N0 4)-標(biāo)記的核苷酸探針，其跨越密碼子521-533,沒(méi)有 接頭或阻斷劑。
[0094] ID N0 5)-標(biāo)記的探針，其包括接頭、熒光殘基和阻 斷劑，在探針的每個(gè)報(bào)告子部分具有5-硝基吲哚替代的單個(gè)沉默突變，覆蓋密碼子507-520〇
[0095] rpoB(507>520)JS(SEQ ID N0 6)-印〇8(507>520)_沉默_1 的較短版本。
[0096] rpOB(520>533)_沉默_全部（SEQIDN0 7)-標(biāo)記的探針，其包括接頭、熒光殘基和 阻斷劑，在探針的每個(gè)報(bào)告子部分具有四個(gè)5-硝基吲哚替代的沉默突變，覆蓋密碼子521-533〇
[0097] 印必(507>520)_沉默_全部（SEQ ID N0 8)-標(biāo)記的探針，其包括接頭、熒光殘基和 阻斷劑，在探針的每個(gè)報(bào)告子部分具有5-硝基吲哚替代的所有沉默突變，覆蓋密碼子507-520〇
[0098] rpoB(507>520)JSA(SEQ ID N0 9)-印〇8(507>520)_沉默_1 的較短版本。
[0099] rpoB(507>520)_shortB(SEQ ID NO 10)-印〇8(507>520)_沉默_全部的較短版本。
[0100] 用于從樣品PCR擴(kuò)增靶rpoB序列的引物顯示如下：
[0101] FWD 引物 vl
[0102] (5'>3'）
[0103] GCAGACGTTGATCAACATCCC(SEQ ID NO 11)
[0104] FWD 引物 v2
[0105] (5，>3，）
[0106] CGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTT(SEQ ID NO 12)。
[0107] 莖里
[0108] 使用引物擴(kuò)增包含rpoB的樣品，并且用rpoB(507>520)連接的探針探針和rpoB (520>533)連接的探針二者(無(wú)一包含沉默的突變位點(diǎn)）進(jìn)行解鏈曲線分析。數(shù)據(jù)顯示單個(gè) 和多個(gè)突變可以作為探針解鏈溫度的變化進(jìn)行檢測(cè)（圖6&7)。圖6(上圖）顯示文獻(xiàn)中報(bào)道的 每個(gè)密碼子的突變頻率。紅（實(shí)心的）點(diǎn)表示在印度這些突變的頻率。圖6的下圖顯示507> 520探針上的507>520之間的密碼子的突變，和520>533探針上的520>533之間密碼子的突變 對(duì)報(bào)道的解鏈溫度(作為來(lái)自野生型的偏差)的影響。
[0109] 與在密碼子520-533中存在突變且因此以74.8°C±1.14°C的平均TM的TM變化表示 的模板相比，對(duì)于探針rpoB(520>533)連接的探針在密碼子507-520中存在突變且因此不被 所述探針報(bào)道的模板中報(bào)道的TM表示為77.5°C ±0.27°C的峰值。
[0110]代表性的解鏈曲線顯示在圖7中，其使用分離的探針由臨床RRDR分離株D516V(上） 和N531L(下）提供rpoB中rpoB突變的解鏈曲線分析。在上圖中，使用覆蓋密碼子507>520的 探針，與N531L(紫色，右側(cè)峰）（突變落在探針?lè)秶馇覍?duì)于該探針報(bào)道在72.2°C的野生 型（黑色，右側(cè)峰）位置）相比較，D516V模板(橙色，左側(cè)峰）報(bào)道為在69.9°C具有峰，。相反 地，與N531L突變體（紫色，左側(cè)峰）（其報(bào)道在位置73.5°C處)相比較，當(dāng)使用相同的模板聯(lián) 合覆蓋520>533的探針時(shí)，對(duì)于D516V(橙色，右側(cè)峰）報(bào)道的位置是野生型（黑色，右側(cè)峰） 75.9。。。
[0111] 用5-硝基吲哚的導(dǎo)致野生型表型（沉默突變）的堿基置換表現(xiàn)出取消去穩(wěn)定的作 用。之前表明是沉默的、但是可用常規(guī)SNP探針檢測(cè)的507和514的兩個(gè)突變被完全中和（圖 7)。如果需要，可以使用相同的方法中和520>533中潛在的10個(gè)位置。
[0112] 圖8顯示使用完全沉默的探針rpoB(507>520)沉默_全部和不沉默的探針rpoB(520 >533)連接的-探針的組合在rpoB基因上一系列不同SNP或多個(gè)突變中觀察到的Tm的變化。 明顯的是，沉默突變507.3、508.2、512.1和514.2將1'111保持在野生型范圍內(nèi)，而與野生型相 比，其他不沉默的突變表現(xiàn)出較大的Tm變化。這證實(shí)了該方法和探針是穩(wěn)健的。
[0113] 圖8顯示507>520之間的密碼子突變對(duì)507>520探針的影響，和520>533之間的密碼 子突變對(duì)520>533探針的影響。在與表型沉默突變相對(duì)應(yīng)的位置(其中堿基被5-硝基吲哚置 換），變化被阻抑。還顯示了具有多個(gè)突變的模板在兩個(gè)探針的報(bào)道位置產(chǎn)生變化，或者同 樣地，在與沉默突變相對(duì)應(yīng)的堿基處被5-硝基吲哚置換時(shí)，變化被沉默，以允許正確的表型 報(bào)道。
[0114] 多個(gè)突變與具有增加的錯(cuò)配數(shù)量的增加的TM變化相關(guān)。還以大的TM變化檢測(cè)缺 失。
[0115] 使用少至100種(上)或10種（下）樣品，測(cè)定是高靈敏性的（圖9)。這使得能夠檢測(cè) 所有密碼子中的突變，包括密碼子516、526、531和533中的關(guān)鍵突變，并且另外中和密碼子 507和514中的沉默突變(之前已經(jīng)在備選產(chǎn)物中報(bào)道為有問(wèn)題的）的作用。
[0116] 我們相信這種兩個(gè)標(biāo)記的-探針的組合代表著靈敏且最先進(jìn)的對(duì)于RIF-突變檢測(cè) 的測(cè)試，并且所述方法同等適用于其他基因組基因座。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)多態(tài)性靶核酸序列中存在變體核酸序列的方法，所述靶序列存在于給 定群體內(nèi)的多個(gè)等位基因中，所述方法包括： a) 提供包含寡核苷酸探針和靶核酸序列的反應(yīng)混合物，所述寡核苷酸探針在與所述靶 序列的第一等位基因雜交時(shí)具有第一解鏈溫度(Tm)，并且在與所述靶序列的第二等位基因 雜交時(shí)具有第二較低的Tm，其中所述探針在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含至少一個(gè)通用堿 基； b) 允許所述探針與靶核酸序列雜交;并且 c) 當(dāng)所述探針與所述靶核酸序列雜交時(shí)，確定所述探針的Tm; 由此確定是否存在變體核酸序列。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述通用堿基選自2'-脫氧肌苷(次黃嘌呤脫氧核苷酸） 衍生物、硝基吡咯類(lèi)似物和疏水芳族無(wú)氫鍵合的堿基。3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述通用堿基選自d-肌苷和5-硝基吲哚。4. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)是該處的突變是 表型沉默突變的殘基。5. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)是該處的突變產(chǎn) 生不改變所表達(dá)的肽的特性的保守替換的殘基。6. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述探針在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含多于 一個(gè)通用堿基。7. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述探針包含多于一個(gè)不希望檢測(cè)到變體的位 點(diǎn)。8. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述確定所述探針的Tm的步驟進(jìn)一步包括將所 述探針的Tm與預(yù)期的Tm比較，從而確定所述等位基因是否是變體等位基因。9. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述確定所述探針的Tm的步驟包括下述步驟： 檢測(cè)所述探針與靶標(biāo)在等于或低于第二Tm的第一溫度的雜交，并且檢測(cè)在等于或低于第一 Tm但高于第二Tm的第二溫度的雜交。10. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述探針被標(biāo)記。11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述標(biāo)記是熒光或放射性標(biāo)記，或是第二探針可以結(jié) 合的配體。12. 權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，取決于所述探針是否已經(jīng)與靶標(biāo)鏈雜交，所述 標(biāo)記產(chǎn)生差異性的信號(hào)。13. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包括優(yōu)先擴(kuò)增所述靶序列的第二等位基 因的步驟。14. 權(quán)利要求13所述的方法，其中所述方法在步驟c)之前包括下述步驟： b2)向所述反應(yīng)混合物提供一對(duì)用于核酸擴(kuò)增的寡核苷酸引物，所述引物與側(cè)連寡核 苷酸探針結(jié)合位點(diǎn)的第一和第二位點(diǎn)處的核酸雜交;其中引物:樣品的Tm高于探針:第二等 位基因的Tm; b3)將所述反應(yīng)混合物維持在介于探針:第一等位基因的Tm與探針:第二等位基因的Tm 之間的溫度，以使所述探針優(yōu)先與第一等位基因雜交； b4)對(duì)所述反應(yīng)混合物進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增，所述擴(kuò)增包括解鏈階段、退火階段和延伸階 段，其中延伸和退火階段的溫度介于探針:第一等位基因的Tm與探針:第二等位基因的Tm之 間，以使所述探針在這些階段與第一等位基因雜交；由此擴(kuò)增第二等位基因；并且 其中步驟c)包括在等于或低于探針:第二等位基因的Tm的溫度檢測(cè)所述探針與樣品的 雜交;在等于或低于探針:第一等位基因的Tm的較高的溫度檢測(cè)所述探針與樣品的雜交;并 且比較這兩個(gè)雜交；由此檢測(cè)擴(kuò)增的第二等位基因。15. 權(quán)利要求14所述的方法，其中所述檢測(cè)雜交的探針?lè)肿拥牟襟E進(jìn)一步包括定量擴(kuò) 增混合物中第一和第二等位基因的相對(duì)量。16. 權(quán)利要求15所述的方法，其中第一和第二等位基因的比率通過(guò)下述定量:將所述反 應(yīng)混合物維持在等于或低于探針:第二等位基因的Tm的第一溫度;檢測(cè)雜交的探針?lè)肿?將 所述反應(yīng)混合物升溫至高于探針：第二等位基因的Tm但是等于或低于探針：第一等位基因 的Tm的第二溫度;并且檢測(cè)雜交的探針?lè)肿印?7. 權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一引物結(jié)合所述探針靶標(biāo)的3'-方向， 而第二引物結(jié)合所述探針靶標(biāo)的5方向。18. 權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中引物中的一種以限速量提供，并且所述 擴(kuò)增反應(yīng)是不對(duì)稱(chēng)PCR。19. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述探針包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或 更多個(gè)通用堿基。20. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述探針包含與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一 核酸序列；與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列；和連接所述第一和第二核酸序列的接 頭核酸序列；其中所述接頭隔開(kāi)第一和第二兩個(gè)序列，使得與第一靶核酸序列退火的第一 序列的解鏈溫度和與第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度不相關(guān)。21. 權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一和第二靶核酸序列是相鄰的。22. 權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述接頭是核苷接頭;更優(yōu)選地，所述接頭包含 多聚脫氧核糖核苷酸;最優(yōu)選地，所述接頭包含多聚脫氧肌苷或由多聚脫氧肌苷組成。23. 權(quán)利要求20、21或22所述的方法，其中所述接頭長(zhǎng)度多至5、10、15、20、30、40、50個(gè) 核苷酸。24. 權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和第二核酸序列二者都是報(bào)告 子區(qū)，其各自包含標(biāo)記。25. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述探針包含阻斷區(qū)。26. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中提供多個(gè)寡核苷酸探針，優(yōu)選提供兩個(gè)寡核苷 酸探針。27. 權(quán)利要求26所述的方法，其中所述多個(gè)探針各自包含至少一個(gè)通用堿基。28. 權(quán)利要求26或27所述的方法，其中選擇所述探針，使其與所述靶序列的相鄰部分雜 交。29. 權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多個(gè)探針中的每一個(gè)是權(quán)利要求 20-24中任一項(xiàng)定義的接頭探針。30. 任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述靶序列是微生物藥物抗性基因的一部分， 優(yōu)選是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)基因的一部分，更優(yōu)選是rpoB的一部 分。31. 權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶序列是對(duì)針對(duì)某些藥物或其他治 療的敏感性有影響的基因。32. 權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶序列是造成遺傳病癥的基因。33. -種寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針在與靶序列的第一等位基因雜交時(shí)具有第 一解鏈溫度(Tm)，并且在與靶序列的第二等位基因雜交時(shí)具有第二較低的Tm，其中所述探 針在不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含至少一個(gè)通用堿基。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的探針，其中所述通用堿基是2'-脫氧肌苷(次黃嘌呤脫氧核 苷酸)衍生物、硝基吡咯類(lèi)似物或疏水芳族無(wú)氫鍵合的堿基。35. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的探針，其中所述通用堿基是d-肌苷或5-硝基吲哚。36. 根據(jù)權(quán)利要求33-35所述的探針，其在所述不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)包含多于一個(gè) 通用堿基。37. 根據(jù)權(quán)利要求33-36所述的探針，其包含多于一個(gè)不希望檢測(cè)到變體的位點(diǎn)。38. 根據(jù)權(quán)利要求33-37所述的探針，其中所述探針是DNA。39. 根據(jù)權(quán)利要求33-38所述的探針，其中所述探針被標(biāo)記。40. 根據(jù)權(quán)利要求33-39所述的探針，其中所述探針包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或 更多個(gè)通用堿基。41. 根據(jù)權(quán)利要求33-40所述的探針，其中所述探針包含與第一靶核酸序列互補(bǔ)的第一 核酸序列；與第二靶核酸序列互補(bǔ)的第二核酸序列；和連接所述第一和第二核酸序列的接 頭核酸序列；其中所述接頭隔開(kāi)第一和第二兩個(gè)序列，使得與第一靶核酸序列退火的第一 序列的解鏈溫度和與第二靶核酸序列退火的第二序列的解鏈溫度不相關(guān)。42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的探針，其中所述接頭是核苷接頭；更優(yōu)選地，所述接頭包含 多聚脫氧核糖核苷酸;最優(yōu)選地，所述接頭包含多聚脫氧肌苷或由多聚脫氧肌苷組成。43. 根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的探針，其中所述接頭長(zhǎng)度多至5、10、15、20、30、40、50個(gè) 核苷酸。44. 根據(jù)權(quán)利要求41-43所述的探針，其中所述第一和第二核酸序列二者都是報(bào)告子 區(qū)，其各自包含標(biāo)記。45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的探針，其中所述報(bào)告子區(qū)還包含阻斷區(qū)。46. 根據(jù)權(quán)利要求33-45中任一項(xiàng)所述的探針，其包含選自SEQ ID NO 5至SEQ ID NO 10的核苷酸序列，或選自SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 10的序列的修飾版本。47. -種包含多種根據(jù)權(quán)利要求33-46所述的探針的試劑盒。48. 權(quán)利要求47所述的試劑盒，其中選擇所述多種探針與靶序列的相鄰部分雜交。49. 權(quán)利要求47或48所述的試劑盒，其中所述多種探針是權(quán)利要求41-46所述的各個(gè)探 針。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105916999SQ201480065325
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2014年9月30日
【發(fā)明人】本·科布
【申請(qǐng)人】艾皮斯托姆有限公司