專利名稱：突變體的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的制造突變體方法，所述方法包括將改進(jìn)的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中，以及涉及用于制造基因突變體或表達(dá)突變基因的DNA構(gòu)建體和試劑盒。
背景技術(shù)：
現(xiàn)存的生物是通過(guò)誘變和環(huán)境對(duì)突變體的選擇長(zhǎng)期進(jìn)化而來(lái)的。普通進(jìn)化速度很慢，而且是經(jīng)過(guò)許多代才向前發(fā)展。另一方面，在免疫系統(tǒng)的制造抗體的細(xì)胞中，抗原誘變和選擇是在一代中完成的，下一代不會(huì)遺傳獲得的功能。免疫系統(tǒng)中這種快速的進(jìn)化可以解釋成對(duì)環(huán)境依賴的病原微生物突變的對(duì)抗。
本發(fā)明者以前獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，其中轉(zhuǎn)入了細(xì)菌來(lái)源的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因，并證明抗體基因的突變是受它的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制的，而且任何基因的突變都可以通過(guò)抗體基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的控制來(lái)誘導(dǎo)(Azuma，T.等，Int.Immunology，5(2)121-130(1992))。
現(xiàn)在使用的制造突變體的方法是一種突變體制造方法，在這個(gè)方法中，將缺失，插入和/或添加突變適當(dāng)?shù)匾胨璧腄NA序列中，即位點(diǎn)特異性地取代一定長(zhǎng)度DNA序列的位點(diǎn)特異性突變(位點(diǎn)特異突變(Site-specific mutagesis)，Zoller等，Nucleic Acid Res，10，6487-6500(1982)；Zooler等，Methods in Enzymol.，100，468-500(1983))。在利用人工合成的寡核苷酸做引物的一般錯(cuò)配突變中，合成的由大約20個(gè)堿基組成的互補(bǔ)寡核苷酸在堿基序列中準(zhǔn)備誘導(dǎo)突變的位點(diǎn)附近會(huì)產(chǎn)生一個(gè)任選突變，寡核苷酸和靶DNA雜交，然后，用DNA聚合酶可產(chǎn)生和靶DNA剩余序列互補(bǔ)的DNA。這樣就可能把所需的突變導(dǎo)入所需的位點(diǎn)。但這種方法不能一次誘導(dǎo)許多突變體。
在其他誘變系統(tǒng)中，有人檢測(cè)了在損傷基因的化合物存在的情況下，某種特定功能的消失或顯示(Myers等，科學(xué)，232，613-618(1986))，而另外的人則是利用細(xì)菌等。但是這些方法基本上和上述本發(fā)明者誘導(dǎo)突變的方法不同。
小鼠和人Ig V區(qū)的變異(多樣性)的產(chǎn)生方法如下將胚系中分隔存在的V，D和J基因區(qū)段組合連接，在連接過(guò)程中，這些區(qū)段的連接處有核苷酸的缺失和和添加，以及連接的V-(D)-J基因發(fā)生體細(xì)胞高變。體細(xì)胞高變和抗體的親和力成熟相關(guān)，而且在T細(xì)胞依賴的抗原(TD)刺激后可以經(jīng)常觀察到(Bothwell，A.L.M.等，細(xì)胞，24，625(1981)Gearhart，P.J.等，自然，291，29(1981)Griffiths，G.M.等，自然，312，271(1984)Maizels，N.等，細(xì)胞，43，715(1985)Wysocki，L.T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，1847(1986)Cumano，A.等，EMBO.J.，5，2459(1986)Berek，C.等，細(xì)胞，67，1121(1991)Taketani，M.等，Mol.Immunol.，32，983(1995)Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999)2-10)。利用κ鏈(O’Brien，R.L.等，自然，326，405(1987)Sharpe，M.J.等，Eur.J.Immunol.，20，1379(1990)Sharpe，M.J.等，EMBO.J.，10，2139(1991)Betz，A.G.等，細(xì)胞，77，239(1994)Yelamos，J.等，自然，376，225(1995)Peter，A.等，Immunity，4，57(1996)11-16)，λ鏈(Klotz，E.等，J.Immunol.，157，4458(1996)17)和H鏈轉(zhuǎn)基因小鼠(Durdik，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2346(1989)Sohn，J.等，J.Exp.Med.，177，493(1993)Tumas-Brundage，K.M.和Manser，T.，J.Exp.Med.，1985，239(1997)18-20)已經(jīng)鑒定出負(fù)責(zé)誘導(dǎo)體細(xì)胞高變的順式作用元件。
如上所述，本發(fā)明者制備了攜帶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，而氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因通過(guò)VH17.2.25(Loh，D.Y.等，細(xì)胞，33，85(1983)Grosschedl，R.和Baltimore，D.，細(xì)胞，41，885(1985)22，23)和J-C內(nèi)含子增強(qiáng)子(以后簡(jiǎn)寫成Eμ)(Gillies，S.D.等，細(xì)胞，33，715(1983)Banerji，J.等，細(xì)胞，33，729(1983)24，25)/基質(zhì)結(jié)合區(qū)(以后簡(jiǎn)寫成MAR)(Forrester，W.C.等，科學(xué)，265，1221(1994)26)驅(qū)動(dòng)的。結(jié)果，在CAT中檢測(cè)到了體細(xì)胞高變，而在VH啟動(dòng)子或Eμ/MAR側(cè)翼序列卻檢測(cè)不到。但是，在內(nèi)源性VH-D-JH中觀察到的突變頻率是約1/10，這表明這些順式作用元件對(duì)于高變而言是關(guān)鍵或重要的，而其他成分如3’端的Cλ，Cα或Cα的增強(qiáng)子側(cè)翼序列(3’增強(qiáng)子)(Pettersson，S.等，自然，344，165(1990)Dariavach，P.等，Eur.J.Immunol.，21，1499(1991)Lieberson，R.等，EMBO.J.，14，6229(1995)27-29)可能是造成高頻率的體細(xì)胞高變的原因(Sohn，J.等，J.Exp.Med.，177，493(1993)Tumas-Brundage，K.M.和Manser，T.，J.Exp.Med.，185，239(1997)Giusti，A.M.和Manser，T.J.Exp.Med.，177，793(1997)19，20，30)發(fā)明內(nèi)容為了鑒定對(duì)提高IgH基因高變頻率至關(guān)重要的成分，本發(fā)明者采用了由Chen等人開發(fā)的一個(gè)RAG-2缺陷(重組激活基因基因重排蛋白-2基因)胚泡補(bǔ)體系統(tǒng)(Chen，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，4528(1993)31)。將一系列僅在3’側(cè)翼區(qū)存在差異的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體微注射入RAG-2缺陷胚泡以轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(以后簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞)。從這個(gè)系統(tǒng)中得到的嵌合小鼠然后用T細(xì)胞依賴的抗原免疫。
結(jié)果，轉(zhuǎn)基因的VH-D-JH中體細(xì)胞高變頻率揭示出插入DNase I敏感區(qū)3b(以后簡(jiǎn)稱HS3b)和/或HS4(Madisen，L.和Groudine，M.，GenesDev.8，2212(1994)Michaelson，J.S.等，Nucleic Acids Res.，23，975(1995)Arulampalam，V等，Immunol.Today，18，549(1997)32-34)會(huì)誘導(dǎo)隨機(jī)的體細(xì)胞高變。
本發(fā)明的目的是提供隨機(jī)突變體的制造方法，在這種方法中，將其中修飾的真核啟動(dòng)子，外部DNA序列，內(nèi)含子增強(qiáng)子和3’HS3/4增強(qiáng)子連在一起的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)DNA構(gòu)建體而獲得一個(gè)突變基因的方法。本發(fā)明者找到了一種能產(chǎn)生這種突變體的DNA構(gòu)建體以及一種制造基因突變體或表達(dá)突變基因的試劑盒，從而完成了本發(fā)明。此外，從動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中獲得的突變基因表達(dá)產(chǎn)物意味著它已進(jìn)行了針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒性篩選。
本發(fā)明提供了下列第1到第20項(xiàng)。
第1項(xiàng).一種外源基因隨機(jī)突變體的制造方法，其中將至少含有下列(a)-(d)DNA序列的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，這樣，在動(dòng)物細(xì)胞中就獲得了外源基因的突變體(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子。
第2項(xiàng).根據(jù)第1項(xiàng)所述的制造方法，其中(d)增強(qiáng)子進(jìn)一步包括HS1和HS2。
第3項(xiàng).根據(jù)第1或第2項(xiàng)所述的制造方法，其中(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO1或2中的一段DNA序列。
第4項(xiàng).根據(jù)第1到第3項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列來(lái)自免疫球蛋白DNA序列。
第5項(xiàng).根據(jù)第2項(xiàng)所述的制造方法，其中(d)增強(qiáng)子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
第6項(xiàng).根據(jù)第1到第5項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中(a)啟動(dòng)子是VH啟動(dòng)子；和
(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO1和2中的DNA序列。
第7項(xiàng).根據(jù)第5或第6項(xiàng)所述的制造方法，其中所述的DNA構(gòu)建體是pvehc3’EHS3b/4。
第8項(xiàng).根據(jù)第1到第7項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中動(dòng)物細(xì)胞是B細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞。
第9項(xiàng).根據(jù)第8項(xiàng)所述的制造方法，其中B細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞源自前B淋巴細(xì)胞系細(xì)胞。
第10項(xiàng).一種在動(dòng)物細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)外源基因突變體而獲得突變基因表達(dá)產(chǎn)物的方法，所述外源基因突變體是根據(jù)第1到第9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的制造方法獲得的。
第11項(xiàng).一種制造外源基因突變體的DNA構(gòu)建體，其至少包括(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子。
第12項(xiàng).根據(jù)第11項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(d)增強(qiáng)子進(jìn)一步包括HS1和HS2。
第13項(xiàng).根據(jù)第11項(xiàng)或第12項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO1或2中的一段DNA序列。
第14項(xiàng).根據(jù)第11到第13項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列來(lái)自免疫球蛋白DNA序列。
第15項(xiàng).根據(jù)第11到第14項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(d)增強(qiáng)子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
第16項(xiàng).根據(jù)第11到第15項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(a)啟動(dòng)子是VH啟動(dòng)子，和(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO1和2中的DNA序列。
第17項(xiàng).根據(jù)第11或第12項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中所述DNA構(gòu)建體是pvehc3’EHS3b/4。
第18項(xiàng).一種用于外源基因突變體的制造方法或產(chǎn)生突變基因的表達(dá)產(chǎn)物的試劑盒，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)制造外源基因突變體的突變DNA序列的表達(dá)，所述試劑盒包括一種載體，所述載體具有(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因插入位點(diǎn)；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子。
第19項(xiàng).根據(jù)第18項(xiàng)所述的試劑盒，其中(d)增強(qiáng)子進(jìn)一步包括HS1和HS2。
第20項(xiàng).含有SEQ ID NO14序列的VH17.2.25啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明，將外源基因?qū)胧芸贵w基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子控制的系統(tǒng)，因此能獲得具有頻繁和隨機(jī)突變的基因簇，同時(shí)提供一種用于動(dòng)物細(xì)胞系突變體的制造方法，其中突變被廣泛引入肽或蛋白，這樣就可能去改進(jìn)和改變自然發(fā)生的蛋白的功能。例如，有可能開發(fā)新型的針對(duì)抗生素抗性細(xì)菌具有改進(jìn)功能的抗生素，農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品或一些功能更好的改進(jìn)的肽類藥物，如干擾素和生長(zhǎng)激素。此外，利用動(dòng)物細(xì)胞，可以同時(shí)進(jìn)行毒性篩選，因此，能檢查初步的毒力，并快速創(chuàng)造出功能改進(jìn)的各種不同的肽類產(chǎn)物。
在本說(shuō)明書后文中，氨基酸，肽，堿基序列，核酸等的簡(jiǎn)寫表示應(yīng)遵循IUPAC-IUB的規(guī)定(IUPAC-IUB對(duì)生物命名的通訊(IUPAC-IUBcommunication on Biological Nomenclature)，Eur.J.Biochem，1389(1984))“說(shuō)明書的準(zhǔn)備和其他含堿基序列或氨基酸序列的材料指南”(Guideline for the preparation of specification and others containing abase sequence or an ammo acid sequence)(日本專利局編輯)及本領(lǐng)域的常規(guī)符號(hào)。
根據(jù)通用基因工程技術(shù)(分子克隆第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)；Continuation of Biochemical Experiment Course，GeneticResearch Method I，II和III，Japanese Biochemical Society(1986))或基因重組技術(shù)(例如參考，科學(xué)，224，1431(1984)；Biochem.Biophys.Res.Comm.，130，692(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，80，5990(1983))能輕易地合成DNA，構(gòu)建含有外源基因的DNA構(gòu)建體(例如表達(dá)載體)，DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及由宿主細(xì)胞分泌表達(dá)蛋白等。
在本發(fā)明中，突變體指的是含有外源基因的隨機(jī)突變DNA序列的基因或含有由隨機(jī)突變基因編碼的突變氨基酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，可在動(dòng)物細(xì)胞中獲得突變體產(chǎn)物的方法如下制備DNA構(gòu)建體，其由本發(fā)明提供，用于誘導(dǎo)突變體(重組DNA)，它能在含有編碼所需蛋白的基因的宿主細(xì)胞中表達(dá)，然后把構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
在說(shuō)明書中“把DNA構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞”意思是指把外源基因整合到動(dòng)物細(xì)胞的基因組中。
獲得突變基因表達(dá)產(chǎn)物的方法如下培養(yǎng)含有上述外源基因突變體的轉(zhuǎn)化子，然后從所得的培養(yǎng)物中收集表達(dá)產(chǎn)物。
由本發(fā)明提供的用于誘導(dǎo)突變體的DNA構(gòu)建體在其結(jié)構(gòu)中至少包括(a)啟動(dòng)子，(b)外源基因，(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子，以及(d)在Dnase I敏感區(qū)含HS1，HS2和HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子，并且通過(guò)通用基因工程技術(shù)可輕易地制備或獲得。
為了制備本發(fā)明中的各個(gè)基因(DNA)，這個(gè)基因可以來(lái)源于合適的起源或通過(guò)化學(xué)合成。
具體來(lái)說(shuō)，DNA合成可以通過(guò)亞磷酰胺法或三酯法進(jìn)行化學(xué)合成，或者也可用商業(yè)上的全自動(dòng)寡核苷酸合成儀進(jìn)行合成。從化學(xué)合成的單鏈產(chǎn)物也可制備雙鏈DNA片段，其方法如下合成互補(bǔ)鏈，在合適的條件下使這些鏈一起退火，然后用DNA聚合酶和合適的引物序列合成互補(bǔ)鏈。
此外，每個(gè)基因也可用下述方法獲得用上述的方法進(jìn)行DNA合成，或從含有該基因的載體或從其中基因得以表達(dá)的合適起源中，用一般方法構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù)，然后用合適的探針或?qū)蛱禺惖目贵w去篩選所需的克隆(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，6613(1981)；科學(xué)，222，778(1983)等)。
上面列舉為cDNA起源的有各種不同的細(xì)胞和組織，其中每個(gè)基因都可以表達(dá)，以及衍生自這些細(xì)胞和組織的培養(yǎng)細(xì)胞等。此外，用常規(guī)的方法可以從這些起源中分離總RNA，分離和純化mRNA，制備和克隆cDNA等。商業(yè)上買到cDNA文庫(kù)，如來(lái)自Clontech Lab.Inc的cDNA文庫(kù)也能用于本發(fā)明。從cDNA文庫(kù)中篩選基因的方法不受限制，它也可以采用常規(guī)方法進(jìn)行。
具體而言，使用針對(duì)蛋白的特異抗體，對(duì)通過(guò)cDNA所產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行免疫篩選的方法，選擇對(duì)應(yīng)cDNA克隆的方法，用選擇性結(jié)合靶DNA的探針進(jìn)行噬菌斑雜交和集落雜交的方法，以及這些方法的組合等均可使用。
作為這里使用的探針，一般采用根據(jù)每個(gè)基因的堿基序列信息而化學(xué)合成的DNA序列，但根據(jù)本發(fā)明獲得的基因或基因片段使用起來(lái)也能獲得滿意的效果。根據(jù)外源基因堿基序列設(shè)計(jì)的有義引物或反義引物也能作為篩選用探針。
對(duì)應(yīng)于每個(gè)基因DNA序列的部分核苷酸序列均可用作上述的探針。核苷酸序列可至少含15個(gè)連續(xù)的堿基，優(yōu)選的是20個(gè)連續(xù)堿基，更優(yōu)選的是30個(gè)連續(xù)堿基，而最優(yōu)選的則是50個(gè)連續(xù)的堿基。此外，含有所述序列的陽(yáng)性克隆本身也可用作探針。
用PCR法擴(kuò)增DNA/RNA是獲得基因的優(yōu)選方法(科學(xué)，230，1350(1985))。尤其是當(dāng)很難從文庫(kù)中獲得全長(zhǎng)cDNA時(shí)，RACE法(cDNA末端快速擴(kuò)增法，Journal of Experimental Medicine，12(6)，35(1994))，尤其是5’RACE法(M.A.Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，8，8998(1998))等可以優(yōu)選采用。
當(dāng)采用PCR方法時(shí)，所用引物可根據(jù)基因序列信息加以設(shè)計(jì)，并用常規(guī)方法合成。擴(kuò)增的DNA/RNA片段可以用如上所述的常規(guī)方法分離和純化，如凝膠電泳。
上面獲得的基因序列或各種不同的DNA片段序列可以用雙脫氧測(cè)序法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463(1977)和Maxam-Gilber化學(xué)測(cè)序法(Methods in Enzymology，65，499(1980)等常規(guī)方法確定，或者，更容易地可以使用商用測(cè)序試劑盒等來(lái)測(cè)序。
(b)所需的外源基因在上述DNA構(gòu)建體的組成中，用作(b)外源基因的DNA既可以是衍生自所需基因的外源基因，也可是誘導(dǎo)突變體的表達(dá)蛋白?；蛘?，用作外源基因的DNA可以是合成的。用于本發(fā)明制造突變體的方法的外源基因長(zhǎng)度一般是4kb或更小，優(yōu)選的是3kb或更小，更優(yōu)選的是大約2kb，但也可使用長(zhǎng)度大于4kb的外源DNA序列。
就從外源基因表達(dá)時(shí)展示生物活性來(lái)看，對(duì)它沒有特別限制，如生長(zhǎng)激素(GH)，胰島素，干擾素，促紅細(xì)胞生成素等。
為了更容易地檢測(cè)插入到宿主細(xì)胞基因組的外源基因，用作所謂的標(biāo)記基因的DNA序列可以和上述(b)外源基因的DNA序列連接在一起。
使用這樣獲得的外源基因的部分或全部序列，可以特異性地檢測(cè)外源基因及其突變體在個(gè)體或各種不同組織中的表達(dá)。
可以用常規(guī)的方法進(jìn)行這種檢測(cè)，如通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增RNA(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，E.S.Kawasaki等，RNA的擴(kuò)增(Amplification ofRNA)，In PCR Protocol，方法和應(yīng)用指南(A Guide to methods andapplications)，Academic Press，Inc.，San Diego，21-27(1991))，RNA印跡分析(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Lab.(1989))，利用原位RT-PCR(Nucl.Acids Res.，21，3159-3166(1993))和原位雜交在細(xì)胞水平上的檢測(cè)，NASBA方法(基于核酸序列的擴(kuò)增，自然，350，91-92(1991)以及其他各種方法。RT-PCR是優(yōu)選的檢測(cè)方法。
外源基因用合適的限制酶剪切，得到限制性DNA片段，即DNA構(gòu)建體的(b)外源基因。
(c)啟動(dòng)子用作上述DNA構(gòu)建體的組成的(a)啟動(dòng)子包括免疫球蛋白重鏈可變區(qū)啟動(dòng)子(VH啟動(dòng)子)，來(lái)自SV40的啟動(dòng)子，反轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子，腺病毒啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，來(lái)自諸如多瘤病毒或乙型肝炎病毒的啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子，熱激啟動(dòng)子，SRα啟動(dòng)子，以及其它對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效的啟動(dòng)子等。VH啟動(dòng)子，尤其是VH17.2.25啟動(dòng)子(Gillies，S.D.等，細(xì)胞，33，715(1983)Banerji，J.等，細(xì)胞，33，729(1983))在本發(fā)明中是優(yōu)選使用的。
例如，上述啟動(dòng)子可包括誘導(dǎo)新霉素抗性基因或四霉素抗性基因的啟動(dòng)子。
上述啟動(dòng)子可以兩個(gè)或多個(gè)連在一起。
上述啟動(dòng)子的各種DNA序列是已知的，而且其背景信息也是可得到的。
(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子內(nèi)含子增強(qiáng)子是一段DNA序列，它能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，含有插在重鏈JH基因和Cμ基因的外顯子之間的未表達(dá)區(qū)序列。免疫球蛋白的重鏈增強(qiáng)子(Cμ增強(qiáng)子)和κ-鏈增強(qiáng)子(κ增強(qiáng)子)便是(c)中內(nèi)含子增強(qiáng)子的例子。
(d)脫氧核糖核酸酶I(DNase I)敏感區(qū)DNase I敏感區(qū)是用低濃度DNase I處理分離的細(xì)胞核時(shí)遭受片段化的區(qū)域。在免疫球蛋白重鏈基因中，HS1，HS2，HS3b和HS4都是已知的。HS3b/4指的是HS3b和HS4兩者或其中一個(gè)。本發(fā)明的特征是含有HS3b區(qū)和/或HS4區(qū)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了HS3b和/或HS4，還包含HS1和HS2(它們?cè)谶@里稱作3’E)。沒有內(nèi)含子的序列表示為3’EHS3b/4，它包含Lieberson，R等人公開的3’增強(qiáng)子的Xba I片段(4.0kb)(EMBO，J.，14，6229(1995)和Madisen，L等人公開的MP11的HS3(1182bp)和HS4(1381bp)(Genes Dev.，8，2212(1994)。
連接每段基因(DNA構(gòu)建體的制備用)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的制備方法為，例如，通過(guò)常規(guī)方法把上述每個(gè)基因插入合適的表達(dá)載體，例如，把每個(gè)元件插入到有合適抗生素抗性基因的載體。具體而言，DNA構(gòu)建體的的構(gòu)建是將啟動(dòng)子，外源基因，內(nèi)含子增強(qiáng)子，DNase I敏感區(qū)(包括HS3b和/或HS4的DNA序列，如果有必要，進(jìn)一步還包括含3’E的增強(qiáng)子)插入到動(dòng)物細(xì)胞系中所用的帶任選抗生素抗性基因的載體，這些元件用任選的限制性酶從載體克隆，基因組DNA或質(zhì)粒中切割而來(lái)或人工合成的。
具體而言，用限制性酶，連接酶等根據(jù)常規(guī)方法，便可將基因插入到載體。
在所需的重組表達(dá)載體中，內(nèi)含子增強(qiáng)子和3’EHS3b/4增強(qiáng)子可以從5’到3’端同向構(gòu)建，也可從3’到5’端同向構(gòu)建或從5’到3’端反向構(gòu)建，也可從3’到5’端反向構(gòu)建。
在上述DNA構(gòu)建體中，插入外源基因的啟動(dòng)子和3’EHS3b/4增強(qiáng)子之間的間隔可以是0.1kb-100kb，優(yōu)選的是1-10kb，更優(yōu)選的是2-5kb。
優(yōu)選的表達(dá)載體的例子是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。更具體而言，如pIND(Invitrogen)，pcDNA3.1/His(Invitrogen)，Pegfp-N，pEGFP-C(Clontech)等。
根據(jù)本發(fā)明者和其它人(Azuma，T等，Int，Immunology，5(2)121-130(1993)，含有(a)啟動(dòng)子和(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子的DNA構(gòu)建體的例子是一種含VH啟動(dòng)子和內(nèi)含子增強(qiáng)子的表達(dá)載體。它可被優(yōu)選用來(lái)制備DNA構(gòu)建體。
在上述含啟動(dòng)子和內(nèi)含子增強(qiáng)子的表達(dá)載體中，啟動(dòng)子位于外源基因的上游5’端，從而可誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。然后依次是外源基因，內(nèi)含子增強(qiáng)子。
上述載體用于制備含有外源基因的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，當(dāng)對(duì)其進(jìn)行修飾，使其含有一個(gè)啟動(dòng)子，所需外源基因的插入位點(diǎn)，對(duì)誘導(dǎo)突變所必需的一個(gè)/或多個(gè)增強(qiáng)子(尤其是免疫球蛋白增強(qiáng)子和內(nèi)含子增強(qiáng)子)和DNase I敏感區(qū)時(shí)，它都可以有效作為DNA構(gòu)建體用于外源基因突變體的制造方法或獲得突變基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑盒中。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以是環(huán)形DNA或線形DNA。
可以用常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)是否獲得了本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，例如用限制性酶去切割構(gòu)建體，然后進(jìn)行電泳，或結(jié)合PCR，Southern雜交和測(cè)序等。
突變體的制造方法在外源基因的制造方法中，首先，把用上述方法產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，從而獲得同源性重組體。
宿主細(xì)胞的例子包括真核生物，包括哺乳動(dòng)物，酵母，植物等的細(xì)胞，但哺乳動(dòng)物細(xì)胞是優(yōu)選的。和可使突變更有效的決定子一起轉(zhuǎn)化的確立的細(xì)胞系優(yōu)選用作這樣的細(xì)胞，猴COS細(xì)胞(細(xì)胞，23，175(1981))，中國(guó)倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞，Hela細(xì)胞，大鼠II成纖維細(xì)胞，消化道上皮細(xì)胞和它的二氫葉酸還原酶缺陷株(Proc.Nalt.Acad.Sci.USA.774126(1980))。就已經(jīng)建立起來(lái)的細(xì)胞系而言，優(yōu)選使用，但不限于，例如T細(xì)胞或B細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞，尤其是前B細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選的是J558細(xì)胞和J558L細(xì)胞。就酵母細(xì)胞而言，用的是酵母屬等的酵母細(xì)胞。此外，來(lái)自動(dòng)物活體的細(xì)胞也能用作宿主細(xì)胞。
把外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞基因組的結(jié)果是能獲得轉(zhuǎn)化了本發(fā)明DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化子。
把本發(fā)明DNA構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以用本領(lǐng)域已知的把DNA導(dǎo)入細(xì)胞的各種方法來(lái)進(jìn)行，例如電穿孔法，磷酸鈣共沉淀法，脂質(zhì)體法，DEAE葡聚糖法，顯微注射法，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)等。電穿孔法是優(yōu)選采用的。
能導(dǎo)入本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞的例子包括受精卵，胚胎，生殖細(xì)胞等。導(dǎo)入細(xì)胞可以用常規(guī)的方法來(lái)進(jìn)行。
突變體是否獲得可以用已知的方法來(lái)檢查，例如通過(guò)隨機(jī)測(cè)序方法或通過(guò)確定外源基因表達(dá)產(chǎn)物的活性以及選擇其活性區(qū)別于外源基因表達(dá)產(chǎn)物的突變體。此外，也可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)活性和活性的程度，或根據(jù)活性高低來(lái)選擇突變體。
轉(zhuǎn)化有目的外源DNA的分離形式的細(xì)胞本身，含有隨機(jī)突變基因，可改進(jìn)成和人外源基因相關(guān)的肽，肽的功能更好。因此，它能用作藥物來(lái)改善疾病，也能作為一種模式系統(tǒng)用于治療研究。
得到的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)的方法培養(yǎng)。結(jié)果，由外源基因的突變體所編碼的本發(fā)明的目的蛋白在胞內(nèi)，胞外或轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞膜上表達(dá)和產(chǎn)生(積累，分泌)。
根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，各種普通培養(yǎng)基可以適當(dāng)?shù)丶右赃x擇并用于培養(yǎng)，而培養(yǎng)可在適合宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)下進(jìn)行。
如果有必要，可以根據(jù)重組蛋白的物理或化學(xué)特性，采用各種不同的分離方法來(lái)分離和純化本發(fā)明獲得的重組蛋白(例如，參考Biochemistry Data Book II，1175-1259，Editionl，Issue 1，由TokyoKagaku Dojin出版(1980年6月23日)；Biochemistry，25(25)，8274(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313(1987)等)。
普通重建方法，即能使蛋白沉淀的方法(鹽析法)，離心分離，滲透沖擊法，超聲破碎，超濾，分子篩層析(凝膠過(guò)濾)，吸附層析，離子交換層析，親和層析，各種液相層析如高效液相色譜(HPLC)，透析及這些方法的組合都可以作為上述方法的具體例子。例如，用一個(gè)結(jié)合有本發(fā)明蛋白特異抗體的柱子進(jìn)行親和層析是特別優(yōu)選的。
這樣，將本發(fā)明的重組表達(dá)載體導(dǎo)入一動(dòng)物細(xì)胞中以生成外源DNA，導(dǎo)致由所述DNA編碼的隨機(jī)突變體。本發(fā)明的重組表達(dá)載體表達(dá)隨機(jī)突變體的頻率至少是在約1×10-4到約1×10-3/bp/代。
本發(fā)明提供了一種突變體的制造方法，這個(gè)突變體含有真核細(xì)胞，尤其是動(dòng)物細(xì)胞，所述動(dòng)物細(xì)胞中含有上述的重組載體，而重組載體中則含有外源DNA或外源基因的插入位點(diǎn)，從而可以完成導(dǎo)入的DNA序列或基因突變體的表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明制造突變體的方法，可以對(duì)具抗微生物活性、但由于其對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒性而不可用的肽進(jìn)行改進(jìn)，使這種肽變成低毒性和高抗微生物活性的肽。同樣，試圖改進(jìn)或改變一些蛋白的功能也是有可能的，如自然存在的干擾素，生長(zhǎng)激素等。因此，可以提供一種開發(fā)農(nóng)業(yè)化學(xué)物質(zhì)或改進(jìn)藥物功能等的有用方法。
而且，本發(fā)明還提供用來(lái)制造外源基因突變體或制造突變基因的表達(dá)產(chǎn)物的試劑盒，其含有DNA構(gòu)建體，這個(gè)DNA構(gòu)建體中有外源DNA或外源基因的插入位點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，DNA構(gòu)建體包括(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子，如果有必要，還進(jìn)一步包括HS1和HS2。
根據(jù)本發(fā)明制造突變體的試劑盒，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞具低毒性和高抗微生物活性的改進(jìn)肽以及功能改善的蛋白藥物如天然存在的干擾素，生長(zhǎng)激素等本發(fā)明也提供。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A所示的是IgH突變轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體用來(lái)制造嵌合小鼠的示意圖。
在
圖1B中，用來(lái)擴(kuò)增cDNA的引物的位置和方向用箭頭表示。
圖2所示的是從轉(zhuǎn)染有
圖1所示的IgH突變基因的J558L細(xì)胞中制造產(chǎn)抗-NP抗體的人Cμ。使用包被有NP9-BSA的平板，對(duì)培養(yǎng)了12小時(shí)的J558L細(xì)胞(1×106細(xì)胞/ml)的上清進(jìn)行ELISA，從而估計(jì)抗體的產(chǎn)量。
圖3A所示的是在嵌合小鼠A4-3，2-1和2-3中，用ES細(xì)胞對(duì)RAG-2-/-小鼠的免疫系統(tǒng)進(jìn)行重建的過(guò)程。使用包被有大鼠抗小鼠IgM單克隆抗體的平板和POD標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgM抗體，通過(guò)ELISA檢測(cè)免疫前小鼠中的小鼠IgM的水平。
圖3B所示的是使用包被有小鼠抗人IgM抗體和POD標(biāo)記的山羊IgM抗體檢測(cè)免疫前或免疫血清中人IgM的水平。免疫血清被稱作TD。
來(lái)自Balb/c小鼠和RAG-2-/--小鼠的抗血清在A中用作對(duì)照，除了這些血清以外的J558L的培養(yǎng)物上清在B中用作對(duì)照。
圖3C所示的是抗NP抗體與包被抗NP9-BSA抗體的平板結(jié)合的分析。用POD標(biāo)記的抗小鼠IgG來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。
圖3D所示的是來(lái)自嵌合小鼠的抗血清和用NP1-BSA或NP12-BSA包被的平板的結(jié)合比率。
圖4所示的是用RT-PCR特異性擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因。用NP34-CGG免疫嵌合小鼠，從中提取嵌合小鼠IgM-B220+脾細(xì)胞的mRNA，然后以此制備cDNA，并通過(guò)PCR擴(kuò)增。只有嵌合小鼠會(huì)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)基因的條帶(泳道1-6)，而C57BL/6小鼠卻不會(huì)產(chǎn)生這樣的條帶(泳道7)。J558L細(xì)胞轉(zhuǎn)染子(泳道8)和非轉(zhuǎn)染子(泳道9)也如圖所示被用作陽(yáng)性或陰性對(duì)照。
圖5所示為來(lái)自脾臟IgM-B220+細(xì)胞(A)和腹膜B1細(xì)胞(B)的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中體細(xì)胞高變的分布和發(fā)生頻率的比較。
來(lái)自兩種嵌合小鼠的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中體細(xì)胞高變的分布和頻率分別如圖A所示。底部數(shù)值表示的是根據(jù)Kabat等人的方法所編號(hào)的氨基酸位置。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式下面給出的一些實(shí)施例可以更詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但這些實(shí)施例并不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例11)IgH轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建構(gòu)建了攜帶不同3’側(cè)翼區(qū)的人Cμ的IgH鏈(IgH)。含有VH啟動(dòng)子和含Eμ/MAR的片段的獲得將含有VH17.2.25啟動(dòng)子(0.55kbSEQ ID No.14)、帶有Kpn I和Apa I限制酶切位點(diǎn)的片段，以及另一個(gè)含有Eμ/MAR(1kb)、帶有XhoI和Sal I位點(diǎn)的片段，通過(guò)PCR從構(gòu)建體[具氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的質(zhì)粒，CAT基因由位于pBluescript SK(+)限制酶Xba I和XhoI位點(diǎn)之間、來(lái)源于VH17.2.25的VH啟動(dòng)子和內(nèi)含子增強(qiáng)子(J-C內(nèi)含子增強(qiáng)子/基質(zhì)結(jié)合區(qū)(簡(jiǎn)寫成Eμ/MAR))所控制]中克隆出來(lái)，這個(gè)質(zhì)粒是本發(fā)明者以前制備用來(lái)制造CAT轉(zhuǎn)基因小鼠的(Azuma，T.等，Int.Immunology，5(2)121-130(1993))。
VH-D-JH基因片段的獲得含有限制酶Apa I和Xho I位點(diǎn)的重排VH-D-JH基因片段(2.0kb)也可利用來(lái)自A6的基因組DNA，通過(guò)PCR克隆，A6是一個(gè)能制造抗4-羥基-3-硝基苯基因乙酰單克隆抗體(下文稱作抗-NP單克隆抗體)的雜交瘤，它是從C57BL/6小鼠(Tokyo Animal Center)中獲得的(Taketani，M.等，Mol.Immunity，32，983(1995)Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999))。
依次將VH啟動(dòng)子，VH-D-JH基因和Eμ/MAR克隆進(jìn)Bluescript IISK(購(gòu)自Stratagene)。
人Cμ基因的獲得從一個(gè)噬菌體克隆CH.H.Igμ-24(Takahashi，N.等，Nucleic AcidRes.，8，5983(1980)；Health Science Resources Bank)獲得人Cμ基因的6.9kb Xba I片段。
3’增強(qiáng)子的獲得從J.Manis和F.Alt博士(Harvard Medical School)獲得含3’增強(qiáng)子(后文簡(jiǎn)寫成3’E)的Xba I片段(4.0kb)的質(zhì)粒(Lieberson，R.等，EMBO.J，14，6229(1995))。用如SEQ ID No.3-6所示的引物和來(lái)自B細(xì)胞淋巴瘤MPC11(Madisen，L.和Groudine，M.，Genes Dev.8，2212(1994))的基因組DNA，通過(guò)PCR克隆片段，該片段含有如SEQ ID No.1所示的HS3b(1.2kb)和如SEQ ID No.2所示的HS4(1.4kb)。在每個(gè)引物序列中，限制酶Spe I或Xba I的識(shí)別位點(diǎn)用下劃線表示。
SEQ ID NO.3HS3-S5’-TCTAGAACCACATGCGATCTAAGGGATATTGGGG-3’SEQ ID NO.4反義HS3 Spe I5’-CAGGACTAGTGATCATTGAGCTCCGGCTCTAAC-3’SEQ ID NO.5HS4-S XbaI5’-CTAGTCTAGACTGCAGACTCACTGTTCACCATG-3’SEQ ID NO.6反義HS4 Spe I5’-GTGGACTAGTAAGCTTGGAGTTAGGTGGGTAGG-3’將這些片段按HS3b和HS4的順序連接到3’E的3’端。3’E，HS3b和HS4串聯(lián)，中間沒插入任何Ig內(nèi)含子序列。
通過(guò)基因重組技術(shù)，利用上述的各個(gè)片段，可以獲得如下三種構(gòu)建體pvehc△3’E(12kb)，pvehc3’E(16kb)和pvehc3’EHS3b/4(19kb)。
2)轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體包含由小鼠VH186.2編碼的V區(qū)，它是參與對(duì)4-羥基-3-硝基苯乙酰半抗原應(yīng)答的顯性VH(Bothwell，A.L.M.等，細(xì)胞，24，625(1981))。
將從A6重排的小鼠VH186.2-DFL16.1-JH2基因連接到人Cμ，這樣便于區(qū)別編碼的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性小鼠H，A6是能制造針對(duì)4-羥基-3-硝基苯乙酰的單克隆抗體的雜交瘤(Taketani，M.等，Mol.Immunity，32，983(1995)Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999))。
此外，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因在B細(xì)胞表面的表達(dá)會(huì)改變B細(xì)胞的發(fā)育，所以從Cμ去除跨膜外顯子能防止轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞表面的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因僅包含Cμ，而沒有編碼其它H鏈同種型的基因區(qū)。
所有這三種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體都包含來(lái)自小鼠J-Cμ內(nèi)含子的VH啟動(dòng)子和Eμ/MAR，它們作為順式作用元件，已用于CAT轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建(Azuma，T.等，Int.Immunol.，5，121(1993))。因此，轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的差異主要限制在3’側(cè)翼區(qū)(
圖1)。
構(gòu)建體之一pvehc△3’E，缺乏3’增強(qiáng)子區(qū)，受VH啟動(dòng)子和Eμ/MAR控制。另一個(gè)構(gòu)建體pvehc3’E除了VH啟動(dòng)子和Eμ/MAR外，還包含3’增強(qiáng)子(Lieberson，R.等，EMBO.J.，14，6229(1995))。將含有3’增強(qiáng)子(3’E)的限制酶BamH I片段(4.0kb)用于基因構(gòu)建。在pvehc3’E上添加HS3b和HS4產(chǎn)生一個(gè)稱作pvehc3’EHS3b/4的構(gòu)建體。
內(nèi)源性IgH基因含有一個(gè)附加的順式作用元件，叫HS3a(Matthias，P.和Baltimore，D.，Mol.Cell Biol.，13，1547(1993))，它和HS3b的核苷酸序列完全一樣，但方向相反(Arulampalam，V.等，Immunol.Today，18，549(1997))。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體不含這個(gè)順式作用元件。
實(shí)施例21)將IgH突變基因(Lundblad，A.等，Immunochemistry 9，535-544(1972))轉(zhuǎn)染進(jìn)J558L細(xì)胞以及制備抗體為了評(píng)估這三個(gè)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄活性，將這些載體轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系J558L細(xì)胞中。將含有限制酶Not I識(shí)別位點(diǎn)的線形IgH基因構(gòu)建體(10μg)進(jìn)行電穿孔(Sahagaw，B.G.等，1986，J.Immunol.，1371066-1074)，和質(zhì)粒pSV2-gpt(1.6μg)(Mulligan，R.C.&Berg P.科學(xué)，209；1422-1427(1980))共轉(zhuǎn)染進(jìn)J558L細(xì)胞。特異的電穿孔條件如下所示。
設(shè)備基因脈沖發(fā)生器(BIO-RAD laboratories)
條件緩沖液PBS細(xì)胞0.5mL PBS中的J558L，濃度是2×107細(xì)胞/ml線形DNAIgH轉(zhuǎn)基因(10μg)和pSV2-gpt(1.6μg)反應(yīng)條件電容(960μF)，電壓(350V)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)在存在CO2以及次黃嘌呤，黃嘌呤和霉酚酸(Sigma)的混合物中。對(duì)藥物抗性IgH基因的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行有限稀釋，根據(jù)抗體的產(chǎn)量來(lái)選擇克隆。具體而言，用ELISA來(lái)檢測(cè)抗-NP嵌合抗體的產(chǎn)量(圖2)。
為了定量分析抗體產(chǎn)量，將從每個(gè)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中誘導(dǎo)而來(lái)的一些轉(zhuǎn)化子克隆，用含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基(總體積200μL；Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd)在平底96孔的平板中培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/mL。用含1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖液(PBS)將培養(yǎng)物上清稀釋成不同濃度，利用包被有NP9-BSA的聚乙烯平板，通過(guò)ELISA進(jìn)行分析。過(guò)氧化物酶(POD)標(biāo)記的抗小鼠λ1鏈抗體(Southern Biotech)或抗人μ鏈抗體(ZYMED)可以用來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。
結(jié)果如圖2所示。
轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體被設(shè)計(jì)來(lái)表達(dá)嵌合H鏈，嵌合H鏈含有小鼠抗-NP單克隆抗體的VH區(qū)和人Ig的C區(qū)，它們被期望用來(lái)和小鼠λ1鏈裝配從而產(chǎn)生抗-NP的嵌合抗體。
所有構(gòu)建體被有效地轉(zhuǎn)染在J558L細(xì)胞中，并通過(guò)和內(nèi)源性λ1鏈配對(duì)從而制造抗-NP的抗體。在這些構(gòu)建體中，pvehc△3’E和其他構(gòu)建體相比表現(xiàn)出很弱的產(chǎn)量。3’E的添加(pvehc3’E)導(dǎo)致抗體產(chǎn)量的顯著增長(zhǎng)，然而，進(jìn)一步添加HS3b和HS4看起來(lái)對(duì)抗體產(chǎn)量沒有影響。盡管涉及轉(zhuǎn)錄對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)染DNA的拷貝數(shù)的依賴知之甚少，本發(fā)明者還是認(rèn)為，抗體產(chǎn)量數(shù)反應(yīng)了構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄活性，這種轉(zhuǎn)錄活性在pvehc3’E和pvehc3’EHS3b/4之間沒有顯著差異。
實(shí)施例31)嵌合小鼠的制造為了制造嵌合小鼠，本發(fā)明者采用至少兩種獨(dú)立的轉(zhuǎn)染ES克隆用于對(duì)RAG-2-/-小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行顯微注射。本發(fā)明者也使用至少兩種嵌合小鼠/轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體用于分析體細(xì)胞高變。用于本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞系和嵌合小鼠如表1所示。
用Bio-Rad基因脈沖發(fā)生器將PGKneo的EcoR I片段(1.5kb，1μg)和三種線形IgH轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(30μg)以實(shí)施例2中同樣的方式電穿孔進(jìn)1×107的E14-1細(xì)胞(Kuhn，R等，科學(xué)，254，707(1991))。
然后用G418(150μg/mL，Gibco)選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。選擇的克隆通過(guò)如下方法篩選用如SEQ ID No.7和8所示的兩個(gè)引物進(jìn)行PCR，這兩個(gè)引物可以和位于VH17.2.25啟動(dòng)子和JH2中的DNA序列雜交；然后分別使用人Cμ基因作為探針進(jìn)行Southern印跡。
SEQ ID NO.75’-GACTCAGGAGGACTCTAGTT-3’SEQ ID NO.85’-GGTGTCCCTAGTCCTTCATG-3’用95℃30sec，65℃30sec，和72℃1min，30個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。整合的pvehc3’E的拷貝數(shù)通過(guò)Southern印跡計(jì)算為2-3。用來(lái)自pvehc3’E轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)PCR分析，對(duì)pvehc△3’E和pvehc3’EHS3b/4的拷貝數(shù)進(jìn)行估計(jì)。
2)用嵌合小鼠制備抗體將含有IgH轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞克隆注射入RAG-2-/-的成纖維細(xì)胞(Takahashi，N.等，Nucleic Acids Res.，8，5983(1980))，并移植到ICR代養(yǎng)母鼠(8-12周大，CLEA Japan Inc.)的子宮中。用PE抗-CD3抗體或生物素抗-B220/SA-FITC將細(xì)胞染色后，含有源自嵌合小鼠ES細(xì)胞的B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫系統(tǒng)的互補(bǔ)性通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
將POD標(biāo)記的綿羊抗小鼠μ鏈抗體用來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體。為了分析具人Cμ的抗體，用綿羊抗人IgM抗體(Southern Biotech)包被平板，并將POD標(biāo)記的抗人IgM單克隆抗體(ZYMED)用作檢測(cè)結(jié)合抗體。J558L轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物上清，人Waldenstrom IgM，和抗-NP IgM單克隆抗體B4-3用作對(duì)照抗體。
圖1.使用的ES細(xì)胞和嵌合小鼠

和C57BL/6小鼠進(jìn)行回交來(lái)檢查轉(zhuǎn)基因的生殖傳遞，從產(chǎn)生的小鼠尾巴中提取DNA，根據(jù)小鼠中是否含有轉(zhuǎn)基因，從而分析嵌合小鼠的產(chǎn)生。
3)免疫和抗體產(chǎn)量為了檢查免疫系統(tǒng)是否和源自ES細(xì)胞的淋巴細(xì)胞發(fā)生重建，用ELISA檢測(cè)嵌合小鼠A4-3，2-1和2-3的免疫前血清中的IgM數(shù)量。
結(jié)果如圖3A所示。不管是何種轉(zhuǎn)基因，來(lái)自這些小鼠的所有血清中的小鼠IgM檢測(cè)數(shù)量是相似的，但比正常的BALB/c小鼠中的數(shù)量要小。
下一步，具不同NP值的NP34-雞γ球蛋白(NP34-CGG)和NP-BSA用Azuma等人相同的方法(Azuma，T等，Molec.Immunol.，24，287(1987))制備。
將包括4-羥基-3-硝基苯乙酰雞γ球蛋白(后文中簡(jiǎn)寫成NP34-CGG)的CFA(弗氏完全佐劑Difco，100μg/小鼠)施用給嵌合小鼠中，也可施用等量的IFA(弗氏不完全佐劑)進(jìn)行再次免疫。在最終給藥含NP34-CGG的PBS后三天，收集免疫小鼠的抗血清。然后把小鼠殺死，獲得組織樣品。
用包被有NP1-BSA或NP16-BSA的平板來(lái)檢測(cè)抗-NP的抗體產(chǎn)量以及這些抗體的親和力成熟。POD標(biāo)記的綿羊抗-小鼠IgG(ZYMED)被用作檢測(cè)這些抗體。
抗-NP的單克隆抗體F8用作不成熟抗體的對(duì)照，而C6則用作成熟單克隆抗體的對(duì)照(Takatani，M.等，Mol.Immunol.，32，983(1995)；Furukawa，K.等，Immunty，11，329(1999))。
結(jié)果如圖3B所示。表達(dá)人Cμ的由轉(zhuǎn)基因編碼的抗體在用NP34-CGG免疫的小鼠的免疫前或免疫后抗血清中沒有檢測(cè)到。
生成抗-NP單克隆抗體(γ1λ1)的雜交瘤制備自用NP34-CGG免疫的pvehc3’EHS3b/4小鼠。沒有一種分泌型抗體能表達(dá)人Cμ，然而，它們中的一些能在胞內(nèi)合成具人Cμ的H鏈。
結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因能在嵌合小鼠的B細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。然而，分泌的H鏈產(chǎn)物水平比可檢測(cè)的水平要低。
下一步，用ELISA檢測(cè)嵌合小鼠中針對(duì)TD抗原NP34-CGG的抗體反應(yīng)。結(jié)果如圖3C所示。抗體值改變了，但所有小鼠會(huì)產(chǎn)生抗IgG抗體，這表明免疫系統(tǒng)對(duì)抗NP抗體生成有應(yīng)答。
此外，這些抗體對(duì)NP1-BSA的結(jié)合比率涉及到對(duì)NP16-BSA的結(jié)合，其可以如檢測(cè)親和力成熟來(lái)加以檢測(cè)。結(jié)果如圖3D所示。
如圖3D所示，對(duì)照的單克隆抗體F8沒有表示出體細(xì)胞高變，它和NP-Cap的締合常數(shù)(Ka)是2×105/M，比率是0.29。另一方面，Ka是2×107的成熟單克隆抗體C6的比率在1左右(Furukawa，K.等，Immunity，11，329(1999))。所有來(lái)自嵌合小鼠的血清表示出和C6相似的比率，因此，用NP34-CGG免疫后，所有嵌合小鼠中的抗-NP抗體的親和力成熟向前發(fā)展的程度相似。
實(shí)施例4.VH基因的克隆和測(cè)序盡管免疫系統(tǒng)在嵌合小鼠中得以重建，但獲得足夠的PNAhiIgG+B細(xì)胞還是十分困難的，它們作為源自單個(gè)嵌合小鼠的核心生發(fā)細(xì)胞是很流行。因此，用NP34-CGG免疫后，用FACS Vantage對(duì)預(yù)計(jì)可選擇同種型轉(zhuǎn)換記憶B細(xì)胞的脾臟IgM-B220+細(xì)胞，，以及XX通過(guò)流式細(xì)胞儀加以分選。
來(lái)自用NP34-CGG免疫的嵌合小鼠脾臟的單細(xì)胞懸浮液用0.83％的氯化銨處理誘導(dǎo)溶血。在一些實(shí)驗(yàn)中，T細(xì)胞也用抗-Thy1抗體(T24/40和HO13.4)處理誘導(dǎo)溶血，然后用兔補(bǔ)體處理。這些細(xì)胞用藻紅素(PE)-標(biāo)記的抗-CD45R/B220(細(xì)胞表面分子，pherMingen)或異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗小鼠IgM(ZYMED)進(jìn)行染色。
腹膜細(xì)胞用生物素標(biāo)記的抗-CD5/FITC標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(pherMingen)和PE標(biāo)記的抗-CD45R(B220)染色。
CD45R(B220)+IgM-，CD45R(B220)+IgM-，或CD5+CD45R(B220)+在熒光激活細(xì)胞分選儀Vantage上通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分級(jí)(Becton，Dickinson公司)。
此外，作為一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，染色和分選后，從胸腺中獲得CD4+細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞。
根據(jù)制造商的說(shuō)明書，利用TRIzol(RNA制備試劑，GIBCO BRL)從用上述流式細(xì)胞術(shù)分級(jí)的脾臟或腹膜細(xì)胞中制備總RNA。
用寡(dT)作為引物和Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL)從總RNA中制備cDNA。這些cDNA樣品每個(gè)都用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，分別利用SEQ ID No.9的VH186.2引物和SEQ ID No.10的人Cμ引物用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因，而用SEQ ID No.9的VH186.2引物和SEQ ID No.11的小鼠Cγ1引物擴(kuò)增內(nèi)源性小鼠Ig基因。
SEQ ID NO.95’-CATGCTCTTCTTGGCAGCAAC-3’SEQ ID NO.105’-GCAGCCAACGGCCACGCTGC-3’SEQ ID NO.115’-GGCCGAATTCCATGGAGTTAGTTTGGG-3’PCR反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行95℃1min，62℃1min，和72℃1min，30個(gè)循環(huán)。轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性小鼠IgH基因的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，或使用TA克隆試劑盒(Invitrogen公司)連接到pCR-2.1(Invitrogen公司)，以及用如SEQ.NO.12(-20，Takara Bio公司)所示的M13引物，如SEQ ID NO.13(Takara Bio公司)所示的M13反式引物和Hitachi DNA測(cè)序儀model 5500(Hitachi，Ltd.)進(jìn)行測(cè)序。
如圖4所示，包括轉(zhuǎn)基因的抗體片段的表達(dá)得以鑒定。
2)在脾臟和腹膜B細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞高變將突變總數(shù)除序列確定的堿基總數(shù)便能計(jì)算出突變頻率。結(jié)果如表2所示。
表2.嵌合小鼠脾臟IgM-B細(xì)胞V區(qū)序列的突變

aCDR中的突變百分比＝100×(CDR中點(diǎn)突變的總數(shù))/(點(diǎn)突變的總數(shù))b突變頻率＝100×(點(diǎn)突變的總數(shù))/(堿基對(duì)的總數(shù))c分析了兩個(gè)嵌合小鼠為了分析轉(zhuǎn)基因中的體細(xì)胞高變，使用了能和VH186.2或人Cμ雜交的引物。對(duì)通過(guò)RT-PCR制備的cDNA進(jìn)行克隆和測(cè)序。結(jié)果如表3所示。在脾臟B細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中的體細(xì)胞高變的分布和頻率如圖5所示。
因?yàn)榻M合使用引物，因此轉(zhuǎn)基因的特異性擴(kuò)增只在嵌合小鼠的脾細(xì)胞中觀察到，但在用NP34-CGG免疫的C57BL/6小鼠中觀察不到。此外，還觀察到所有序列Z在CDR3中都有相同的連接多樣性，這是用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的A6DNA的特征。
關(guān)于基因構(gòu)建體pveh△3’E，由于體細(xì)胞高變導(dǎo)致的核苷酸改變?cè)赩H186.2-DFL16.1-JH2中觀察到了，但頻率比較低。突變頻率估計(jì)是0.17％(表2)。
盡管和pvehc△3’E相比，基因構(gòu)建體pvehc3’E的高變頻率有輕微上升，但仍表現(xiàn)出和pvehc△3’E基本相似的高變分布(表2)。
就pvehc3’EHS3b/4而言，它是把HS3b/4進(jìn)一步加到本發(fā)明基因構(gòu)建體pvehc3’E上，如在VH186.2-DFL16.1-JH2基因中的結(jié)果所示，體細(xì)胞高變的頻率顯著增長(zhǎng)(圖5)。盡管所有測(cè)序了的PCR克隆是隨機(jī)挑選的，但它們含有的核苷酸是變化的。這些核苷酸變化在CDR2(高可變區(qū)2)和CDR3區(qū)附近發(fā)現(xiàn)的頻率是很高的(圖5和表2)。
這些數(shù)據(jù)從兩種嵌合小鼠中獲得，這兩種嵌合小鼠對(duì)應(yīng)圖5所示的每種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，并且這些數(shù)據(jù)相互之間一致性良好。pvehc3’EHS3b/4中高的高變頻率是很明顯的。然而，來(lái)自同樣嵌合小鼠的腹膜B1細(xì)胞中突變明顯缺乏(圖5)。
下面表3所示的是轉(zhuǎn)基因中鑒定的堿基取代特征。
表3.IgH基因中的突變

從IgH轉(zhuǎn)基因之間的比較來(lái)看，很明顯堿基轉(zhuǎn)換和堿基易位頻率幾乎相同。
此外，在稱作RGYW基元(A/G，G，C/T，A/T)的基因座序列中(Kabat，E.A.等，US National Institutes of Health，Bethesda，M.D.，USA，p1394(1991)Rogozin，I.B.等，Biochim.Biophys.Acta.，1171，11(1992))，分析了在VH186.2轉(zhuǎn)基因中出現(xiàn)的體細(xì)胞高變。種系基因VH186.2(294bp)含有RGYW/WRCY基元(93bp)，對(duì)應(yīng)于總堿基的32％，而這個(gè)基元中出現(xiàn)的體細(xì)胞高變的頻率是34％，不顯著高于其他VH區(qū)。
工業(yè)實(shí)用性在上述的實(shí)施例中，本發(fā)明者采用了一個(gè)RAG-2-/-成纖維細(xì)胞系統(tǒng)制備嵌合小鼠，它攜帶不同順式元件的IgH轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明的制造方法優(yōu)于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，當(dāng)ES細(xì)胞用低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化時(shí)，它的優(yōu)點(diǎn)更甚。事實(shí)上，轉(zhuǎn)化子ES細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)通過(guò)Southern印跡和PCR計(jì)算，絕大部分情況下是3或更少(表1)。
在pvehc△3’E中只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)的高變，而該發(fā)現(xiàn)得以證實(shí)，因?yàn)轫樖阶饔迷?，VH啟動(dòng)子和Eμ/MAR不足以誘導(dǎo)高頻率的高變。在pvehc△3’E(pvehc3’E)添加3’增強(qiáng)子片段(4kb)導(dǎo)致高變的頻率上升約30％。
在本發(fā)明中，通過(guò)將HS3b和HS4導(dǎo)入pvehc3’E的3’增強(qiáng)子的3’端，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的高變的表達(dá)頻率大大增強(qiáng)，這表明構(gòu)建體pvehc3’EHS3b/4含有體細(xì)胞高變必需的所有元件。本發(fā)明者進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)闡明，造成高頻率高變的基元位于長(zhǎng)度為2.6kb的HS3b/4區(qū)域。
因此有可能提供一個(gè)重組表達(dá)載體用于誘導(dǎo)所需轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)突變。此外，也可能提供一種制造高頻隨機(jī)突變體的方法，它通過(guò)在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組表達(dá)載體來(lái)獲得。另外，也可能提供一種方法用于表達(dá)隨機(jī)突變體，或提供一種用于制造隨機(jī)突變體的試劑盒，所述試劑盒含有重組表達(dá)載體和動(dòng)物細(xì)胞。
序列表<110>大塚制藥株式會(huì)社等(OTSUKA PHARMACEUTICAL CO.，LTD.et al)<120>突變體的制造方法(PRODUCTION PROCESS FOR MUTANT)<130>SCT033859-47<140>
<141>
<150>2001-191884<151>2001-06-25<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1182<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1tctagaacca catgcgatct aagggatatt ggggcaatac atgtgtagtg agatacctgc 60ctttctgatg agccctgtct ggcagggata aactctcctt tctgcatctc cagggcctcg 120atgagctgac tatctagtcc tctgccagaa tagctgtgtg gccttgggtg atgctggctg 180acctcaggct ggtctgggtt gtctctggct gacacccctt gactctggat gaccctggga 240agaccatact taatcttaat tggacttgtt ctcattggga gagaacatgg cctcactaag 300gcacgagtgt ggatggcctt gggtgatggg ggttggggcc tcctcagccc ctggcaggct 360tccctggctg ccacccctca tccaggtccc aggcccacct ggcctggtcc agtgtggtgt 420gattctcaga acagtagctg tggtttgggg cacctgtgct gagaaaggct caggatgact 480cagctgccct cagctcagag ctgctttgaa tgtttcagca ggtgatagac aacagagact 540tcagaagaga gaaaaacaag ttgctaatgt gaacatccct gccctacccc cacacctgta 600ctgcaaatct ccccacactg ttgaccccag atagagatcc caggacagca ggtgatagac 660aaaggaggct ccagaggaga gaaaaatagt atctacaagc atgactacct ctgccctgcc 720ccacacctgc cctgcaaagc tccccaggat gctgacccca catctgtaga ccccaggcca 780gaggctccat ctcccagggc ctgggcttgc tttgtctcca ttctgcgcct ctgagcctgg 840gcaaggccaa tgagcgaaag gggtcactgt cccagttgca gcccagtgtg tgacagtgtt 900gtggggattc tggaatcttc tgcaggaatc ccctgtaggg atcctcctaa tgtgaatgag 960gcttggaata gcaaagggac gtcttgtaaa ataccactga ttccttgggc ctcagacaat 1020ggatgtgaga tgaggaccaa ggtccagggc cagtgttggt aagcagaatt tggggctaga 1080gttcaggctt agaagtcaat gatgagggcc agggcccaat gactaggtca gggcccattg 1140atcagtacag gacccagttg ttagagccgg agctcaatga tc1182
<210>2<211>1381<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2ctgcagactc actgttcacc atgaacccag ctagtcagat tcatatgtga aactcatatc 60agcctctgca cacacataca cacacataca cacatattac acccatgcac acacatgtac 120acatacatac acatgtacac atacatgtgt acacacacat atagagaagg cattggtggg 180gaaaacatta ggccatggct acagtacagg gcacaaggat ggtggtacag aatgaggtca 240ggctgggtca gcataacaag aacacttgga caaagtgagg gtagtgtgtg tgtgtgtgtg 300tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cacgttgaaa gtcttcagta gactggtatc actagccctg 360atatgggcaa cacagcaagc ctgggtcaca ctcaagctga gtatcagggt agccagggcc 420ttctaaccaa gggtagatgc agcctgtgtt ccgtttactg accagtgaga agccatgagc 480tgaaceagac cagaagaccc ttactgttcc caccccaccc ccacccagtt tagtctcagc 540aagaccctgt actgtgggcc acagctctcc tctacactcc acctgtagca caaacactat 600ttgcaaacat ttctaaaaag tagtagaaca ggaaccacag agcagagggg gggactggcg 660tggaaagccc cattcaccca tgggactgaa actcagggaa ccagaaccgt aaggagattt 720gcatggtgct gggggaggtt ggccctggat cagtgagccc agagagttac tggtttctca 780cttccatcat gtcaacctcc tcaaccccca aaaatggcca ggcctaggct atggatgagt 840ttcaatgacc aggccctaag gacgagtcac agaggacttc ctggtgggct caggcagcag 900acctgctcag atggattgca gagccagagg gagccatggc caggaaggcc agacgcctta 960ggggtgtgct gtctctgcat cctttgccct ctctgctcct cacagtccat ctgccatctc 1020acaatccctg ctgtcgctct ggggcccaga cctggccagt ctgggtacct gtggaataca 1080cccaaagaag caatccccag cctcaggatc cacaactact tcccctacag acatgagtga 1140tctcagccca catgtctggg ggccacagaa gcccctaaga ccctactctg ctaataggcc 1200ctcctcccac cacgcaagac aatacacagg caaggtgatg tggatgagag gaccaaccca 1260ggtacctgtg tgtgagatac accctgtggg tatcctggcc agaatctggt gaccaaccca 1320acctgtgtcc ctagaggagt actccgtgcc tgcactcacc tacccaccta actccaagct 1380t 1381<210>3<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<400>10gcagccaacg gccacgctgc 20<210>11<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>11ggccgaattc catggagtta gtttggg 27<210>12<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述M13正向引物<400>12ctctacagac acgggcc17<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述M13反向引物<400>13aaaaagcttg gtgtccctag tccttcatg 29<210>14<211>546<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述啟動(dòng)子<400>14ttcttaaata aaatgctgaa tgaacatttg aatacacata ttgctgagac atgttctctt 60
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1.一種外源基因隨機(jī)突變體的制造方法，其中將至少含有下列(a)-(d)DNA序列的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，以及在所述動(dòng)物細(xì)胞中制造外源基因突變體(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，其中(d)增強(qiáng)子進(jìn)一步包括HS1和HS2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO1或2中的一段DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列來(lái)自免疫球蛋白DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制造方法，其中(d)增強(qiáng)子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中(a)啟動(dòng)子是VH啟動(dòng)子；和(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO1和2中的DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制造方法，其中所述的DNA構(gòu)建體是pvehc3’EHS3b/4。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中動(dòng)物細(xì)胞是B細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制造方法，其中B細(xì)胞系動(dòng)物細(xì)胞源自前B淋巴細(xì)胞系細(xì)胞。
10.一種通過(guò)表達(dá)外源基因突變體而獲得突變基因表達(dá)產(chǎn)物的方法，所述外源基因突變體是由權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)所述的制造方法獲得的。
11.一種用于制造外源基因突變體的DNA構(gòu)建體，其至少包括(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA構(gòu)建體，其中(d)增強(qiáng)子進(jìn)一步包括HS1和HS2。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的DNA構(gòu)建體，其中(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其至少含有SEQ ID NO1或2中的一段DNA序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(a)，(c)和(d)中的DNA序列來(lái)自免疫球蛋白DNA序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求11到14中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(d)增強(qiáng)子包括HS1，HS2，HS3b和HS4。
16.根據(jù)權(quán)利要求11到15中任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體，其中(a)啟動(dòng)子是VH啟動(dòng)子；和(d)增強(qiáng)子有一段DNA序列，其含有SEQ ID NO1和2中的DNA序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的DNA構(gòu)建體，其中所述的DNA構(gòu)建體是pvehc3’EHS3b/4。
18.一種用于外源基因突變體的制造方法或產(chǎn)生突變基因的表達(dá)產(chǎn)物的試劑盒，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)制造外源基因突變體的突變DNA序列的表達(dá)，其包括一種載體，所述載體含有(a)啟動(dòng)子；(b)外源基因插入位點(diǎn)；(c)內(nèi)含子增強(qiáng)子；以及(d)在DNase I敏感區(qū)含HS3b和/或HS4的增強(qiáng)子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中(d)增強(qiáng)子進(jìn)一步包括HS1和HS2。
20.含有SEQ ID NO14序列的VH17.2.25啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明提供目的外源基因的高頻隨機(jī)突變體的制造方法，在這種方法中，將真核啟動(dòng)子，外源DNA序列，內(nèi)含子增強(qiáng)子和3’HS3/4增強(qiáng)子連在一起，構(gòu)建成一個(gè)重組表達(dá)載體，導(dǎo)入并在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1520459SQ0281279
公開日2004年8月11日 申請(qǐng)日期2002年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月25日
發(fā)明者東隆親 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社, 東隆親, 大 制藥株式會(huì)社