專利名稱：檢測(cè)dna堿基突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)DNA中是否存在堿基突變的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，DNA堿基錯(cuò)配受到了大家的廣泛關(guān)注，研究表明，人類基因大約含有IO9個(gè) 堿基對(duì)。對(duì)DNA的物理和化學(xué)破壞都有可能導(dǎo)致DNA在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生堿基錯(cuò)配或誤配， 雖然生物體自身存在強(qiáng)大的修復(fù)系統(tǒng)用于修復(fù)錯(cuò)配，但是仍有部分錯(cuò)配未被修復(fù)。由于一 個(gè)堿基突變都有可能引發(fā)致命的癌癥以及基因相關(guān)疾病，所以對(duì)于DNA堿基錯(cuò)配的檢測(cè)對(duì) 于臨床診斷，基因表達(dá)分析和治療以及生物醫(yī)藥研究都具有重要的意義。目前已有多種方法可用于DNA堿基錯(cuò)配的檢測(cè)，其中大部分是基于DNA錯(cuò)配會(huì)對(duì) DNA雙螺旋的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響的原理，利用寡核苷酸的特異性雜交來(lái)檢測(cè)DNA堿基錯(cuò) 配?；谏鲜鲈淼姆椒ň哂性砗?jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但存在步驟繁瑣、成本較高、靈敏度低的缺 點(diǎn)，而且由于非特異性雜交的影響，導(dǎo)致上述方法選擇性降低，很難實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基突變的檢 測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)DNA中是否存在堿基突變的方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)DNA中是否存在堿基突變的方法，依次包括以下步驟1)用熒光素標(biāo)記單鏈多核苷酸M ；所述M與待測(cè)DNA的正常序列完全互補(bǔ)且可以 形成G-四聚體結(jié)構(gòu)；2)使熒光素標(biāo)記的M形成G-四聚體結(jié)構(gòu)； 3)將形成G-四聚體結(jié)構(gòu)的M和溴乙錠混合，加入待測(cè)DNA和下述式(I)的化合 物、同時(shí)設(shè)置加入由待測(cè)DNA的正常序列組成的DNA片段和下述式(I)的化合物的對(duì)照體 系，按照如下方法確定待測(cè)DNA是否存在突變?nèi)舸郎y(cè)DNA反應(yīng)體系的I6citlmZI422nm小于等于 對(duì)照體系的1. 5士0. 08，待測(cè)DNA存在堿基突變；若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I6tltlnm/I422nm等于對(duì) 照體系的2. 0士0. 07，待測(cè)DNA不存在堿基突變；所述I6tltlnm為發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的發(fā)射峰 的熒光強(qiáng)度；所述I422nm為發(fā)射波長(zhǎng)為422nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度；
式(I)中，m= 1 10，n = 2 100 ；R1,R2,R3,R4 = CXH2X+1 或-0(CXH2X+1)，χ = 1 10 ；R5 = CXH2X+1, χ = 1 3 ;R6 = Br、Cl、I、CF3COO 或 CH3C00。所述式(I)中，m= 6、n = 6、隊(duì)=H、R2 = H、R3 二 H、R4 = H、R5 = CH3、R6 = Br。所述式(I)中，m= 6、n = 6、隊(duì)=H、R2 = H、R3 = H,R4 = H,R5 = CH2CH3、R6 = I。本發(fā)明提供的檢測(cè)DNA中是否存在堿基突變的方法，還可依次包括以下步驟1)制備單鏈多核苷酸Dl,所述Dl與待測(cè)DNA的正常序列完全互補(bǔ)；2)制備單鏈多核苷酸D2，用熒光素標(biāo)記序列D2 ；所述D2能形成發(fā)卡DNA，莖環(huán)與 Dl完全互補(bǔ)，莖干與Dl至少有6nt不互補(bǔ)，且莖干區(qū)含有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；3)將Dl和D2混合，再加入待測(cè)DNA，然后加入與D2莖干區(qū)的酶切位點(diǎn)相應(yīng)的限 制性內(nèi)切酶，再加入下述式(I)的化合物；同時(shí)設(shè)置用待測(cè)DNA的正常序列組成的DNA片段 取代待測(cè)DNA的體系作為對(duì)照；按照如下方法確定待測(cè)DNA是否存在突變?nèi)舸郎y(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm小 于等于對(duì)照體系的2. 57 士0. 05，待測(cè)DNA存在堿基突變；若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm 等于對(duì)照體系的3. 8±0. 11，待測(cè)DNA不存在堿基突變；所述I424nm為發(fā)射波長(zhǎng)為424mn的 發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度；所述I527nm為發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度； 式(I)中，m= 1 10，n = 2 100 ；R1,R2,R3,R4 = CXH2X+1 或-0(CXH2X+1)，χ = 1 10 ；R5 = CXH2X+1, χ = 1 3 ;R6 = Br、Cl、I、CF3COO 或 CH3C00。所述式(I)中，m= 6、n = 6、隊(duì)=H、R2 = H、R3 二 H、R4 = H、R5 = CH3、R6 = Br。
所述式(I)中，m= 6、n = 6、隊(duì)=H,R2 = H,R3 = H,R4 = H,R5 = CH2CH3、R6 = I。本發(fā)明提供的檢測(cè)DNA中是否存在堿基突變的方法，還可依次包括以下步驟1)制備單鏈多核苷酸Kl，所述Kl與待測(cè)DNA的正常序列完全互補(bǔ)；2)制備單鏈多核苷酸K2，所述K2的中間部分具有脫氧核酶活性(其中活性部分 的序列為5’ -AGGCTAGCTACAACGA-3’)，K2與Kl至少有15nt完全互補(bǔ)，且包含有至少IOnt 的脫氧核酶(DNAzyme)序列，K2與Kl頭尾至少各有6nt不互補(bǔ)；3)制備脫氧核酶底物S，用熒光素標(biāo)記S ；底物S的DNA部分與K2完全互補(bǔ)，底物 S中間有包含兩個(gè)特異的RNA堿基的酶切位點(diǎn)；4)將Kl和K2混合，然后加入底物S，加入待測(cè)DNA和下述式(I)的化合物，同時(shí) 設(shè)置加入由待測(cè)DNA的正常序列組成的DNA片段和下述式(I)的化合物的對(duì)照體系，按照 如下方法確定待測(cè)DNA是否存在突變?nèi)舸郎y(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nmA527nm小于等于對(duì)照體 系的1. 595士0. 06，待測(cè)DNA存在堿基突變；若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm等于對(duì)照體 系的3. 08士0. 1，待測(cè)DNA不存在堿基突變；所述I424nm為發(fā)射波長(zhǎng)為424nm的發(fā)射峰的熒 光強(qiáng)度；所述I527nm為發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。
式(I)中，m= 1 10，n = 2 100 ；R1,R2,R3,R4 = CXH2X+1 或 _0(CXH2X+1)，χ = 1 10 ；R5 = CXH2X+1, χ = 1 3 ;R6 = Br、Cl、I、CF3COO 或 CH3C00。所述式(I)中，m= 6、η = 6、R1 = H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH3> R6 = Br。所述式(I)中，m= 6、n = 6、隊(duì)=H、R2 = H、R3 = H,R4 = H,R5 = CH2CH3、R6 = I。本發(fā)明提供的方法克服了現(xiàn)有的檢測(cè)DNA堿基突變方法步驟繁瑣、成本較高、靈 敏度低和選擇性低等缺點(diǎn)，具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高且可靠的優(yōu)點(diǎn)。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為使用G-四聚體DNA檢測(cè)堿基突變的結(jié)果圖。圖2為使用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA檢測(cè)堿基突變的結(jié)果圖。圖3為使用脫氧核酶DNA檢測(cè)堿基突變的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
首先，合成聚2，7-[9，9_ 二(6，-N，N，N-三甲基溴化胺)己烷-芴]-共_(1，4-苯)(PFP)。按照參考文獻(xiàn)(Stork,Μ. ；Gaylord, B. S. ；Heeger, A. J. ；Bazan, G. C. Adv. Mater. 2002，14，361-366.)合成上述式(I)的陽(yáng)離子發(fā)光共軛聚合物，命名為PFP。PFP是 一種新型的熒光探針，與小分子的熒光探針相比，它具有高度共軛的分子結(jié)構(gòu)，由許多重復(fù) 單元組成，這種結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它具有熒光放大的效果，可以高靈敏的檢測(cè)到光學(xué)信號(hào)從而大大
提高檢測(cè)靈敏度。PFP的最大吸收值為380nm，最大發(fā)射峰在427nm。依據(jù)I^rster能量轉(zhuǎn)
移理論，在一定距離條件下它可以和熒光素發(fā)生能量轉(zhuǎn)移(最大吸收峰為480nm，最大發(fā)射 峰為527nm)。熒光素被標(biāo)記在寡核苷酸上，帶正電荷的PFP和帶負(fù)電荷的寡核苷酸通過(guò)靜 電相互作用形成復(fù)合物。PFP和標(biāo)記的熒光素的距離被拉近，從而能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。由于DNA 結(jié)構(gòu)或長(zhǎng)度變化對(duì)電荷密度影響，靜電作用強(qiáng)度發(fā)生變化從而造成能量轉(zhuǎn)移效率的變化。然后，利用PFP和寡聚核苷酸通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物后和標(biāo)記的染料發(fā)生 能量轉(zhuǎn)移以及DNA的構(gòu)象變化來(lái)檢測(cè)DNA中的堿基突變。DNA具有多種構(gòu)象，其中比較常見(jiàn)的有雙螺旋結(jié)構(gòu)，另外還有三螺旋結(jié)構(gòu)和特殊的 G-四聚體，發(fā)卡式結(jié)構(gòu)等。本發(fā)明提供了三種檢測(cè)方法，方法一主要是基于DNA的G-四聚體 結(jié)構(gòu)到雙鏈的轉(zhuǎn)化影響了從PFP到熒光素再到溴乙錠(EB)的雙重能量轉(zhuǎn)移；方法二主要是 利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA (beacon)的保護(hù)和釋放，通過(guò)加入目標(biāo)DNA驅(qū)動(dòng)DNA發(fā)生交換，從而釋放 出限制性內(nèi)切酶的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的底物DNA，底物被酶切后變成短鏈的熒光素片段降低能量轉(zhuǎn) 移效率，由于堿基突變阻礙交換，所以通過(guò)能量轉(zhuǎn)移來(lái)檢測(cè)DNA酶切和交換可以檢測(cè)到DNA 的堿基突變；方法三主要是基于脫氧核酶(DNAzyme)的保護(hù)和釋放，通過(guò)加入目標(biāo)DNA驅(qū) 動(dòng)DNA發(fā)生交換，釋放出脫氧核酶對(duì)標(biāo)記有熒光素的底物S進(jìn)行酶切，底物被酶切后變成短 鏈的熒光素片段降低能量轉(zhuǎn)移效率，由于堿基突變阻礙交換，所以通過(guò)能量轉(zhuǎn)移來(lái)檢測(cè)DNA 酶切和交換可以檢測(cè)到DNA的堿基突變。結(jié)果證明，以上的三種方法對(duì)于DNA的堿基突變 檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高而且可靠的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的三種方法，具體如下方法一、利用G-四聚體結(jié)構(gòu)DNA和PFP檢測(cè)DNA中的堿基突變本方法主要基于DNA的G-四聚體結(jié)構(gòu)到雙鏈的轉(zhuǎn)化。DNA的G-四聚體結(jié)構(gòu)是一 類特殊的構(gòu)象。一些富含堿基G的DNA在鉀離子或凝血酶存在時(shí)可以被誘導(dǎo)形成G-四聚 體結(jié)構(gòu)。1)合成 PFP。2)設(shè)計(jì)并制備G-四聚體DNA序列M。設(shè)計(jì)一段DNA序列M，M可以形成G-四聚體結(jié)構(gòu)且與待測(cè)DNA的正常序列完全互 補(bǔ)，在M的末端(5’或3’ )標(biāo)記熒光素。3)檢測(cè)待測(cè)DNA中的堿基突變。①將熒光素標(biāo)記的M和PFP、EB混合，加入鉀離子或凝血酶DNA，M形成G-四聚體結(jié)構(gòu)。②加入待測(cè)DNA序列，得到反應(yīng)體系；同時(shí)，在步驟①的混合溶液中，加入與待測(cè) DNA等量的正常序列，作為對(duì)照體系。對(duì)于不含有堿基突變的DNA(即與M完全互補(bǔ))，G-四 聚體被破壞，雙鏈結(jié)構(gòu)形成，EB嵌入dsDNA ；對(duì)于含有堿基突變的DNA(即不能與M完全互補(bǔ))，突變的堿基會(huì)大大影響G-四聚體和雙鏈DNA的平衡。③IOmin后，在380nm激發(fā)下得到激發(fā)光譜。對(duì)于不含有堿基突變的DNA，會(huì)發(fā)生 從PFP到熒光素再到EB的雙重能量轉(zhuǎn)移；對(duì)于含有堿基突變的DNA，從PFP到熒光素再到 EB的能量轉(zhuǎn)移效率降低，隨著突變堿基數(shù)的增加，從PFP到熒光素再到EB的能量轉(zhuǎn)移效率 降低幅度增加。所以，若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I6cicimZI422mi小于等于對(duì)照體系的1. 5士0. 08， 待測(cè)DNA存在堿基突變；若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I6(l(lmi/I422nm等于對(duì)照體系的2. 0 士0. 07，待 測(cè)DNA不存在堿基突變。I6tltlnm為發(fā)射波長(zhǎng)為600nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度；I422nm為發(fā)射波長(zhǎng) 為422nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。此方法中，雙鏈DNA嵌入劑溴乙錠(EB)被引入。EB的最大吸收峰在520nm，最大 發(fā)射峰為610nm。當(dāng)加入鉀離子或凝血酶DNA形成G-四聚體結(jié)構(gòu)，DNA的電荷密度增大，造 成PFP和熒光素之間的很高的能量轉(zhuǎn)移效率，但由于EB分子不能嵌入到G-四聚體中，所以 不能觀察到從熒光素到FB的能量轉(zhuǎn)移。而當(dāng)與G-四聚體序列互補(bǔ)的DNA加入后，G-四聚 體被破壞而雙鏈結(jié)構(gòu)形成。EB嵌入dsDNA后就會(huì)發(fā)生從PFP到熒光素再到EB的雙重能量 轉(zhuǎn)移。DNA的堿基突變會(huì)大大影響G-四聚體和雙鏈DNA的平衡，通過(guò)觀察被放大的EB的熒 光強(qiáng)度就可以檢測(cè)DNA的堿基突變。利用此方法可以實(shí)現(xiàn)DNA中堿基突變的檢測(cè)，而且可 被檢測(cè)的最低DNA濃度可達(dá)到50nM。因此，本方法可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高選擇性檢測(cè)DNA 中的堿基突變。方法二、利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA和PFP檢測(cè)DNA中的堿基突變主要是利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA(beacon)的保護(hù)和釋放。發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA —般含有25 35個(gè)核苷酸，含有兩部分(1)環(huán)區(qū)為單鏈狀態(tài)，一般由10 30個(gè)核苷酸組成，用于與目 標(biāo)DNA特異結(jié)合；(2)莖干區(qū)為雙鏈結(jié)構(gòu)，用于穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA—般 莖干區(qū)堿基對(duì)的數(shù)目應(yīng)大于8個(gè)。1)合成 PFP。2)設(shè)計(jì)并制備DNA序列Dl和D2。設(shè)計(jì)兩段DNA序列Dl和D2，Dl與待測(cè)DNA的正常序列完全互補(bǔ)；D2為發(fā)卡DNA， 且在莖干區(qū)含有限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，D2的莖環(huán)與Dl完全互補(bǔ)，D2的莖干與Dl至少 有6nt不互補(bǔ)，用熒光素標(biāo)記D2 ；
3)檢測(cè)待測(cè)DNA中的堿基突變。①將Dl和D2混合，破壞D2的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，形成穩(wěn)定的dsDNA。②加入待測(cè)DNA，同時(shí)，在步驟1的混合溶液中，加入與待測(cè)DNA等量的正常序列， 作為對(duì)照體系。再加入與D2莖干區(qū)的酶切位點(diǎn)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶。對(duì)于不含有堿基突 變的DNA，則與D2發(fā)生交換而形成Dl和待測(cè)DNA的dsDNA，D2被釋放，重新形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)， 產(chǎn)生酶切位點(diǎn)，D2的莖干從酶切位點(diǎn)被切斷，釋放出帶有熒光素的短鏈DNA片段；對(duì)于含有 堿基突變的DNA，DNA之間的交換能量禁阻，D2的酶切位點(diǎn)被Dl保護(hù)。③加入PFP，在380nm激發(fā)下得到激發(fā)光譜。對(duì)于不含有堿基突變的DNA，由于 短鏈DNA片段的電荷密度較小，PFP和熒光素之間只有弱的能量轉(zhuǎn)移；對(duì)于含有堿基突變 的DNA，PFP和熒光素之間發(fā)生較強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)移，隨著突變堿基數(shù)的增加I424nmA527nm逐漸降 低，能量轉(zhuǎn)移效率逐漸增大。所以，若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm小于等于對(duì)照體系的 2. 57士0. 05，待測(cè)DNA存在堿基突變；若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm等于對(duì)照體系的3. 80士0. 11，待測(cè)DNA不存在堿基突變；所述I424nm為發(fā)射波長(zhǎng)為424nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng) 度；所述I527nm為發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。利用此方法可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高選擇性檢測(cè)DNA中的堿基突變。目標(biāo)DNA的最 低檢測(cè)濃度可以達(dá)到75nM。另外此方法還具有很好的普適性，可以檢測(cè)多個(gè)序列的DNA。方法三、利用脫氧核酶(DNAzyme)和PFP檢測(cè)DNA中的堿基突變主要是基于脫氧核酶的保護(hù)和釋放。脫氧核酶是利用體外分子進(jìn)化技術(shù)獲得的一 種具有高效催化活性和結(jié)構(gòu)識(shí)別能力的單鏈DNA片段。本方法中主要選用的是具有RNA切 割活性的脫氧核酶。1)合成 PFP。 2)設(shè)計(jì)并制備DNA序列Kl和K2。設(shè)計(jì)兩段DNA序列Kl和K2，Kl與待測(cè)DNA的正常序列完全互補(bǔ)；K2的中間部分 具有脫氧核酶活性(其中活性部分的序列為5’ -AGGCTAGCTACAACGA-3’)，K2與Kl至少有 15nt完全互補(bǔ)，且包含有至少IOnt的脫氧核酶(DNAzyme)序列，K2與Kl頭尾至少各有6nt 不互補(bǔ)；3)設(shè)計(jì)脫氧核酶底物S，底物S的DNA部分與K2完全互補(bǔ)，底物S中間有包含兩 個(gè)特異的RNA堿基的酶切位點(diǎn)，用熒光素標(biāo)記S ；4)檢測(cè)待測(cè)DNA中的堿基突變。①將Kl和K2混合，形成部分雙鏈，頭尾各有小部分的核苷酸不匹配。②加入底物S，再加入待測(cè)DNA、同時(shí)在步驟1的混合溶液中加入與待測(cè)DNA等量 的正常序列作為對(duì)照體系，37°C反應(yīng)。對(duì)于不含有突變堿基的DNA，則與K2發(fā)生交換而形成 Kl和待測(cè)DNA的dsDNA，K2被釋放，與底物S結(jié)合，底物S被酶切釋放出標(biāo)記有熒光素的短 鏈DNA ；對(duì)于含有突變堿基的DNA，DNA之間的交換能量禁阻，從而不能釋放脫氧核酶K2，底 物S不能被切除。③加入PFP，在380nm激發(fā)下得到激發(fā)光譜。對(duì)于不含有突變堿基的DNA，只能觀 察到弱的能量轉(zhuǎn)移；對(duì)于含有堿基突變的DNA，可以觀察到強(qiáng)的能量轉(zhuǎn)移。所以，若待測(cè)DNA 反應(yīng)體系的I424nm/I527nm小于等于對(duì)照體系的1.595士0. 06，待測(cè)DNA存在堿基突變；若待 測(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm等于對(duì)照體系的3. 08 士0. 1，待測(cè)DNA不存在堿基突變；所述 I424nm為發(fā)射波長(zhǎng)為424nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度；所述I527nm為發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的發(fā)射峰 的熒光強(qiáng)度。利用此方法同樣可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高選擇性檢測(cè)DNA中的堿基突變。目標(biāo)DNA 的最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到20nM。此方法對(duì)目標(biāo)DNA的序列也沒(méi)有嚴(yán)格的限制，而且操作更 加方便、簡(jiǎn)單。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所有的標(biāo)記和未標(biāo)記的寡聚核苷酸都由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司以 及寶生物工程(大連)有限公司合成。本發(fā)明使用的紫外光譜儀型號(hào)為Jasco V-550型。熒光光譜儀的型號(hào)為Hitachi F-4500，激發(fā)光源為氙燈。所用的熒光比色皿為3mL的一次性聚苯乙烯比色皿。實(shí)驗(yàn)中所 用的水都需經(jīng)過(guò)Millipore純化系統(tǒng)過(guò)濾。本發(fā)明中的寡聚核苷酸的濃度都是通過(guò)檢測(cè)260nm處的吸收值得到的。
實(shí)施例1、應(yīng)用PFP和G-四聚體檢測(cè)DNA中的堿基突變一、PFPl 的合成 PFPl的結(jié)構(gòu)如式(II)所示，合成方法如下向IOOmL的單口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克對(duì)甲苯磺酸，回流24 小時(shí)，蒸除溶劑后硅膠柱分離(洗脫劑二氯甲烷)后得到4.8克1，4_苯二硼酸新戊二酯。 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) 7. 78 (4H, s)，3. 77 (8H, s)，1. 02(12H, s)。向25mL的二口瓶中加入5. 4mL甲苯和3. 6mL 2M碳酸鉀，鼓入氮?dú)?0分鐘后，力口 入325毫克2，7-二溴-9，9-二(6-溴己基)芴，165毫克1，4-苯二硼酸新戊二酯和20毫 克四(三苯基膦)鈀，于氮?dú)庀?5°C攪拌反應(yīng)24小時(shí)，冷卻后加入氯仿和水，取氯仿層水洗 后用無(wú)水硫酸鎂干燥，旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到210毫克淺黃色固體。將固體溶于20毫升 二氯甲烷，加入1毫升三甲胺于室溫?cái)嚢?4小時(shí)后離心，收集沉淀并干燥，得到208毫克聚 合物 PFPl，Mn = 3· 5X104。1H 匪R (400MHz，DMS0) δ (ppm) 7. 3-8. 0 (10H，m)，2. 9-3. 2 (16Η， m)，2. 2-2. 3 (4H, m)，1. 5-1. 6 (4H, m)，0. 9-1. 2 (30H, m)。二、待測(cè)樣本的制備合成DNA序列如下序列1 (無(wú)堿基突變 DNA 序列 ssDNAc) :5，-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3，；序列2 (單堿基突變 DNA 序列 SSDNA1nc) :5，-CCCTAACCCTAACACTAACCC-3，；序列3 (三個(gè)堿基突變 DNA 序列 ssDNA3NC) :5，-CCCAAACCCAAACCCAAACCC-3，；序列4 (六個(gè)基突變 DNA 序列 ssDNA6NC) :5，-CCCAATCCCAATCCCAATCCC-3，。三、檢測(cè)序列的堿基突變1)設(shè)計(jì)序列M，用熒光素標(biāo)記M。序列M 5，-FAM-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，。2)在1900 μ L離子強(qiáng)度為50mM的磷酸緩沖溶液(pH = 7. 4)中加入100 μ L濃度 為IM的KCl，使KCl的終濃度為50mM。3)將在4°C誘導(dǎo)的熒光素標(biāo)記的M加入步驟2)得到的溶液中，至終濃度為 [G-quadrupIex-Fl] = 5. OX 1(Γ8Μ。4)將PFP和EB加入步驟3)得到的溶液中，至終濃度為[PFP] = 1. 25 X 10_6Μ，重 復(fù)單元濃度；[ΕΒ] = 1. 5Χ 10_6Μ。5)在步驟4)得到的溶液中加入待測(cè)DNA，制備反應(yīng)液，分如下兩種情況①反應(yīng)液A 在步驟4)得到的溶液中加入序列1所示的DNA，至終濃度為[ssDNAc] =5.0X10_8M，即為對(duì)照體系甲。②反應(yīng)液B 在步驟4)得到的溶液中加入序列2所示的DNA，至終濃度為[sSDNAinc] = 5. 0X10_8M。③反應(yīng)液C:在步驟4)得到的溶液中加入序列3所示的DNA，至終濃度為 [sSDNA3NC] = 5· 0Χ1(Γ8Μ。④反應(yīng)液D 在步驟4)得到的溶液中加入序列4所示的DNA，至終濃度為 [sSDNA6NC] = 5· 0Χ1(Γ8Μ。⑤反應(yīng)液E 步驟4)得到的溶液，作為對(duì)照乙。6)熒光光譜的測(cè)定IOmin后，分別取10 μ L步驟5)得到的兩種反應(yīng)液，在380nm激發(fā)下得到激發(fā)光
■；並進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，圖中的數(shù)據(jù)和結(jié)果均為平均值。圖1為使用G-四聚體DNA檢測(cè)堿基突變的結(jié)果圖；Ia為反應(yīng)液A和反應(yīng)液E的 熒光光譜，實(shí)線為反應(yīng)液A，虛線為反應(yīng)液E ；Ib為反應(yīng)液A、B、C和D的FRET效率柱狀圖， [ssDNAc] = [ s sDNA1nc] = [ssDNA3nc] = [ssDNA6NC] = 5·0Χ1(Γ8Μ。由圖可見(jiàn)，反應(yīng)液E只能觀察到PFP和熒光素的熒光而不能觀察到EB的熒光；反 應(yīng)液A出現(xiàn)了 EB的發(fā)射峰，發(fā)生了從PFP到熒光素再到FB的雙重能量轉(zhuǎn)移，且I6tltlmZl422mi =1.6士0. 08 ；反應(yīng)液B出現(xiàn)從PFP到熒光素再到EB的能量轉(zhuǎn)移，I6ticimZI422nm= 1.2士0. 07， 效率比反應(yīng)液A降低了 25%;反應(yīng)液C出現(xiàn)從PFP到熒光素再到EB的能量轉(zhuǎn)移，I600nm/I422nm =0. 8 士 0. 06，效率比反應(yīng)液A降低了 50% ；反應(yīng)液D出現(xiàn)從PFP到熒光素再到EB的能量 轉(zhuǎn)移，16。?！?1422 = 0.8士0. 04，效率比反應(yīng)液A降低了 50%。實(shí)施例2、利用PFP和G-四聚體檢測(cè)DNA中的堿基突變 PFP2的結(jié)構(gòu)如式(III)所示，合成方法如下向IOOmL的單口瓶加入50mL甲苯、5. 2克新戊二醇和0. 5克對(duì)甲苯磺酸，回流24 小時(shí)，蒸除溶劑后硅膠柱分離(洗脫劑二氯甲烷)后得到4.8克1，4_苯二硼酸新戊二酯。 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm) 7. 78 (4H, s)，3. 77 (8H, s)，1. 02(12H, s)。向50mL的單口瓶加入IOmL干燥的四氫呋喃和0. 65克2，7-二溴芴(鄭州太平洋 化源公司)，低溫冷卻至_78°C后加入2mL 2M 丁基鋰溶液(AlfaAesar公司)低溫?cái)嚢?小 時(shí)，加入1.0克1，6_ 二碘己烷(北京偶合公司)于室溫反應(yīng)過(guò)夜，結(jié)束反應(yīng)。向反應(yīng)液加入 IOmL水和15mL氯仿，分液，有機(jī)層經(jīng)水洗、無(wú)水硫酸鎂干燥后蒸除溶劑，硅膠柱分離(石油 醚 / 乙酸乙酯=20/1, ν/ν)得到 0.8 克 2，7-二溴-9，9 二 (6-碘己基)芴。1H NMR(400MHz， CDCl3) δ (ppm) 7. 82 (d, 2H)，7. 42 (m, 4H)，3. 39 (m, 4H)，2. 06 (m, 4H)，1. 67 (m, 4H)，1. 22 (m, 8H)，0. 69 (m, 4H)。向25mL的二口瓶中加入6mL四氫呋喃和3mL 2M碳酸鈉，鼓入氮?dú)?0分鐘后，力口入390毫克2，7- 二溴-9，9- 二(6-碘己基)芴，182毫克1，4_苯二硼酸新戊酯和23毫克 四(三苯基膦)鈀，于氮?dú)庀?0°C攪拌反應(yīng)48小時(shí)，冷卻后加入氯仿和水，取氯仿層水洗 后用無(wú)水硫酸鎂干燥，旋蒸濃縮，丙酮沉淀，得到230毫克淺黃色固體。將固體溶于25毫升 二氯甲烷，加入1毫升33%三甲胺醇溶液于室溫?cái)嚢?4小時(shí)后離心，收集沉淀并干燥，得 到 222 毫克聚合物 PFP2, Mn = 4. 1 X IO4。1HNMR (400MHz, DMSO)δ(ppm) 7. 1-8. 0 (10H, m)， 3. 2 (4H, m)，3.1(12H,m)，2.1 (4H, m)，1.2(16H, m)。二、待測(cè)樣本的制備合成DNA序列如下序列5 (無(wú)堿基突變 DNA 序列 ssDNAc) :5，-CCAACCACACCAACC-3，；序列6 (單堿基突變 DNA 序列 ssDNA1nc) :5，-CCTACCACACCAACC-3，。三、檢測(cè)序列的單堿基突變1)設(shè)計(jì)序列M，用熒光素標(biāo)記M。序列M 5，-FAM-GGTTGGTGTGGTTGG-3，。2)在1900 μ L離子強(qiáng)度為50mM的磷酸緩沖溶液(pH = 7. 4)中加入100 μ L濃度 為IM的KCl，使KCl的終濃度為50mM。3)將在4°C誘導(dǎo)的熒光素標(biāo)記的M加入步驟2)得到的溶液中，至終濃度為 [G-quadrupIex-Fl] = 5. OX 1(Γ8Μ。4)將PFP和EB加入步驟3)得到的溶液中，至終濃度為[PFP] = 1. 25Χ 10_6Μ，重 復(fù)單元濃度；[ΕΒ] = 1. 5Χ 10_6Μ。5)在步驟4)得到的溶液中加入待測(cè)DNA，制備反應(yīng)液，分如下兩種情況①反應(yīng)液A 在步驟4)得到的溶液中加入序列5所示的DNA，至終濃度為[ssDNAc] =5. OX 10_8M，作為對(duì)照體系甲。②反應(yīng)液B 在步驟4)得到的溶液中加入序列6所示的DNA，至終濃度為[ssDNAj =5· 0Χ1(Γ8Μ。③反應(yīng)液C 步驟4)得到的溶液，作為對(duì)照乙。6)熒光光譜的測(cè)定IOmin后，分別取10 μ L步驟5)得到的兩種反應(yīng)液，在380nm激發(fā)下得到激發(fā)光
■；並進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果數(shù)據(jù)為平均值。反應(yīng)液C只能觀察到PFP和熒光素的熒光而不能觀察到EB的熒光；反應(yīng)液A 出現(xiàn)了 EB的發(fā)射峰，發(fā)生了從PFP到熒光素再到EB的雙重能量轉(zhuǎn)移，且I6ticimZI422nm = 1. 86士0. 05 ；反應(yīng)液B出現(xiàn)從PFP到熒光素再到EB的能量轉(zhuǎn)移，I6QQmi/I422nm = 1. 56士0. 08， 效率比反應(yīng)液A降低了 16%。實(shí)施例3、利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA和PFP檢測(cè)DNA中的堿基突變一、PFP 的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、待測(cè)樣本的制備合成DNA序列如下序列7 (無(wú)堿基突變DNA序列Tc)
5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATGTCAC-3，；序列8 (單堿基突變DNA序列Tinc)5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATATCAC-3’ ；
序列9 (2個(gè)堿基突變DNA序列T2NC)5， -GATTGCGTAAAGAAGGTATGAGATAATATCAC-3，；序列10 (3個(gè)堿基突變DNA序列T3NC)5， -GATTGCGTAAAGAAGGTATGAGACAATATCAC-3，；序列11 (5個(gè)堿基突變DNA序列T5NC)5 ’ -GATTACGGAAAGTAGGTCTGAGATCATGCCAC-3’。三、檢測(cè)序列的堿基突變1)設(shè)計(jì)Dl和D2，用熒光素標(biāo)記D2，Dl和D2的序列如下Dl :5，-GTGACATTATCTCATACCTTCTTTCCGCAATCGGA-3，；D2 5 ’ -FAM-CTGGCCTCCGATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATCGGAGGCCAG-3’。2)將 7. 5μ L 的 Dl(IOyM)和 5. 0 μ L 的 D2 (10 μ M) 80°C 雜化 20min 后降至室溫得 到雙鏈結(jié)構(gòu)。3)制備反應(yīng)液反應(yīng)液A 將2. 5 μ L的限制酶緩沖液，1. 5 μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeLLI (1 Ounit/ μ L) (NEB 公司)，7. 5 μ L 序列 7 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. 0 μ L 的 Millipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min，即為對(duì)照體系甲。反應(yīng)液B 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5 μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB 公司)，7. 5 μ L 序列 8 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. O μ L 的 Millipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min。反應(yīng)液C 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB 公司)，7. 5 μ L 序列 9 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. O μ L 的 Millipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min。反應(yīng)液D 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5 μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB 公司)，7· 5 μ L 序列 10 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. O μ L 的 MiIlipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min。反應(yīng)液E 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5 μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB 公司)，7· 5 μ L 序列 11 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. O μ L 的 MiIlipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min。反應(yīng)液F 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5 μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB公司)和LOyL的Millipore水一同加入于37°C反應(yīng)50min，作為對(duì)照乙。反應(yīng)液G 將2. 5 μ L的限制酶緩沖液，7. 5 μ L序列7的DNA (10 μ Μ)禾口 1. O μ L的 Millipore水一同加入于37°C反應(yīng)50min，作為對(duì)照丙。
4)熒光光譜的測(cè)定分別取10 μ L步驟3)得到的四種反應(yīng)液，分別加入到2. OmL的HEPEs緩沖液(含 HEPEs 25mM，pH = 8. 0)中，分別加入1. 5 μ L的PFP (2X I(T3M)后，在380nm下激發(fā)，檢測(cè)熒
光光譜。
進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)三次，圖中的數(shù)據(jù)和結(jié)果均為3次試驗(yàn)的平均值。圖2為使用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA檢測(cè)堿基突變的結(jié)果圖；2a為反應(yīng)液A、B、F、G的熒光 光譜；2b 為反應(yīng)液 A、B、C、D 和 E 的 FRET 效率柱狀圖。[Tc] = [T1NC] = [T2NC]] = [T3NC]]= [T5NC]] = 15nM。結(jié)果表明，反應(yīng)液G的I424nm/I527nm約為0. 42 士 0. 05 (平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)；反應(yīng)液 A 的 I424nm/I527nm 約為 1. 597 士0. 107 ；反應(yīng)液 B 的 I424nm/I527nm 約為 1. 08 士0. 046，比反應(yīng)液 A 降低了 32% ；反應(yīng)液C的I424mi/I527nm約為0. 69 士0. 046，比反應(yīng)液A降低了 57% ；反應(yīng)液 D 的 I424nm/I527nm 約為 0. 503 ±0. 006，比反應(yīng)液 A 降低了 69% ；反應(yīng)液 E 的 I424nm/I527nm 約為 0. 46士0.01，比反應(yīng)液A降低了 72%。實(shí)施例4、利用發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA和PFP檢測(cè)DNA中的堿基突變一、PFP2 的合成同實(shí)施例2的步驟一。二、待測(cè)樣本的制備合成DNA序列如下序列12 (無(wú)堿基突變DNA序列Tc)5， -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATAATGTCAC-3，；序列13 (單堿基突變DNA序列Tinc)5 ’ -GATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATATTGTCAC-3’。三、檢測(cè)序列12和序列13的單堿基突變1)設(shè)計(jì)Dl和D2，用熒光素標(biāo)記D2，Dl和D2的序列如下Dl :5，-GTGACATTATCTCATA CCTTCTTTCCGCAATCGGA-3，；D2 5 ’ -FAM-CTGGCCTCCGATTGCGGAAAGAAGGTATGAGATCGGAGGCCAG-3’。2)將 7. 5μ L 的 Dl(IOyM)和 5. 0 μ L 的 D2 (10 μ M) 80°C 雜化 20min 后降至室溫得 到雙鏈結(jié)構(gòu)。3)制備反應(yīng)液反應(yīng)液A 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB 公司)，7· 5 μ L 序列 12 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. O μ L 的 MiIlipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min，即為對(duì)照體系甲。反應(yīng)液B 將2. 5μ L的限制酶緩沖液，1. 5μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB 公司)，7· 5 μ L 序列 13 的 DNA (10 μ Μ)禾口 1. 0 μ L 的 MiIlipore 水一同加入于 37°C 反應(yīng)50min。反應(yīng)液C 將2. 5 μ L的限制酶緩沖液，1. 5 μ L的限制酶內(nèi)切酶HaeIII (lOunit/ μ L) (NEB公司)和LOyL的Millipore水一同加入于37°C反應(yīng)50min，作為對(duì)照乙。4)熒光光譜的測(cè)定分別取IOyL步驟1得到的三種反應(yīng)液，分別加入到2. OmL的HEPEs緩沖液(含 HEPEs 25mM，pH = 8. 0)中，分別加入1. 5 μ L的PFP (2X I(T3M)后，在380nm下激發(fā)，檢測(cè)熒
光光譜。進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)三次，數(shù)據(jù)結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值。反應(yīng)液C 的 I424nm/I527nm 約為 0. 45士0. 04 ；反應(yīng)液 A 的 I424nm/I527nm 約為 1. 65士0. 08 ；反應(yīng)液B的I424nm/I527nm約為1. 12士0. 045，比反應(yīng)液A降低了 32%。結(jié)果表明，反應(yīng)液A的能量轉(zhuǎn)移效率比對(duì)照的轉(zhuǎn)移效率降低達(dá)3倍。隨著突變堿基數(shù)的增加I424nm/I527nm逐漸降低， 能量轉(zhuǎn)移效率逐漸增大。對(duì)于單堿基突變的DNA可以觀察到非常明顯的變化。實(shí)施例5、利用脫氧核酶和PFP檢測(cè)DNA中的堿基突變一、PFPl 的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、待測(cè)樣本的制備合成DNA序列如下序列14 (無(wú)堿基突變 DNA 序列 Mc) :5，-CGGTGAAGCTACAACGAGAGC-3，；序列15 (單堿基突變 DNA 序列 Minc) :5，-CGTTGAAGCTACAACGAGAGC-3，；序列16 (2 個(gè)堿基突變 DNA 序列 M2nc) :5，-CGTTGAAGCAACAACGAGAGC-3，；序列17 (3 個(gè)堿基突變 DNA 序列 M3nc) :5，-CGGAGAAGCTTCAACGTGAGC-3，；序列18 (5 個(gè)堿基突變 DNA 序列 M5nc) :5，-CGGAGAAGCTTGAGCGAGTGC-3，。三、檢測(cè)序列的堿基突變1)設(shè)計(jì)Kl和K2，Kl和K2的序列如下Kl :5，-GCTCTCGTTGTAGCTTCACCG-3，；K2 :5， -TACAGCTAATAGGCTAGCTACAACGAGAGC-3，。設(shè)計(jì)底物S，用熒光素標(biāo)記S，S的序列如下5，-FAM-GCTCrArUATTAGCTGTA-3 。2) 2. 0 μ L 的 Kl (10 μ Μ)和 2. 0 μ L 的 Κ2 (10 μ Μ)在 80°C雜化 20min 后降至室溫得 到雙鏈結(jié)構(gòu)。3)制備反應(yīng)液反應(yīng)液A 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7. 5)中，然后加入0.5μ L的底物S(IOyM)禾口 2. 0 μ L序列14的DNA (10 μ Μ)，即為對(duì) 照體系甲。反應(yīng)液B 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH = 7.5)中，然后加入 0. 5μ L 的底物 S(IOyM)禾口 2. 0 μ L 序列 15 的 DNA(IOyM)。反應(yīng)液C 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH = 7.5)中，然后加入 0. 5μ L 的底物 S(IOyM)禾口 2. 0 μ L 序列 16 的 DNA(IOyM)。反應(yīng)液D 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH = 7.5)中，然后加入 0.5μ L 的底物 S(IOyM)禾口 2. 0 μ L 序列 17 的 DNA(IOyM)。反應(yīng)液E 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH = 7.5)中，然后加入 0. 5μ L 的底物 S(IOyM)禾口 2. 0 μ L 序列 18 的 DNA(IOyM)。反應(yīng)液F 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, PH= 7.5)中，然后加入0.5μ L的底物S(IOyM)，作為對(duì)照乙。4)熒光光譜的測(cè)定將上一步的溶液在37°C誘導(dǎo) lh，加入 10yL&PFP(0. ImM)和 3. 0 μ L 的Kl (10 μ M，
為了去除非特異性相互作用)后在380nm下激發(fā)得到熒光光譜。進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)三次，圖中的數(shù)據(jù)和結(jié)果均為3次試驗(yàn)的平均值。
圖2為使用脫氧核酶DNA檢測(cè)堿基突變的結(jié)果圖；3a為反應(yīng)液A、B和F的熒光 光譜；3b 為反應(yīng)液 A、B、C、D 和 E 的 FRET 效率柱狀圖，[Mc] = [M1NC] = [M2NC]] = [M3NC]]= [M5NC]] = 20nM。結(jié)果表明，反應(yīng)液F 的 I424nm/I527nm = 0. 6士0. 10，反應(yīng)液 A 的 I424nm/I527nm = 1. 847 士0. 121 ；反應(yīng)液 B 的 I424nm/I527nm = 0. 957 士0. 035 ；反應(yīng)液 C 的 I424nm/I527nm = 0. 78 士 0. 07 ；反應(yīng)液 D 的 I424nm/I527nm = 0. 71 士 0. 04 ；反應(yīng)液 E 的 I424nm/I527nm = 0. 67 士 0. 04， 可以觀察到非常明顯的變化。隨著突變堿基數(shù)的增加I424nm/I527nm逐漸降低，能量轉(zhuǎn)移效率 逐漸增大。實(shí)施例6、利用脫氧核酶和PFP檢測(cè)單堿基突變
一、PFP2 的合成同實(shí)施例2的步驟一。二、待測(cè)樣本的制備合成DNA序列如下序列19 (無(wú)堿基突變 DNA 序列 Mc) :5，-CGGTGAAGCTACAACGAGAGC-3，；序列20 (單堿基突變 DNA 序列 Minc) :5，-CGGTGTAGCTACAACGAGAGC-3，。三、檢測(cè)序列的單堿基突變1)設(shè)計(jì)Kl和K2，Kl和K2的序列如下Kl :5，-GCTCTCGTTGTAGCTTCACCG-3，；K2 :5， -TACAGCTAATAGGCTAGCTACAACGAGAGC-3，。設(shè)計(jì)底物S，用熒光素標(biāo)記S，S的序列如下5， -FAM-GCTCrArUATTAGCTGTA-3，。2) 2. 0 μ L 的 Kl (10 μ Μ)和 2. 0 μ L 的 Κ2 (10 μ Μ)在 80°C雜化 20min 后降至室溫得 到雙鏈結(jié)構(gòu)。3)制備反應(yīng)液反應(yīng)液A 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH= 7. 5)中，然后加入0.5μ L的底物S(IOyM)禾口 2. 0 μ L序列19的DNA (10 μ Μ)，即為對(duì) 照體系甲。反應(yīng)液B 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, pH = 7.5)中，然后加入 0. 5μ L 的底物 S(IOyM)禾口 2. 0 μ L 序列 20 的 DNA(IOyM)。反應(yīng)液C 將雙鏈DNA加入到ImL的HEPEs緩沖溶液(含25mM HEPEs, 50mMMgCl2, PH= 7.5)中，然后加入0.5μ L的底物S(IOyM)，作為對(duì)照乙。4)熒光光譜的測(cè)定將上一步的溶液在37°C誘導(dǎo) lh，加入 10yL&PFP(0. ImM)和 3. 0 μ L 的Kl (10 μ M，
為了去除非特異性相互作用)后在380nm下激發(fā)得到熒光光譜。進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)三次，數(shù)據(jù)結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值。結(jié)果表明，對(duì)照乙的I424nm/I527nm = 0. 58士0. 08 ；反應(yīng)液 A 的 I424nm/I527nm = 1.95士0. 12 ；反應(yīng)液B的I424nm/I527nm = 1.02士0.08，比反應(yīng)液A降低了 48%?？梢杂^察到 非常明顯的變化。隨著突變堿基數(shù)的增加i424nm/i527nm逐漸降低，能量轉(zhuǎn)移效率逐漸增大。序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所<120>檢測(cè)DNA堿基突變的方法<130>CGGNARZ102005<160>20<210>1<211 >21<212>DNA<213>人工序列<400>1ccctaaccct aaccctaacc c 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2ccctaaccct aacactaacc c 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cccaaaccca aacccaaacc c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4cccaatccca atcccaatcc c 21<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>5ccaaccacac caacc 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列
<400>6
cctaccacac caacc 15<210>7<211>32
<212>DNA<213>人工序列<400>7gattgcggaa agaaggtatg agataatgtc ac 32<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>8gattgcggaa agaaggtatg agataatatc ac 32<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>9gattgcgtaa agaaggtatg agataatatc ac 32<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>10gattgcgtaa agaaggtatg agacaatatc ac 32<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>11gattacggaa agtaggtctg agatcatgcc ac 32<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>12gattgcggaa agaaggtatg agataatgtc ac 32<210>13<211>32
<212>DNA
<213>人工序列<400>13gattgcggaa agaaggtatg agatattgtc ac 32<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14cggtgaagct acaacgagag c 21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>15cgttgaagct acaacgagag c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16cgttgaagca acaacgagag c 21<210>17<211 >21<212>DNA<213>人工序列<400>17cggagaagct tcaacgtgag c 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>18cggagaagct tgagcgagtg c 21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>19
cggtgaagct acaacgagag c 21<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列
<400>20cggtgtagct acaacgagag c 2權(quán)利要求
一種檢測(cè)DNA中是否存在堿基突變的方法，依次包括以下步驟1)制備單鏈多核苷酸K1，所述K1與待測(cè)DNA的正常序列完全互補(bǔ)；2)制備單鏈多核苷酸K2，所述K2的中間部分具有脫氧核酶活性，K2與K1至少有15nt完全互補(bǔ)，而且包含有至少10nt的脫氧核酶序列，K2與K1頭尾至少各有6nt不互補(bǔ)；3)制備脫氧核酶底物S，用熒光素標(biāo)記S；底物S的DNA部分與K2完全互補(bǔ)，底物S中間有包含兩個(gè)特異的RNA堿基的酶切位點(diǎn)；4)將K1和K2混合，然后加入底物S，加入待測(cè)DNA和下述式(I)的化合物，同時(shí)設(shè)置加入由待測(cè)DNA的正常序列組成的DNA片段和下述式(I)的化合物的對(duì)照體系，按照如下方法確定待測(cè)DNA是否存在突變?nèi)舸郎y(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm小于等于對(duì)照體系的1.595±0.06，待測(cè)DNA存在堿基突變；若待測(cè)DNA反應(yīng)體系的I424nm/I527nm等于對(duì)照體系的3.08±0.1，待測(cè)DNA不存在堿基突變；所述I424nm為發(fā)射波長(zhǎng)為424nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度；所述I527nm為發(fā)射波長(zhǎng)為527nm的發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。式(I)；式(I)中，m＝1～10，n＝2～100；R1，R2，R3，R4＝CXH2X+1或-O(CXH2X+1)，x＝1～10；R5＝CXH2X+1，x＝1～3；R6＝Br、Cl、I、CF3COO或CH3COO。F2010100026022C00011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述式(I)*，m= 6、n = 6、R1 = H、R2 = H、R3 = H、R4 = H、R5 = CH3、R6 = Br0
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述式(I)*，m= 6、n = 6、R1 = H、R2 = H、R3 = H，、R4 = H、R5 = CH2CH3、R6 = I o
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)DNA中堿基突變的方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)DNA中堿基突變的方法為首先，合成式(I)的化合物；然后通過(guò)式(I)的化合物與單鏈寡聚核苷酸通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物后和標(biāo)記的染料發(fā)生能量轉(zhuǎn)移以及DNA的構(gòu)象變化來(lái)檢測(cè)DNA中的堿基突變。本發(fā)明提供的方法克服了現(xiàn)有的檢測(cè)DNA中堿基突變的方法步驟繁瑣、成本較高、靈敏度低和選擇性低等缺點(diǎn)，具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、靈敏度高且可靠的優(yōu)點(diǎn)。式(I)
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101838688SQ20101000260
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月7日
發(fā)明者王樹(shù), 賀芳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所