專(zhuān)利名稱(chēng)：用于復(fù)制核酸序列的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于復(fù)制核酸序列的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于復(fù)制核酸序列 的方法，其中聚合酶反應(yīng)通過(guò)使用具有特定結(jié)構(gòu)的模板核酸序列作為起始點(diǎn)溫育具有DNA 聚合酶的反應(yīng)溶液而進(jìn)行。
背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)研究中，核酸的擴(kuò)增通常通過(guò)使用DNA聚合酶的酶方法進(jìn)行。作為 用于擴(kuò)增核酸的方法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)已被廣泛已知。為了擴(kuò)增目的靶核酸序列， PCR方法包括以下三個(gè)步驟變性作為模板使用的雙鏈DNA以將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA的步驟 (變性步驟)；針對(duì)所述單鏈DNA對(duì)引物退火的步驟(退火步驟)；和利用引物作為起始點(diǎn) 延長(zhǎng)互補(bǔ)鏈的步驟(延伸步驟)。在一般的PCR法中，使用熱循環(huán)儀，且變性步驟、退火步驟 和延伸步驟以不同的溫度進(jìn)行。然而，所述以3種不同溫度類(lèi)型進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)需要 復(fù)雜的溫度控制。而且，PCR法也已經(jīng)引起一些問(wèn)題，因?yàn)殡S著循環(huán)次數(shù)的增加時(shí)間損失也 增加。在前述情況下，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了可以在等溫條件下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法。所述核酸擴(kuò) 增方法的實(shí)例包括RCA(旋轉(zhuǎn)循環(huán)擴(kuò)增Pr0C. Natl. Acad. Sci (國(guó)際科學(xué)院學(xué)報(bào))，卷92， 4641-4645(1995))，ICAN(等溫和嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增)，LAMP (環(huán)-介導(dǎo)的等溫DNA 擴(kuò)增；Bio Industry (生物工業(yè))，卷18，第2號(hào)(2001))，NASBA (基于核酸序列的擴(kuò)增法； Nature (自然)，350，91-(1991))，和 TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增法;J. Clin Microbiol (臨床微 生物學(xué)雜志).卷31，3270-(1993))。SDA法(日本專(zhuān)利公開(kāi)(Kokai)號(hào)5-130870A (1993))是使用核酸外切酶的循環(huán)測(cè) 定法，其是一種用于利用聚合酶延長(zhǎng)反應(yīng)擴(kuò)增靶核酸片段目的位點(diǎn)的擴(kuò)增方法類(lèi)型。這是 一種利用與靶核酸片段的所述目的位點(diǎn)特異性雜交的引物作為起始點(diǎn)進(jìn)行聚合酶延長(zhǎng)反 應(yīng)，并同時(shí)，容許5’ 一3’核酸外切酶在其上作用，從而從反向分解引物的方法。代替分解 的引物，新引物與該位點(diǎn)雜交，并再用DNA聚合酶進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。連續(xù)周期性重復(fù)這種使用 聚合酶的延長(zhǎng)反應(yīng)和隨后的使用核酸外切酶解離延長(zhǎng)的鏈的分解反應(yīng)。于此，使用聚合酶 的延長(zhǎng)反應(yīng)和使用核酸外切酶的分解反應(yīng)可以在等溫條件下進(jìn)行。然而，在該方法中，應(yīng)該 使用了核酸外切酶以及聚合酶。因此，這需要高成本，且還需要設(shè)計(jì)引物的裝置工具。LAMP方法是擴(kuò)增靶核酸片段的目的位點(diǎn)的方法，其是近期開(kāi)發(fā)的。該方法使用互補(bǔ)識(shí)別靶核酸片段的至少6個(gè)特定位點(diǎn)的至少4種類(lèi)型的引物和不具有5’ 一 3’核酸外切 酶活性的鏈置換型Bst DNA聚合酶，并在釋放模板上的雙鏈DNA作為單鏈DNA的同時(shí)催化 延長(zhǎng)反應(yīng)，以使得可以在等溫條件下將靶核酸片段的目的位點(diǎn)擴(kuò)增為特定結(jié)構(gòu)。然而，應(yīng)該 使用了識(shí)別6個(gè)特定位點(diǎn)的至少4種類(lèi)型的引物，且因此非常難以設(shè)計(jì)所述引物。ICAN法也是用于擴(kuò)增靶核酸片段目的位點(diǎn)的方法，其是近期開(kāi)發(fā)的。這是一種在 等溫條件下，使用RNA-DNA嵌合引物，具有鏈置換活性和模板交換活性的DNA聚合酶，和RNA 酶H來(lái)擴(kuò)增基因的方法。在所述嵌合引物結(jié)合模板后，通過(guò)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈。其后，RNA酶H裂解嵌合引物-來(lái)源的RNA部分，并由裂解位點(diǎn)開(kāi)始，延長(zhǎng)反應(yīng)伴隨鏈置換反應(yīng)和 模板交換反應(yīng)發(fā)生。通過(guò)重復(fù)該反應(yīng)，擴(kuò)增基因。然而，該方法也需要使用特定的引物，即 嵌合引物，且因此很難設(shè)計(jì)該引物。日本專(zhuān)利公開(kāi)(Kohyo)號(hào)11_509406A(1999)描述在等溫條件下，通過(guò)使目的區(qū)域內(nèi)的DNA在存在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的條件下與至少一對(duì)寡核苷酸引物反應(yīng)而對(duì) 其進(jìn)行擴(kuò)增的方法。然而，日本專(zhuān)利公開(kāi)(Kohyo)號(hào)11-509406A(1999)中所述的方法已經(jīng) 引起了問(wèn)題，因?yàn)槠湫枰喈?dāng)長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。日本專(zhuān)利公開(kāi)(Kokai)號(hào)2002-233379描述在等溫條件下，通過(guò)使目的區(qū)域內(nèi)的 DNA在存在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的條件下與至少一對(duì)寡核苷酸引物反應(yīng)而對(duì)其進(jìn) 行擴(kuò)增的方法。然而，日本專(zhuān)利公開(kāi)(Kokai)號(hào)2002-233379中所述的方法已經(jīng)在顯著水 平的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物生成方面引起了問(wèn)題。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶復(fù)制核酸序列的方法。本發(fā) 明的另一個(gè)目的是提供用于復(fù)制核酸序列的方法，所述方法可以在等溫條件下進(jìn)行并容許 以高效率短時(shí)間特異性復(fù)制核酸序列，其不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)或特殊的酶。作為針對(duì)實(shí)現(xiàn)前述目的的密集研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了核酸序列可以以 高效率特異性擴(kuò)增，這通過(guò)提供具有這樣的結(jié)構(gòu)的核酸序列實(shí)現(xiàn)，在所述結(jié)構(gòu)中，交替排列 由模板核酸序列上的20以上-200以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)和由1以上-100 以下個(gè)核苷酸組成的與模板核酸序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，由此完成本發(fā)明。 Ac和Bc代表A和B的各個(gè)互補(bǔ)序列。本發(fā)明提供用于復(fù)制核酸序列的方法，其包括用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚 合酶合成互補(bǔ)鏈，其中將在兩個(gè)末端具有由20以上-200以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列 A(Ac)的雙鏈模板核酸用作起始點(diǎn)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的用于復(fù)制核酸序列的方法包括以下步驟(a)提供具有這樣的結(jié)構(gòu)的雙鏈模板核酸的步驟，其中交替排列由20以上-200 以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)和由1以上-100以下個(gè)核苷酸組成的與模板核酸序 列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中雙鏈模板核酸的特征是其中存在至少兩個(gè)序列 A(Ac)；(b)解離步驟(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步驟；(c)在新核酸鏈和步驟(b)中獲得的全部或部分解離的雙鏈模板核酸之間通過(guò)序 列A(Ac)形成堿基對(duì)的步驟；和(d)用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈的步驟，其中將在步驟 (c)堿基配對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)核酸鏈的3’ -末端用作合成起始點(diǎn)。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的用于復(fù)制核酸序列的方法包括以下步驟(a)提供具有這樣的結(jié)構(gòu)的雙鏈模板核酸的步驟，其中交替排列由20以上-200以 下個(gè)連續(xù)核苷酸序列組成的序列A(Ac)和由1以上-100以下個(gè)核苷酸組成的與模板核酸 序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc),其中雙鏈模板核酸的特征是其中存在至少兩個(gè)序 列 A (Ac)；(b)解離步驟(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步驟；
(c)在步驟(b)中獲得的全部或部分解離的雙鏈模板核酸之間通過(guò)序列A(Ac)形 成堿基對(duì)的步驟；和(d)用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈的步驟，其中將在步驟 (c)堿基配對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)核酸鏈的3’ -末端用作合成起始點(diǎn)。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液包括與雙鏈模板核酸的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。優(yōu)選地，將在步驟(d)中由鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)獲得的產(chǎn)物用作步驟(a)中的 雙鏈模板核酸。優(yōu)選地，所有步驟在等溫條件下進(jìn)行。
優(yōu)選地，所有步驟在50°C以上-100°C以下的等溫溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶選自由源自嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)的5，一 3，核酸外切酶-缺陷型Bst. DNA聚合酶，源自熱 堅(jiān)芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)的5，一3，核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自 Termococcus Iitoralis的5’ 一 3’核酸外切酶缺陷型Vent. DNA聚合酶，和源自酸熱脂環(huán) 酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶組成的組。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液包括至少0. 01 %以上的表面活性劑。優(yōu)選地，所述表面活性劑是非離子表面活性劑。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液還包括二價(jià)陽(yáng)離子。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液還包括解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，所有步驟在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。按照本發(fā)明，只要提供具有特定結(jié)構(gòu)的模板核酸序列和使用具有鏈置換活性的 DNA聚合酶，則模板核酸序列持續(xù)延長(zhǎng)。因此，模板核酸序列可以以非常高的效率特異性復(fù) 制。即，靶核酸序列可以在等溫條件下，以高效率短時(shí)間復(fù)制，其不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)或 特殊的酶。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示用于按照本發(fā)明擴(kuò)增核酸的方法的概述。圖2顯示用于按照本發(fā)明擴(kuò)增核酸的方法的概述。圖3顯示用于按照本發(fā)明擴(kuò)增核酸的方法的概述。圖4顯示在關(guān)于β 2AR基因的實(shí)施例中使用的引物的位置關(guān)系。圖5顯示通過(guò)電泳來(lái)自使用引物⑴和引物(3)的復(fù)制反應(yīng)的產(chǎn)物獲得的結(jié)果。圖6顯示通過(guò)電泳來(lái)自使用引物(2)和引物(3)的復(fù)制反應(yīng)的產(chǎn)物獲得的結(jié)果。發(fā)明的實(shí)施方式在下文中，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。按照本發(fā)明用于擴(kuò)增核酸的方法是在等溫條件下以高效率短時(shí)間擴(kuò)增靶核酸序 列的方法，其不需要復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)或特殊的酶，其特征在于至少包括以下步驟(a)提供具有這樣的結(jié)構(gòu)的雙鏈模板核酸的步驟，其中交替排列由20以上_200 以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)和由1以上-100以下個(gè)核苷酸組成的與模板核酸序 列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中雙鏈模板核酸的特征是其中存在至少兩個(gè)序列 A(Ac)；(b)解離步驟(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步驟；
(c)在新核酸鏈和步驟(b)中獲得的全部或部分解離的雙鏈模板核酸之間通過(guò)序 列A(Ac)形成堿基對(duì)的步驟；和(d)用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈的步驟，其中將在步驟 (c)堿基配對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)核酸鏈的3’ -末端用作合成起始點(diǎn)。按照本發(fā)明用于擴(kuò)增核酸的方法的概述顯示在圖1中。按照本發(fā)明，解離模板核酸的全部或一部分的步驟既不需要特殊的試劑，也不需 要以高溫處理。優(yōu)選地，解離模板核酸的全部或一部分的步驟在50°C以上-100°C以下的溫度進(jìn) 行。按照本發(fā)明，步驟(C)中的新核酸鏈可以由全部或部分解離的不同雙鏈模板核酸 分子提供(圖2)。按照本發(fā)明，步驟(C)中的新核酸鏈可以由全部或部分解離的原始雙鏈模板核酸 分子提供(圖3)。
按照本發(fā)明，反應(yīng)溶液可以包括與雙鏈模板核酸的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。在此，將在下文中描述本發(fā)明中使用的成分。(1)脫氧核苷酸三磷酸酯將脫氧核苷酸三磷酸酯用作延長(zhǎng)反應(yīng)的底物。具體地，優(yōu)選使用dATP，dCTP，dGTP 和dTTP的混合物。脫氧核苷酸三磷酸酯可以包括dNTP的類(lèi)似物(例如，7-脫氮-dGTP，
寸J ο另外，所述脫氧核苷酸三磷酸酯(dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物)的終濃度 在 0. ImM-lOOmM，優(yōu)選0. 75mM_3. OmM，更優(yōu)選 1. OmM-2. OmM，和特別優(yōu)選 1. OmM-1. 5mM 的范圍內(nèi)。(2) DNA 聚合酶在本發(fā)明中，使用具有鏈置換能力的聚合酶。術(shù)語(yǔ)“鏈置換能力”在本說(shuō)明書(shū)中 用于意指利用核酸序列作為模板進(jìn)行DNA復(fù)制同時(shí)置換DNA鏈從而釋放對(duì)模板鏈退火的 互補(bǔ)鏈的活性；即進(jìn)行鏈置換的活性。所述具有鏈置換能力的聚合酶的特殊實(shí)例包括源自 嗜熱脂肪芽孢桿菌的5’ 一3’核酸外切酶-缺陷型Bst. DNA聚合酶，源自熱堅(jiān)芽孢桿菌的 5’ 一 3’核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自Termococcus Iitoralis的5’ 一 3’核酸 外切酶缺陷型Vent. DNA聚合酶，和源自酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的DNA聚合酶，但實(shí)例不僅限 于此。所述具有鏈置換能力的聚合酶可以是天然存在的蛋白或通過(guò)遺傳工程生成的重組蛋 白。(3) 二價(jià)陽(yáng)離子在本發(fā)明中，為了所用酶等的金屬性需求使用二價(jià)陽(yáng)離子。作為這樣的二價(jià)陽(yáng)離 子，可以使用鎂鹽、鈣鹽、和其他金屬鹽。例如，可以使用氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂等。所述二 價(jià)陽(yáng)離子的終濃度在優(yōu)選lmM-20mM，和更優(yōu)選2mM-10mM的范圍內(nèi)。(4)表面活性劑在本發(fā)明中，可以將表面活性劑加入到反應(yīng)溶液中。使用這樣的表面活性劑，可以 獲得本發(fā)明的有利效果，即防止核酸的非特異性擴(kuò)增。本發(fā)明中使用的表面活性劑的類(lèi)型 不受特別的顯著。本發(fā)明中可以使用的表面活性劑的實(shí)例包括陰離子表面活性劑諸如烷基苯磺酸鈉，十二烷基硫酸鈉(SDS)，辛基磺基琥珀酸鹽或硬脂酸皂；非離子表面活性劑諸 如蔗糖脂肪酸酯，POE失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，等)，脂肪 酸鏈烷醇酰胺，POE烷基醚(Brij 35, Brij 58，等)，POE烷基苯基醚(Triton X-100, Triton X-114，Nonidet P40，等)))，壬基苯酚，月桂醇，聚乙二醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合 物，POE烷基胺或POE脂肪酸二苯基醚；和陽(yáng)離子表面活性劑諸如十六烷基氯化吡啶鐺，月 桂基二甲基芐基氯化銨或硬脂基三甲基氯化銨。所用表面活性劑的量不受特別的限制，條 件是可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果。所用表面活性劑的量是優(yōu)選0. 01 %以上，更優(yōu)選0. 05%以 上，和進(jìn)一步優(yōu)選0.1%以上。所用表面活性劑的量的上限不受特別的顯著。通常是10% 以下，優(yōu)選5%以下，和更優(yōu)選以下。在所述表面活性劑中，使用非離子表面活性劑是特別優(yōu)選的。在非離子表面活性 劑中，具有強(qiáng)親水性的非離子表面活性劑是優(yōu)選的，且在HLB值方面，具有12以上的HLB值 的非離子表面活性劑是優(yōu)選的。所述HLB值更優(yōu)選是14以上。優(yōu)選應(yīng)用的HLB值的上限 是20。HLB值的上限更優(yōu)選是17以下，和進(jìn)一步優(yōu)選是14-17。在結(jié)構(gòu)上，本發(fā)明中使用的 表面活性劑優(yōu)選選自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。在所述聚氧乙烯 失水山梨糖醇脂肪酸酯中，僅具有一個(gè)脂肪酸酯的那些是優(yōu)選的。所述化合物的實(shí)例通過(guò) 以下結(jié)構(gòu)式表示
<formula>formula see original document page 8</formula>
x + y + z + w = 20
R:具有12-18個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)烷基基團(tuán)的位置不受特別的限制。還可以?xún)?yōu)選使用以下結(jié)構(gòu)。<image>image see original document page 9</image>
由上述通式表示的表面活性劑包括稱(chēng)為聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯的非離 子表面活性劑。所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯非離子表面活性劑的實(shí)例包括聚氧乙 烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯，聚氧乙烯(20) 失水山梨糖醇單硬脂酸酯，和聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單油酸酯。(產(chǎn)品名吐溫20，吐 溫40，吐溫60，吐溫80，等)。使用的所述非離子表面活性劑的量不受特別的限制。優(yōu)選是 0. 01 %以上，更優(yōu)選0. 05%以上，和進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 %以上。(5)寡核苷酸本發(fā)明中使用的寡核苷酸具有基本與模板DNA互補(bǔ)的核苷酸序列，并容許DNA鏈 由其3’端開(kāi)始延長(zhǎng)。因此，由于所述寡核苷酸具有基本與模板DNA互補(bǔ)的核苷酸序列，所 以其可以對(duì)作為模板使用的DNA退火。作為本發(fā)明中使用的寡核苷酸，可以使用由脫氧核 糖核苷酸或核糖核苷酸組成的寡核苷酸，且所述寡核苷酸還可以包括修飾的核糖核苷酸或 修飾的脫氧核糖核苷酸。寡核苷酸的長(zhǎng)度不受特別的限制。所述長(zhǎng)度由通常約10-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選約 15-50個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選約15-40個(gè)核苷酸組成。所述寡核苷酸可以通過(guò)使用可商購(gòu)的DNA合成器(例如，由 AppliedBiosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng))制造的394型DNA合成器，等)的亞磷酰胺 (phosphoamidite)法合成。 反應(yīng)溶液中使用的所述寡核苷酸的量是優(yōu)選0. 1 μ M以上，更優(yōu)選1 μ M以上，和特別優(yōu)選1.5μΜ以上。(6)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑可以將解鏈溫度調(diào)節(jié)劑加入到本發(fā)明的反應(yīng)溶液中。所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的具體實(shí)例包括二甲亞砜(DMSO)，甜菜堿，甲酰胺，甘油，四烷基銨鹽，和這些化合物中兩種以上類(lèi) 型的混合物。使用的所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的量不受特別的限制。當(dāng)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是DMS0， 甲酰胺，或甘油時(shí)，通?？梢砸?0%以下的百分比包含在反應(yīng)溶液中。甜菜堿或四烷基銨鹽可以以約0. 2-3. 0Μ，和優(yōu)選約0. 5-1. 5Μ的濃度添加到反應(yīng) 溶液中。(7)緩沖成分本發(fā)明中使用的反應(yīng)溶液可以包括緩沖成分。所述緩沖成分的類(lèi)型不受特別的限 制。例如，可以使用N-二(羥乙基)甘氨酸，麥黃酮(tricin)，!fepes，TriS，磷酸鹽(磷酸 鈉，磷酸鉀，等)，等。緩沖成分的終濃度在5mM-100mM，和特別優(yōu)選10mM-50mM的范圍內(nèi)。緩 沖成分的PH值取決于擴(kuò)增反應(yīng)中使用的酶的最佳pH。通常是pH 6. 0-9.0，和特別優(yōu)選是 pH 7. 0-9. 0。(8)熒光染料本發(fā)明中使用的反應(yīng)溶液可以包括熒光染料。所述熒光染料的類(lèi)型不受特別的限 制。例如，可以使用SYBRGreen I等。其次，將描述按照本發(fā)明的用于擴(kuò)增核酸的方法。在本發(fā)明中，擴(kuò)增核酸的步驟可以?xún)?yōu)選在基本等溫條件下進(jìn)行。溫育反應(yīng)溶液的 溫度是優(yōu)選50°C以上，和更優(yōu)選55°C以上。反應(yīng)溶液可以在例如約60°C溫育。溫度范圍是 優(yōu)選約50°C -約70°C，和更優(yōu)選約55°C -約65°C。按照本發(fā)明的用于擴(kuò)增核酸的方法可以在基本等溫條件下進(jìn)行。在本發(fā)明中，術(shù) 語(yǔ)“等溫條件”意指在不顯著改變各個(gè)步驟中的反應(yīng)溫度的條件下，在基本恒定的溫度下進(jìn) 行各個(gè)步驟。在本發(fā)明中，在基本等溫條件下溫育反應(yīng)溶液所需的時(shí)間不受特別的限制，條件 是可以擴(kuò)增靶核酸序列。溫育時(shí)間是，例如，5分鐘-12小時(shí)。溫育時(shí)間是優(yōu)選5分鐘-2小 時(shí)，更優(yōu)選5分鐘-60分鐘，和進(jìn)一步優(yōu)選5分鐘-30分鐘。還可以設(shè)置為5分鐘-15分鐘。在基本等溫條件下擴(kuò)增核酸的步驟是有利的，因?yàn)槠洳恍枰龈呋蚪档蜏囟?。?常規(guī)PCR方法中，必需增高或降低溫度，且因此需要反應(yīng)器諸如熱循環(huán)儀。然而，當(dāng)擴(kuò)增核 酸的步驟在基本等溫條件下進(jìn)行時(shí)，所述步驟可以?xún)H利用維持恒定溫度的裝置進(jìn)行。將描述使用按照本發(fā)明擴(kuò)增核酸的方法的方法。按照本發(fā)明的擴(kuò)增核酸的方法可以用于檢測(cè)核酸，標(biāo)記、確定核苷酸序列，檢測(cè)核 苷酸突變(包括檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性等)，等。由于本發(fā)明的用于擴(kuò)增核酸的方法不需要使 用能夠溫度控制的反應(yīng)容器，因此擴(kuò)增反應(yīng)可以利用大量反應(yīng)溶液進(jìn)行。通過(guò)本發(fā)明的擴(kuò)增核酸的方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知 的方法檢測(cè)。例如，根據(jù)凝膠電泳，可以通過(guò)使用溴化乙錠染色凝膠檢測(cè)特定尺寸的反應(yīng)產(chǎn) 物。作為用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)系統(tǒng)，可以使用熒光偏振、免疫測(cè)定、熒光能量轉(zhuǎn)移、酶標(biāo) 記(例如，過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶，等)、熒光標(biāo)記(例如，熒光素、若丹明，等)、化學(xué)發(fā)光、 生物發(fā)光等。還可能利用Taqman探針或分子信標(biāo)(Molecular Beacon)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。還可能利用用生物素等標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在這種情形中，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含的 生物素可以利用熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白或酶標(biāo)記的抗生物素蛋白檢測(cè)。而且，使用本領(lǐng) 域中技術(shù)人員已知的氧化還原嵌入劑，可以用電極檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物還可以利 用sra檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)焦磷酸鎂，可以檢測(cè)核酸擴(kuò)增。在這種情形中，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)本領(lǐng)域 中技術(shù)人員已知的其他方法，諸如檢測(cè)濁度來(lái)檢測(cè)。本發(fā)明將在以下實(shí)施例中更加具體地描述。然而，這些實(shí)施例不意欲限制本發(fā)明 的范圍。
實(shí)施例<實(shí)施例1>復(fù)制β 2AR基因序列(1)制備含有靶核酸序列的核酸樣品溶液將3. Ong人基因組DNA (由Clonetech制造)在98°C加熱3分鐘，以生成單鏈。隨 后，在以下條件下擴(kuò)增3 2AR基因中的序列?！匆铩凳褂靡韵乱铮瑥亩砂泻怂嵝蛄械臉悠帆@得具有這樣的結(jié)構(gòu)的雙鏈模板核 酸，其中交替排列由20以上-200以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)和由3以上-100以 下個(gè)核苷酸組成的與模板核酸序列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中雙鏈模板核酸 的特征是其中存在至少兩個(gè)序列A(Ac)。各種引物的序列顯示如下。引物(1)5，-CCACGACGCTTGCTGGCACCCAATA3，(SEQ ID NO 1)引物(2)5，-TGGGTGGTCTTGCTGGCACCCAATA-3，(SEQ ID NO 2)引物(3)5，-CCGGCGCATGGCTT-3，(SEQ ID NO 3)前述引物與β 2AR基因的位置關(guān)系的詳細(xì)信息顯示在圖4中。在此，引物(1)和(2)中每一種的5’端處的8個(gè)核苷酸與基本互補(bǔ)于引物(3)的 序列的5’端側(cè)存在的序列基本互補(bǔ)。(2)核酸序列的復(fù)制反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)利用具有以下組成的反應(yīng)溶液，在60°C進(jìn)行60分鐘。作為酶，使用由NEB 制造的Bst. DNA聚合酶?！捶磻?yīng)溶液的組成〉IOXBst 緩沖液(DF)LOyLIOOmM MgS040. 6 μ L10% (ν/ν)吐溫 200. 1 μ L100% DMSO0. 5μ L25mM 各種 dNTP0. 56 μ LSYBRGreen I (2000-倍稀釋)0· 2 μ L
50μΜ 引物(1)或(2)0. 64μ L50 μ M 引物(3)0· 64 μ LBst.聚合酶0. 4yL在(1)中獲得的核酸片段樣品3. Ong純化水_4. 96 μ L10. 0μ L(3)通過(guò)電泳檢測(cè)利用3wt%瓊脂糖凝膠和 0. 5ΧΤΒΕ 緩沖液(50mM Tris，45mM 硼酸，0. 5mM EDTA, ρΗ8. 4)，以IOOV進(jìn)行電泳60分鐘。結(jié)果顯示在圖5和6中。通過(guò)組合引物⑴和引物(3)，獲得由序列A(Ac)的42個(gè)堿基對(duì)和序列B(Bc)的 1對(duì)堿基對(duì)組成的模板核酸序列。利用由具有A (Ac) B (Be) A (Ac)結(jié)構(gòu)的85對(duì)堿基對(duì)的模板 核酸序列作為起始點(diǎn)，通過(guò)圖1、圖2、或圖3中所示的反應(yīng)機(jī)制，假定應(yīng)該復(fù)制由128個(gè)堿 基對(duì)、171個(gè)堿基對(duì)、214個(gè)堿基對(duì)、和257個(gè)堿基對(duì)(此后，將由43個(gè)堿基對(duì)聚合)組成的 核酸序列。圖5中所示的結(jié)果對(duì)應(yīng)于預(yù)期的條帶尺寸。因此，該結(jié)果證明核酸序列的復(fù)制 反應(yīng)以A(Ac)B (Be) A(Ac)結(jié)構(gòu)作為起始點(diǎn)進(jìn)行。具有最小分子量的條帶是被夾在引物之間 的區(qū)域(42個(gè)堿基對(duì))。通過(guò)組合引物⑵和引物(3)，獲得由序列A(Ac)的42個(gè)堿基對(duì)和序列B(Bc)的 32個(gè)堿基對(duì)組成的模板核酸序列。利用由具有A(Ac)B(Be)A(Ac)結(jié)構(gòu)的116個(gè)堿基對(duì)的 模板核酸序列作為起始點(diǎn)，通過(guò)圖1或圖2中所示的反應(yīng)機(jī)制，假定應(yīng)該復(fù)制由190個(gè)堿基 對(duì)，264個(gè)堿基對(duì)，338個(gè)堿基對(duì)，和1412個(gè)堿基對(duì)(此后，將由74個(gè)堿基對(duì)聚合)組成的 核酸序列。圖6中所示的結(jié)果對(duì)應(yīng)于預(yù)期的條帶尺寸。因此，該結(jié)果證明核酸序列的復(fù)制 反應(yīng)以A(Ac)B (Be) A(Ac)結(jié)構(gòu)作為起始點(diǎn)進(jìn)行。具有最小分子量的條帶是被夾在引物之間 的區(qū)域(42個(gè)堿基對(duì))。(4)復(fù)制反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)序分析復(fù)制反應(yīng)產(chǎn)物利用NucleoSpin (注冊(cè)商標(biāo))Extract II (由MACHEREY-NAGEL制 造)和然后利用TOPO TA克隆試劑盒(由Invitrogen制造)純化，將其引入載體。隨后， 用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)
基中培養(yǎng)。利用QIApr印Miniprep (由Qiagen制造)，從培養(yǎng)的大腸桿菌中回收質(zhì)粒DNA。對(duì)回收的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，以確定其核苷酸序列。所述測(cè)序利用ABI PRISM 310 基因分析儀(由ABI制造)進(jìn)行。作為引物，使用M13反向引物。M13反向引物5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，(SEQ ID NO 4)作為測(cè)序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)具有以下序列的核酸可以通過(guò)組合引物(1)和引物(3)獲得。(1)5’ -CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCC GG-3’3’ -GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGG CC-5’(42 個(gè)堿基對(duì))(SEQ ID NO 5)
(2)5’ -CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCCGGACCACGAC-3，3， -GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5，5， -GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGG-3，3’ -CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCC-5’(85 個(gè)堿基對(duì))(SEQ ID NO 6)(3)5’ -CCACGACGTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCCGGACCACGAC-3'3， -GGTGCTGCAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5'5’ -GTTCTTGCTG GCACCCAATA GAAGCCATGC GCCGGACCACGACGTTCTTG-3，3’ -CAAGAACGAC CGTGGGTTAT CTTCGGTACG CGGCCTGGTGCTGCAAGAAC-5，5’ -CTGGCACCCA ATAGAAGCCA TGCGCCGG-3，3， -GACCGTGGGT TATCTTCGGT ACGCGGCC-5，(128 個(gè)堿基對(duì))(SEQ ID NO 7)作為測(cè)序分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)復(fù)制反應(yīng)產(chǎn)物中存在具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)結(jié)構(gòu)的核 酸序列的85個(gè)堿基對(duì)和具有A (Ac) B (Be) A (Ac) B (Be) A (Ac)結(jié)構(gòu)的核酸序列的128個(gè)堿基對(duì)。由前述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)序列A(Ac)和序列B(Bc)可以從具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)結(jié)構(gòu)的 模板核酸序列開(kāi)始以高效率特異性復(fù)制。作為測(cè)序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)具有以下序列的核酸可以通過(guò)組合引物(2)和引物(3)獲得。(1)5' -TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCCGG-3，3’ -ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGGCC-5’(42 個(gè)堿基對(duì))(SEQ ID NO 8)(2)5' -TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCCGGACCACGAC-3，3， -ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5，5’ -GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCTGGCACCCAAT3’ -CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGAC CGTGGGTTA5， -AGAAGCCATG CGCCGG-3，3， -TCTTCGGTAC GCGGCC-5，(116 個(gè)堿基對(duì))(SEQ ID NO 9)(3)5' -TGGGTGGTTT CTTGCTGGCA CCCAATAGAA GCCATGCGCCGGACCACGAC-3'3， -ACCCACCAAA GAACGACCGT GGGTTATCTT CGGTACGCGGCCTGGTGCTG-5，5， -GTCACGCAGG AAAGGGACGA GGTGTGGGTG GTTTCTTGCTGGCACCCAAT-3，3， -CAGTGCGTCC TTTCCCTGCT CCACACCCAC CAAAGAACGACCGTGGGTTA-5，5’ -AGAAGCCATG CGCCGGACCA CGACGTCACG CAGGAAAGGGACGAGGTGTG-3’
3，-TCTTCGGTAC GCGGCCTGGT GCTGCAGTGC GTCCTTTCCC TGCTCCACAC-5，5' -GGTGGTTTCT TGCTGGCACC CAATAGAAGC CATGCGCCGG-3‘3’ -CCACCAAAGA ACGACCGTGG GTTATCTTCG GTACGCGGCC-5，(190 個(gè)堿基對(duì))(SEQ ID NO 10)作為測(cè)序分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)復(fù)制反應(yīng)產(chǎn)物中存在具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)結(jié)構(gòu)的核 酸序列的116個(gè)堿基對(duì)和具有A(Ac)B(Be)A(Ac)B(Be)A(Ac)結(jié)構(gòu)的核酸序列的190個(gè)堿基 對(duì)。由前述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)序列A(Ac)和序列B(Bc)可以從具有A(Ac)B(Bc)A(Ac)結(jié)構(gòu)的 模板核酸序列開(kāi)始以高效率特異性復(fù)制。序列表<110>富士膠片株式會(huì)社<120>用于復(fù)制核酸序列的方法<120>FA9174A<160>10
<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>1ccacgacgct tgctggcacc caata25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>2tgggtggtct tgctggcacc caata25<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>3ccggcgcatg gctt14<210>4
<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>4caggaaacag ctatgac17<210>5<211>42
<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述擴(kuò)增產(chǎn)物<400>5ccacgacgtt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc gg42<210>6<211>85<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述擴(kuò)增產(chǎn)物<400>6ccacgacgtt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gttcttgctg 60gcacccaata gaagccatgc gccgg85<210>7<211>128<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述擴(kuò)增產(chǎn)物<400>7ccacgacgtt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gttcttgctg 60gcacccaata gaagccatgc gccggaccac gacgttcttg ctggcaccca atagaagcca 120tgcgccgg128<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述擴(kuò)增產(chǎn)物<400>8tgggtggttt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc gg42<210>9<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述擴(kuò)增產(chǎn)物<400>9tgggtggttt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gtcacgcagg 60aaagggacga ggtgtgggtg gtttcttgct ggcacccaat agaagccatg cgccgg 116<210>10<211>190<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述擴(kuò)增產(chǎn)物<400>10tgggtggttt cttgctggca cccaatagaa gccatgcgcc ggaccacgac gtcacgcagg 60aaagggacga ggtgtgggtg gtttcttgct ggcacccaat agaagccatg cgccggacca 120cgacgtcacg caggaaaggg acgaggtgtg ggtggtttct tgctggcacc caatagaagc 180catgcgccgg190
權(quán)利要求
用于復(fù)制核酸序列的方法，其包括使用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈，其中將在兩個(gè)末端具有由20以上-200以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)的雙鏈模板核酸用作起始點(diǎn)。
2.按照權(quán)利要求1的用于復(fù)制核酸序列的方法，其包括以下步驟(a)提供具有這樣的結(jié)構(gòu)的雙鏈模板核酸的步驟，其中交替排列由20以上-200以下個(gè) 連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)和由1以上-100以下個(gè)核苷酸組成的與在模板核酸序列上 的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中所述雙鏈模板核酸的特征是其中存在至少兩個(gè)序列 A(Ac)；(b)解離步驟(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步驟；(c)在新核酸鏈和步驟(b)中獲得的全部或部分解離的雙鏈模板核酸之間通過(guò)序列 A(Ac)形成堿基對(duì)的步驟；和(d)用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈的步驟，其中將在步驟(c)堿 基配對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)核酸鏈的3’ -末端用作合成起始點(diǎn)。
3.按照權(quán)利要求1的用于復(fù)制核酸序列的方法，其包括以下步驟(a)提供具有這樣的結(jié)構(gòu)的雙鏈模板核酸的步驟，其中交替排列由20以上-200以下 個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)和由1以上-100以下個(gè)核苷酸組成的與在模板核酸序 列上的序列A(Ac)不同的序列B(Bc)，其中雙鏈模板核酸的特征是其中存在至少兩個(gè)序列 A(Ac)；(b)解離步驟(a)中提供的模板核酸的全部或一部分的步驟；(c)在步驟(b)中獲得的全部或部分解離的雙鏈模板核酸之間通過(guò)序列A(Ac)形成堿 基對(duì)的步驟；和(d)用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈的步驟，其中將在步驟(c)堿 基配對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)核酸鏈的3’ -末端用作合成起始點(diǎn)。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)溶液包括與所述雙鏈模板核酸的一部分互補(bǔ) 的寡核苷酸。
5.按照權(quán)利要求2的方法，其中將在步驟(d)中由鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)獲得的產(chǎn)物 用作步驟(a)中的雙鏈模板核酸。
6.按照權(quán)利要求3的方法，其中將在步驟(d)中由鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)獲得的產(chǎn)物 用作步驟(a)中的雙鏈模板核酸。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中所有步驟在等溫條件下進(jìn)行。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中所有步驟在50°C以上-100°C以下的等溫溫度下進(jìn)行。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中催化所述鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶選自由源自 嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的5’ 一 3’核酸外切酶-缺陷型Bst. DNA聚合酶，源自熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的5，一3，核酸外切酶缺陷型Bca DNA聚合酶，源自Termococcus Iitoralis的5’一 3’核酸外切酶缺陷型Vent. DNA聚合酶， 和源自酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的DNA聚合酶組成的 組。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)溶液包括至少0.01%以上的表面活性劑。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述表面活性劑是非離子表面活性劑。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)溶液還包括二價(jià)陽(yáng)離子。
13.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)溶液還包括解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。
14.按照權(quán)利要求1的方法，其中所有步驟在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供使用寡核苷酸引物和DNA聚合酶復(fù)制核酸序列的方法。本發(fā)明提供用于復(fù)制核酸序列的方法，其包括用催化鏈置換互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)的聚合酶合成互補(bǔ)鏈，其中將在兩個(gè)末端具有由20以上-200以下個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列A(Ac)的雙鏈模板核酸用作起始點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101818142SQ20101000203
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者三好隼人, 巖木義英 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社