專利名稱：一種通過胚性細(xì)胞組織制備蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備蛋白質(zhì)的方法，具體地，本發(fā)明涉及一種通過胚性細(xì)胞組織 制備蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
已證明轉(zhuǎn)基因植物種子合子胚是藥用活性蛋白的極佳來源(Hood etal。2003， Horn et al。2004)，其原因包括胚胎中高蛋白含量，天然擁有蛋白酶抑制劑，且在成熟的種 子中能降低總體代謝活動，并能導(dǎo)致外源蛋白保持長期穩(wěn)定性的低水份含量。大規(guī)模生產(chǎn) 藥用蛋白要求轉(zhuǎn)基因作物種植在開放的田間，因?yàn)榇笈锓N植昂貴因而受到局限。在開放的 田間種植此類作物要求政府統(tǒng)一集中監(jiān)測和批準(zhǔn)，而且對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的可能逃脫監(jiān)管區(qū) 域而進(jìn)入到食物鏈還存在極大的爭議.對此的解決辦法是在大型生物發(fā)酵罐中通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液形式生長轉(zhuǎn)基因植 物細(xì)胞或組織。這種解決辦法有許多優(yōu)點(diǎn)(Hellwig et al。2004)。這些優(yōu)點(diǎn)是(1)從接 種，收成到過程處理完全在密封的容器中進(jìn)行；(2)氣候和季節(jié)不構(gòu)成影響產(chǎn)量的因素，這 意味著藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)可周年進(jìn)行；(3)處理廢棄生物質(zhì)簡單且便宜；(4)發(fā)酵罐生物反 應(yīng)器系統(tǒng)對制藥企業(yè)來講比田間生產(chǎn)系統(tǒng)更容易被接受；(5)商用轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)系可以采用 細(xì)胞庫，采用低溫貯藏辦法。但是，生物反應(yīng)器系統(tǒng)生長轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞用于生產(chǎn)異性蛋白，特別是藥用蛋白 的可見的弱點(diǎn)在于(1)從歷史角度看，產(chǎn)率低(Hellwig etal. 2004)，(2)使用較小規(guī)模生 物反應(yīng)器所帶來的較高的成本(Hood et al,2003) ； (3)必須馬上處理，因?yàn)椴豢梢苑胖幂^ 長時(shí)間。因此，本發(fā)明尋求對這些問題的解決并改進(jìn)制備蛋白質(zhì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
除非特別說明，在本文中，所使用的術(shù)語“胚性細(xì)胞組織”或“胚性體細(xì)胞組織”，是 指還沒有形成胚胎器官如雙極胚胎結(jié)構(gòu)(可分化幼苗和根部)以及子葉(子葉可能是或不 是某個(gè)特定植物種類胚胎器官組成部分)的細(xì)胞組織。除非特別說明，在本文中，所使用的術(shù)語“體細(xì)胞胚”，簡稱“體胚”，是指胚性體細(xì) 胞在培養(yǎng)液中生長發(fā)育一段時(shí)間后形成的物質(zhì)，其可能形成不了成熟的具有器官或類似器 官結(jié)構(gòu)的胚胎，如子葉或胚根，但卻仍然具有成熟器官的特性，即蛋白含量高，具有蛋白酶 抑制劑，干物質(zhì)含量高和水份含量低，并能使外源蛋白保持長期穩(wěn)定。本發(fā)明的目的在于，提供一種通過胚性細(xì)胞組織制備蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供用于制備蛋白質(zhì)的胚性細(xì)胞組織。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種制備蛋白 質(zhì)的方法，所述方法是通過將含有需要制備的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)化到植物胚性細(xì)胞組織中進(jìn)行 培養(yǎng)來制備蛋白質(zhì)的。
優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟1)制備植物胚性細(xì)胞組織；幻將需要制備的蛋 白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入步驟1)所制備的胚性細(xì)胞組織中；；3)培養(yǎng)步驟幻得到的胚性細(xì)胞組織，使 其發(fā)育成熟為體細(xì)胞胚；4)從步驟幻得到的體細(xì)胞胚中提取蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述步驟1)中制備植物胚性細(xì)胞組織的方法包括采用半固體培養(yǎng)基 誘導(dǎo)和液體培養(yǎng)基增殖的步驟；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為添加了 1_2(^!1101/1生長素和/ 或l-20ymol/L細(xì)胞分裂素的1/2 Litvay(LV)培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件為 20-300C，黑暗，90-120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述步驟幻中將需要制備的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入胚性細(xì)胞組織的方法選自 微粒-介導(dǎo)傳遞技術(shù)(基因槍轉(zhuǎn)化)、原生質(zhì)電穿孔方法、聚乙二醇析出技術(shù)、直接基因轉(zhuǎn)移 技術(shù)、生物體外原生質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)、植物細(xì)胞原生質(zhì)或胚性愈傷組織顯微注射技術(shù)和土壤農(nóng) 桿菌轉(zhuǎn)化方法；更優(yōu)選地，所述步驟2、中是通過微粒-介導(dǎo)傳遞技術(shù)和土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方 法將需要制備的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入胚性細(xì)胞組織。優(yōu)選地，所述步驟2、中獲得的轉(zhuǎn)基因胚性細(xì)胞組織是通過超低溫液氮冷凍技術(shù) 并以細(xì)胞庫的方式保存，轉(zhuǎn)基因胚性細(xì)胞組織的細(xì)胞先被制作成種源細(xì)胞庫(master cell bank，MCB)，然后用種源細(xì)胞庫的細(xì)胞制作工作細(xì)胞庫(working cell bank, WCB) 0優(yōu)選地，所述方法還包括在超低溫下冷凍保藏所述步驟1)中制備的胚性細(xì)胞組 織或步驟幻中制備的轉(zhuǎn)入蛋白質(zhì)基因的胚性細(xì)胞組織的步驟；更優(yōu)選地，所述冷凍保藏溫 度為-196°C。優(yōu)選地，所述步驟幻中培養(yǎng)胚性細(xì)胞的方法包括采用液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的步 驟；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為添加了生長抑制劑如5-120 μ mol/L脫落酸和/或滲壓劑如蔗糖 的1/2 Litvay培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件為20-30°C，黑暗，60-120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述步驟幻中培養(yǎng)步驟2~)得到的胚性細(xì)胞的方法還包括催化體細(xì)胞 胚成熟的處理；更優(yōu)選地，所述處理是采用船式RAFT培養(yǎng)方法來實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選地，所述船 式RAFT培養(yǎng)的培養(yǎng)基為添加了生長抑制劑如5-120um/L脫落酸和/或滲壓劑如蔗糖的 Litvay培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件為20-30°C，黑暗靜培養(yǎng)。優(yōu)選地，由于裸子植物或被子植物的種子或幼苗均能誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞組織，故所 述制備植物胚性細(xì)胞組織的外植體選自裸子植物或被子植物種子或幼苗；更優(yōu)選地，所述 裸子植物包括松科、柏科和杉科，如冷杉屬、松屬、云杉屬、鐵杉屬、假鐵杉屬、金鐘柏屬、檜 屬、落葉松屬、紫杉屬和紅杉屬；所述被子植物包括油棕、刺葵屬桉樹、櫟屬、葡萄屬、蘋果 屬、小麥屬、稻屬、大豆屬、燕麥屬、蕓薹屬、甘蔗屬、大麥屬、蕎麥屬、棉屬、甜菜屬、落花生 屬、蛇麻籽屬、番薯屬、蕉麻芭蕉屬、木薯、咖啡屬、山茶屬、薔薇屬、古柯屬、大麻屬、罌粟屬、 番木瓜屬、椰子屬、胡蘿卜屬、苜蓿屬、玉米屬、可可屬、槭屬、榿木屬、楊梅屬、泡泡樹屬、樺 木屬、鵝耳櫪屬、山核桃屬、栗屬、樸屬、紫荊屬、扁柏屬、山茱萸屬、柳杉屬、桉樹屬、水青岡 屬、白賭樹屬、阜莢屬、肥阜莢屬、金縷梅屬、胡桃屬、鵝掌楸屬、木蓮屬、蘋果屬、桑屬、紫樹 屬、鐵木屬、懸鈴木屬、楊屬、李屬、櫟屬、鼠李屬、漆樹屬、柳屬、接骨木屬、檫木屬、花楸屬、 椴樹屬、榆屬以及莢蓮屬；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述制備植物胚性細(xì)胞組織的外植體為云杉屬植 物種子的合子胚。另一方面，本發(fā)明提供了上述方法在制備蛋白質(zhì)中的用途；優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)包括任何一種具有研究，工業(yè)或藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)或多肽，例如疫苗或單克隆抗體等，具體包 括重組人類生長素、人類生長素受體拮抗劑(HGRA)、胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等。又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于制備蛋白質(zhì)的胚性細(xì)胞組織，所述胚性細(xì)胞 組織為針葉類植物的胚性細(xì)胞組織。優(yōu)選地，所述其胚性細(xì)胞組織是通過誘導(dǎo)白云杉種子的合子胚而形成。本發(fā)明所采用的針葉類植物體細(xì)胞胚的生產(chǎn)是利用該過程所獲得的體細(xì)胞胚制 備異類蛋白質(zhì)，即用針葉植物胚性細(xì)胞和在液體培養(yǎng)液中進(jìn)行體胚生成以獲得高濃度蛋白 質(zhì)的制備。本發(fā)明所展示的發(fā)明獨(dú)立地或以聯(lián)合的方式解決了所報(bào)道的使用生物反應(yīng)器懸 浮培養(yǎng)液中制備重組蛋白的三種弱點(diǎn)，具體詳述如下首先胚性細(xì)胞組織本身具備比其它非胚性細(xì)胞更強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成機(jī)制，轉(zhuǎn)化胚性 細(xì)胞并經(jīng)過對轉(zhuǎn)基因的胚性細(xì)胞的挑選，獲得高產(chǎn)率的細(xì)胞組織，可以克服現(xiàn)有蛋白產(chǎn)率 低的缺點(diǎn)。其次，本發(fā)明所提供的白云杉胚性細(xì)胞懸浮液發(fā)酵培養(yǎng)可被操作放大到 1500-7500升，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中使用較小規(guī)模生物反應(yīng)器所帶來的較高超薄的缺陷。 然后更換介質(zhì)進(jìn)一步驟誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的胚性細(xì)胞經(jīng)歷體胚的發(fā)育和形成，在這一過程完成目 標(biāo)蛋白的積增。轉(zhuǎn)基因體胚可被進(jìn)一步誘導(dǎo)在生物反應(yīng)器中成熟(即RAFT反應(yīng)器)，與此 同時(shí)體胚積增更多目標(biāo)蛋白，進(jìn)一步提高了蛋白產(chǎn)率。再次，體胚達(dá)到收成階段時(shí)，可以在低溫下儲存直到處理工藝過程開始而不必馬 上進(jìn)行處理，克服了現(xiàn)有技術(shù)不能放置較長時(shí)間的缺陷。此時(shí)體胚被打碎，目標(biāo)蛋白被提取 并被純化.體細(xì)胞胚(簡稱體胚)形成是分化的體細(xì)胞被誘導(dǎo)發(fā)展成胚胎的過程。體細(xì) 胞胚發(fā)育和合子胚一樣是營養(yǎng)物質(zhì)積累的過程，包括高蛋白含量的積累。體胚與合子 胚的區(qū)別在于，體胚的形成來源于體細(xì)胞通過有絲分裂的再分化，而合子胚則是出自于 生殖細(xì)胞的受精。下面提到包含用于轉(zhuǎn)化目標(biāo)異性蛋白核苷酸序列的植物組織是“早 期階段體胚細(xì)胞組織”。在一些文獻(xiàn)當(dāng)中可能會將此參照為”前”或”先”胚胎發(fā)生物質(zhì) (proembryogenicMassPEMs)。當(dāng)我們談到“早期階段體胚細(xì)胞組織”是指胚胎器官還沒有 形成的細(xì)胞組織，這些器官如雙極胚胎結(jié)構(gòu)(可分化幼苗和根部)以及子葉(子葉可能是 或不是某個(gè)特定植物細(xì)胞族胚胎器官組成部分)。當(dāng)在培養(yǎng)液中生長一段時(shí)間后，胚性細(xì) 胞組織將開始有能力形成體胚。在培養(yǎng)液中發(fā)育的體胚可能形成不了成熟的具有器官或類 似器官結(jié)構(gòu)的胚胎例如子葉和胚根，但它們卻仍然具有成熟體胚的特性，即于上面提到的 高蛋白含量，擁有蛋白酶抑制劑，高干物質(zhì)和低水份含量，并能導(dǎo)致外源蛋白保持長期穩(wěn)定寸。當(dāng)針葉樹類植物用于異性蛋白制備系統(tǒng)時(shí)，本發(fā)明具有特別的實(shí)用價(jià)值。針葉樹 是指木本裸子植物松柏類系屬、包括的植物科系是松科(Pinacae)、柏科(Cupressacae) 和杉科(Taxodiaceae)，裸子植物為異花授粉繁殖種子，具有豐富的遺傳多樣性，這一特 性適合優(yōu)良胚性體細(xì)胞系的多次重復(fù)篩選。其他植物種類還包括冷杉屬(Abies)、松屬 (Pinus)、云杉屬(Picea)、鐵杉屬(Tsuga)、假鐵杉屬(Pseudotsuga)、金鐘柏屬(Thuja)、 檜屬(Juniperus)、落葉松屬(Larix)、紫杉屬(Taxus)和紅杉屬(Sequoia) 0其他被子植物包括但不限于的類屬包括油棕(Elaeis)、刺葵屬(Phoenix)、桉樹屬(Eucalyptus)、櫟 屬(Quercus)、葡萄屬(Vitis)、蘋果屬(Malus)、小麥屬(Triticum)、稻屬(Oryza)、大豆屬 (Glycine)、燕麥屬(Avena)、蕓薹屬(Brassica)、甘蔴屬(Saccharum)、大麥屬(Hordeum)、 蕎麥屬(Fagopyrum)、棉屬(Gossypium)、甜菜屬(Beta)、落花生屬(Arachis)、蛇麻籽屬 (Humulus)、番薯屬(Iopomea)、蕉麻芭蕉屬(musa)、木薯(Manihot)、咖啡屬(Coffea)、山 茶屬(Camellia)、薔薇屬(Rosa)、古柯屬(Coca)、大麻屬(Cannabis)、罌粟屬(Papaver)、 番木瓜屬(Carica)、椰子屬(Cocos)、胡蘿卜屬(Daucus)、苜蓿屬(Medicago)、玉米屬 (Zea)、可可屬(Theobroma)、槭屬(Acer)、榿木屬(Alnus)、楊梅屬(Arbutus)、泡泡樹屬 (Asimina)、樺木屬(Betula)、鵝耳櫪屬(Carpinus)、山核桃屬(Carya)、栗屬(Castanea)、 樸屬(Celtis)、紫荊屬(Cercis)、扁柏屬(Chamaecyparis)、山茱萸屬(Cornus)、柳杉屬 (Cryptomeria)、桉樹屬(Eucalyptus)、水青岡屬(Fagus)、白蠟樹屬(Fraxinus)、皂莢屬 (Gleditsis)、肥皂莢屬(Gymnocladus)、金縷梅屬(Hamamelis)JJ^US (Juglans)、鵝掌楸 屬(Iiriodendron)、木蓮屬(Magnolia)、蘋果屬(Malus)、桑屬(morus)、紫樹屬(Nyssa)、鐵 木屬(Ostrya)、；§:鈴木屬(Platanus)、楊屬(Populus)、李屬(Prunus)、f樂屬(Quercus) > H 李屬(Rhmnus)、漆樹屬(Iihus)、柳屬(Salix)、接骨木屬(Sambucus)、檫木屬(Sassafras)、 花楸屬(Sorbus)、椴樹屬(Tilia)、榆屬(Ulmus)以及莢蓮屬(Viburnum)。在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)例中，使用的植物是白云杉(White Spruce)作為細(xì)胞組織 來源。首先是早期胚性體細(xì)胞組織的誘導(dǎo)。生殖細(xì)胞或受精的合子具有內(nèi)在成胚的能力， 而體細(xì)胞則需要該細(xì)胞有能夠誘導(dǎo)胚胎形成的能力。為了能夠引起體細(xì)胞胚的生成，體細(xì) 胞的基因表達(dá)必須轉(zhuǎn)換到使胚胎能夠形成的狀態(tài)。在這一轉(zhuǎn)換過程中，細(xì)胞發(fā)生脫分化并 改變基因表達(dá)程序(Dudits et al.，1995)。結(jié)果是，細(xì)胞質(zhì)和生理的狀態(tài)從體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成 胚性細(xì)胞狀態(tài)。而被誘導(dǎo)或在體細(xì)胞胚胎形成中分化表達(dá)了的基因組列則被通過采用各種 分子生物學(xué)技術(shù)而得以分離出來，例如荷爾蒙敏感反應(yīng)基因(如可誘導(dǎo)-植物生長激素和 可誘導(dǎo)-脫落酸)，胚形成受體激酶基因，含有homeobox基因，(LEA)基因，細(xì)胞外蛋白調(diào)控 基因，種子儲藏蛋白基因及管家(house keeping)基因，這些基因在胚胎形成過程中被誘發(fā) 或調(diào)控(見 Chugh and Khurana, 2002)。具體實(shí)例之一是，針葉樹種早期胚性體細(xì)胞組織可以通過誘導(dǎo)合子胚胎組織的細(xì) 胞而獲得。通常情況下，針葉類體細(xì)胞胚的形成包括以下三個(gè)步驟(1)通過在有植物生長調(diào)節(jié)劑，主要是植物生長激素和/或細(xì)胞分裂素的介質(zhì)中 的人工培養(yǎng)，以達(dá)到誘導(dǎo)啟動從體細(xì)胞到胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；(2)與在啟動步驟中所使用的相類似的介質(zhì)中，胚性體細(xì)胞得以增殖和維護(hù)；(3)胚胎的發(fā)育和成熟是在通過有脫落酸(ABA)和滲透壓不斷增加的介質(zhì)培養(yǎng)體 系中進(jìn)行，這一階段標(biāo)志著體細(xì)胞胚發(fā)育的終結(jié)。在各種實(shí)例當(dāng)中，被用于作基因轉(zhuǎn)化的組織是早期體胚細(xì)胞組織或胚性(體)細(xì) 胞(組織)。任何含有異性重組核苷酸的序列可被轉(zhuǎn)化到這類細(xì)胞的染色體上。本發(fā)明的 一個(gè)重要方面是被轉(zhuǎn)入的目標(biāo)蛋白可能是任何蛋白質(zhì)或單克隆抗體或多肽類物質(zhì)，期望 在體胚細(xì)胞組織中被生產(chǎn)出來。而且，在特別選定的實(shí)例中，目標(biāo)蛋白是藥用的或工業(yè)上有 價(jià)值的蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)。外源的異性蛋白的信號編碼序列，如那些后面將討論到的，也可 以引進(jìn)到細(xì)胞組織中去。如果適如所愿，被引進(jìn)的核苷酸編碼序列能夠被優(yōu)化以更適應(yīng)植
7物細(xì)胞體系的信息轉(zhuǎn)譯。通過優(yōu)化用于植物的密碼系統(tǒng)和植物轉(zhuǎn)錄起始部位的密碼，可以 去除可能引起信使RNA不穩(wěn)定性的因素?！爱愋浴笔侵改澈塑账峋幋a或蛋白，起源于外部來源或族類，或起源于同一族類但 被修改了而與起源編碼不同。核苷酸編碼序列隱含所期許的多肽或蛋白的轉(zhuǎn)錄信息，但是 也可能是并不構(gòu)成完整基因的核苷酸序列，甚至并不隱含任何多肽或蛋白的轉(zhuǎn)錄信息。例 如，如果是同源的重組過程，重組基因序列可能選中染色體的某個(gè)區(qū)域插入，但是這個(gè)區(qū)域 序列信息并沒有轉(zhuǎn)錄蛋白的信息，而是目標(biāo)核苷酸序列會生成信息RNA，這種信息RNA會被 用于使一個(gè)系統(tǒng)沉默，正象抗轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的啟動，就不會再有蛋白質(zhì)生成。增加或抑制一個(gè)蛋 白的途徑可以有很多，可以包括轉(zhuǎn)基因表達(dá)，抗轉(zhuǎn)錄抑制，共抑制表達(dá)方法包括但并不僅局 限于RNA干擾，使用轉(zhuǎn)錄因子和/或抑制劑啟動或抑制基因表達(dá)?；蜃儺惏ㄞD(zhuǎn)位子標(biāo) 記技術(shù)，定向或定位基因突變技術(shù)，染色體工程，和同源基因重組技術(shù)。在當(dāng)今技術(shù)已經(jīng)非常發(fā)達(dá)，有很多不同的方法和技術(shù)可以用于將某一目標(biāo)蛋白的 核苷酸編碼序列信息引進(jìn)到植物細(xì)胞。在一個(gè)具體實(shí)例中，表達(dá)載體被用于引進(jìn)核苷酸編碼序列。這種載體包括一個(gè)可 以促進(jìn)目標(biāo)核苷酸編碼序列得以表達(dá)的啟動子。用于控制產(chǎn)品蛋白表達(dá)和基因選擇的啟動 子有很多種。只要是與植物組織相匹配的任何啟動子都可以。這些啟動子可能是植物基 因啟動子，例如，泛素(ubiquitinpromoter)蛋白質(zhì)啟動子(歐洲專利申請?zhí)?34 )； 核酮糖-1，5-二度-磷酸鹽羧基酶的小亞子啟動子(ssRUBISCO) (Coruzzi et al. , 1984 ； Broglieet al. , 1984)；或者來源于根癌土壤農(nóng)桿菌質(zhì)粒的腫瘤誘發(fā)啟動子。象胭脂堿合成 酶，章魚堿合成酶(見US專利5，034，322)及有植物活性的甘露堿合成酶啟動子(Velten and Schell, 1985)或病毒啟動子諸如花葉病毒CAMV19S和35S啟動子(Guilley et al.， 1982 ；Odell et al.，1985)，玄參嵌入病毒 FLt 啟動子(Maiti et al.，1997)或 TMV 外被蛋 白啟動子(Grdzelishvili etal.，2000)?？膳c植物相容和的啟動子的范圍包括專用的組織和可誘導(dǎo)的啟動子?？烧T導(dǎo)調(diào)節(jié) 是指在誘導(dǎo)作用下能夠直接或者間接啟動轉(zhuǎn)錄一個(gè)或者更多的DNA序列或基因。沒有誘導(dǎo) 因素存在，DNA序列或基因就不會被轉(zhuǎn)錄。這些誘導(dǎo)因素可以是化學(xué)試劑，諸如某種蛋白， 代謝物，生長因子，滅草劑或酚類化合物或由于直接施以冷、熱、鹽或毒性物，或間接通過病 原體或病毒及其他致病因素。含有可誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制的植物細(xì)胞可以被暴露給外部的誘導(dǎo) 條件。這些誘導(dǎo)因素可以在細(xì)胞生長的某個(gè)階段加入到培養(yǎng)液或介質(zhì)中，或通過噴灑，澆 水，加熱或類似方法。典型的可誘導(dǎo)啟動子包括蛻皮激素受體啟動子(ecdysone receptor promoters)，美國專利號6，504，082 ；由于銅的作用而激活的啟動子ACEl系統(tǒng)。玉米In2_l 和Ιπ2-2基因的啟動子受控于苯磺酰胺滅草劑(美國專利5，364，789)；而煙葉PR-I啟動 子，則是由水楊酸活化。其他化學(xué)調(diào)節(jié)目標(biāo)啟動子包括類固醇-敏感型啟動子，糖(腎上腺) 皮質(zhì)激素啟動子(Schena et al. (1991)及McNellis et al. (1998)。四環(huán)素-可誘導(dǎo)及 四環(huán)素-可抑制啟動子(例，Gats et al.，1991，和美國專利號5，814，618和5，789，156)。 熱休克啟動子如黃豆hsp 17. 5-E (Gurley et al.，1986)或乙醇-可誘導(dǎo)啟動子(Caddick et al. ,1998)都可以作為更進(jìn)一步的例證。有組織傾向性的啟動子可以用于瞄向某種特定植物組織內(nèi)已提高了轉(zhuǎn)錄和/或 表達(dá)的部位。啟動子可以在目標(biāo)組織內(nèi)以較高于其他組織的水平表達(dá)。這些啟動子包括這些能提供對種子有傾向性表達(dá)的例子，諸如菜豆蛋白啟動子(Bustos et al. ,1989)；玉 米 27 kD r-zein 啟動子(Russell andFromm, 1997)；及玉米 globulin-1 啟動子(Belanger and Kriz, 1991 ；Genbankaccession L22344)。還有其他的許多組織傾向性啟動子的描 述見 Yamanotoet al. (1997) ；Kamamata et al. (1996) ；Hansen et al. (1997) ；Russell et al. (1997) ；Rinehart et al. (1996) ；Van Camp et al. (1996) ；Canevascini et al. (1996) ；Yamamoto et al. (1994) ；Orozco et al. (1993)禾口 Matsuoka et al. (1993)。表達(dá)載體可能還包含一個(gè)終止子區(qū)。方便的終止子區(qū)域可以在根癌土壤桿菌 Ti-質(zhì)粒中得到，如章魚堿合成酶終止子。其他各種終止子的例子包括來自于馬鈴薯的 pin II 終止子(An et al.，I989)和 nos 終止子。同時(shí)請見 Guerineau et al. (1991)； Proudfoot(1991) ；Sanfacon et al. (1991) ；Mogenet al. (1990) ；Munroe et al. (1990)； Ballas et al. (1989)及 Joshi et al. (1987)。在一個(gè)實(shí)例當(dāng)中，表達(dá)載體中還包含一段基因，這段基因所隱含的是某一可以選 擇或可報(bào)告的標(biāo)記，這種標(biāo)記具有可操作性或功能性，且可以與控制轉(zhuǎn)錄啟動的啟動子相 連接。有關(guān)植物表達(dá)載體和報(bào)告(r印orter)基因的綜述，請見Gruber et al. (1993)。 此類標(biāo)志基因的例子包括草丁膦抵抗編碼DNA，此類DNA編碼序列可以是草胺膦乙酰轉(zhuǎn) 移酶(pat)或由玉米優(yōu)化的pat基因。這類基因能夠產(chǎn)生對于除草劑雙丙氨酰膦的抵抗 (Gordon-Kamm et al. , 1990 ；Wohllenben et al. 1988)。其他例子，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶， 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，EPSP合成酶和二氫葉酸編碼基因。見Miki et al. (1993)，美國專利 6, 174, 724), Santerre et al. (1984)。還可以選用可用于定量的標(biāo)記基因。這些例證包括 b葡萄糖醛酸酶或UidA(GUS)基因(美國專利5，268，463和5，599，670)。表達(dá)載體可以選擇性的在啟動子和目標(biāo)基因之間或目標(biāo)基因之后放置一個(gè)信 號編碼序列。一個(gè)信號編碼序列是一組序列核苷酸，轉(zhuǎn)譯后給出的是一組有特定序列的 氨基酸，這組有特定序列的氨基酸被細(xì)胞用于指導(dǎo)目標(biāo)蛋白或多肽被置放于該真核細(xì) 胞內(nèi)部或外部某一特定位置。一個(gè)植物信號編碼序列的例子是大麥a淀粉酶分泌信號 (barley-amylase secretionsignal, Rogers，1985)。許多信號編碼序列已經(jīng)為人們所知， 請見例如 Beckeret al. (1992)，F(xiàn)onte et al. (1991)，Matsuoka and Nakamura(1991)， Gould etal. (1989)， Creissen et al. (1992)， Kalderon et al. (1984)and Stiefel et al. (1990)。先導(dǎo)編碼序列可以被包括在內(nèi)以提高轉(zhuǎn)錄水平。各種可以使用的先導(dǎo)編碼 序列可以被置換使用或加起來使用。轉(zhuǎn)譯先導(dǎo)序列編碼已經(jīng)為人們所知，如下例所 示picomavirus先導(dǎo)序列，EMCV先導(dǎo)序列，腦心肌炎5’非編碼區(qū)域(Elroy-Stein et al. 1989)；馬鈴薯Y病毒組先導(dǎo)序列，如TEV先導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒)(Gallie et al., 1995)；人類免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(Bip)先導(dǎo)序列(Macejak et al. , 1991)；從苜蓿 花葉病毒的外被蛋白信使RNA的未轉(zhuǎn)譯先導(dǎo)序列(AMV RNA 4) (Jobling et al. , 1987)；煙 草花葉病毒先導(dǎo)序列(TMV) (Gallie, 1987)和玉米枯黃斑點(diǎn)病毒先導(dǎo)序列(MCMV) (Lommel et al.，1991)。其他已知的能夠提升轉(zhuǎn)譯水平的方法也得到應(yīng)用，例如，內(nèi)含子及其同類。 很顯然，有關(guān)啟動子，可選擇性標(biāo)記，信號編碼序列，先導(dǎo)編碼序列，終止編碼序列，內(nèi)含子， 增強(qiáng)子和其他表達(dá)載體的構(gòu)成組份都有很多種類可供選擇。由于本學(xué)科領(lǐng)域知識和技術(shù)的發(fā)展，已有多種轉(zhuǎn)化表達(dá)載體進(jìn)入到植物細(xì)胞的方法可供選用，但具體選用何種方法則要根據(jù)所選取的植物種類來決定。多種植物 轉(zhuǎn)化的操作方法可以在公開發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道中找到，如Miki and McHugh(2004) ；Klein et al. (1992) ；and Weising et al. (1998)。例如DNA載體可以通過新的技術(shù)方法 被引進(jìn)入到植物細(xì)胞的基因組DNA，這些技術(shù)方法諸如微粒-介導(dǎo)(轟擊)傳遞技術(shù) (MicroprojectileBombardment System (Klein et al. 1992),原生質(zhì)電穿孑L方法(Fromm et al.，1985)，聚乙二醇(PEG)析出技術(shù)(Mathur and Koncz，1998)，直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)(WO 85/01856 and EP-A-275 069)，生物體外原生質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)(美國專利號4，684，611)，植物細(xì) 胞原生質(zhì)或胚性愈傷組織顯微注射技術(shù)(Crossway，1985)，及土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法(Ishida et al, 1996 ；美國專利 5，591，616)。一旦植物細(xì)胞組織被轉(zhuǎn)化后，如果采用可選擇標(biāo)志基因，則細(xì)胞被置于的是選擇 介質(zhì)。存留下來的細(xì)胞組織然后會以胚愈傷組織的形式增加，且會在液態(tài)介質(zhì)中懸浮。在 起始期內(nèi)，細(xì)胞生長在植物生長激素和/或細(xì)胞分裂素繁殖介質(zhì)中以促進(jìn)細(xì)胞分裂。在本 發(fā)明的實(shí)例當(dāng)中在介質(zhì)發(fā)生變化前，細(xì)胞生物量的數(shù)量得到增加。在本發(fā)明的一個(gè)重要的 一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞生物量數(shù)目在換到新介質(zhì)的一到兩周時(shí)間內(nèi)得到迅速增加。在胚性細(xì)胞得到增殖之后，為促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)育達(dá)到成熟階段，對細(xì)胞進(jìn)行促進(jìn) 成熟處理，如在胚形成后期的處理。這將導(dǎo)致體胚體積增大，總蛋白和目標(biāo)蛋白量的增加。 一般而言，植物生長激素和細(xì)胞分裂素將由脫落酸所取代，同時(shí)加入滲壓劑，如蔗糖(Lu and Thorpe, 1987 ；Hakman andVon Arnold, 1985 ；Beardmore and Charest 1995)及/或聚 乙二醇(PEG) (Attreeand Fowke，199 。移走植物生長激素和細(xì)胞分裂素會中止胚性細(xì)胞 組織的繁殖。體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育可以由加入脫落酸和滲壓劑而得到促進(jìn)。植物生長調(diào) 節(jié)劑的變化可以作為體細(xì)胞胚發(fā)育進(jìn)入成熟階段的誘導(dǎo)信號(Bozhkov et al.，2002)。脫落酸曾被報(bào)導(dǎo)在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中起到非常重要的作用(Dimstanet al., 1988 ；Attree et al.，1990)。對針葉類，體胚發(fā)生需要外部的脫落酸加入以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚 的成熟。脫落酸還被證明能夠增加儲存蛋白和LEA蛋白的積累(Flirm et al.，1991)。黑 云杉(picea mariana)儲藏蛋白和LEA蛋白的積累被看作是植物(見Chugh and Khurana 2002綜述)體細(xì)胞胚成熟完成的標(biāo)志。體細(xì)胞胚的發(fā)育，原則上基本類同于合子胚形成發(fā)育的過程(Meward，1958)。這 里，當(dāng)合子胚外植體暴露于植物生長素和/或細(xì)胞分裂素時(shí)可以引發(fā)胚胎形成物質(zhì)的生 成，或胚性體細(xì)胞組織的生成。直到發(fā)育到第一期的非成熟胚胎，胚性細(xì)胞組織有一個(gè)高密 度的略微有些不規(guī)則形狀的胚尖和胚柄。此時(shí)介質(zhì)發(fā)生改變引發(fā)體細(xì)胞胚的成熟和第二期 的組織發(fā)育，更接近球狀發(fā)育，如球狀體細(xì)胞胚(GSEs)。在第三期，體細(xì)胞呈拉長形狀，這 一形狀在第四期變成早期的頂端分生組織，胚軸，胚根，及子葉。在第五期，胚胎器官顯現(xiàn)出 來。圖1所示的是云杉體細(xì)胞胚在固體培養(yǎng)基上的發(fā)育過程，隨著每一期的向前發(fā)展，蛋白 質(zhì)的含量在增加。液體介質(zhì)體細(xì)胞胚形成過程一般也經(jīng)歷三個(gè)階段誘導(dǎo)，繁殖和成熟。外部環(huán)境， 如培養(yǎng)環(huán)境的化學(xué)和物理性質(zhì)的變化控制每一步驟的進(jìn)行。在體細(xì)胞被誘導(dǎo)成胚性體細(xì)胞 的過程中，細(xì)胞獲得胚形成能力，直接相比較，合子胚形成卻沒有相應(yīng)部分。繁殖階段，起始 時(shí)是在半固體介質(zhì)然后是液體介質(zhì)，這里早期體細(xì)胞胚形成事件的發(fā)生類同于早期針葉合 子胚的形成過程。在晚期體細(xì)胞胚成熟的階段與針葉類晚期合子胚形成階段相以。
用內(nèi)生的儲藏蛋白基因作為標(biāo)志來尋蹤體細(xì)胞胚或合子細(xì)胞胚的成熟程度應(yīng)該 更合適。例如，Chatthai et al 1988年所報(bào)道過幾個(gè)針葉儲存蛋白包括四個(gè)隱含2S種子 儲存蛋白同源型cDNA克隆(PM2S1，PM2S2，PM2S3和PM2S4)?？梢宰粉欉@些蛋白的表達(dá)增 加(如用北方墨點(diǎn)分析)，而且當(dāng)胚胎成熟時(shí)這些蛋白還會增加。在一個(gè)重要的實(shí)例中，高收率的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞被確實(shí)，這些細(xì)胞被繁殖并被制作成 種源細(xì)胞庫(Masrer Cell Bank)，且通過使用超低溫冷凍保存技術(shù)而得到長期的冷凍保 存。超低溫冷凍保存是基于減少直至最后中止儲存的超低溫生物體的代謝活動。低溫長時(shí) 間儲存植物或植物細(xì)胞不會改變原本的基因，解凍后的細(xì)胞會很快恢復(fù)原有性質(zhì)和生物合 成能力，這在植物生殖，生物醫(yī)學(xué)研究和基因工程諸方面有重要意義。在液氮溫度零下196 C，幾乎所有細(xì)胞的代謝活動都停止了。細(xì)胞能保持基因穩(wěn)定，直到相當(dāng)長時(shí)間后需要時(shí)，不 發(fā)生體細(xì)胞克隆變異。對制藥工業(yè)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，擁有一個(gè)細(xì)胞庫對植物懸浮培養(yǎng)蛋白制 造系統(tǒng)是一個(gè)巨大優(yōu)勢。一旦冷凍的細(xì)胞解凍，該種源細(xì)胞就可以被放大到預(yù)想的數(shù)量，這 些細(xì)胞經(jīng)誘發(fā)可以形成體細(xì)胞胚，然后這些體細(xì)胞胚以批量生產(chǎn)方式收成。體細(xì)胞胚可以 被儲存，打碎然后提取蛋白。有關(guān)蛋白質(zhì)的提取會有很多不同方式，這在我們目前的發(fā)明當(dāng) 中并不是關(guān)鍵，見例Heney and Orr (1981) 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，通過使用針葉類植物作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)的來源，工藝過程 被優(yōu)化以提高體細(xì)胞胚發(fā)生和蛋白的產(chǎn)率。針葉類植物在液體培養(yǎng)液中通過體細(xì)胞胚形成 產(chǎn)生胚胎的能力不一。主要問題是成熟體細(xì)胞胚生成的數(shù)量很低，或者是某些胚性細(xì)胞組 織在用促成熟條件培養(yǎng)后仍無體細(xì)胞胚生成。為了建立起一個(gè)在液體培養(yǎng)條件下有較高胚 性細(xì)胞轉(zhuǎn)化為體細(xì)胞胚發(fā)生率的生產(chǎn)平臺，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例當(dāng)中，對100個(gè)胚性細(xì)胞 組織進(jìn)行胚胎產(chǎn)生能力的篩選。這一過程極大地增加體細(xì)胞胚形成能力的工藝途徑。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1為離體條件下針葉樹種體細(xì)胞胚的發(fā)育過程；其中a和b箭頭指向的是在成熟介質(zhì)之后的三到七天球型體細(xì)胞胚(第二期)，c 箭頭指向的是14天后(第三期)拉長了的球型胚胎；d箭頭指向的是21天后(第四期)早 期子葉體細(xì)胞胚；e和f箭頭指向的是觀天和40天時(shí)，發(fā)育成熟的體細(xì)胞胚(第五期)。圖2為白云杉細(xì)胞系WS30 (A)和WSll (B)在懸浮培養(yǎng)中發(fā)育形成球型和心型體胚 照片。圖3為在半干半濕的RAFT上，球形體胚繼續(xù)發(fā)育形成有子葉結(jié)構(gòu)的成熟體胚照 片。圖4為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化3天⑶S基因的臨時(shí)表達(dá)(X-GluC染色，藍(lán)斑證實(shí)⑶S表達(dá))。圖5為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組織，藍(lán)色證實(shí)⑶S基因的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1培養(yǎng)基的篩選
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制備胚性細(xì)胞組織，需要采用胚性細(xì)胞組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出胚性細(xì)胞組織，再 采用體胚成熟培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚性細(xì)胞發(fā)育成成熟體胚。本實(shí)施例以白云杉種子作為外植體， 對上述兩種培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，具體詳述如下。1、外植體來源白云杉種子通過加拿大新布郎施威克大西洋地區(qū)森林服務(wù)，國家樹木種子中心獲 得，儲藏溫度保存在4°C。2、外植體的消毒及處理按以下順序進(jìn)行(1)75%的乙醇2分鐘;O) 6%的次氯酸鈉(Chlorox)加數(shù)滴吐溫20 ((Sigma) 10分鐘；(3)用無菌的去離子水沖洗十分鐘，一次；(4)用無菌的去離子水沖洗三次；(5)用無菌去離子水在培養(yǎng)皿中室溫下浸泡4個(gè)小時(shí)以軟化種子外殼；(6)浸泡之后，合子胚在無菌條件下被分離出來。3、胚性細(xì)胞組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選白云杉胚性細(xì)胞愈傷組織的誘導(dǎo)過程具體描述如下將消毒后的合子胚水平放在有半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后置于25°C無光 的條件下保存。三四周之后，在主外植體的表面出現(xiàn)明顯的白色透明或淺棕色的組織—— 胚性(體)細(xì)胞組織(PEMs)。這些胚性細(xì)胞組織(PEMs) —旦長成直徑大約5-10毫米時(shí)， 就被轉(zhuǎn)移到新鮮液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基介質(zhì)中增殖。每一合子胚形成的胚性細(xì)胞組織被指定為一 個(gè)單獨(dú)的胚性細(xì)胞系。胚性細(xì)胞組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其基本培養(yǎng)基采用1/2 Litvay (1/2 LV)培養(yǎng)基，具體配方如表1所示。表11/2 Litvay培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.一種制備蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法是通過將含有需要制備的蛋白質(zhì)基 因轉(zhuǎn)化到植物胚性細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)來制備蛋白質(zhì)的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)制備植物胚性細(xì)胞組織；2)將需要制備的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入步驟1)所制備的胚性細(xì)胞組織中；3)培養(yǎng)步驟幻得到的胚性細(xì)胞組織，使其發(fā)育成熟為體細(xì)胞胚；4)從步驟幻得到的體細(xì)胞胚中提取蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中制備植物胚性細(xì)胞組織 的方法包括采用半固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)體細(xì)胞分化成胚性細(xì)胞和采用液體培養(yǎng)基增殖的步驟; 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為添加了 1 20 μ mol/L生長素和/或1 20 μ mol/L細(xì)胞分裂素的 l/2Litvay培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件為20 30°C，黑暗，90-120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中將需要制備的蛋白質(zhì) 基因轉(zhuǎn)入胚性細(xì)胞的方法選自微粒-介導(dǎo)傳遞技術(shù)、原生質(zhì)電穿孔方法、聚乙二醇析出技 術(shù)、直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、生物體外原生質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)、植物細(xì)胞原生質(zhì)或胚性愈傷組織顯微注 射技術(shù)和土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟幻中培養(yǎng)步驟2) 得到的胚性細(xì)胞組織的方法包括采用液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的步驟；優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為 添加了生長抑制劑如5 120 μ mol/L脫落酸和/或滲壓劑如蔗糖的l/2Litvay培養(yǎng)基；更 優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件為20 30°C，黑暗，60 120轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在超低溫下 冷凍保藏所述步驟1)中制備的胚性細(xì)胞組織或步驟幻中制備的轉(zhuǎn)入蛋白質(zhì)基因的胚性細(xì) 胞組織的步驟；優(yōu)選地，所述冷凍保藏溫度為_196°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟；3)中培養(yǎng)步驟 2)得到的胚性細(xì)胞組織的方法還包括催化體細(xì)胞胚成熟的處理；優(yōu)選地，所述處理是采用 船式RAFT培養(yǎng)方法來實(shí)現(xiàn)的，船式RAFT培養(yǎng)方法中的培養(yǎng)基為添加了生長抑制劑如5 120 μ mol/L脫落酸和/或滲壓劑如蔗糖的l/2Litvay培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件 為20 30°C，黑暗，靜置培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述制備植物胚性細(xì)胞組織 的外植體選自裸子植物或被子植物種子；優(yōu)選地，所述裸子植物包括松科、柏科和杉科，如 冷杉屬、松屬、云杉屬、鐵杉屬、假鐵杉屬、金鐘柏屬、檜屬、落葉松屬、紫杉屬和紅杉屬；所述 被子植物包括油棕、刺葵屬、桉樹屬、櫟屬、葡萄屬、蘋果屬、小麥屬、稻屬、大豆屬、燕麥屬、 蕓薹屬、甘蔗屬、大麥屬、蕎麥屬、棉屬、甜菜屬、落花生屬、蛇麻籽屬、番薯屬、蕉麻芭蕉屬、 木薯、咖啡屬、山茶屬、薔薇屬、古柯屬、大麻屬、罌粟屬、番木瓜屬、椰子屬、胡蘿卜屬、苜蓿 屬、玉米屬、可可屬、械屬、榿木屬、楊梅屬、泡泡樹屬、樺木屬、鵝耳櫪屬、山核桃屬、栗屬、樸 屬、紫荊屬、扁柏屬、山茱萸屬、柳杉屬、桉樹屬、水青R屬、白賭樹屬、阜莢屬、肥阜莢屬、金 縷梅屬、胡桃屬、鵝掌楸屬、木蓮屬、蘋果屬、桑屬、紫樹屬、鐵木屬、懸鈴木屬、楊屬、李屬、櫟 屬、鼠李屬、漆樹屬、柳屬、接骨木屬、檫木屬、花楸屬、椴樹屬、榆屬以及莢蓮屬；更優(yōu)選地， 所述制備植物胚性細(xì)胞系的外植體為白云杉種子的合子胚。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法在制備蛋白質(zhì)中的用途；優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì) 包括任何一種具有工業(yè)或藥用價(jià)值的蛋白質(zhì)或多肽，如單克隆抗體和疫苗等，包括重組人 類生長素、人類生長素受體拮抗劑、胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等。
10.一種用于制備蛋白質(zhì)的胚性細(xì)胞組織，其特征在于，所述胚性細(xì)胞組織為針葉類植 物的胚性細(xì)胞組織；優(yōu)選地，所述其胚性細(xì)胞組織是通過誘導(dǎo)白云杉種子的合子胚而形成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過胚性細(xì)胞組織制備蛋白質(zhì)的方法。所述方法是通過將含有需要制備的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)化到植物胚性細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)來制備蛋白質(zhì)的，具體包括1)制備植物胚性細(xì)胞組織；2)將需要制備的蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入步驟1)所制備的胚性細(xì)胞組織中；3)培養(yǎng)步驟2)得到的胚性細(xì)胞組織，使其發(fā)育成熟為體細(xì)胞胚；4)從步驟3)得到的體細(xì)胞胚中提取蛋白質(zhì)。用于制備蛋白質(zhì)的胚性細(xì)胞組織為針葉類植物的胚性細(xì)胞組織。本發(fā)明所提供的方法是制備轉(zhuǎn)基因藥用蛋白的一個(gè)重大改革，能顯著提高轉(zhuǎn)基因藥用蛋白產(chǎn)率，適合于放大生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/82GK102146377SQ201010000530
公開日2011年8月10日 申請日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月12日
發(fā)明者王為民 申請人:呂新波, 楊博文, 王為民, 鐘云翔