專利名稱：利用靶雜交及檢測引物進行靶檢測的制作方法
利用靶雜交及檢測弓I物進行靶檢測
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種利用靶雜交及檢測引物(THD primer)進行靶核酸序列的檢測。背景技術(shù)：
用于檢測靶核酸的大部分技術(shù)包括靶核酸的擴增過程。核酸擴增是在分子生物學領域中所利用的必須的過程，并對此提出了多種擴增方法。例如，密勒(Miller)、H. I.等(W089/06700)公開了包括將助催化劑/引物序列與靶單鏈DNA (〃ssDNA〃)進行雜交之后，轉(zhuǎn)錄上述序列的許多RNA復制過程的核酸序列擴增方法。其他公知的核酸擴增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴增系統(tǒng)(Kwoh，D. etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,86:1173 (1989);以及GingerasT. R. etal. , W088/10315)。公知為聚合酶連鎖反應(以下簡稱為“PCR”)的最為廣泛利用的核酸擴增方法包括 雙鏈DNA的變性、向DNA模板進行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延長的反復的循環(huán)過程(Mullis等，美國專利第4,683,195號，第4，683，202號以及第4,800,159號；Saiki 等，(1985) Science 230，1350-1354)。基于聚合酶鏈式反應(PCR)的技術(shù)不僅利用在靶DNA序列的擴增，還廣泛地利用在生物學和醫(yī)學研究領域中的科學應用或方法中，例如，靶序列的檢測、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、分別表示(DifferentialDisplay)-聚合酶鏈式反應(DD-PCR)、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、cDNA末端的高速擴增(RACE )、任意的引發(fā)-聚合酶鏈式反應(AP-PCR)、多重PCR、單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因組分型以及基于PCR的基因組分析等(McPherson and Moller, 2000) PCR. BIOSScientif icPublishers, Springer-VerlagNewYorkBerIinHeidelberg, NY)。另一方面，基于至今提出的核酸擴增的靶核酸檢測方法進行如下概括。I.急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)檢測方法典型的急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)方法包括核酸擴增及之后的擴增產(chǎn)物的檢測，用于分析靶核酸序列。根據(jù)以往的急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)檢測方法，應將擴增產(chǎn)物按其大小差異分離(通常利用凝膠電泳來實施)或通過擴增產(chǎn)物的固定化而分離。但是，分離過程會引起污染以及低工作性等嚴重的問題。2.實時檢測方法為了克服急行-聚合酶鏈式反應(post-PCR)方法的問題，提出了實時檢測擴增產(chǎn)物的實時PCR的方法，以此擺脫污染，能夠定量地分析靶核酸序列。2.I利用雜交及延長反應的方法2.I. I發(fā)卡式引物的設計方法該方法利用發(fā)卡式引物(sunrise primer),其通過在5’末端形成發(fā)夾環(huán)來使一對的熒光團以及猝滅劑相鄰近，從而表示出減少的熒光。這樣的引物包含在PCR的產(chǎn)物時，其尾部成為雙鏈，并且其發(fā)夾環(huán)被解開，以此增加熒光(Nazarenko等，2516-2521NucleicAcidsResearch, 1997, ν. 25ηο· 12，以及美國專利第 6，117，635 號)。但是，就發(fā)卡式引物設計方法而言，使引物包含與靶核酸序列互補的序列及能夠在其5’末端形成發(fā)夾環(huán)的序列，這種設計非常復雜，因此大大降低了便利性。2.I. 2加尾引物的設計方法(蝎形引物設計方法)該方法利用加尾(tailed)引物(蝎形引物)以及集成的(integrated)信號系統(tǒng)。上述引物具有模板結(jié)合區(qū)域以及尾部，尾部包含連接肽與靶結(jié)合區(qū)域(region)。靶結(jié)合區(qū)域在引物的延長產(chǎn)物中與互補的序列進行雜交。之后，靶特意雜交結(jié)果與信號系統(tǒng)聯(lián)結(jié)，并且雜交引起可檢測的變化。加尾引物的連接肽妨礙引物模板的尾部區(qū)域的聚合酶-介質(zhì)鏈式復制(Whitcombe 等，804-807, Nature Biotechnology v. 17AUGUST 1999 美國專利第
6.6，326，145號)。加尾引物應包含用于產(chǎn)生擴增子-依賴性信號的連接肽及與引物延長產(chǎn)物雜交的靶結(jié)合區(qū)域，因此類似于發(fā)卡式引物方法，難以對引物進行設計以及合成。2.2利用雜交反應的方法
2.2. I 分子信標(Molecular beacon)方法雖然分子信標包含熒光以及猝滅染料，但是只有在猝滅染料與熒光染料鄰近的情況下發(fā)生突光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET, fluorescence resonance energy transfer)。分子信標通過利用發(fā)夾結(jié)構(gòu)(液相中自由)而進行設計，并使兩個染料鄰近。分子信標與靶進行雜交時，熒光及猝滅染料將會分離。不發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，且熒光染料通過照射(irradiation)來發(fā)光(Indian J Med Res 124:385-398 (2006)以及 Tyagietal,NatureBiotechnologyv. 14MARCH 1996)。但是，分子信標方法存在如下幾個缺點。第一、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的2個反向重復序列(inverted repeat)應在祀核酸具有互補的配對物,這在靶上也要求反向重復的存在。第二、具有互補的核酸序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部位的^以及莖區(qū)部位的^需仔細地保持均衡，這需從分析溫度的觀點保持均衡，其無需非特異性伸展(unfolding)，在存在靶的情況下使發(fā)夾探針可進行特異性伸展。 最終，該方法為了擴增核酸序列需要追加的引物。2.2. 2雜交探針的設計方法該方法利用四個寡核苷酸，即為2個引物以及2個探針。這些雜交探針具有單一標記時，一個具有供體熒光團，另一個具有受體熒光團。2個探針的序列被選為，使這些序列以頭尾排列方式(head to tail arrangement)與祀序列進行雜交,并使兩個染料相鄰近來發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。探針中一個探針的受體染料轉(zhuǎn)移能量，另一個探針在其他波長放出熒光。熒光的量與在PCR過程中生成的靶DNA的量成正比例(385-398，IndianJ Med Res 124,review article 0ctober2006 以及 303-308 以及 Bernad 等，147_148ClinChem 2000 ;4646)。但是，該方法不適合于多重檢測，為了對靶核酸序列進行擴增，需要追加的引物。2.3利用雜交以及核酸酶活性的方法2.3. I拖慢(TaqMan)探針方法(5，一 3’核酸酶活性)這些拖慢(TaqMan)探針制備成，能夠在PCR產(chǎn)物的內(nèi)部進行雜交。在PCR期間，即，聚合酶復制結(jié)合有拖慢(TaqMan)探針的模板時，聚合酶的5’外切核酸酶活性用于切割探針。這將分離熒光和猝滅染料，且不再發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET，fluorescenceresonance energy transfer) (385-398, IndianJMedRes 124, reviewarticIeOctober2006以及303-308，美國專利第5，210，015號)。但是，該方法在利用三個寡核苷酸(I個雙重標記探針以及2個引物)的方面具有限界點。該方法導致探針的設計、合成以及反應條件的最佳化變得復雜。[2. 3.2標記引物法(3，— 5，核酸酶活性)該方法利用在引物的3’末端人為的錯配至少I個核苷酸的標記引物。在雜交發(fā)生的充分的條件下培養(yǎng)標記引物以及試樣，接著，試樣暴露于具有3’ 一 5’校正活性的核酸聚合酶，以此放出標記或標記系統(tǒng)的一部分(美國專利第6，248, 526號)。但是，錯配引物需設計成復雜的形態(tài)，即在其3’末端包含錯配核苷酸。更為困難 的是在3’ -末端與非-靶序列發(fā)生錯配的情況下，錯配的引物由具有3’ 一 5’校正活性的核酸聚合酶來產(chǎn)生假陽性信號的可能性也大。如上所述，至今開發(fā)出的以往的大部分靶檢測方法具有本質(zhì)上的缺點，這將被視為難以克服。因此，需要開發(fā)出改善了技術(shù)性_、實踐性-以及比容積-效率性的用于檢測靶核酸序列的新穎的接近法。在本說明書全文中參照多個專利及文獻，其引用由括號來表示。這些專利及文獻，作為參照全部包括在本說明書中，因此能夠更加明確地說明本發(fā)明所屬的技術(shù)領域的水準及本發(fā)明的內(nèi)容。發(fā)明概述本發(fā)明者為了克服用于檢測靶核酸序列的以往技術(shù)的缺點而銳意研究努力。本發(fā)明者研制出了具有雙重功能，即，具有探索以及引發(fā)功能的新穎的分析-功能性引物，并利用上述引物定立了用于檢測靶核酸序列的多種方案。其結(jié)果，本發(fā)明者確認了，本發(fā)明的新穎的方案或者方法在靶核酸序列的檢測，特別是在實時檢測的方面呈現(xiàn)出優(yōu)秀的工作性，且以更強、更快的方式產(chǎn)生用于表示靶核酸序列的信號。本發(fā)明者的核心發(fā)現(xiàn)在于，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，與靶核酸序列雜交的引物與具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶接觸的情況下，其3’ -末端被延長并且其5’ -末端部位被切割，這是掌握本發(fā)明的基礎。以這樣的發(fā)現(xiàn)為基礎，在PCR反應中用于生成擴增子的引物包含可檢測信號的標記時，查明了在實時PCR反應期間產(chǎn)生信號的原因。經(jīng)研究本發(fā)明，在靶檢測方面相比以往的需要追加性的探針或引物的變形的方法，本發(fā)明更為有效。本發(fā)明的標記引物不僅能夠為靶核酸序列的有效檢測提供既卓越又靈活的手段(tool)，還能夠以更簡便、更快捷、更經(jīng)濟性的方式進行實時PCR試驗的開發(fā)。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用靶雜交及檢測引物(THDprimer)的5’ -切割反應以及3’ -延長反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法。本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用伴隨有靶雜交及檢測引物(THD primer)的5’ -切割反應及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應(PCR)，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用靶雜交及檢測引物(檢測primer)的5’ -切割反應以及3’ -延長反應，從DNA或者核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒。
參照所附的權(quán)利要求書以及附圖，能夠更加明確地說明本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點。

本發(fā)明的基本原理概括在圖I-圖4。圖I表示關(guān)于利用基于具有5’ 一 3’核苷酸活性的模板-依賴性核酸聚合酶的THD引物的5’-切割反應及3’-延長反應，來檢測靶核酸序列的試驗的步驟。圖Ia表示具有檢測靶核酸序列的常規(guī)結(jié)構(gòu)的THD引物的利用。圖Ib表示，在靶核酸序列的檢測上，為了引物退火特異性，利用具有雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)的THD引物。圖2表不利用基于具有5’ 一 3’核苷酸活性的模板-依賴性核酸聚合酶的THD引物的5’ -切割反應及3’ -延長反應，沒有靶核酸序列的擴增地檢測靶核酸序列的實時信號 擴增試驗。圖2a表示具有檢測靶核酸序列的常規(guī)結(jié)構(gòu)的THD引物的利用。圖2b表示，在靶核酸序列的檢測中，為了引物退火特異性，而利用具有雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)的THD引物。圖3表示利用本發(fā)明的THD引物實施的實時PCR過程中靶核酸及信號的實時擴增。圖3a表示為了實時PCR擴增，具有常規(guī)結(jié)構(gòu)的THD引物的利用。圖3b表示，在實時PCR擴增中，為了引物退火特異性，具有雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)的THD引物的利用。圖4表示，在PCR擴增中的THD引物組合的多樣性。圖4a表示作為正向引物的THD引物、作為反向引物的THD引物或者均作為兩種引物的THD引物的利用。圖4b表示與標記探針一起利用作為正向引物的THD引物、作為反向引物的THD引物或者均作為兩種引物的THD引物的例。圖4c表示與作為正向引物的THD引物一起追加地利用上游引物、反向引物或者均作為兩種引物的THD引物的例。圖4d表示與內(nèi)部引物一起利用作為正向引物的THD引物、作為反向引物的THD引物或者均作為兩種引物的THD引物的例。圖5表示沒有變性、雜交、切割及延長的反復地利用本發(fā)明的THD引物及Taq DNA聚合酶的，在預定時間間隔中的靶核酸序列的檢測。圖6表示與變性、雜交、切割及延長的反復一起利用THD引物及Taq DNA聚合酶的，在dNTP的多種濃度中的實時信號擴增結(jié)果。圖7表不對在對肺炎鏈球菌(SP, Streptococcus pneumoniae)基因的實時PCR擴增中的THD引物及標記探針的比較。圖7a表示實時PCR擴增的結(jié)果。圖7b是呈現(xiàn)實時PCR擴增的結(jié)果的瓊脂糖凝膠照片。圖8表示對在對腦膜炎奈瑟菌(NM, Neisseria meningitides)基因的實時PCR擴增中的THD引物及標記探針的比較。圖8a表示實時PCR擴增的結(jié)果。圖8b是呈現(xiàn)實時PCR擴增的結(jié)果的瓊脂糖凝膠照片。圖9表示對在實時PCR擴增中作為正向引物利用THD引物的肺炎鏈球菌(SP，Streptococcus pneumoniae)基因的實時 PCR 特異度。圖10表示對在實時PCR擴增中作為正向引物利用THD引物的腦膜炎奈瑟菌(NM，Neisseria meningitides)基因的實時 PCR 特異度。圖11表示對在實時PCR擴增中作為正向引物利用THD引物的肺炎鏈球菌(SP，Streptococcus pneumoniae)基因的實時 PCR 靈敏度。
圖12表示對在實時PCR擴增中作為正向引物利用THD引物的腦膜炎奈瑟菌(NM，Neisseria meningitides)基因的實時 PCR 靈敏度。圖13表示對在嵌套實時PCR擴增中作為正向引物利用THD引物的肺炎鏈球菌(SP, Streptococcus pneumoniae)基因的實時 PCR 特異度。圖14表示對在嵌套實時PCR擴增中作為正向引物利用THD引物的肺炎鏈球菌(SP, Streptococcus pneumoniae)基因的實時 PCR 靈敏度。圖15表不在對淋病奈瑟菌(NG, Neisseria gonorrhoeae)基因進行的實時PCR擴增中，利用作為正向引物的THD引物、作為反向引物的THD引物或者均作為兩種引物的THD引物的結(jié)果。圖16表不在對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae)基因的實時PCR擴增中，組合標記探針與作為正向引物的THD引物、作為反向引物的THD引物或者均作為兩種引物 的THD引物而利用的結(jié)果。圖17表不在對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae)基因的實時PCR擴增中，組合作為正向引物的THD引物、追加地組合上游引物、反向引物或者均作為兩種引物的THD引物而利用的結(jié)果。圖18表不在對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae)基因的實時PCR擴增中，組合內(nèi)部引物與作為正向引物的THD引物、作為反向引物的THD引物或者均作為兩種引物的THD引物而利用的結(jié)果。圖19表不在對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae)基因的實時PCR擴增中，利用THD引物及TaqMan探針的方法的比較。發(fā)明詳述本發(fā)明介紹利用具有標記的引物以及模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性來檢測靶核酸序列的新穎的方法。尤其是，本發(fā)明提出以實時方式檢測靶核酸序列的卓越的方法。如果被命名為靶雜交及檢測引物(THD primer)的標記引物與靶核酸序列雜交，則上述引物被延長，以此合成對于靶核酸序列的互補的序列，之后將上述引物切割下來，從上述引物放出標記，以此產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號。即，靶雜交及檢測引物經(jīng)過5’ -切割反應以及3’ -延長反應過程。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了，將具有包含熒光報道分子以及猝滅分子的相互作用性標記系統(tǒng)的靶雜交及檢測引物與靶核酸序列進行雜交之后，與具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行培養(yǎng)時，標記(標記片段)從靶雜交及檢測弓I物放出而產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號。并且，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了在靶雜交及檢測引物3’ -末端的延長反應能夠降低基于反應溫度變化的信號強度的變化(variation)程度，對此可判斷出靶雜交及檢測引物3’ -末端的延長反應可使信號幾乎不受反應溫度變化或者使之不受影響，終究能夠得出更具有可靠性、穩(wěn)定性的信號結(jié)果。此外，在本發(fā)明的方法中，靶雜交及檢測引物又可用作擴增引物來提供，因此靶核酸序列與信號擴增一同擴增。根據(jù)本發(fā)明，利用標記的引物以及模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一3’核酸酶活性，通過顯著提高的有效性及可靠性來可實時檢測靶核酸序列。本發(fā)明者可知，由本發(fā)明者最先提出了這些科學性的結(jié)果以及技術(shù)性的戰(zhàn)略。3 ’ -延長反應對用于降低隨著靶核酸序列與靶雜交及檢測弓I物的雜交穩(wěn)定化以及反應溫度變化而發(fā)生的信號強度的變化起重要的作用?；谌缟系谋景l(fā)明者的研究結(jié)果，提出本發(fā)明的普通的方法如下通過以往的方法，將標記的引物以及具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶與包含靶核酸序列的試樣同時進行培養(yǎng)，誘導出引物的3’ -延長反應以及5’ -切割反應，使得標記從引物放出，最終產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號。根據(jù)本發(fā)明，使得相互作用性標記以實時方式檢測靶核酸序列，上述相互作用性標記是利用 FRET (fluorescence resonance energy transfer)現(xiàn)象的標記。并且，連續(xù)的兩個步驟，S卩，靶核酸序列與引物的雜交以及與具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶反復進行的培養(yǎng)，使得對靶核酸序列的信號得到擴增。因 此，信號擴增對提高靶檢測的靈敏度相當有貢獻。對于本發(fā)明來說，同時利用靶雜交及檢測引物以及能夠擴增靶的配對引物時，不僅能夠擴增信號，還能夠擴增祀序列，由此成功的提供同類的(homogeneous)試驗方法。本發(fā)明的同類的(homogeneous)試驗方法與至今開發(fā)出的以往的方法明確不同。為了檢測靶提出了利用標記引物的發(fā)卡式引物設計方法(Nazarenko等，2516-2521NucleicAcidsResearch, 1997，ν. 25ηο· 12，以及美國專利第 6，117,635 號)以及蝎形引物設計方法(Whitcombe 等，804-807, NatureBiotechnologyv. 17AUGUST 1999 美國專利第6，326，145號)。這種方法只有在引物延長的時候才能產(chǎn)生表示靶的信號，而不利用核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶的活性。但是，在本發(fā)明的方法中，上述核酸酶的活性對信號的產(chǎn)生起重要的作用。這種信號產(chǎn)生機制的區(qū)別在于，以往的方法必須利用復雜結(jié)構(gòu)的引物，本發(fā)明提供的方法無需利用復雜的引物，也能夠更容易地檢測出靶核酸序列。美國專利第6，248，526號中公開了利用標記引物以及核酸聚合酶的靶檢測方法。這種方法為了產(chǎn)生信號，利用核酸聚合酶的3’ 一 5’校正活性來切割標記引物的3’ -末端部位?？偠灾?，以往的方法利用不同于本發(fā)明提供的核酸酶活性。在利用核酸聚合酶的3’ 一 5’校正活性的情況下，難以在3’ -末端設計包含錯配序列的靶-雜交引物。引物僅除了 3’-末端的錯配序列，與非-靶序列進行雜交時，錯配序列借助3’一 5’校正活性所切害I]，產(chǎn)生假陽性信號。但是，本發(fā)明無需錯配序列，因此擺脫以往方法的問題。在本領域中利用核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性的拖慢(TaqMan)探針方法主要用于靶檢測(美國專利第5，210，015號)。上述方法需要標記探針以及上游引物，以此產(chǎn)生用于表不祀的信號。拖慢(TaqMan)探針技術(shù)提出針對信號產(chǎn)生的兩種接近法聚合-依賴性切割以及聚合-獨立性切割。在聚合-依賴性切割中，上游引物的延長必須在核酸聚合酶與標記探針的5’-末端接觸之前發(fā)生。接著延長反應，聚合酶逐漸地切割標記探針的5’-末端。在聚合-獨立性切割中，上游引物以及標記探針非常鄰近，以此與靶核酸進行雜交，與上游引物的3’ -末端結(jié)合的核酸聚合酶與標記探針的5’ -末端相接觸，最終放出標記。如上所述，為了利用拖慢(TaqMan)探針技術(shù)來產(chǎn)生信號，不僅需要上游引物，還需要標記探針。標記探針并不參與靶擴增。與拖慢(TaqMan)探針技術(shù)不同地本發(fā)明以獨立的方式利用核酸聚合酶的5’一 3’核酸酶活性來產(chǎn)生信號，5’ 一 3’核酸酶活性無需其他活性(例如，聚合活性)以及其他添加物(例如，上游引物)也能夠表示其核酸切割反應。本發(fā)明者為了克服用于檢測靶核酸序列的以往技術(shù)的問題而銳意研究。本發(fā)明者研制出了具有雙重功能，例如，具有探索以及引發(fā)功能的新穎的分析-功能性引物，并且定立了利用引物來檢測靶核酸序列的多種方案。其結(jié)果，本發(fā)明者確認到，新穎的方案或者方法非常適合于靶核酸序列的檢測，尤其是實時檢測，以更強、更快的方式產(chǎn)生用于表示靶核酸序列的信號。本發(fā)明者的核心發(fā)現(xiàn)在于，在借助模板-依賴性核酸聚合酶來發(fā)生引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，與靶核酸序列雜交的引物與具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶接觸時，其3’ -末端被延長，并且其5’ -末端部位被切割，這就是掌握本發(fā)明的基礎?；谶@些發(fā)現(xiàn)確認到，在PCR反應中用于生成擴增子的引物包含可產(chǎn)生檢測信號的標記時，在實時PCR反應期間產(chǎn)生信號。以往的方法需要探針或者引物的進一步的變形，可知本發(fā)明比以往的方法，在靶檢測方面更為有效。本發(fā)明的標記引物不僅能夠提供用于有效檢測靶核酸序列的既卓越又靈活的手段(tool)，還能夠以更簡便、更縮 短的、更經(jīng)濟的方式來開發(fā)出實時PCR試驗的方法。根據(jù)本發(fā)明的一實施方式，提供一種利用靶雜交及檢測引物(THD primer)的5’ -切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，包括以下步驟步驟(a)，對上述靶核酸序列與上述THD引物進行雜交，上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記(label)或者多個標記；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及，步驟(c )，對上述信號進行檢測，上述信號表示上述靶核酸序列的存在。根據(jù)本發(fā)明，與靶核酸序列雜交的寡核苷酸，對靶核酸序列表示出雙重功能 第一，互補序列的合成；第二，產(chǎn)生用于表示靶核酸序列的信號。因此，將上述寡核苷酸命名為“靶雜交及檢測引物(THD primer”，且將本發(fā)明的方法命名為“THD引物靶檢測試驗”。根據(jù)本發(fā)明，首先靶核酸序列與THD引物進行雜交。在本說明書中使用的術(shù)語“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味著所要檢測的核酸序列，且，在雜交、退火或者擴增條件下與引物以及探針進行退火或者雜交。在本說明書中使用的術(shù)語“引物”意味著寡核苷酸，在誘導與核酸鏈(模板)互補的引物延長產(chǎn)物的合成的條件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合劑的存在以及適合的溫度與PH的條件下，可起到合成的起始點的作用。優(yōu)選地，引物在擴增中作為具有最大有效性的單鏈。優(yōu)選地，引物為寡脫氧核糖核苷酸。在本發(fā)明中利用的引物可包含自然(naturallyoccurring)脫氧單磷酸核苷(dNMP)(即，脫氧腺苷酸(dAMP)、dGMP (脫氧鳥苷酸)、dCMP (脫氧胞苷酸)及dTMP (脫氧胸苷酸))、變形的核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，探針還可包含核糖核苷酸。就引物而言，應充分長，以便能夠在聚合劑的存在之下引發(fā)延長產(chǎn)物的合成。引物的適合的長度取決于多個因素，例如，溫度、應用領域及引物的根源(source)。在本說明書中使用的術(shù)語“退火”或“引發(fā)”意味著在模板核酸并置(apposition)寡脫氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通過聚合酶對核苷酸進行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互補的核酸分子。在本說明書中使用的術(shù)語“雜交(hybridization)”意味著互補的單鏈核酸形成雙鏈核酸。在本說明書中使用的術(shù)語“退火”和“雜交”沒有區(qū)分，在本說明書中混用。在本說明書中使用的術(shù)語“ THD引物”意味著與靶核酸序列雜交的引物，該引物誘導出靶核酸序列的互補的序列的生產(chǎn)，其5’ -末端部位由具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶所切割。本說明書中使用的術(shù)語“正向引物”意味著與向3’ 一 5’方向排列的靶核酸序列的單鏈互補的引物。反向引物在上述核酸序列的另一側(cè)鏈上具有互補的序列。說明書中使用的術(shù)語“上游引物”意味著，與在目的(或者關(guān)注的)引物(a primerof interest)進行雜交的位點(site)的上游位點雜交的引物,與目的(或者關(guān)注的)引物具有相同的方向性。本說明書中使用的術(shù)語“下游引物”意味著，在目的(或者關(guān)注的)引物(aprimerofinterest)進行雜交位點(site)的下游位點進行雜交的引物,且,與目的(或者關(guān)注的)引物具有相同的方向性。THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記。在本說明書中使用的術(shù)語“互補的”意味著在預定的退火條件或者嚴格條件(stringent conditions)下引物或者探針以選擇性地與靶核酸序列雜交的程度充分地互補，并包括術(shù)語“實質(zhì)上互補的(substantiallycomplementary)”及“完全互補的(perfectly complementary)”,優(yōu)選地意味著完全互補的意思。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，THD引物的5’ -末端或者5’ -末端部位與靶核酸序列是完全互補的。
在本說明書中提及THD引物而使用的術(shù)語“5’ -末端部位”意味著，從THD引物的5’_末端包含某一長度的連續(xù)序列的部位或者區(qū)域。優(yōu)選地，THD引物的5’-末端部位由從其5’ -末端包含1-10核苷酸的序列組成(更優(yōu)選為1-5核苷酸，進而優(yōu)選為1-3核苷酸)。本發(fā)明中所利用的，產(chǎn)生可檢測信號的標記均包含本發(fā)明所屬技術(shù)領域公知的任何標記。大部分標記包含單分子或者單原子(atom)標記；但是,部分標記(例如,相互作用性標記系統(tǒng))包含至少兩個或者其以上的標記分子或者原子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，THD引物在其5’ -末端部位包含至少一個標記(更優(yōu)選地，包含來自5’ -末端的1-10核苷酸的序列的任何位點(site)，進而優(yōu)選地，包含來自5’_末端的1-5核苷酸的序列的任何位點,尤其優(yōu)選地,包含來自5’-末端的1-3核苷酸的序列的任何位點)。最優(yōu)選地，THD引物在其5’ -末端包含至少一個標記。
在模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性為5’ 一 3’外切核酸酶活性的情況下，與THD引物的5’ -末端連接的標記可借助外切核酸酶的活性所切割。在模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性為5’ 一 3’內(nèi)切核酸酶活性的情況下，與從THD引物的5’ -末端隔開1-3核苷酸的位點連接的標記可借助內(nèi)切核酸酶的活性所切割。除了包含至少兩種標記分子的相互作用性標記系統(tǒng)以外，一個或者一個以上的標記(優(yōu)選地，一個標記)可與THD引物的5’ -末端部位連接。例如，利用包含一對的供體分子以及受體分子的相互作用性標記系統(tǒng)的情況下，如果兩個分子之間發(fā)生能量傳遞，上述一對中的一個與THD引物的5’ -末端部位連接，另一個可與THD引物的任何位點連接。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，用于產(chǎn)生可檢測的信號的標記為化學標記、酶標記、放射性標記、突光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或者金屬標記(例如，金)。上述化學標記包含生物素。鏈霉親和素(或者抗生物素蛋白)與生物素的結(jié)合特異性產(chǎn)生表示靶核酸序列的間接性信號。
上述酶標記包含堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β _半乳糖苷酶(β -galactosidase)、β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)、突光素酶(luciferase)、細胞色素(cytochrome) P45tl及辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)。利用對于上述酶標記的基質(zhì)，從而能夠得到表示祀核酸序列的信號。利用堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)時，5-溴-4-氯-3- 口引哚基-磷酸鹽(BCIP, bromochloroindolylphosphate)、氮藍四唑(NBT, nitro blue tetrazolium)或者無兀素氯(ECF, elemental chlorine free)可作為對于顯色反應的基質(zhì)而利用，利用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)時，氯萘酌'(chloronaphtol)、氨基乙基咔唑(aminoethylcarbazol)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)、D-蟲突光素(D-luciferin)、光澤精(Iucigenin)(雙(N-甲基二口丫唆)硝酸鹽bis-N_methylacridiniumnitrate)、節(jié)氧基試齒靈(resoruf in benzylether)、魯米諾(luminol )、安普思紅試劑(AmplexRedreagent) (10-乙酰基 _3，7- 二輕基吩惡嗪(lO-acetyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine ) )> HYR (對苯二胺-氯化氫(p-phenylenediamine-HCl)及鄰苯二酌·(pyrocatechol))、TMB (3,3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺3，3’，5，5’ -TETRAMETHYLBENZIDINE)、ABTS (2，2-連氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯)2，2-AZINE-DI [3-ETHYLBENZTHIAZ0LINESULF0NATE])、鄰苯二胺(0PD :
o-phenylenediamine)或者萘酹/派洛寧(naphtol/pyronine)可作為基質(zhì)而利用；并且利用葡糖氧化酶(glucoseoxidase)時，t_NBT (氮藍四唑)或者m_PMS (吩嗪硫酸甲酯phenazinemethosulfate)可作為基質(zhì)而利用。上述放射性標記包含C14、I125、P32及S35。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，與THD引物連接的標記為能夠提供實時信號的單一標記。例如，上述單一標記為突光鋪(Tb)螯合物(terbiumchelate)(Nurmi等,Nucleic AcidsResearch, 2000, Vol. 28No. 8)。努米(Nurmi)等提出了上述標記在探針-連接的形態(tài)中放出低水準的熒光，但是借助5’ 一 3’核酸切割活性而從探針-模板二聚物解離時，增加熒光信號。因此，單一標記與探針或者THD弓丨物連接時，上述熒光鋱(Tb)螯合物在本發(fā)明中能夠?qū)崿F(xiàn)實時靶檢測。上述相互作用性標記系統(tǒng)為能量非-放射性地(non-radioacively)傳達到供體分子及受體分子之間的信號產(chǎn)生系統(tǒng)。
作為相互作用性標記系統(tǒng)的代表性例子，熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET，fluorescence resonance energy transfer)標記系統(tǒng)包含突光報道分子(供體分子)及粹滅分子(受體分子)。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)中，能量供體為熒光性，但是，能量受體可以是熒光性或者非-熒光性。在相互作用性標記系統(tǒng)的再一形態(tài)中，能量供體為非-熒光性，例如，為發(fā)色團(chromophore),能量受體為突光性。在相互作用性標記系統(tǒng)的另一形態(tài)中，能量供體為發(fā)光性，例如，生物發(fā)光性、化學發(fā)光性或者電化學發(fā)光性，受體為熒光性。更優(yōu)選地，用于表示靶核酸序列的信號借助相互作用性標記系統(tǒng)來產(chǎn)生，進而優(yōu)選為熒光共振能量轉(zhuǎn)移標記系統(tǒng)。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移標記時，兩種標記(位于THD引物上的熒光報道分子及猝滅分子，上述猝滅分子位于猝滅上述報道分子的熒光的位點)借助THD引物內(nèi)的一個位點(產(chǎn)生核酸酶切割的部位)而分離，由此模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性通過在上述位點的切割反應從猝滅分子分離報道分子，這將會產(chǎn)生用于表示靶核酸序列的存 在的信號。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，熒光報道分子位于THD引物的5’ -末端部位(更優(yōu)選為5’ -末端)，猝滅分子位于熒光報道分子的下游位點。選擇性地，猝滅分子位于THD引物的5’ -末端部位(更優(yōu)選地，5’ -末端)，熒光報道分子位于上述猝滅分子的下游位點。在本發(fā)明中利用的熒光分子以及猝滅分子還可以是熒光物質(zhì)。報道分子以及猝滅分子可利用本發(fā)明所屬技術(shù)領域中公知的任何標記，例如Cy2 (506)、YOPROtm-I (509)、YOYOtm-I (509),Calcein (517),FITC (518)、FluorX (519)、Alexa (520)、RhodamineI10(520)、5-FAM (522)、Oregon Green 500 (522)、Oregon 25Green 488 (524)、RiboGreen (525)、Rhodamine Green (527)、Rhodaminel23 (529)、Magnesium Green (531)、CalciumGreen (533)、TO-PROtm-I (533)、TOTOl (533)、JOE (548)、B0DIPY530/550 (550)、Dil(565)、BODIPY TMR (568)、B0DIPY558/568 (568)、B0DIPY564/570 (570)、Cy3 (570)、Alexa 546 (570)、TRITC (572)、Magnesium Orange (575), Phucoerythrin R&B (575)、Rhodamine Phalloidin (575)、CalciumOrange (576)、PyroninY (580)、Rhodamine B(580),TAMRA (582)、Rhodamine Red (590)、Cy3. 5 (596),ROX (608),Calcium Crimson (615)、Alexa 594 (615)、Texas Red (615)、Nile Red (628)、Y0-PR0 -3 (631)、Y0Y0 -3(631)、Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648)、T0-PR0 -3 (660)、T0T03 (660)、DiDDilC (5) (665)、Cy5 (670)、Thiadicarbocyanine (671)以及 Cy5. 5 (694)。括號的數(shù)字為以納米單位表示的最大發(fā)光波長。適合的一對報道分子-猝滅分子公開在如下的許多文獻中PeSCe等，editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (MarcelDekker, NewYork, 1971) ；ffhite 等，F(xiàn)LUORESCENCE ANALYSIS A PRACTICAL APPROACH (MarcelDekker, NewYork, 1970)；BerIman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2ndEDITI0N(AcademicPress,NewYork, 1971) Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OFORGANIC MOLECULES (AcademicPress, NewYork, 1976) ；Bishop, editor, INDICATORS(PergamonPress, Oxford, 1972)；Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES ANDRESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992)；Pringsheim, FLUORESCENCE ANDPHOSPHORES CENCE (Interscience Publishers, NewYork, 1949)；Haugland,R. P. , HANDBOOKOF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes,Eugene, Oreg.，1996 ;美國專利第 3，996，345 號以及第 4，351，760 號。本發(fā)明中，值得關(guān)注的是可以利用能夠?qū)V范圍波長或者特定波長的熒光進行猝滅的非-熒光黑猝滅分子。在應用于THD引物的熒光共振能量轉(zhuǎn)移標記中，報道分子包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體，猝滅分子包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移的剩余伙伴(受體)。例如，熒光素染料(fluorescein dye)利用為報道分子,羅丹明染料(rhodamine dye)利用為粹滅分子。本發(fā)明利用包含聚合酶活性以及5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的兩種不同的活性。本說明書中使用的術(shù)語“5’ 一 3’核酸酶活性”通常意味著與DNA聚合酶建立關(guān)聯(lián)的5’ 一 3’外切核酸酶活性(以此核苷酸從與模板雜交的寡核苷酸的5’ -末端開始被切割)或者5’ 一3’內(nèi)切核酸酶活性(從與模板雜交的寡核苷酸的5’-末端隔開一 個以上核苷酸的位點被切割)。在本說明書中，將借助聚合酶活性而發(fā)生催化的反應表現(xiàn)為3’ -延長反應。在本說明書中，將借助5’ 一 3’核酸酶活性而催化的反應表現(xiàn)為5’ -切割反應。5’ -切割反應意味著，與靶核酸序列雜交的寡核苷酸(例如，引物以及探針)的5’ -末端或者5’ -末端部位(例如,從5’ -末端隔開一個以上核苷酸)的核酸切割反應。該反應引起引物以及探針的切割現(xiàn)象，產(chǎn)生各種大小的核苷酸切片。3’-延長反應意味著借助模板-依賴性核酸聚合酶而發(fā)生的引物3’-末端的核酸聚合反應。本說明書中使用的“標記的放出”的表現(xiàn)包括標記自身的放出或者包含標記(或多個標記)的核苷酸切片的(或多個核苷酸切片)放出。利用于本發(fā)明的寡核苷酸(例如，引物以及探針)包含至少兩種標記時，“標記的放出”的表現(xiàn)意味著至少一種標記的放出或者包含至少一種標記的至少一種核苷酸切片的放出。本說明書中使用的“相互作用性標記系統(tǒng)的至少一種標記的放出”的表現(xiàn)意味著組成相互作用性標記系統(tǒng)的多個標記中至少一種標記本身的放出，或者包含至少一種標記的核苷酸切片(多個核苷酸切片)的放出。本發(fā)明通常包括用于檢測靶核酸序列的六個具體方案，但不局限于此第一方案為僅利用THD引物來檢測核酸序列。第二方案為利用THD引物以及標記探針來檢測靶核酸序列。第三方案為利用THD引物以及上游引物(或者下游引物)來檢測靶核酸序列。第四方案為利用正向引物以及反向引物中的至少一個引物為THD引物的一對引物來檢測靶核酸序列。第五方案為利用(i)正向引物以及反向引物中至少一個引物為THD引物的一對引物，以及(ii)標記探針來檢測靶核酸序列。第六方案為利用(i)正向引物以及反向引物中至少一個引物為THD引物的一對引物，以及(ii)上游引物(或者下游引物)來檢測靶核酸序列。如下，將對所有的檢測方案進行詳細的說明。I.利用THD引物的THD引物靶檢測試驗
根據(jù)本發(fā)明的最基本過程的第一方案，與靶核酸序列雜交的THD引物被延長的情況下，其由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶所切割，使得標記從THD引物放出，以此產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號。第一方案包括如下的步驟步驟(a)，對靶核酸序列與THD引物進行雜交，上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸；上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶的活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個的標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列的存在的信號；以及， 步驟(c )，對上述信號進行檢測，上述信號表示上述靶核酸序列的存在。圖I表示第一方案的基本步驟，圖5表示，無需反復地進行變性、雜交、切割以及延長，利用本發(fā)明的THD引物以及Taq DNA聚合酶的、在預定時間間隔內(nèi)的靶核酸序列的檢測。優(yōu)選地，上述方法在反復循環(huán)之間包括變性過程，還包括至少反復進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟，以便擴增用于表示靶核酸序列存在的信號。反復循環(huán)切割與靶核酸序列雜交的THD引物，貢獻于表示靶核酸序列存在信號的擴增。這樣的信號擴增被視為實時信號擴增。優(yōu)選地，第一方案包括以下步驟步驟(a)，對靶核酸序列與THD引物進行雜交，上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應發(fā)生的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸；上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶的活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列的存在的信號；步驟(b’)，使步驟(b)的上述結(jié)果物發(fā)生變性；步驟(b〃)，至少反復兩次上述步驟(a)_步驟(b’)，用于對表示上述靶核酸序列存在的所有的上述信號進行擴增；以及，步驟(C)，用于檢測上述靶核酸序列存在的上述信號，上述檢測在步驟(b〃)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(b〃)的上述反復的終點或者步驟(b〃)的上述反復過程中的各個預定時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。圖2表示包括上述反復步驟的該方法，圖6表示利用變性、雜交、切割以及反復延長的同時利用THD引物以及Taq DNA聚合酶的，在dNTP各種濃度中的實時信號擴增結(jié)果。
根據(jù)第一方案，表示靶核酸序列的存在的信號僅借助THD引物中的切割反應來發(fā)生或擴增。步驟(b)的上述結(jié)果物的變性使通過步驟(b)中形成的雙鏈二聚物變成單鏈核酸。關(guān)于變性的方法包括加熱、堿、甲酰胺、尿素及乙醇酸處理、酶方法(例如，解旋酶反應)及結(jié)合蛋白質(zhì)，但并不局限于此。例如，變性可以通過以80°C至105°C范圍的溫度進行加熱而達成。用于達成這種處理的一般的方法提供在Joseph Sambrook,等，MolecularCloning， ALaboratory Manual， ColdSpring Harbor Laboratory Press， Cold SpringHarbor, N. Y. (2001)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，信號的檢測，以實時方式、終-點(end-point)方式或者以預定時間間隔(predetermined time interval)方式來實施。實時方式中的檢測指反復的各循環(huán)中檢測信號。終-點方式中的檢測指反復的終點檢測信號的方法。預定時間間隔方式中的檢測指在反復過程期間在各個預定時間間隔檢測信號的方法。
本發(fā)明非常適合靶核酸序列的多重檢測。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列至少包含兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上述THD引物包含至少二種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。利用至少兩個THD引物的情況下，可制備出根據(jù)不同的分析目的以不同的組合來包含標記的引物。例如，多個THD引物可與全部相同的標記、全部不同的標記或者部分不同的標記連接。并且，要么部分或全部不同，要么部分或全部相同的至少兩個標記可與一個THD引物相連接。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。本發(fā)明利用預-擴增的核酸序列，使得對靶檢測的靈敏度以及特異性顯著提高。少量的靶核酸序列以適當?shù)乃疁蔬M行預-擴增之后，基于本發(fā)明來進行檢測，從而大大提高靶檢測的靈敏度。有趣的是，能夠與預-擴增反應中利用的引物的下游序列進行雜交的THD引物，也可用作提高靶檢測特異性的套式引物。2.利用THD引物以及標記探針的THD引物靶檢測試驗第二方案不僅利用THD引物，還利用標記探針。標記探針具有產(chǎn)生可檢測信號的標記,標記探針與THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點進行雜交,且與THD引物具有相同的方向性，在連續(xù)的步驟中被切割。標記探針的3’ -末端被阻斷(blocking)，以便抑制延長。就上述阻斷而言，可以利用非-互補的堿基或者在其最后核苷酸的3’羥基添加如生物素或者磷酸鹽基的化學組成部分(moiety)而達成。并且，阻斷過程可利用去除3’-OH或者如雙脫氧核苷酸一樣沒有3’ -OH的核苷酸來實現(xiàn)。本說明書中利用的術(shù)語“探針(probe)”意味著與靶核酸序列實質(zhì)性的互補的部位或者包含這些部位的單-鏈核酸分子。第二方案中，不僅是THD引物，還有標記探針都能夠產(chǎn)生信號，因此相比僅利用THD引物的第一方案，對靶核酸序列就有更高的信號強度。對標記探針有用的標記如THD引物中所述。優(yōu)選地，標記為FRET標記。
并且，標記探針由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶所切割，使標記從標記探針放出。因此，第二方案提供用于表示靶核酸序列存在的兩個不同信號。根據(jù)第二方案，與靶核酸序列雜交的THD引物延長的情況下，由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，在THD引物和/或標記探針中發(fā)生5’-切割反應，從而標記從THD引物和/或標記探針放出，以此產(chǎn)生用于表示靶核酸序列的存在的信號。第二方案包括如下的步驟步驟(a)，對靶核酸序列、THD引物以及標記探針進行雜交，上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依 賴性核酸聚合酶進行接觸，上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；上述標記探針借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’一 3’核酸酶活性所切割，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及，步驟(c )，對上述信號進行檢測，上述信號表示上述靶核酸序列的存在。優(yōu)選地，第二方案在反復循環(huán)之間包括變性過程，還包括至少反復進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟，以便擴增用于顯示靶核酸序列存在的信號。具體地，第二方案包括如下的步驟步驟(a)，對靶核酸序列、THD引物以及標記探針進行雜交，上述THD引物包含
(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；上述標記探針與在THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點雜交，并且與THD引物具有相同的方向性；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記；上述標記探針借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一3’核酸酶活性所切割，使得上述探針放出上述標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(b’)，使步驟(b)的上述結(jié)果物發(fā)生變性；步驟(b〃)，至少反復兩次上述步驟(a)_步驟(b’)，對表示上述靶核酸序列存在的上述所有信號進行擴增；以及，步驟(C)，用于檢測表示上述靶核酸序列存在的上述信號；上述檢測在步驟(b〃)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(b〃)的上述反復的終點或者步驟(b〃)的上述反復期間的各個預定時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為，至少三種，最優(yōu)選為至少5種)，上述THD引物包含至少兩種引物(更優(yōu)選為，至少三種，最優(yōu)選為至少5種)，上述標記探針包含至少兩種探針(更優(yōu)選為，至少三種，最優(yōu)選為至少5種)。在利用至少兩個THD引物以及至少兩個探針的情況下，這些根據(jù)分析目的，可制備出以多種組合包含標記。例如，多個THD引物以及至少兩個探針可與全部相同的標記、全部不同的標記或者部分不同的標記進行連接。并且，要么部分或全部不同，要么部分或全部相同的至少兩個標記可與一個THD引物或者一個探針進行連接。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增出的核酸序列。3.利用THD引物以及上游引物(或者下游引物)的THD引物靶檢測試驗
根據(jù)第三方案，在與靶核酸序列雜交的THD引物以及上游引物(或者下游引物)延長的情況下，由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，在THD引物和/或上游引物(或者下游引物)發(fā)生5’ -切割反應，使得標記從THD引物放出，以此產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號。上游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的上游位點雜交，且具有與THD引物相同的方向性。下游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點雜交，并具有與THD引物相同的方向性。第三方案包括如下步驟步驟(a)，對靶核酸序列、THD引物以及上游引物或者下游引物進行雜交，上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；上述上游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的上游位點雜交，具有與THD引物相同的方向性；上述下游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點雜交，并具有與THD引物相同的方向性；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶 活性而延長，并且，借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及，步驟(c )，對上述信號進行檢測，上述信號表示上述靶核酸序列的存在。優(yōu)選地，上述方法在反復循環(huán)之間包括變性過程，還包括至少反復進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)_步驟(C)的步驟，以便擴增用于顯示靶核酸序列存在的信號。反復循環(huán)切割與靶核酸序列進行雜交的THD引物，貢獻于表示靶核酸序列存在信號的擴增。具體地，第三方案包括如下的步驟步驟(a)，對靶核酸序列、THD引物以及上游引物或者下游引物進行雜交，上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；上述上游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的上游位點進行雜交，具有與THD引物相同的方向性；上述下游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點進行雜交，并具有與THD引物相同的方向性；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從而上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(b’)，使步驟(b)的上述結(jié)果物變形；步驟(b〃)，至少反復兩次上述步驟(a)_ (b’)，對用于表示上述靶核酸序列存在的所有的上述信號進行擴增；以及，步驟(C)，用于檢測表示上述靶核酸序列存在的上述信號，在步驟(b〃)的上述反 復的各循環(huán)中進行上述檢測，在步驟(b〃)的上述反復的終點或者步驟(b〃)的上述反復進行期間在各預定時間間隔實施，且這些信號表示靶核酸序列的存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上游引物或者下游引物具有產(chǎn)生可檢測信號的標記。與上游引物或者下游引物連接的標記與THD引物連接的標記可同時從步驟(b)中放出，并且可參與步驟(c)發(fā)出的信號。根據(jù)實例，與上游引物或者下游引物連接的標記不同于與THD引物連接的標記。有用于上游引物或者下游引物的標記如THD引物的說明相同。優(yōu)選地，標記為FRET標記。上游引物或者下游引物具有標記的情況下，第三方案不僅是THD引物，還從標記的上游引物(或者標記的下游引物)也可產(chǎn)生信號，因此相比僅利用THD引物的第一方案相t匕，對靶核酸序列可產(chǎn)生更高的信號強度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上述THD引物包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上述上游引物(或者下游引物)包含至少兩種引物(更優(yōu)選為，至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。4.利用THD引物的實時靶擴增試驗根據(jù)第四方案，由正向引物以及反向引物組成，其中，作為至少一個引物與靶核酸序列進行雜交的THD引物的一對引物延長的情況下，由具有5’一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶，在兩個引物中發(fā)生5’ -切割反應，使得標記從THD引物放出，以此產(chǎn)生用于表不祀核酸序列存在的信號(圖3)。在正向引物以及反向引物中至少一個引物，即，作為THD引物的一對引物在反復實施步驟的情況下均可進行靶擴增以及信號擴增。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的方法包括如下的步驟步驟(a)，對上述靶核酸序列與一對引物進行雜交，上述一對引物由正向引物以及反向引物組成，其中，至少一個引物為能夠?qū)ι鲜霭泻怂嵝蛄羞M行擴增的上述THD引物；上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記(label)或者多個標記；
步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述兩個引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述兩個引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，使得上述兩個引物中的上述THD引物中放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表不上述祀核酸序列存在的信號；步驟(C)，使步驟(b)的上述結(jié)果物發(fā)生變性；步驟(d)，至少反復兩次上述步驟(a)_步驟(c);用于擴增對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的所有的上述信號；以及，步驟(e)，用于檢測表示上述靶核酸序列存在的上述信號；上述檢測在步驟(d)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(d)的上述反復的終點或者上述反復期間的各個時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。 第四方案利用由正向引物以及反向引物組成的一對引物。兩個引物中至少一個為THD引物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，步驟(a)利用針對THD引物具有反方向的至少一個追加的標記探針來實施。此時，模板(即，靶核酸序列)的可利用性更為提高，且可利用于THD引物的雜交。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，兩個引物均具有步驟(b)中放出的一個標記。與兩個引物連接的標記相同或者不同。作為THD引物的配對引物的有效標記，如THD引物說明。優(yōu)選地,標記為FRET標記。步驟(b)的上述結(jié)果物的變性使步驟(b)形成的雙鏈二聚物變成單鏈核酸。關(guān)于變性的方法包括加熱、堿、甲酰胺、尿素及乙醇酸處理、酶方法(例如，解旋酶反應)及結(jié)合蛋白質(zhì)，但并不局限于此。例如，變性可以通過以80°C至105°C范圍的溫度進行加熱而達成。用于達成這種處理的一般的方法提供在Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning,ALaboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y. (2001)。本發(fā)明非常適合于靶核酸序列的多重檢測。本發(fā)明者可知，本發(fā)明是能夠?qū)崿F(xiàn)多重實時檢測的唯一的方法。第四方案，如圖4所述，可制備出THD引物的多種組合。(A)作為正向引物的THD引物；(B)作為反向引物的THD引物；以及(C)作為正向引物及反向引物的THD引物。圖15表不對淋病奈瑟菌(NG, Neisseria gonorrhoeae)基因進行的實時PCR擴增中，利用正向引物、反向引物或者作為這兩種引物的THD引物的圖4a的引物組合的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上述THD引物包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，兩個引物包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。本發(fā)明的方法利用預-擴增的核酸序列作為初始物質(zhì)時，可誘導出套式擴增，以便大大改善靶檢測中的靈敏度以及特異性。
5.利用THD引物以及標記探針的實時靶擴增試驗第五方案，不僅利用正向引物以及反向引物中至少一個引物為THD引物的一對引物，還利用標記探針。標記探針具有產(chǎn)生可檢測信號的標記，標記探針與在THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點雜交，具有與THD引物相同的方向性，之后在后續(xù)的步驟中被切割。兩個引物與靶核酸序列進行雜交而延長的情況下，兩個引物由具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶而發(fā)生5’ -切割反應，使標記從兩個引物中的THD引物放出；就上述標記探針而言，其3’-末端發(fā)生變形，防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，并且在上述兩個引物之間的一個位點上進行雜交和切割，使與上述標記探針連接的標記放出，以此產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號(圖4b)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的方法包括如下步驟步驟(a)，對上述靶核酸序列與一對引物以及追加的標記探針進行雜交，上述一對引物由能夠?qū)ι鲜霭泻怂嵝蛄羞M行擴增的正向引物以及反向引物組成，其中，至少一個引 物為上述THD引物；上述THD引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記(label)或者多個標記；就上述標記探針而言，其3’ -末端發(fā)生變形，防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，并與上述兩個引物之間的某一位點進行雜交；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述兩個引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述兩個引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，使得上述兩個引物中的上述THD引物中放出上述標記(label)或上述相互作用性標記系統(tǒng)中的至少一個標記；上述標記探針借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，使上述探針放出標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(C)，使步驟(b)的上述結(jié)果物發(fā)生變性；步驟(d)，至少反復兩次上述步驟(a)_步驟(C)，對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的上述所有信號進行擴增；以及，步驟(e)，用于檢測表示上述靶核酸序列存在的上述信號；上述檢測在步驟(d)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(d)的上述反復的終點或者上述反復期間的各個時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，步驟(a)利用具有與THD引物的方向相反的方向的至少一個追加引物來實施。這時，可更多利用模板(即，靶核酸序列)，可利用于對THD引物以及上游引物(或者下游引物)的雜交。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，兩個引物均具有步驟(b)中放出的標記。與兩個引物連接的標記相同或者不同。對THD引物的配對引物有用的標記如同THD引物說明。優(yōu)選地，標記為FRET標記。第五方案，如圖4b所示，可制備出一對引物以及標記探針的各種組合。其為如下(A)作為正向引物的THD引物；(B)作為反向引物的THD引物；以及(C)作為正向引物及反向引物的THD引物。圖16表示圖4b例示的引物組合的結(jié)果，并對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae)基因進行的實時PCR擴增中，與標記探針同時利用正向引物、反向引物或者作為正向引物以及反向引物的THD引物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上述THD引物包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，作為正向引物以及反向引物的兩種引物分別包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，標記探針包含至少兩種探針(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。6.利用THD引物以及上游引物(或者下游引物)的實時靶擴增試驗
根據(jù)第六方案，與靶核酸序列雜交的(i )正向引物以及反向引物中至少一個引物為THD引物的一對引物，以及(ii)上游引物(或者下游引物)延長的情況下，由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶而在兩個弓I物和/或上游引物(或者下游引物)上發(fā)生5’-切割反應，使得標記從兩個引物中的THD引物放出，以此產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明的方法包括如下的步驟步驟(a)，對上述靶核酸序列與一對引物以及上游引物(或者下游引物)進行雜交，上述一對引物由正向引物以及反向引物組成，其中，至少一個引物為THD引物；上述THD弓I物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記(label)或者多個標記；上述上游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的上游位點雜交，具有與THD引物相同的方向性；上述下游引物與在THD引物進行雜交的位點(site)的下游位點雜交，具有與THD引物相同的方向性；步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述兩個引物及上游引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述兩個引物以及上游引物(或者下游引物)借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一3’核酸酶活性所切割，使得上述兩個引物中的上述THD引物中放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)中的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；步驟(C)，使上述步驟(b)的上述結(jié)果物發(fā)生變性；步驟(d)，至少反復兩次上述步驟(a)_步驟(C)，用于對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的上述所有信號進行擴增；以及，步驟(e)，用于檢測表示靶核酸序列存在的上述信號；上述檢測在步驟(d)的上述反復的各循環(huán)中，在驟(d)的上述反復的終點或者上述反復期間的各個預定時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，步驟(a)利用與THD引物的方向相反方向的至少一個追加引物來實施。這時，模板(即，靶核酸序列)的利用可能性變多，且可利用在THD引物以及上游引物(或者下游引物)的雜交上。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，不僅是上述THD引物，還有其他引物均具有產(chǎn)生可檢測信號的標記。與引物連接的標記相同或者不同。對引物有用的標記如上述THD引物的說明。優(yōu)選地，標記為FRET標記。第六方案中，可如圖4c所示的方法來制備一對引物以及上游引物的各種組合。其為如下(A)作為正向引物以及上游引物的THD引物；(B)作為正向引物以及反向引物的THD引物；(C)作為正向引物、上游引物以及反向引物的THD引物；(D)作為正向引物的THD引物。圖17表示圖4c所示的引物組合的結(jié)果，對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae)基因進行的實時PCR擴增中，與作為正向引物的THD引物一起追加利用上游引物、反向引物或者作為該兩種引物的THD引物。第六方案中，如圖4d所示，可制備一對引物以及下游引物的各種組合。其為如下(A)作為正向引物的THD引物；(B)作為反向引物的THD引物；以及(C)作為正向引物以及反向引物的THD引物。
圖18表示圖4d所示的引物組合的結(jié)果，對淋病奈瑟菌(NG, Neisseriagonorrhoeae )基因進行的實時PCR擴增中，利用內(nèi)部引物，追加利用正向引物、反向引物或者作為該兩種引物的THD引物。圖4d中，下游引物可表現(xiàn)為內(nèi)部引物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，作為正向引物以及反向引物的兩個引物分別包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上游引物包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包括核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。優(yōu)選實例利用THD引物的實時聚合酶鏈式反應(PCR)試驗第四-第六方案中，正向引物以及反向引物中至少一個引物利用作為THD引物的一對引物，該引物能夠擴增出靶核酸序列。因此，反應的反復伴隨著靶核酸序列的擴增。優(yōu)選地，上述擴增根據(jù)PCR (聚合酶連鎖反應)實施，這公開在美國專利號第4，683，195號、第4，683，202 號以及第 4，800，159 號中。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，本發(fā)明提供一種利用伴隨有靶雜交及檢測引物(THDprimer)的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應(PCR)，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，該方法包括以下步驟步驟(a)，準備包含上述靶核酸序列、一對引物以及具有5’ 一3’外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的的PCR混合物，上述一對引物包含可擴增出上述靶核酸序列的兩個引物，其中，至少一個引物為上述THD引物；上述THD弓丨物包含(i )雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii) 一對的熒光報道分子以及猝滅分子；并且上述猝滅分子位于上述THD引物上，以便對上述報道分子的熒光進行猝滅；上述兩個標記通過發(fā)生核酸酶切割的THD引物內(nèi)的一個位點而分離，以此上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一3’核酸酶活性通過上述位點上的切割反應來將上述報道分子從上述猝滅分子中分離出，以便產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信號；步驟(b)，利用上述PCR混合物來對上述靶核酸序列進行擴增，將引物退火、引物延長以及變性至少實施兩次，上述兩個引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，以此對靶核酸序列進行擴增，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性所切割，來從兩個引物中的上述THD引物中放出上述報道分子或者上述猝滅分子，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及，步驟(C)，檢測用于表示上述靶核酸序列存在的上述熒光信號，上述檢測在步驟(b)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(c)的上述反復的終點或者上述反復期間各個預定時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。如上所述，第四方案可提出實時PCR反應中的THD引物的各種組合，其為如下(A)作為正向引物的THD引物；(B)作為反向引物的THD引物；以及(C)作為正向引物以及反向引物的THD引物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，PCR混合物包含正向引物以及反向引物中至少一個引物為THD引物的一對引物、上游引物(或者下游引物)以及具有5’ 一 3’外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶；上述上游引物與在上述THD引物進行雜交的位點(site)的上游位 點雜交，并且具有與上述THD引物相同的方向。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，PCR混合物包含兩個引物中至少一個引物為THD引物的一對引物以及具有產(chǎn)生可檢測信號的標記的標記探針；就上述標記探針而言，3’ -末端發(fā)生變形，防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，與上述兩個引物之間的某一位點(site)雜交。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，因為此方案不僅由THD引物，而且由標記探針也產(chǎn)生信號，所以比起僅利用一對引物的方案，能對靶核酸序列產(chǎn)生更高的信號強度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，步驟(a)通過利用具有與THD引物的方向相反的方向的至少一個追加引物來實施。這種情況時，模板(即，靶核酸序列)將更可利用，也可利用于THD引物的雜交。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例,步驟(C)的檢測通過實時方式、終點方式(end-point)或預定時間間隔(predetermined time interval)方式來進行。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，作為正向引物及反向引物的兩個引物分別包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，作為正向引物及反向引物的兩個引物分別包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，上游引物(或下游引物)包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含至少兩種核酸序列(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，作為正向引物及反向引物的兩個引物分別包含至少兩種引物(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)，標記探針包含至少兩種探針(更優(yōu)選為至少三種，最優(yōu)選為至少五種)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，不僅是THD引物，還有其他引物均具有產(chǎn)生可檢測信號的標記。與引物連接的標記可能相同或相異。對引物有用的標記的說明如同在THD引物中所做的敘述。優(yōu)選地，標記為FRET標記。
在不僅是THD引物，還有其他引物均具有標記的情況時，由于不僅是由THD引物，還有由其他引物均產(chǎn)生信號，因而比起僅利用THD引物的方案，能對靶核酸序列產(chǎn)生更高的信號強度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列包含核苷酸變異。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，所利用的THD引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)或者以下通式II的變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)5’ -ΧΡ _3’ (I)在上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位(5，-first priming portion) ;Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位(separation portion) ;Z,為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第二次引發(fā)部位(3’ -secondpriming portion) ;p、q及r表示核苷酸的數(shù)量,X、Y及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位及上述3’-第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述THD引物的整體雜交特異性得到提高；5，-X’p-Y’fZ’r-3，(II)在上述通式中，X’p為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第二次引發(fā)部位(5，-second priming portion) ;Y’q為包含至少三個通用堿基的分離部位(separationportion) ;Z\為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第一次引發(fā)部位(3’ -firstpriming portion);p、q及r表示核苷酸的數(shù)量,X’、Y’及Ζ’為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第二次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第一次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第二次引發(fā)部位從上述3’ -第一次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第二次引發(fā)部位以及上述3’-第一次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述THD引物的整體雜交特異性得到提高。更為優(yōu)選的是，THD引物具有通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)。具有變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)的THD引物尤其適合于利用上游引物的第三及第六方案。具有雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)的THD引物適合于其他方案。作為雙重特異性寡核苷酸(DS0, dual specificity oligonucleotide)的引物形態(tài)的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)的結(jié)構(gòu)首次由本發(fā)明者所提出(參照W02006/095981 ；Chun et al. , Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detectionof respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic AcidResearch, 35:6e40 (2007)))。變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)是雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)的新的變形形態(tài)，此首次由本發(fā)明者所提出(參照W02006/095981)。雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)體現(xiàn)雜交或退火借助分離區(qū)域相互分離的5’ -高Tm特異性部位(或者5’ -第一次雜交部位、5’ -第一次引發(fā)部位)及3’ -低Tm特異性部位(或者3’ -第二次雜交部位、3’ -第二次引發(fā)部位)雙重性地決定的新穎的概念，表示出非常驚人的雜交特異性(參照W02006/095981 ;Kim et al., Directdetection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplexPCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of VirologicalMethods,149:76-84 (2008);Kimj et. al. , Rapid detection and identification of 12respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplexPCR assay,Journal of Virological Methods,doi:10. 1016/j. jviromet. 2008. 11. 007(2008);Horii et. al. , Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplexsexually transmitted pathogens in clinical specimens,Letters in AppliedMicrobiology, doi :10. 111/j. 1472-765X2009. 02618x (2009)))。如上所述，雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)最終獲得具有相互不同的雜交特性的兩個引物部分(segment)，其為如下造成初期的穩(wěn)定的雜交的5’ -第一次引發(fā)部位及決定靶特異性的3’ -第二次引發(fā)部位。變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)是上述雙重特異性寡核苷酸(DSO)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)而成的，即，決定靶特異性的5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)及造成初期的穩(wěn)定的雜交的3’ -第一次引發(fā)部位(或者3’ -第一次雜交部位)。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，位于分離部位的通用堿基選自包含脫氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7_ 去氮-2，-脫氧肌苷(7-deaza_2，-deoxyinosine)、2-氮雜-2’ -脫氧肌苷(2_aza_2’ -deoxyinosine)Λ2^ -甲氧基肌苷(2’ -OMe inosine)、2’ -F 肌苷(2’ -F inosine)、脫氧 3-硝基卩比咯(deoxy 3-nitropyrrole)、3-硝基 P比咯(3-nitropyrrole)、2，-甲氧基 3_ 硝基卩比咯(2，-0Me3-nitropyrrole)、2，_F3_ 硝基吡咯(2’ -F 3-nitropyrrole)U- (2’ -脫氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(I- (2，-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脫氧 5_ 硝基批咯(deoxy5_nitroindole)、5-硝基口引哚(5_nitroindole)、2’ -甲氧基 5-硝基口引哚(2，-OMe5_nitroindole)、2’ -F5-硝基口引哚(2，-F 5_nitroindole)、脫氧 4-硝基苯并咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)λ4-硝基苯并咪唑(4_nitrobenzimidazole)、脫氧 4_ 氨基苯并咪唑(deoxy 4-aminobenzimidazole)、4_ 氨基苯并咪唑(4_aminobenzimidazole)、脫氧水粉蕈素(deoxy nebularine)、2’ -F 水粉蕈素(2’ -F nebularine)、2’ -F 4_ 硝基苯并咪唑(2’ -F4_nitrobenzimidazole)、妝核酸 _5_ 硝基卩引哚(PNA-5-nitroindole)、妝核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸_4_硝基苯并咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、妝核酸 _3_ 硝基卩比咯(PNA-3-nitropyrrole)、嗎啉基 _5硝基卩引哚(morpholino-5-nitroindole)、嗎啉基 _ 水粉蕈素(morpholino-nebularine)、嗎啉基-肌苷(morpholino-inosine)、嗎啉基-4-硝基苯并咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)λ 嗎啉基-3-硝基卩比咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯_5_硝基卩引哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基憐酸酉旨-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基憐酸酯_4_硝基苯并咪唑(phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基憐酸酯_3_硝基批咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2’ -O-甲氧基乙基肌苷(2’ -O-methoxyethylinosine)、2，-O-甲氧基乙基水粉蕈素(2’ O-methoxyethyl nebularine)、2’ -O-甲氧基乙基5_硝基卩引哚(2’ -O-methoxyethyl 5_nitroindole)、2’ -O-甲氧基乙基4_硝基-苯并咪唑(2’ -O-methoxyethyl 4-nitro_benzimidazole)、2’ -O-甲氧基乙基 3_ 硝基卩比咯(2’ -O-methoxyethyl 3-nitropyrrole)及上述堿基的組合的群。更優(yōu)選地,通用堿基為脫氧肌苷(deoxyinosine)、l- (2’_ 脫氧-β -D-呋喃核糖)_3_ 硝基卩比咯(I- (2’-deoxybeta_D-ribofuranosyl)-3_nitropyrrole)或者 5-硝基卩引哚(5_nitroindole),最優(yōu)選為脫氧肌昔(deoxyinosine)ο優(yōu)選地，上述分離部位包含至少三個通用堿基，更優(yōu)選地包含至少四個通用堿基，最優(yōu)選地包含至少五個通用堿基。優(yōu)選地，雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)的結(jié)構(gòu)的5’ -第一次引發(fā)部位的長度比3’ -第二次引發(fā)部位的長度更長。上述5’-第一次引發(fā)部位優(yōu)選地具有15-60核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有15-40核苷酸的長度，進而優(yōu)選地具有15-25核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述3’-第二次引發(fā)部位具有3-15核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有5-15核苷酸的長度，進而優(yōu)選地具有6-13核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述分離部位具有3-10核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有4-8核苷酸的長度，最優(yōu)選地具有5-7核苷酸的長度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述5’-第一次引發(fā)部位具有40°C -80°C的Tm，更優(yōu)選地具有45°C _65°C的Tm。上述3’ -第二次引發(fā)部位優(yōu)選地具有10°C -40°C的Tm。上述分離部位優(yōu)選地具有3°C -15°C的Tm。 優(yōu)選地，變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)的3’-第一次引發(fā)部位(或者3’-第一次雜交部位)的長度比5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)的長度更長。上述3’ -第一次引發(fā)部位優(yōu)選地具有15-60核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有15-40核苷酸的長度，進而優(yōu)選地具有15-25核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述5’ -第二次引發(fā)部位具有3-15核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有5-15核苷酸的長度,進而優(yōu)選地具有6-13核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述分離部位具有3-10核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有4-8核苷酸的長度，最優(yōu)選地具有
5-7核苷酸的長度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述3’ -第一次引發(fā)部位具有40°C -80°C的Tm，更優(yōu)選地具有45°C -65°C的Tm。上述5’ -第二次引發(fā)部位優(yōu)選地具有10°C _40°C的Tm。上述分離部位優(yōu)選地具有3°C -15°C的Tm。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，標記探針具有通式II的變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)5，-X，p-Y，rZ，r-3，(II)在上述通式中，X’p為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)-X q為包含三個以上的通用堿基的分離部位(separationportion);Z\為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第一次引發(fā)部位(或者3’ -第一次雜交部位);p、q及r表示核苷酸的數(shù)量,X’、Y’及Z’為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)的Tm低于3’ -第一次引發(fā)部位(或者3’ -第一次雜交部位)的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)從上述3’ -第一次引發(fā)部位(或者3’ -第一次雜交部位)分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)及上述3’ -第一次引發(fā)部位(或者3’ -第一次雜交部位)來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述探針的整體退火特異性的得到提聞。優(yōu)選地，用于標記探針的變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)的3’-第一次引發(fā)部位(或者3’ -第一次雜交部位)的長度比5’ -第二次引發(fā)部位(或者5’ -第二次雜交部位)的長度更長。上述3’-第一次引發(fā)部位優(yōu)選地具有15-60核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有15-40核苷酸的長度，進而優(yōu)選地具有15-25核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述5’-第二次引發(fā)部位具有3-15核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有5-15核苷酸的長度，進而優(yōu)選地具有6-13核苷酸的長度。優(yōu)選地，上述分離部位具有3-10核苷酸的長度，更優(yōu)選地具有4-8核苷酸的長度，最優(yōu)選地具有5-7核苷酸的長度。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述3 ’ -第一次引發(fā)部位(或者3 ’ -第一次雜交部位)具有40°C -80°C^^Tm，更優(yōu)選地具有45°C -65°C的Tm。上述5’-第二次引發(fā)部位(或者5’-第二次雜交部位)優(yōu)選地具有10°C -40°C的Tm。上述分離部位優(yōu)選地具有3°C -15°C的Tm。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上游引物或者下游引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)5’ -ΧΡ _3’ (I) 在上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位(5，-first priming portion) ;Yq為包含至少三個通用堿基的分離部位(separationportion) ;Z,為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第二次引發(fā)部位(3’ -secondpriming portion) ;p、q及r表示核苷酸的數(shù)量,X、Y及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使得上述上游引物的整體退火特異性得到提高。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，利用于靶擴增的引物(S卩，配對引物)及THD引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)5’ -ΧΡ _3’ (I)在上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位(5，-first priming portion) ;Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位(separationportion) ;Z,為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第二次引發(fā)部位(3’ -secondpriming portion) ;p、q及r表示核苷酸的數(shù)量,X、Y及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使得上述引物的整體退火特異性得到提聞。為檢測靶核酸而利用引物的以往技術(shù)，因所使用的引物的內(nèi)在的局限性，并不能充分擺脫誤差信號。但是包含為擺脫此種情況刻意設計的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)或者變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)的THD引物、標記引物、上游引物、上游引物及反向引物，以戲劇性地提高的特異度與靶核酸序列雜交，以便無誤差信號地檢測出靶核酸序列。在本說明書中揭示引物或者探針而使用的術(shù)語“常規(guī)的”意味著不包含雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)或者變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)的所有引物或者探針。這些在本說明書中被解釋為常規(guī)弓I物或者常規(guī)探針。與靶核酸序列雜交后，與在借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述THD引物的5’ -切割反應及3’ -延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶接觸；上述THD引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶的活性而延長，借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從上述THD引物放出上述標記或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，由此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列的存在的信號?！霸诮柚０?依賴性核酸聚合酶發(fā)生THD引物的5’ -切割反應及3’ -延長反應的條件下”的內(nèi)容意味著由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶充分誘導在上述THD引物的3’ -末端的延長反應及在5’ -末端或者5’ -末端部位的切割反應的條件。這些條件可遵循以往核酸聚合酶引起的引物延長所需的條件。例如，這些條件可在 Joseph Sambrook 等、Molecular Cloning、A Laboratory Manuals Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor> N. Y. (2001)中確認。如實施例所不，條件包含適當時間內(nèi)在相對高溫(例如，50°C _75°C)下的靶核酸序列、THD引物、熱穩(wěn)定性DNA聚合 酶(例如，Taq DNA聚合酶)、dNTPs及MgCl2的培養(yǎng)?！霸诮柚０?依賴性核酸聚合酶發(fā)生兩種引物的5’ -切割反應及3’ -延長反應的條件下”的內(nèi)容意味著由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶充分誘導用于擴增靶的上述一對引物(正向引物及反向引物)在3’ -末端的延長反應及在5’ -末端或者5’-末端部位的切割反應的條件。對條件的詳細說明可在上述所敘述的內(nèi)容的參照中說明。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶是熱穩(wěn)定性DNA聚合酶,能從多種細菌種類中獲得,例如包含Thermus aquaticus (Taq) >ThermusthermophiIus (Tth)、Thermus filiformiS、Thermis flavus> Thermococcus literalis、Pyrococcus furiosus (Pfu) > Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermuschliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermusoshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophiIus> Thermotogamaritima、Thermotoga neapolitana 及 Thermosipho africanus。最優(yōu)選地，具有 5’ —3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶是Taq DNA聚合酶。最終，檢測出表示靶核酸序列的存在的信號。信號的檢測可在反復的各循環(huán)、在反復的結(jié)束點或者在反復的過程中的各個預定時間間隔實施。優(yōu)選地，信號檢測應在反復的各循環(huán)實施，這將提高檢測的準確性。本發(fā)明對需要檢測和/或擴增的靶核酸序列并不需要任何特定序列或者長度。RNA 祀序列應被反轉(zhuǎn)錄為 cDNA (Joseph Sambrook 等、Molecular Cloning、A LaboratoryManual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor> N. Y. (2001);及Noonan> K. F.等、Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988))。尤其，在本發(fā)明中能夠檢測和 /或擴增的靶核酸序列包含任何核酸分子，例如，也可以均包含DNA(gDNA或者cDNA)及RNA分子。祀核酸序列還均包含任何自然(naturally occurring)原核細胞核酸、真核細胞(例如，原生動物和寄生動物、菌類、酵母、高等植物、低等動物及包含哺乳動物和人類的高等動物)核酸、病毒(例如，皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV :HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS)、流感病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒以及脊髓灰質(zhì)炎病毒等)核酸或者類病毒核酸。與靶核酸序列雜交的THD引物由具有5’ 一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶被切割，放出與THD引物連接的標記，產(chǎn)生用于表示靶核酸序列的存在的信號。對各標記的信號可通過以往方法進行檢測或測定。例如，標記包含酶時，利用酶的基質(zhì)檢測信號。利用作為金屬標記的金屬粒子時，通過利用硝酸銀的銀染色法檢測信號。熒光信號可通過以往方法，例如，利用熒光強度測定儀進行檢測或測定。檢測的信號可直接從標記本身得到，或間接地從連續(xù)的包含標記的反應得到。此夕卜，檢測的信號可從釋放的標記或保留的標記(不包括在切割的核苷酸中)得到(例如，反應性標記系統(tǒng))。能同時檢測至少兩個靶核酸序列，這一點能更加突顯本發(fā)明的優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，能同時檢測多個靶核酸序列。并且，本發(fā)明對核苷酸變異的檢測而言非常有用。在本發(fā)明中使用的術(shù)語“核苷酸變異”意味著在連續(xù)的DNA片段或者序列類似的DNA片段中存在于特定位點的DNA序列的核苷酸的多樣性。這種連續(xù)的DNA片段包含一個基因或者一個染色體的任意其他部位。例如，可以通過本發(fā)明的方法而檢測的核苷酸變異包括缺失、插入、置換。核苷酸變異的例子包括人類基因組的多種變異(例如，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase)基因的變異)、藥物耐性病原體的核苷酸變異及癌產(chǎn)生-相關(guān)核苷酸的變異。優(yōu)選的是，在本發(fā)明中被檢測的核苷酸變異為堿基置換，更優(yōu)選為單核苷酸多態(tài)性(SNP，single nucleotide polymorphism)及點突變。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供一種利用靶雜交及檢測引物(THDprimer)的5’ -切割反應及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物檢測靶核酸序列的試劑盒，其特征在于，包含(a) THD引物，其包含(i )雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補；以及(ii )相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記(label)或者多個標記；以及(b)模板-依賴性核酸聚合酶，其具有5’ 一 3’核酸酶活性；
上述THD引物與上述靶核酸序列進行雜交的情況下，上述THD引物借助上述核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，上述THD引物借助上述核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從上述THD引物放出上述標記(label)或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，上述試劑盒還包含用于擴增靶的追加的引物、THD引物、上游引物、下游引物、標記探針或者它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實例，用于擴增靶的追加引物、上游引物和/或下游引物具有
己 O對引物或者標記探針有用的標記的說明如在THD引物中所述的內(nèi)容。優(yōu)選地，標記為FRET標記。并且，標記探針及被標記的引物由具有5’ 一3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶所切割，由此放出標記，并提供用于表示靶核酸序列的存在的兩種不同的信號。本發(fā)明的試劑盒是通過實施上述的本發(fā)明的檢測方法而構(gòu)成的，為了避免本說明書的復雜性，故而省略與其重復的內(nèi)容。本發(fā)明的試劑盒可選擇性地包含在靶擴增聚合酶鏈式反應(PCR)(例如，聚合酶鏈式反應)中所需的如緩沖液、DNA聚合酶輔因子及脫氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等試劑。選擇性地，本發(fā)明的試劑盒還可包含多種多聚核苷酸分子、反轉(zhuǎn)錄酶、多種緩沖液、試劑以及抑制DNA聚合酶活性的抗體。并且，試劑盒可包含實施陽性對照組及陰性對照組反應時所需的試劑。熟知本說明書的公開事項的本領域的技術(shù)人員能夠容易地決定在任意一個特定反應中使用的試劑的最適量。典型的是，本發(fā)明的試劑盒由包含在前面揭示的組成成分的額外的包裝或者部分而制備?？梢詫Ρ景l(fā)明的特征和優(yōu)點如下進行概括 (a)以往的實時PCR方法需要如標記探針或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)一樣復雜地變形的引物結(jié)構(gòu)，這導致難以選擇探針及引物的設計、合成或者序列。但是，就本發(fā)明的THD引物而言，沒有追加的標記探針或者復雜地變形的引物結(jié)構(gòu)地，不僅利用于靶擴增，而且還利用于信號擴增，因此相對簡單而容易地選擇用于PCR的THD引物的設計、合成或者序列。(b)不僅對引物，而且還對探針最佳化的雜交條件對以往的實時PCR反應為必需，因此難以實現(xiàn)以往的實時PCR方法的最佳化。利用具有形成發(fā)夾環(huán)的尾部的引物的以往的實時PCR方法，考慮到在引物中的發(fā)夾環(huán)形成及變形，應實現(xiàn)反應條件的最佳化。但是，本發(fā)明可以完全擺脫關(guān)于以往的實時PCR方法的最佳化的頑固性問題及缺點。(C)如在實施例7中確認，(i )作為正向引物、反向引物或者上游引物的THD引物的多種組合，或者(ii) THD引物及探針的多種組合有效地檢測靶核酸序列。(d)就以往的實時PCR方法而言，由于難以實現(xiàn)引物或者探針的設計及最佳化，因此不適于多重試驗。相反，本發(fā)明在實時PCR中，沒有追加的探針或者復雜地變形的引物結(jié)構(gòu)地，僅利用標記的引物，因此，能夠以多重方式，卓越地呈現(xiàn)實時靶檢測。(e)與以往的實時PCR探針相比較，THD引物被延長，延長的THD引物對靶核酸序列呈現(xiàn)更加高的結(jié)合力。以往的實時PCR引物需要如發(fā)夾結(jié)構(gòu)一樣復雜地變形的結(jié)構(gòu)，這妨礙與靶核酸序列結(jié)合。相反，THD引物不需要那種變形，從而具有THD引物與靶核酸序列的更好的結(jié)合效率。這一特征貢獻于基于本發(fā)明的靶檢測效率的提高。(f)本發(fā)明一般利用使用于PCR反應的引物，從而可以容易地實施實時PCR反應。簡言之，在PCR反應中生成擴增子的引物確保成功的實時PCR反應。因此，本發(fā)明在實時PCR試驗的開發(fā)中，視為改善了時間有效性及費用有效性。(g)如上所述，就在本發(fā)明中使用的具有DPO或者mDSO結(jié)構(gòu)的引物和/或探針而言，在實時PCR反應中，帶來了結(jié)合特異性的提高，由此除去關(guān)于引物和/或探針的非-靶結(jié)合的假陽性信號。下面，將通過實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明。這些實施例僅用于更加具體說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明的范圍不局限于這些實施例，這對于本發(fā)明所屬技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。實施例實施例I:靶核酸檢測中的THD引物的評價在Taq DNA聚合酶反應下，評價了本發(fā)明的THD引物與靶核酸序列進行退火，由具有5’ 一 3’核苷酸活性的模板-依賴性核酸聚合酶實施THD引物的5’ -切割反應及3’ -延長反應，而熒光報道分子從位于THD引物上的猝滅分子分離時，雙重-標記THD引物能否產(chǎn)生充分對靶核酸序列進行檢測的信號。THD引物作為報道分子具有6-羧基熒光素(6-FAM，
6-carboxy-fluorescein),作為粹滅分子具有黑洞粹滅劑(BHQ-1, Black Hole QuencherI)。標記的位點表示在寡核苷酸序列。為了對此評價進行實驗,本發(fā)明者將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因用作模板，為了確保實驗的簡便，將對于金黃色葡萄球菌(S. aureus)基因的合成 寡核苷酸用作模板。在沒有祀核酸序列的擴增的預定時間間隔(predetermined timeinterval)內(nèi)測定了信號。對于作為祀的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因的信號的產(chǎn)生及檢測的方法及結(jié)果，在說明書中進行了敘述。在本實施例中利用的合成模板及雙重-標記THD引物的序列如下SA-Tem5，-gccaataaaactaggaggaaatttaaatgttagaatttgaacaaggatttaatcatttagcgactttaaaggtcattggtgtaggtggtggcggtaacaacgccgtaaaccgaatgattgaccacggaatgaataatgttgaatttatcgctatcaacacagacggtcaagctttaaacttatctaaagctgaatctaaa-3> (SEQ ID NO 1);及SA-THD5 ’ -[6-FAM]CATTCCG[BHQl-dT]GGTCAATCATTCGGTT-3 ’(SEQ ID NO :2)。含有模板2pmole(皮摩爾)(SEQ ID NO l)U0mM MgCl2的2X主混合液10 μ I、含有Taq DNA聚合酶(索爾杰恩特公司，韓國Solgent,Korea)2單元(unit)、4種dNTPs (dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP)各 200M 及雙重-標記 THD 引物(SEQ ID NO :2) 5pmole 的 20 μ I 為最終體積實施了雙重-標記THD引物的5’ -切割反應及3’ -延長反應；將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘變性后，在55°C或者65°C下，60秒過程反復進行了 40次。檢測基于預定時間間隔(predetermined time interval)的各循環(huán)中產(chǎn)生的信號。如圖5所示，在沒有靶核酸序列的擴增的情況的反應中，也將在預定時間間隔中的突光信號，通過監(jiān)控，以對于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的突光信號的增加為實時單位進行了觀察。并且，沒有出現(xiàn)55°C (No.2XS65°C (No. 4)之間的信號差。沒有模板時，不出現(xiàn)熒光信號的變化(No. I及3)。實施例2:在用于靶核酸檢測的實時PCR反應條件下的THD引物的評價本發(fā)明者在實時PCR反應條件下，將變性、雜交、切割及延長的反復適用于dNTP的多種濃度時，還確認了 THD引物能否產(chǎn)生充分對靶核酸序列進行檢測的信號。為了對此評價進行實驗，將在本實施例I中利用的同一模板(SEQID N0:1)及雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :2)利用于實時靶信號擴增。將多種濃度的dNTP(最終濃度500M、200M、20M及0M)，以含有模板2pmole(SEQ IDNO l)UOmM MgClJMx主混合液10 μ I、Taq DNA聚合酶(索爾杰恩特公司，韓國Solgent，Korea) 2單元及含有雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :2) 5pmole的20 μ I為最終體積實施了實時靶信號擴增；將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘變性后，在94°C下、30秒及在55°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。如圖6所示，在如沒有Taq DNA聚合酶(No. I),或者沒有模板情況(NO. 2)的陰性對照組反應中沒有出現(xiàn)靶核酸序列的熒光信號擴增。這樣的結(jié)果表示，通過靶模板和THD引物的雜交或者單鏈的THD引物本身的切割，不會發(fā)生信號的擴增。另一方面，不僅在沒有dNTP的情況(NO. 6)，而且還在dNTP的其他濃度下(No. 3、4及5)也確認了靶核酸序列的熒光信號。就20M dNTP而言，Ct值最低，信號的強度最高(No. 5)，就500M dNTP而言，Ct值最高，信號的強度最低(No. 3)。因此，沒有靶核酸序列的擴增地，利用THD引物的變性、雜交、切割及延長的反復 充分都能產(chǎn)生靶熒光信號，由此，能夠?qū)崿F(xiàn)基于實時信號擴增的靶核酸序列的檢測。實施例3:在實時PCR擴增中的THD引物及探針的不同點引物及探針的最大的不同點是，探針不包含于擴增產(chǎn)物。為了確認THD引物包含于實時PCR擴增產(chǎn)物，但是探針在實時PCR條件下不包含在內(nèi)，作為正向引物利用THD弓丨物實施了檢測肺炎鏈球菌基因及腦膜炎奈瑟菌基因的實時PCR。將肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因的祀核酸序列作為模板利用時,在本實施例中利用的作為正向引物的雙重-標記THD引物、反向引物及雙重-標記探針的序列如下SP-THD5，-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQl-dT]GGGTGT-3，(SEQ ID NO :4)SP-Probe5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQl-dT]GGGTGT[Phos-Q]-3’ (SEQ ID NO :5)SP-P2 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’ (SEQ ID NO :6)含有肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)基因組 DNA 10ng、6mM MgCl2 的 2X QIAGEN 多重主混合液10 μ I、含有Taq DNA聚合酶、dNTP(QIAGEN)、雙重-標記THD引物(SEQ ID NO 4)IOpmole或者雙重-標記探針(SEQ ID NO :5)10pmole及反向引物(SEQ ID NO :6)10pmole 的20 μ I為最終體積實施了實時PCR ;將包含上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘變性后，在94°C下，30秒及在60°C下，90秒及在72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。在利用溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠中分離了擴增的PCR產(chǎn)物。如圖7所示，在實時PCR中，THD引物不僅可以通過靶信號擴增，而且還可以通過靶核酸序列的擴增得到產(chǎn)物(圖7a的No. 3)，在瓊脂糖凝膠上確認了從擴增的靶核酸序列S. pneumoniae產(chǎn)生的產(chǎn)物(圖7b的通道2)。另一方面，與THD引物不同，在利用雙重-標記探針的實時PCR中沒有出現(xiàn)任何熒光信號(圖7a的No. I )，并且在瓊脂糖凝膠上也不能確認任何產(chǎn)物(圖7b的通道I)。將腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)基因的祀核酸序列用作模板時,在本實施例中利用的作為正向引物的雙重-標記THD引物、反向引物及雙重-標記探針的序列如下
NM-THD25，-[6-FAM]TCCACCAATGGCG[BHQl-dT]ATAGCGGA-3’(SEQID NO :8)NM-Probe5’_[6-FAM]TCCACCAATGGCGTATAGCGGA[BHQla-Q]-3’(SEQID NO :9)NM-Pl 5’-CCAATCCCTATACCTTTACGTC-3’ (SEQ ID NO :10)利用含有肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)基因組 DNA 10ng、6mMMgCl2 的 2X QIAGEN多重主混合液10 μ I、Taq DNA聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有雙重-標記THD引物(SEQ IDNO:8) IOpmole 或者雙重-標記探針(SEQ ID NO :9) IOpmole 及反向引物(SEQ IDNO :10)IOpmole的20 μ I的最終體積實施了實時PCR ;將包含上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了在各循環(huán)的延長步 驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。從利用溴化乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠中分離了擴增的PCR產(chǎn)物。對于作為祀核酸的腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)基因的實時PCR擴增呈現(xiàn)與圖7類似的結(jié)果。利用THD引物的實時PCR的結(jié)果不僅表示出了靶信號的擴增，而且還表示出了靶核酸序列的擴增(圖8a的No. 3)，在瓊脂糖凝膠上檢測出腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)基因的PCR產(chǎn)物(圖8b的通道2)。但是，在利用雙重-標記探針的實時PCR中沒有出現(xiàn)任何熒光信號(圖8a的No. I)，并且，在瓊脂糖凝膠上也沒能確認靶核酸序列的任何產(chǎn)物(圖8b的通道I)。實施例4:利用THD引物的實時PCR特異度通過檢測出肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)基因及腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)基因的靶核酸序列，確認了利用THD引物的實時PCR特異度。為了本實驗，在實時PCR擴增中，將雙重-標記THD引物用作正向引物。A.對于肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的實時PCR特異度在本實施例中利用的雙重-標記THD引物及反向引物的序列如下SP-THD5，-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQl-dT]GGGTGT-3，(SEQ ID NO :4)SP-P2 5，-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’ (SEQ ID NO :6)利用含有肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)、腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)或者淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae)基因組 DNA lng、6mM MgCl2 的 2X QIAGEN 多重主混合液 10 μ I、Taq DNA聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :4)10pmole及反向引物(SEQ ID NO 6)10pmole的20 μ I的最終體積實施了實時PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。在作為靶核酸利用S. pneumoniae基因的實時PCR中，產(chǎn)生了熒光信號擴增(圖9的 No. I )，相反，不僅在如 N. gonorrhoeae (圖 9 的 No. 2)及 N. meningitidis (圖 9 的 No. 3)的非-靶核酸序列，而且還在陰性對照組(圖9的No. 4)的實時PCR中未觀察到任何熒光信號擴增。B.對于腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的實時PCR特異度
在本實施例中利用的雙重-標記THD引物及反向引物的序列如下NM-THDl5，_[6_FAM]CCATAACC[BHQl-dT]TGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3，(SEQ ID NO :7)NM-Pl 5’-CCAATCCCTATACCTTTACGTC-3’ (SEQ ID NO :10)利用含有S. pneumoniae、N. meningitidis 或者 N. gonorrhoeae 基因組 DNA lng、6mM MgCl2的2乂 QIAGEN多重主混合液10 μ l、TaqDNA聚合酶、dNTP(QIAGEN)、含有雙重-標記 THD 引物(SEQ IDNO :7) IOpmole 及反向引物(SEQ ID NO : 10) IOpmole 的 20 μ I 的最終體積實施了實時PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。 在作為靶核酸利用N. meningitidis基因的實時PCR中，產(chǎn)生了熒光信號擴增(圖10 的 No. I),相反，不僅在如 N. gonorrhoeae (圖 10 的 No. 2)及 S. pneumoniae (圖 10 的No. 3)的非-靶核酸序列，而且還在陰性對照組(圖10的No. 4)的實時PCR中未觀察到任何熒光信號擴增。實施例5:利用THD引物的實時PCR靈敏度通過檢測S. pneumoniae基因及N. meningitidis基因的祀核酸序列,來確認了利用THD引物的實時PCR靈敏度。為了本實驗，在實時PCR擴增中，將雙重-標記THD引物用作正向引物。A.對于肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)的實時PCR靈敏度在本實施例中利用的雙重-標記THD引物及反向引物的序列如下SP-THD5，-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQl-dT]GGGTGT-3，(SEQ ID NO :4)SP-P2 5，-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’ (SEQ ID NO :6)利用含有一連的稀釋的S. pneumoniae 基因組 DNA (10ng、lng、100pg、10pg、Ipg 或者 0. lpg)、6mM MgCl2 的 2X QIAGEN 多重主混合液 10 μ l、Taq DNA 聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :4) IOpmole及反向引物(SEQ ID NO :6) IOpmole的20 μ I的最終體積實施了實時PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C )中產(chǎn)生的信號。如圖11所示,利用從IOng開始一連稀釋的S. pneumoniae基因組DNA來實施實時PCR的情況，直到稀釋到0. Ipg情況也檢測到了靶核酸序列(No. 1-6)。B.對于腦膜炎奈瑟菌(N. meningitidis)的實時PCR靈敏度在本實施例中利用的雙重-標記THD引物及反向引物的序列如下NM-THDl5，_[6_FAM]CCATAACC[BHQl-dT]TGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3，(SEQ ID NO :7)NM-Pl 5’-CCAATCCCTATACCTTTACGTC-3’ (SEQ ID NO :10)利用含有一連的稀釋的N. meningitidis 基因組 DNA (10ng、lng、100pg、10pg、Ipg或者 O. lpg)、6mM MgCl2 的2乂 QIAGEN多重主混合液 10 μ l、Taq DNA聚合酶、dNTP(QIAGEN)、含有雙重-標記 THD 引物(SEQ ID NO :7) IOpmole 及反向引物(SEQ ID NO :10) IOpmole的20 μ I的最終體積實施實時PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 40次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C )中產(chǎn)生的信號。如圖12所示,利用從IOng開始一連稀釋的N. meningitidis基因組DNA來實施實時PCR的情況，直到稀釋到O. Ipg情況也檢測到了靶核酸序列(No. 1-6)。實施例6:利用THD引物的嵌套實時PCR通過檢測S. pneumoniae基因的祀核酸序列，還確認了利用THD引物的嵌套(Nested)實時PCR的特異度及靈敏度。為了本實驗，在實時PCR擴增中，將雙重-標記THD引物用作正向引物。A.嵌套實時PCR的特異度本實施例中，利用于第一次PCR的正向引物及反向弓丨物的序列和利用于嵌套實時PCR的雙重-標記THD引物的序列如下SP-Pl 5，-TTGACCACTTCGCTATTTCC-3，(SEQ ID NO 3)SP-THD5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT/BHQl-dT/GGGTGT-3，(SEQ ID NO :4)SP-P2 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’ (SEQ ID NO :6)利用含有S. pneumoniae、N. meningitidis 或者 N. gonorrhoeae 基因組 DNA 10ng、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10 μ I、TaqDNA聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有正向引物(SEQ ID NO :3) IOpmole及反向引物(SEQ ID NO :6) IOpmole的20 μ I的最終體積實施了第一次PCR擴增；將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(ΑΒΙ9700，ABI);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 30次。利用含有第一次PCR產(chǎn)物2 μ l、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10 μ l.TaqDNA聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :4) 5pmole及反向引物(SEQ ID NO 6) 5pmole的20 μ I的最終體積實施嵌套實時PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 20次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。如圖13所示,在對于作為祀核酸的S. pneumoniae (No. I)的實時PCR中確認到了信號，但是在對于作為非-革巴核酸的N. gonorrhoeae (No. 2)及N. meningitidis (No. 3)和沒有模板的陰性對照組(No. 4)的實時PCR中沒有出現(xiàn)任何信號。B.嵌套實時PCR的靈敏度在本實施例中利用的正向引物、反向引物及雙重-標記THD引物的序列如下利用了在對于嵌套實時PCR的特異度的實施例6A中利用的，第一次PCR用正向引物及反向引物的序列以及與嵌套實時PCR用雙重-標記THD引物的序列相同的序列。利用含有一連的稀釋的S. pneumoniae 基因組 DNA (10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg 或者 lfg)、6mM MgCl2 的 2X QIAGEN 多重主混合液 10 μ l、Taq DNA 聚合酶、dNTP(QIAGEN)、含有正向引物(SEQ ID NO :3) IOpmole 及反向引物(SEQ ID NO :6) IOpmole 的20 μ I的最終體積實施了第一次PCR擴增；將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(ΑΒΙ9700, ABI);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 30次。利用含有PCR 產(chǎn)物 2 μ l、6mM MgCl2 的 2X QIAGEN 多重主混合液 10 μ I、Taq DNA聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :4)5pmole及反向引物(SEQID NO 6)5pmole的20 μ I的最終體積實施了嵌套實時PCR ;將含有上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 20次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。如圖14所示，利用從IOng開始一連稀釋的作為祀模板的S. pneumoniae基因組DNA來實施實時PCR時，直到稀釋到IOfg基因組DNA濃度情況也檢測到了靶核酸序列 (No. 1-7)。實施例7:利用THD引物的多種組合的實時PCR在分子信標、發(fā)卡式引物或者蝎形引物中，沒有如發(fā)夾莖區(qū)的任何結(jié)構(gòu)變形地，能夠?qū)⒊Ｒ?guī)的引物作為雙重功能利用于實時PCR，這通過本發(fā)明第一次提出第一功能為互補的序列的合成，第二功能為表示靶核酸序列的信號的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明者在實時PCR擴增中適用了 THD引物的多種組合，這是THD引物的最大的優(yōu)點之一。為了本實驗，將N. gonorrhoeae基因用作靶核酸模板。THD引物具有DPO結(jié)構(gòu)或者包含雙重標記的以往的結(jié)構(gòu)。在本實施例中利用的雙重-標記THD引物及引物的序列如下NG-Pl5， -CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3， (SEQIDN0:11)NG-THDl5，_[6_FAM]CAATGGATCGG[BHQl-dT]ATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3， (SEQ ID NO:12)NG-P2 5，-ATTGGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3’ (SEQ IDNO :13)NG-THD25’-[6-FAM]ATTGGCGTGTTTCGCATA[BHQl-dT]TTAAG-3’ (SEQID NO :14)NG-Probe5，-[6-FAM]ATTGGCGTGTTTCGCATA[BHQl-dT]TTAAG[Phos-Q]-3’ (SEQ ID NO :15)NG-P35’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(SEQID NO :16)NG-THD35，-[6-FAM]TACGCCTGCTAC[BHQl-dT]TTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’ (SEQ ID NO:17)A.作為正向引物的雙重-標記THD引物、作為反向引物的雙重-標記THD引物或者該兩個組合
利用含有N. gonorrhoeae基因組DNA lng、6mM MgCl2的2XQIAGEN多重主混合液
10μ l.Taq DNA聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有作為正向引物的雙重-標記THD引物(SEQ IDNO 12) lOpmole、作為反向引物的雙重-標記THD引物(SEQ ID NO 17) IOpmole或者該兩個組合(SEQ ID NO :12及17)及作為正向引物的引物(SEQID NO :11) IOpmole或者作為反向引物的引物(SEQ ID NO :16)10 111016的2(^1的最終體積實施了實時PCR ;將包含上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad);將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了40次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。B.雙重-標記THD引物及雙重-標記內(nèi)部探針的組合除了使用雙重-標記內(nèi)部探針以外，雙重-標記THD引物的組合及實時PCR反應與實施例 7A 相同(5pmole，SEQ ID NO 15)0C.作為正向引物的雙重-標記THD引物及反向引物和/或上游引物的組合除了使用作為正向引物的雙重-標記THD引物(5pmole，SEQ IDNO :14)及上游雙重-標記 THD 引物(lOpmole，SEQ ID NO : 12)或者上游引物(lOpmole，SEQ ID NO :11)以夕卜，與實施例7A相同地實施了實時PCR反應。D.內(nèi)部非標記引物及雙重-標記THD引物的組合就實時PCR反應而言，除了使用內(nèi)部引物以夕卜，與在實施例7A利用的相同(lOpmole, SEQ ID NO :13)。如圖15-18所示，就實時PCR擴增而言，實時信號擴增及靶核酸序列擴增表示出多種THD引物組合的可適用性。實施例8:在實時PCR中，Taq Man探針方法與THD引物方法的比較為了調(diào)查信號的機制,本發(fā)明者利用作為祀核酸模板的N. gonorrhoeae基因，通過Taq Man實時PCR方法，對利用THD引物的本發(fā)明的實時PCR方法進行了比較。THD引物具有包含雙重標記的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)。本實施例中利用的雙重-標記THD引物、Taq Man探針及引物的序列如下NG-Pl5， -CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3， (SEQ ID NO:11)NG-THDl5’ _[6_FAM]CAATGGATCGG[BHQl-dT]ATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’ (SEQ IDNO:12)NG-P2 5，-ATTGGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3’ (SEQ IDNO :13)NG-Probe5’-[6-FAM]ATTGGCGTGTTTCGCATA[BHQl-dT]TTAAG[Phos-Q]-3’ (SEQ ID NO :15)NG-P35’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(SEQID NO :16)NG-THD35，-[6-FAM]TACGCCTGCTAC[BHQl-dT]TTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’ (SEQ ID NO:17)利用含有N. gonorrhoeae基因組DNA lng、6mM MgCl2的2XQIAGEN多重主混合液10 μ l.Taq DNA 聚合酶、dNTP (QIAGEN)、含有作為正向引物的引物(SEQ ID NO ll)10pmole或者雙重-標記THD引物(SEQ ID NO :12) lOpmole、作為反向引物的引物(SEQ IDNO :16)IOpmole或者雙重-標記THD引物(SEQ ID NO : 17)或者作為內(nèi)部探針/引物的Taq Man探針(SEQ ID NO :15)5pmole或者內(nèi)部引物(SEQ ID NO : 13)5pmole的20 μ I的最終體積實施了實時PCR;將包含上述反應混合物的管位于實時熱循環(huán)儀(CFX96，伯樂公司=Bio-Rad)；將上述反應混合物在95°C中進行10分鐘的變性后，在94°C下30秒、60°C下90秒及72°C下90秒的過程反復進行了 20次。檢測了在各循環(huán)的延長步驟(72°C)中產(chǎn)生的信號。如圖19所示，證明出多種THD引物組合對靶核酸序列進行擴增的情況。但是，一般而言，即時沒有Taq Man探針方法(No. 4)中要求的雙重-標記探針時，信號擴增也能更加有效地發(fā)生(No. 2、3、5及6)。S卩，與Taq Man探針反應相比較，不僅呈現(xiàn)更低的Ct值，而且還呈現(xiàn)出更高的強度的熒光信號。因此，與以往Taq Man探針方法不同地，僅利用設計成能夠使靶核酸序列擴增的引物，可以更加有效地擴增靶信號及靶核酸序列。對本發(fā)明的優(yōu)選實例進行了詳細記述，可以進行根據(jù)本發(fā)明的原理的變形及修 正，本發(fā)明的范圍借助所附的權(quán)利要求和與其均等的內(nèi)容而定義，這對于本發(fā)明所屬的技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種利用靶雜交及檢測引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下的步驟 步驟(a)，對上述靶核酸序列與上述靶雜交及檢測引物進行雜交，上述靶雜交及檢測引物包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記； 步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述靶雜交及檢測引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一 3’核酸酶活性而切割，從而上述靶雜交及檢測引物放出上述標記或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及， 步驟(c )，對上述信號進行檢測，上述信號表示上述靶核酸序列的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)借助(i)上述靶雜交及檢測引物以及(ii)利用標記探針來實施；上述標記探針使其3’-末端發(fā)生變形來防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，上述靶雜交及檢測引物進行雜交的位點的下游位點進行雜交，且，在步驟(b)中被切割而放出與上述標記探針連接的標記。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)借助(i)上述靶雜交及檢測引物以及(ii)利用上游引物或者下游引物來實施；上述上游引物與上述靶雜交及檢測引物雜交的位點的上游位點進行雜交，并且，與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向；上述下游引物與上述靶雜交及檢測引物雜交的位點的下游位點進行雜交，且與上述靶雜交及檢測弓I物具有相同的方向。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在反復循環(huán)之間包括變性過程，還包括至少反復進行兩次上述步驟(a)_步驟(b)或者步驟(a)-步驟(c)的步驟，以便擴增用于表示靶核酸序列存在的信號。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(c)的上述檢測以實時方式、終-點方式或者預定時間間隔方式來實施。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物，具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)或具有以下通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu) . 5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位；Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位；&為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發(fā)部位；P、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位以及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高； .5， -2，「3，(II) 上述通式中，X’p為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第二次引發(fā)部位；Y’q為包含三個以上的通用堿基的分離部位；Z\為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的.3’ -第一次引發(fā)部位；p、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X’、Y’以及Z’為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第二次引發(fā)部位的Tm低于3’ -第一次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述X’、Y’以及Ζ’三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第二次引發(fā)部位從上述3’ -第一次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第二次引發(fā)部位以及上述3’ -第一次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物具有上述權(quán)利要求6的通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述標記探針具有上述權(quán)利要求6的通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下 游引物具有上述權(quán)利要求6的通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’ -末端部位包含至少一個標記。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’ -末端包含至少一個標記。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及.3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述標記為化學標記、酶標記、放射性標記、突光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或者金屬標記。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述相互作用性標記系統(tǒng)為一對的熒光報道分子以及猝滅分子，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物上，以便對上述報道分子的熒光進行猝滅，上述兩個標記通過發(fā)生核酸酶切割的靶雜交及檢測引物內(nèi)的某一位點而分離，由此上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一3’核酸酶活性，通過上述位點中的切割反應從上述猝滅分子中分離出上述報道分子，以便產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列的存在的上述信號。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述熒光報道分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述猝滅分子位于上述熒光報道分子的下游位點。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述熒光報道分子位于上述猝滅分子的下游位點。
16.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述標記探針連接的上述標記不同于與上述靶雜交及檢測引物連接的標記。
17.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有步驟(b)中放出的標記。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述上游引物或者下游引物連接的上述標記不同于與上述靶雜交及檢測引物進行連接的標記。
19.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，具有5’ 一 3’核酸酶活性的上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有5’ 一 3’核酸酶活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測弓I物包含至少兩種引物。
21.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測引物包含至少兩種引物，上述標記探針包含至少兩種探針。
22.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測引物包含至少兩種引物，上述上游引物或者上述下游引物包含至少兩種引物。
23.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
24.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
25.一種利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下的步驟步驟(a)，對上述靶核酸序列與一對弓I物進行雜交，上述一對弓I物由能夠?qū)ι鲜霭泻怂嵝蛄羞M行擴增的正向引物以及反向引物組成，這些引物中的至少一個引物為上述靶雜交及檢測引物；上述靶雜交及檢測弓I物包含(i )雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記； 步驟(b)，借助模板-依賴性核酸聚合酶發(fā)生上述靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的條件下，將上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’一 3’核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶進行接觸，上述靶雜交及檢測引物借助上述模板依賴性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延長，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的上述5’ 一3’核酸酶活性所切割，使得上述兩個引物中的上述靶雜交及檢測引物中放出上述標記或上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號； 步驟(c)，使步驟(b)的上述結(jié)果物變形； 步驟(d)，至少反復兩次上述步驟(a)_步驟(C)，用于對上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的上述所有信號進行擴增；以及， 步驟(e)，用于檢測表示靶核酸序列存在的上述信號；上述檢測在步驟(d)的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(d)的上述反復的終點或者上述反復期間的各個預定時間間隔內(nèi)實施，這些信號表示靶核酸序列的存在。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)利用追加的標記探針來實施；上述標記探針，其通過3’ -末端發(fā)生變性來防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，在上述兩個引物之間的某一位點進行雜交，并且，在步驟(b)中被切割而放出與上述標記探針連接的標記。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)追加利用上游引物或者下游引物來實施；上述上游引物與上述靶雜交及檢測引物進行雜交的位點的上游位點進行雜交，且與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向；上述下游引物與上述兩個引物之間的某一位點進行雜交，且與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向。
28.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)利用具有與靶雜交及檢測引物的方向相反的方向的至少一個追加引物來實施。
29.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)或具有以下通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu) .5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位；Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位，&為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發(fā)部位；P、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位以及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高； .5， -2，「3，(II) 上述通式中，X’p為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第二次引發(fā)部位；Y’q為包含三個以上的通用堿基的分離部位，Z’r為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第一次引發(fā)部位；p、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X’、Y’以及Z’為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第二次引發(fā)部位的Tm低于3’ -第一次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述X’ p、Y’，以及三個區(qū)域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第二次引發(fā)部位從上述3’ -第一次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第二次引發(fā)部位以及上述3’ -第一次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物具有上述權(quán)利要求29的通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
31.根據(jù)權(quán)利要求25至27以及29中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述兩個引物中非靶雜交及檢測引物的另一個引物具有上述權(quán)利要求29的通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸(DPO)結(jié)構(gòu)。
32.根據(jù)權(quán)利要求26所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述標記探針具有上述權(quán)利要求29的通式II的變性雙重特異性寡核苷酸(mDSO)結(jié)構(gòu)。
33.根據(jù)權(quán)利要求27所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有上述權(quán)利要求29的通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
34.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’ -末端部位包含至少一個標記。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’ -末端包含至少一個標記。
36.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述標記為化學標記、酶標記、放射性標記、突光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或者金屬標記。
37.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述相互作用性標記系統(tǒng)為一對的熒光報道分子以及猝滅分子，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物上，以便對上述報道分子的熒光進行猝滅，并且，上述兩個標記通過發(fā)生核酸酶切割的靶雜交及檢測引物內(nèi)的某一位點而分離，由此上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性通過上述位點上的切割反應從上述猝滅分子分離上述報道分子，以便產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信號。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述熒光報道分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述猝滅分子位于上述熒光報道分子的下游位點。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述熒光報道分子位于上述猝滅分子的下游位點。
40.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述兩個引物均具有步驟(b)中放出的標記。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述兩個引物連接的上述標記為互不相同的標記。
42.根據(jù)權(quán)利要求26所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述標記探針連接的上述標記不同于與上述靶雜交及檢測弓I物連接的標記。
43.根據(jù)權(quán)利要求27所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有步驟(b)中放出的標記。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述上游引物或者上述下游弓I物連接的上述標記不同于與上述靶雜交及檢測弓I物連接的標記。
45.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，具有5’ 一 3’核酸酶活性的上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有5’ 一 3’核酸酶活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
46.根據(jù)權(quán)利要求25所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序包含至少兩種核酸序列，作為上述正向引物以及上述反向引物的上述兩個引物各包含至少兩種引物。
47.根據(jù)權(quán)利要求26所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，作為上述正向引物以及上述反向引物的上述兩個引物各包含至少兩種引物，上述標記探針包含至少兩種探針。
48.根據(jù)權(quán)利要求27所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，作為上述正向引物以及上述反向引物的上述兩個引物各包含至少兩種引物，上述上游引物或者下游引物包含至少兩種引物。
49.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包括核苷酸變異。
50.根據(jù)權(quán)利要求25至27中的任一項所述的利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
51.一種利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟(a)，準備包含上述靶核酸序列、一對引物以及具有5’ 一3’外切核酸酶活性的模板-依賴性核酸聚合酶的PCR混合物，上述一對引物包含可擴增出上述靶核酸序列的正向引物及反向引物，其中，至少一個引物為上述靶雜交及檢測引物；上述靶雜交及檢測引物包含(i )雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補，以及(i i ) 一對的熒光報道分子以及猝滅分子；上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物上，以便對上述報道分子的熒光進行猝滅；上述兩個標記通過發(fā)生核酸酶切割的靶雜交及檢測引物內(nèi)的一個位點而分離，以此上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性通過上述位點上的切割反應來將上述報道分子從上述猝滅分子中分離出，以便產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信號； 步驟(b )，利用上述PCR混合物來對上述靶核酸序列進行擴增，將引物退火、引物延長以及變性至少實施兩次，上述兩個引物借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，以此對靶核酸序列進行擴增，并且借助上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性所切割，來從兩個引物中的上述靶雜交及檢測引物中放出上述報道分子或者上述猝滅分子，以此產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的信號；以及， 步驟(c )，檢測用于表示上述靶核酸序列存在的上述熒光信號，上述檢測在步驟(b )的上述反復的各循環(huán)中，在步驟(c)的上述反復的終點或者上述反復期間各個預定時間間隔內(nèi)實施，這些信號表不祀核酸序列的存在。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)追加利用標記探針來實施，上述標記探針使其3’ -末端發(fā)生變形來防止模板-依賴性核酸聚合酶引起的延長，在上述兩個引物之間的某一位點進行雜交，在步驟(b)中被切割而放出與上述標記探針連接的標記。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)通過追加利用上游引物或者下游引物來實施；上述上游引物與上述靶雜交及檢測引物雜交的位點的上游位點進行雜交，且與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向；上述下游引物與上述兩個引物之間的某一位點進行雜交，且與上述靶雜交及檢測引物具有相同的方向。
54.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步驟(a)利用具有與靶雜交及檢測引物的方向相反的方向的至少一個追加引物來實施。
55.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)或具有以下通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu) · 5，-Xp-Yq-ZrI，(I) 上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位；Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位；&為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發(fā)部位；P、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位以及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高； ·5， -2，「3，(II) 上述通式中，X’p為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第二次引發(fā)部位；Y’q為包含三個以上的通用堿基的分離部位；Z\為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3’ -第一次引發(fā)部位；p、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X’、Y’以及Z’為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第二次引發(fā)部位的Tm低于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述X’ p、Y’，以及三個區(qū)域中具有最低的Tm ;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第二次引發(fā)部位從上述3’ -第一次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第二次引發(fā)部位以及上述3’ -第一次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物具有權(quán)利要求55的上述通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
57.根據(jù)權(quán)利要求51至53及55中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’ -切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述兩個引物中，非靶雜交及檢測引物的另一個引物具有權(quán)利要求55的上述通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
58.根據(jù)權(quán)利要求52所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述標記探針具有權(quán)利要求55的上述通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
59.根據(jù)權(quán)利要求53所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有權(quán)利要求55的上述通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
60.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’ -末端部位包含至少一個標記。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’ -末端包含至少一個標記。
62.根據(jù)權(quán)利要求51所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述熒光報道分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述猝滅分子位于上述熒光報道分子的下游位點。
63.根據(jù)權(quán)利要求51所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，并且，上述熒光報道分子位于上述熒光報道分子的下游位點。
64.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述兩個引物均具有步驟(b)中放出的標記。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延 長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述兩個引物連接的上述標記為互不相同的標記。
66.根據(jù)權(quán)利要求52所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述標記探針連接的上述標記不同于與上述祀雜交及檢測引物連接的標記。
67.根據(jù)權(quán)利要求53所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有步驟(b)中放出的標記。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，與上述上游引物或者上述下游引物連接的上述標記不同于與上述靶雜交及檢測引物連接的標記。
69.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，具有5’ 一 3’核酸酶活性的上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有5’ 一 3’核酸酶活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
70.根據(jù)權(quán)利要求51所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，作為上述正向引物以及上述反向引物的上述兩個引物各包含至少兩種引物。
71.根據(jù)權(quán)利要求52所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，作為上述正向引物以及上述反向引物的上述兩個引物各包含至少兩種引物，上述標記探針具有至少兩種探針。
72.根據(jù)權(quán)利要求53所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，作為上述正向引物以及上述反向引物的上述兩個引物各包含至少兩種引物，上述上游引物或者下游引物包含至少兩種引物。
73.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
74.根據(jù)權(quán)利要求51至53中的任一項所述的利用伴隨有靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’ -延長反應的聚合酶連鎖反應，從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
75.一種利用靶雜交及檢測引物的5’-切割反應以及3’-延長反應來從DNA或者核酸混合物中檢測靶核酸序列的試劑盒，其特征在于，包括 (a)靶雜交及檢測引物，其包含(i)雜交核苷酸序列，其與上述靶核酸序列互補；以及(ii)相互作用性標記系統(tǒng)，其包含一個標記或者多個標記；以及 (b)模板-依賴性核酸聚合酶，其具有5’一 3’核酸酶活性；上述靶雜交及檢測引物與上述靶核酸序列進行雜交的情況下，上述靶雜交及檢測引物借助上述核酸聚合酶的聚合酶活性而延長，上述靶雜交及檢測引物借助上述核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性所切割，從上述靶雜交及檢測引物放出上述標記或者上述相互作用性標記系統(tǒng)的至少一個標記，以此產(chǎn)生用于表不上述IE核酸序列存在的信號。
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的試劑盒，其特征在于，上述試劑盒還包括至少一個追加引物、標記探針或者這些組合。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的試劑盒，其特征在于，上述至少一個追加引物包含相互作用性標記的系統(tǒng)，該相互作用性標記的系統(tǒng)包含一個標記或者多個標記。
78.根據(jù)權(quán)利要求75所述的試劑盒，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物具有以下通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)或具有以下通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu) 上述通式中，Xp為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第一次引發(fā)部位；Yq為包含三個以上的通用堿基的分離部位；&為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的3，-第二次引發(fā)部位；P、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X、Y以及Z為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第一次引發(fā)部位的Tm高于3’ -第二次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第一次引發(fā)部位從上述3’ -第二次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第一次引發(fā)部位以及上述3’ -第二次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高；上述通式中，X’p為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的5’ -第二次引發(fā)部位；Y’q為包含三個以上的通用堿基的分離部位；Z\為具有與靶序列互補的雜交核苷酸序列的·3’ -第一次引發(fā)部位；p、q以及r表示核苷酸的數(shù)量，X’、Y’以及Z’為脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’ -第二次引發(fā)部位的Tm低于3’ -第一次引發(fā)部位的Tm，上述分離部位在上述X’ p、Y’，及三個區(qū)域中具有最低的Tm;上述分離部位在針對靶核酸的退火方面，使上述5’ -第二次引發(fā)部位從上述3’ -第一次引發(fā)部位分離，由此上述寡核苷酸的上述退火特異性借助上述5’ -第二次引發(fā)部位以及上述3’ -第一次引發(fā)部位來雙重性地決定，其結(jié)果，使上述靶雜交及檢測引物的整體雜交特異性得到提高。
79.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的試劑盒，其特征在于，上述至少一個追加引物具有上述權(quán)利要求78的通式I的雙重引發(fā)寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
80.根據(jù)權(quán)利要求76所述的試劑盒，其特征在于，上述標記探針具有上述權(quán)利要求78的通式II的變性雙重特異性寡核苷酸結(jié)構(gòu)。
81.根據(jù)權(quán)利要求75所述的試劑盒，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’-末端部位包含至少一個標記。
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的試劑盒，其特征在于，上述靶雜交及檢測引物在其5’-末端包含至少一個標記。
83.根據(jù)權(quán)利要求75或者77所述的試劑盒，其特征在于，上述標記為化學標記、酶標記、放射性標記、突光標記、發(fā)光標記、化學發(fā)光標記或者金屬標記。
84.根據(jù)權(quán)利要求75或者77所述的試劑盒，其特征在于，上述相互作用性標記系統(tǒng)為一對的熒光報道分子以及猝滅分子，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物上，以便對上述報道分子的熒光進行猝滅，并且，上述兩個標記通過發(fā)生核酸酶切割的靶雜交及檢測引物內(nèi)的某一位點而分離，由此上述模板-依賴性核酸聚合酶的5’ 一 3’核酸酶活性通過上述位點上的切割反應從上述猝滅分子分離上述報道分子，以便產(chǎn)生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信號。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的試劑盒，其特征在于，上述熒光報道分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述猝滅分子位于上述熒光報道分子的下游位點。
86.根據(jù)權(quán)利要求84所述的試劑盒，其特征在于，上述猝滅分子位于上述靶雜交及檢測引物的5’ -末端部位，上述熒光報道分子位于上述猝滅分子的下游位點。
87.根據(jù)權(quán)利要求75或者77中的任一項所述的試劑盒，其特征在于，具有5’一 3’核酸酶活性的上述模板-依賴性核酸聚合酶為具有5’ 一 3’核酸酶活性的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。
88.根據(jù)權(quán)利要求76或者77所述的試劑盒，其特征在于，上述追加引物(多個引物)和/或與上述標記探針連接的上述標記不同于與上述祀雜交及檢測弓I物連接的標記。
89.根據(jù)權(quán)利要求75所述的試劑盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測引物包含至少兩種引物。
90.根據(jù)權(quán)利要求76所述的試劑盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測引物包含至少兩種引物，上述追加的各個引物(多個引物)包含至少兩種引物。
91.根據(jù)權(quán)利要求76所述的試劑盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測引物包含至少兩種引物，上述標記探針包含至少兩種探針。
92.根據(jù)權(quán)利要求76所述的試劑盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少兩種核酸序列，上述靶雜交及檢測引物包含至少兩種引物，且，上述追加的各個引物(多個引物)包含至少兩種引物，上述標記探針包含至少兩種探針。
93.根據(jù)權(quán)利要求75至77中的任一項所述的試劑盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸變異。
94.根據(jù)權(quán)利要求75至77中的任一項所述的試劑盒，其特征在于，上述靶核酸序列為預-擴增的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用靶雜交及檢測引物(THD primer)的靶核酸序列的檢測。本發(fā)明將對PCR(聚合酶鏈式反應)反應中使用的引物引入標記，使靶以及信號均得到擴增，并無需使用復雜的寡核苷酸，利用PCR(聚合酶鏈式反應)反應也可進行實時靶檢測。本發(fā)明擺脫以往的實時PCR(聚合酶鏈式反應)方法的頑固的問題以及缺點。本發(fā)明僅利用標記引物成功的進行實時靶檢測。利用這些本發(fā)明的特征，在多路傳輸方式中可進行優(yōu)秀的實時靶檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102782150SQ200980163265
公開日2012年11月14日 申請日期2009年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月7日
發(fā)明者千鐘潤, 李榮祚, 黃仁澤 申請人:Seegene株式會社