專利名稱：擴(kuò)增重復(fù)核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增靶核酸，特別是直接擴(kuò)增重復(fù)核酸序列的組合物和方法。
背景技術(shù)：
在醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)、遺傳分析和公共衛(wèi)生的眾多應(yīng)用中，檢測(cè)靶核酸的存在是非常重要的。例如，對(duì)于診斷遺傳疾病、確定對(duì)疾病的易感性和鑒定傳染病的病原體(causal agents)來說，鑒定特定的DNA序列是關(guān)鍵的。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)選擇性地?cái)U(kuò)增靶核酸，提供一種高度靈敏的檢測(cè)靶核酸存在的方法。該方法取決于雜交到靶核酸片段的相反端的寡核苷酸引物，擴(kuò)增子的使用和由聚合酶引發(fā)核酸片段的復(fù)制。DNA合成、變性和重退火的反復(fù)循環(huán)可以指數(shù)性地?cái)U(kuò)增特定的靶核酸。
擴(kuò)增反應(yīng)成功與否，引物選擇是主要的決定因素。關(guān)鍵的因素包括引物長度、解鏈溫度(Tm)、序列特異性、互補(bǔ)引物序列、G/C含量，和3’末端區(qū)域的序列。總之，引物必須特異地與靶核酸雜交，但是不雜交和擴(kuò)增非靶核酸序列。
當(dāng)引物的3’末端與另一引物互補(bǔ)時(shí)，擴(kuò)增非靶核酸帶來了麻煩。這些引物將會(huì)相互雜交，然后被聚合酶延伸以形成“引物-二聚體”產(chǎn)物。引物-二聚體接著擴(kuò)增導(dǎo)致引物損耗，使得靈敏度下降或甚至不能擴(kuò)增預(yù)定的靶核酸。在限制引物-引物雜交的溫度下進(jìn)行引物延伸或預(yù)擴(kuò)增退火(如，“熱啟動(dòng)”PCR，D’Aquila，R.T.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)193749(1991)；“降落(touchdown)”PCR，Don，.H.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)194008(1991))或調(diào)整緩沖液的成分來提高雜交嚴(yán)緊性可能會(huì)最小化引物-二聚體的干擾。但是，在PCR反應(yīng)中存在過量的引物使得既便是3’末端區(qū)域微弱互補(bǔ)性也生成這些干擾副產(chǎn)物。
雖然選擇靶核酸的不同區(qū)域來篩選引物給限制非靶核酸的被動(dòng)擴(kuò)增提供了基礎(chǔ)，但是對(duì)篩選用于產(chǎn)生引物的序列的限定限制了對(duì)可替代的引物設(shè)計(jì)的選擇。例如，直接擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列如端粒重復(fù)是困難的，這是由于這些序列的引物總是具有一定程度的互補(bǔ)性。這些重復(fù)序列一般不具有限制引物-二聚體產(chǎn)物形成的引物序列。因此，當(dāng)前用于評(píng)估端粒長度的方法依賴限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA，接著與重復(fù)序列雜交(末端限制性片段分析；見Harley，C.B.等自然(Nature)345458-460(1990))，用位于重復(fù)區(qū)外的特定序列間接地?cái)U(kuò)增重復(fù)序列(見Kozlowski，M.R.等，美國專利第5,741,677)，熒光原位雜交(見Henderson，S.細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)1341-12(1996))，或流速細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(見Hultdin，M.核酸研究(Nucleic AcidsRes.)263651-3656(1998))?？傊?，這些操作耗時(shí)或者需要相當(dāng)多的DNA。由于端粒重復(fù)的拷貝數(shù)和細(xì)胞中的其它串聯(lián)重復(fù)序列與細(xì)胞的生理或疾病狀態(tài)相關(guān)，需要用于快速擴(kuò)增和量化這些序列并且在擴(kuò)增中通常能避免競(jìng)爭(zhēng)性的引物-二聚體副反應(yīng)的組合物和方法。
發(fā)明概述按照上述目的，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增靶核酸而限制非靶核酸被動(dòng)擴(kuò)增的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括將包含基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中第一引物雜交到靶核酸的第一條鏈而第二引物雜交到靶核酸的第二條鏈，和其中當(dāng)雜交到各自的鏈時(shí)被雜交的引物能夠引物延伸。第一引物的至少一個(gè)核苷酸被改變以使當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)在被改變的殘基與第二引物的3’末端核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配。靶核酸主要是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被擴(kuò)增。
在另一個(gè)方面，用于擴(kuò)增靶核酸的方法還包括改變第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基來使得引物相互雜交時(shí)第二引物上被改變的殘基與第一引物的3’末端核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供擴(kuò)增靶核酸的重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)單位的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將包含基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中第一引物雜交到靶核酸的第一條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位上而第二引物雜交到靶核酸的第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位上，和其中雜交到各自的鏈時(shí)被雜交的引物能夠引物延伸(primer extention)。第一引物的至少一個(gè)核苷酸被改變以在被改變的殘基與第一條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)被改變的殘基還與第二引物的3’末端核苷酸產(chǎn)生錯(cuò)配。靶核酸隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被擴(kuò)增。
在另一個(gè)方面，用于擴(kuò)增重復(fù)序列的方法還包括改變第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基來使得在被改變的殘基和第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)引物相互雜交時(shí)第二引物上的被改變的殘基還與第一引物的3’末端核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
在另一個(gè)用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)單位的優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包含將基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈與第一引物和第二引物接觸，其中第一引物雜交到靶核酸的第一條鏈的一個(gè)以上重復(fù)單位上而第二引物雜交到靶核酸的第二條鏈的一個(gè)以上重復(fù)單位上，和其中雜交到各自鏈時(shí)被雜交的引物能夠引物延伸。第一引物的核苷酸殘基被改變以使在被改變的殘基與第一條鏈的各個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)被改變的殘基還與第二引物的3’末端核苷酸產(chǎn)生錯(cuò)配。然后靶核酸被擴(kuò)增。
在另一個(gè)方面，用于擴(kuò)增重復(fù)序列的方法還包含改變第二引物的核苷酸殘基來在被改變的殘基與第二條鏈的各個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)引物相互雜交時(shí)第二引物上被改變的殘基還與第一引物的3’末端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過測(cè)定被擴(kuò)增的靶核酸的數(shù)量來確定靶核酸如端粒的重復(fù)區(qū)中重復(fù)單位的數(shù)量的方法。這些方法可應(yīng)用于癌癥診斷和細(xì)胞衰老的檢測(cè)。
按照所述的方法，本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增受體(subject)靶核酸，包括端粒重復(fù)區(qū)域的組合物。
附圖描述附

圖1描述寡核苷酸引物對(duì)tel1和tel2的序列，被用于擴(kuò)增人端粒重復(fù)單位。所示的是引物與端粒重復(fù)序列的雜交方案和引物之間的雜交。tel-1引物能與沿著端粒DNA鏈朝向著絲粒的從5’到3’的任何可得到互補(bǔ)的31個(gè)堿基對(duì)序列雜交。tel-2引物能與沿著該鏈朝向染色體末端的從5’到3’的任何可得到互補(bǔ)的31個(gè)堿基對(duì)序列雜交。對(duì)于每條引物，核苷酸殘基被改變來在被改變的殘基與引物所雜交的各個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。因此，對(duì)于tel1和tel2來說，每第6個(gè)堿基(everysixth base)被錯(cuò)配。為了限制引物-二聚體產(chǎn)物，當(dāng)引物相互雜交時(shí)每條引物上被改變的殘基還與其它引物3’末端的核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配，從而阻斷通過聚合酶的延伸。此外，引物的5’末端區(qū)被設(shè)計(jì)使得不與端粒重復(fù)發(fā)生堿基對(duì)。這些非互補(bǔ)性的5’末端區(qū)序列防止PCR產(chǎn)物的3’末端在端粒擴(kuò)增生產(chǎn)中起始DNA合成。通過設(shè)計(jì)具有相似GC含量和類似Tms的端粒特異性引物(見實(shí)施例1)，進(jìn)一步減少不期望的擴(kuò)增。
附圖2顯示用于測(cè)定相對(duì)T/S比的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中T/S比是端粒(T)與單拷貝基因(S)相比(見實(shí)施例2)。通過系列稀釋(稀釋因子～1.68)和等分到微量滴定板(Microtiter plate)的孔中得到超過8倍范圍的5種DNA濃度；每孔的最終含量在12.64ng到100ng的范圍內(nèi)，與被分析的樣本具有中度量近似匹配。DNA樣本的Ct是樣本必須進(jìn)行的PCR循環(huán)分?jǐn)?shù)(fractional number)，來積累足夠產(chǎn)物的以超過設(shè)定的熒光信號(hào)大小的閾值。只要每個(gè)被分析的樣本的Ct落入標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct范圍內(nèi)，任何個(gè)別的或匯集的人DNA樣本被用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(O＝單拷貝基因36B4；Δ＝端粒)。
附圖3顯示采用本文描述的引物通過實(shí)時(shí)(real time)定量PCR測(cè)定的相對(duì)T/S比的相關(guān)性和通過傳統(tǒng)的Southern雜交分析測(cè)定的平均端粒限制性片段(TRF)長度。用于分析的DNA樣本是采自21個(gè)個(gè)體的血液。由于采用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的起始T/S比都被歸一化到在樣本中觀察到的最小T/S比(0.69)，被繪制的所有相對(duì)T/S比具有＝1.0的值。給出了與數(shù)據(jù)最佳擬合的線性回歸曲線的方程。
附圖4顯示通過瓊脂凝膠電泳分離和采用溴乙啶染色和UV照射可視化的擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)過25個(gè)PCR循環(huán)后，被擴(kuò)增的人端粒DNA以成片條帶出現(xiàn)，該條帶具有起始于約76個(gè)堿基對(duì)的最大強(qiáng)度，而在約400個(gè)堿基對(duì)處逐漸減弱到背景(人基因組DNA)。當(dāng)含有已知數(shù)量的人端粒重復(fù)單位的靶核酸模板(TTAGGG)20被用于擴(kuò)增時(shí)，也得到了起始于約76個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物的成片條帶。當(dāng)人基因組DNA被去除(即緩沖液)或用大腸桿菌DNA替代時(shí)，直到25個(gè)PCR循環(huán)都沒有檢測(cè)到產(chǎn)物。給出了DNA長度標(biāo)準(zhǔn)(123bp序列梯)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增靶核酸而限制非靶核酸被動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)的方法和組合物。特別地，本發(fā)明提供用于限制相互雜交的引物的擴(kuò)增而可以擴(kuò)增靶核酸的引物?？傊?，本發(fā)明的引物包含被改變或被突變的核苷酸殘基，使得當(dāng)引物相互雜交時(shí)，一條引物的3’末端殘基與另一引物上被改變或突變的核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配，從而阻止引物延伸。本發(fā)明可用于降低PCR背景和用于擴(kuò)增和量化重復(fù)序列特別是端粒重復(fù)序列。
在此所用的“引物”、“引物核酸”、“寡核苷酸引物”或語法等同物是指與靶核酸的某些部分雜交的核酸。本發(fā)明的引物被設(shè)計(jì)成基本上與靶序列互補(bǔ)以使靶序列與本發(fā)明的引物發(fā)生雜交，而且恰當(dāng)?shù)?’堿基配對(duì)可以發(fā)生引物延伸。這種互補(bǔ)性不必是最優(yōu)的。因此，在此“互補(bǔ)的”或“基本上互補(bǔ)”是指在常規(guī)反應(yīng)條件下探針與靶序列相當(dāng)?shù)鼗パa(bǔ)以發(fā)生雜交。只要偏離最優(yōu)互補(bǔ)不足以完全地阻礙雜交，該偏離是允許的。但是，如果改變或突變的數(shù)量足以至少在如下定義的嚴(yán)緊雜交條件下不發(fā)生雜交，該序列不是互補(bǔ)的靶序列。
本發(fā)明的引物包含核酸。此處的“核酸”或“寡核苷酸”或語法同等物是指共價(jià)連接在一起的至少兩核苷酸。本發(fā)明的核酸通常含有磷酸二酯鍵，雖然在有些情形下包括的核酸類似物可能具有其它主鏈，包含如磷酰胺(Beaucage，S.L.等，四面體(Tetrahdron)491925-1963(1993)及其參考文獻(xiàn)；Letsinger，R.L等，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)353800-3803(1970)；Sprinzl，M.等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)81579-589(1977)；Letsinger，R.L.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)143487-3499(1986)；Sawai等，化學(xué)通訊(Chem.Lett.)805(1984)；Letsinger，R.L.等，美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica.Scripta 26141-149(1986))、硫代磷酸酯(Mag，M.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)191437-1441(1991)；和美國專利5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等，美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1112321(1989))、O-甲基氨基磷酸鹽鍵(O-methylphosphoroamidite linkages)(見Eckstein，F(xiàn).，寡核苷酸及類似物實(shí)用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大學(xué)出版社，1991)，及肽核酸的主鏈和鍵(Egholm，M.美國化學(xué)協(xié)會(huì)(Am.Chem.Soc.)1141895-1897(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.311008(1992)；Egholm，M，自然(Nature)365566-568(1993)；Carlsson，C.等.自然(Nature)380207(1996)，全部被引入作為參考)。其它類似物核酸包括具有正電(positive)主鏈的那些(Dempcy，R.O.等，美國國家科學(xué)院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)926097-6101(1995))；非離子主鏈(美國專利5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.(英文)30423(1991)；Letsinger，R.L.等，美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Am.Chem.Soc.)1104470(1988)；Letsinger，R.L.等，核苷與核苷酸(Nucleoside & Nucleotide)131597(1994)；Y.S.Sanghui和P.Dan Cook編輯的ASC討論叢書(ASC SymposiumSeries)580，“反義研究中的糖修飾”(Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch)，第2和3章；Mesmaeker等，生物有機(jī)化學(xué)和醫(yī)學(xué)化學(xué)通訊(Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.)4395(1 994)；Jeffs等，J.Biomolecular NMR3417(1994)；四面體通訊(Tetrahedron Lett.)37743(1996))和非核糖體主鏈，包括在美國專利5,235,033和5,034,506、和Y.S.Sanghui和P.Dan Cook編輯的ASC討論叢書(ASC Symposium Series)580，“反義研究中的糖修飾”(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)，第6和7章中描述的那些。含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義中(見Jenkins等，化學(xué)協(xié)會(huì)研究(Chem.Soc.Rev.)169-176(1995))；所有引用的文獻(xiàn)在此特別地被引入作為參考。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸是肽核酸(PNA)，其包括肽核酸類似物。與天然核酸的高電荷磷酸二酯主鏈相反，在中性條件下這些主鏈基本上是非離子的。這帶來許多優(yōu)點(diǎn)。PNA主鏈具有增強(qiáng)的雜交動(dòng)力學(xué)。在錯(cuò)配的解鏈溫度下(Tm)的PNAs具有比最佳匹配的堿基對(duì)更多的電荷。內(nèi)部錯(cuò)配時(shí)DNA和RNA的Tm通常降低2-4℃，而具有非離子的PNA主鏈則降低約7-9℃。類似地，由于其非離子的特性，結(jié)合到這些主鏈的堿基的雜交對(duì)鹽濃度相對(duì)不敏感。特別優(yōu)選的是能夠通過聚合酶延伸的PNA衍生物。這些引物包含具有結(jié)合的核苷酸的PNA低聚物，該低聚物可以被聚合酶識(shí)別和延伸(見Lutz，M.J.等，核苷與核苷酸(Nucleosides Nucleotides)18393-401(1999)和Misra，H.S.，生物化學(xué)(Biochemistry)371917-1925(1988)；出版物在此被引入作為參考)。具有核苷酸和二核苷酸3’末端的PNAs能夠被一些聚合酶識(shí)別和延伸，存在PNA片段將使PNA-修飾鏈抵抗核酸酶、特別是5’-3’外切核酸酶。
雖然引物通常是單鏈的，在此描述的核酸可以是單鏈或雙鏈的，特別地，或含有雙鏈或單鏈序列的部分。雖然一般天然的堿基是優(yōu)選的，核酸可以是DNA、RNA或雜交體，其中核酸含有任何脫氧核糖核酸和核糖核酸的組合，和任何堿基的組合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶(isocytosine)、異鳥嘌呤(isoguanine)、次黃嘌呤核苷等。在此所用術(shù)語“核苷(nucleoside)”包括核苷酸以及核苷和核苷酸類似物，和被修飾的核苷如氨基修飾的核苷。此外，“核苷”包括非天然的類似物結(jié)構(gòu)。因此，例如，含有堿基(a base)的肽核酸(PNA)的獨(dú)立單位在此稱作為核苷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，所有這些核酸類似物都可以用于本發(fā)明。此外，可以制備天然核酸及其類似物的混合物或者不同核酸類似物的混合物。
引物核酸的大小是變化的，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期的，一般長度在5-500個(gè)核苷酸間變化，在10-100個(gè)核苷酸之間的引物是優(yōu)選的，在12-75個(gè)核苷酸之間的引物更加優(yōu)選，而在15-50個(gè)核苷酸之間的引物是極其優(yōu)選的，這取決于具體的用途、所需特異性和擴(kuò)增技術(shù)。
一般地，本發(fā)明的組合物提供與靶核酸的第一條單鏈雜交的第一引物以及與靶核酸的第二條單鏈雜交的第二引物，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補(bǔ)的。引物與各自的鏈雜交時(shí)能夠通過聚合酶進(jìn)行引物延伸。也就是說，與靶核酸雜交的引物具有與靶核酸的核苷酸殘基互補(bǔ)的3’末端核苷酸殘基，使得引物能夠引物延伸。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少引物之一還包含至少一個(gè)變化的或者突變的核苷酸殘基，在引物相互雜交時(shí)在變化的殘基與另一條引物的3’末端核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配。此處的“變化的”、“改變的”或“突變的”核苷酸殘基是指產(chǎn)生所需錯(cuò)配的引物核苷酸殘基的任何改變，如顛換和轉(zhuǎn)換。在3’末端核苷酸上出現(xiàn)錯(cuò)配阻斷了通過聚合酶的延伸，從而限制了非靶核酸的被動(dòng)延伸反應(yīng)。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少第一引物的一個(gè)核苷酸被改變來在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)，在變化的殘基和第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
對(duì)于任何的引物對(duì)，引物相互雜交的能力可以通過將第一引物的序列與第二引物對(duì)比來檢測(cè)。確定雜交的穩(wěn)定性、特別是熱解鏈溫度(Tm)可以采用下面描述的方法和通過本領(lǐng)域熟知的方法(見Breslauer，T.等，美國國家科學(xué)院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838893-8897(1986)；Wetmur，J.G.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26227-259(1991)；Rychlik，W.等，J.NIH Res.678(1994))；Wallace Rule estimations(Suggs，S.V.等，“化學(xué)合成的寡脫氧核苷酸用于特異的克隆DNA序列的分離”(Use of Synthetic oligodeoxribonucleotidesfor the isolation of specific cloned DNA sequences)，利用純化基因的發(fā)育生物學(xué)(Developmental biology using purified genes)，D.B.Brown編輯，第683-693頁，學(xué)院出版社(Academic Press)，紐約，1981)，和基于Bolton和McCarthy的T檢驗(yàn)(T estimations based on Bolton and McCarthy)(見Baldino，F(xiàn).J.等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)168761-777(1989)；Sambrook，J.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第10章，冷泉巷出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉巷(Cold Spring Harbor)，紐約，2001)。所有文獻(xiàn)在此特別地引入作為參考。當(dāng)評(píng)價(jià)雜交穩(wěn)定性時(shí)，各種參數(shù)的影響其中包括，離子強(qiáng)度、探針長度、G/C含量，和錯(cuò)配都被考慮。對(duì)這些因素的考慮對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的(Sambrook，J.，同上文)。
引物之間形成的雜合體是否能夠通過聚合酶無模板地被動(dòng)延伸，可以通過雜合體的3’末端區(qū)域是否具有互補(bǔ)性來評(píng)定。能夠通過聚合酶延伸的那些雜合體的至少一條引物的3’末端核苷酸與其它引物的核苷酸序列互補(bǔ)(Watson，R.擴(kuò)增(Amplifications)5-6(1989))。因此，包含與至少一條引物的至少3’末端核苷酸互補(bǔ)的雜合體被選擇，進(jìn)行引物序列的變化或突變。由于接近3’末端的核苷酸錯(cuò)配時(shí)通過聚合酶的引物延伸的效率較低，具有至少2個(gè)或多個(gè)核苷酸變化對(duì)于引物雜合體來說是優(yōu)選的，在3’末端區(qū)域具有3個(gè)或更多個(gè)互補(bǔ)的核苷酸的雜合體是最優(yōu)選的。還可以采用各種計(jì)算方法確定3’末端區(qū)域具有互補(bǔ)性的雜合體，例如，擴(kuò)大(Amplify)1.2軟件(威斯康星州大學(xué)，遺傳系，麥迪遜，威斯康星州。
另外，通過在無靶核酸時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和如通過電泳檢測(cè)引物-二聚體種類的生成，很容易確定非靶核酸被動(dòng)引物延伸的產(chǎn)物的存在。在此所用的“引物-二聚體”是指由引物與其它引物雜交引起的非靶核酸通過聚合酶的被動(dòng)延伸。還可以在缺乏或存在靶核酸時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并分析擴(kuò)增產(chǎn)物的融合曲線，來確定引物-二聚體的存在(見Ririe，K.M.生物化學(xué)年評(píng)(Anal.Biochem.)245154-160(1997)；引入作為參考)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，變化的或突變的核苷酸殘基離引物的3’末端足夠遠(yuǎn)，使得當(dāng)引物與各自的靶核酸鏈雜交時(shí)可以通過聚合酶進(jìn)行有效擴(kuò)增。由于已知3’末端核苷酸或接近3’末端核苷酸的錯(cuò)配會(huì)影響引物延伸，變化的核苷酸殘基至少是被1個(gè)或多個(gè)來自改變的引物的3’末端核苷酸的殘基。更優(yōu)選地，變化的殘基至少是2個(gè)或更多個(gè)殘基，而在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，變化的殘基3個(gè)或更多個(gè)來自3’末端核苷酸。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的兩條引物包含至少一個(gè)變化的核苷酸殘基，使得引物相互雜交在兩條引物的3’末端殘基上產(chǎn)生錯(cuò)配以阻止通過聚合酶的延伸。當(dāng)每條引物具有與另一條引物的3’末端區(qū)域互補(bǔ)時(shí)出現(xiàn)這種情況。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，除了在第一引物上的至少一個(gè)變化的核苷酸殘基外，第二引物上至少一個(gè)核苷酸殘基被改變，使得當(dāng)?shù)谝灰锱c第二引物相互雜交時(shí)在第二引物上被改變的殘基與第一引物的3末端核苷酸之間產(chǎn)生錯(cuò)配。如上討論，被改變的殘基優(yōu)選為至少一個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選為至少2個(gè)核苷酸殘基，和最優(yōu)選為第二引物3’末端核苷酸的至少3個(gè)核苷酸殘基。由于第一引物和第二引物的3’末端核苷酸殘基未被改變，當(dāng)引物與各自的靶核酸鏈雜交時(shí)，它們?nèi)匀荒軌蛲ㄟ^聚合酶延伸。因此，當(dāng)非靶核酸未被擴(kuò)增時(shí)，靶核酸容易被擴(kuò)增。
雖然上述的實(shí)施方案涉及兩種能夠相互雜交的不同引物，還存在引物與自身互補(bǔ)的情況，產(chǎn)生單引物的引物-二聚體產(chǎn)物。因此，本發(fā)明不限于不同的引物，還適用于在擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生引物-二聚體的自身互補(bǔ)的引物。
考慮到用于限制非靶核酸被動(dòng)擴(kuò)增的引物的總體設(shè)計(jì)，本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增靶核酸的重復(fù)區(qū)域中的大量重復(fù)單位的組合物。在此所用的“重復(fù)單位”(repetitive unit)、“重復(fù)單位”(repeat unit)、“重復(fù)元件”或者語法上的等同物是指在重復(fù)區(qū)域中反復(fù)或重復(fù)的最小核苷酸序列。擴(kuò)增的重復(fù)單位可能包含任何重復(fù)序列，具有1個(gè)或多個(gè)核苷酸的重復(fù)單位是優(yōu)選的，更加優(yōu)選的重復(fù)單位在3-100個(gè)核苷酸之間，和最優(yōu)選的重復(fù)單位在4-30個(gè)核苷酸之間?？傊?，雖然在重復(fù)單位之間存在非重復(fù)的核苷酸，這些重復(fù)單位以串聯(lián)方式排列。在此“大量”的重復(fù)元件是指重復(fù)區(qū)域中的至少2個(gè)和多個(gè)重復(fù)單位。這些重復(fù)區(qū)域包含天然存在的重復(fù)區(qū)域，如著絲粒和端粒包含的重復(fù)區(qū)域，或者可能包含例如通過轉(zhuǎn)染、重組或位點(diǎn)特異性整合(如逆轉(zhuǎn)錄病毒呈遞)被導(dǎo)入細(xì)胞或生物中的重復(fù)區(qū)域。每套引物擴(kuò)增的重復(fù)單位的數(shù)量依賴于引物長度和重復(fù)單位的核苷酸長度。這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可預(yù)期的，引物序列和引物長度可以依據(jù)引物對(duì)該重復(fù)單位的穩(wěn)定性和特異性來選擇。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域的重復(fù)單位的組合物包含雜交到靶核酸的第一條鏈上的至少一個(gè)重復(fù)單位上的第一引物和雜交到靶核酸的第二條鏈上的至少一個(gè)重復(fù)單位上的第二引物，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補(bǔ)的。當(dāng)引物雜交到其各自的靶核酸鏈時(shí)能夠引物延伸。也就是說，雜交到靶核酸的引物，其3’末端核苷酸殘基與靶核酸上的核苷酸殘基互補(bǔ)，使得這些引物能夠起始延伸(primer extension)。一個(gè)方面，至少一條引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變來與引物所雜交的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配，其中在引物相互雜交時(shí)被改變的核苷酸殘基還與另一條引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，從而限制起始引物-引物二聚體雜合體的延伸。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變，以在被改變的殘基與引物所雜交的第一條鏈上的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)被改變的核苷酸殘基還與第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
被改變的殘基優(yōu)選為至少1個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選地至少2個(gè)核苷酸殘基，和最優(yōu)選地3’末端核苷酸的3個(gè)核苷酸殘基，使得當(dāng)被改變的引物雜交到靶核酸時(shí)可以通過聚合酶的有效延伸。
在另一個(gè)方面，用于擴(kuò)增重復(fù)單位的兩條引物都包含至少一個(gè)被改變的核苷酸殘基，使得引物相互雜交在被改變的殘基與兩條引物的3’末端殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，除了上述的第一引物上的被改變的殘基之外，第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變來在被改變的殘基與第二引物所雜交的第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中在引物相互雜交時(shí)第二引物上被改變的殘基還與第一引物的3’末端殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。
在還有一個(gè)用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域的重復(fù)單位的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明包含雜交到靶核酸的第一條單鏈上的一個(gè)以上重復(fù)單位的第一引物和雜交到靶核酸的第二條單鏈上的一個(gè)以上重復(fù)單位的第二引物，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補(bǔ)的。如上所述，在雜交到各自的靶核酸鏈上時(shí)引物能夠引物延伸。在一個(gè)方面，至少一條引物的核苷酸殘基被改變來在被改變的殘基與引物所雜交的靶核酸的一條鏈上的每個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸產(chǎn)生錯(cuò)配。在引物相互雜交時(shí)，這些被改變的核苷酸殘基還與另一條引物的3’末端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配，從而進(jìn)一步限制引物-引物二聚體雜合體的起始-延伸。
因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一引物的核苷酸殘基被改變，來在被改變的殘基與引物所雜交的靶核酸的第一條鏈的每個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)，這些被改變的核苷酸還與第二引物的3’末端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。
被改變的核苷酸殘基優(yōu)選至少1個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選地至少2個(gè)核苷酸殘基，和最優(yōu)選地3’末端核苷酸的3個(gè)核苷酸殘基，使得當(dāng)被改變的引物與靶核酸雜交時(shí)可以通過聚合酶有效延伸。
在另一個(gè)方面，兩條引物都含有被改變的殘基，使得引物相互雜交產(chǎn)生兩條引物的3’末端核苷酸的錯(cuò)配。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，除了第一引物的被改變的核苷酸殘基外，第二引物上的核苷酸殘基也被改變來在第二條引物的被改變殘基與引物所雜交的第二條鏈的每個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。當(dāng)引物相互雜交時(shí)，第二引物上的這些被改變的核苷酸還與第一引物的3’末端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。
由于雜交到靶核酸的引物必須能夠起始延伸，第一引物和第二引物的改變必須位于重復(fù)單位的非互補(bǔ)核苷酸上。因此，在一個(gè)方面，當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锒及桓淖兊臍埢鶗r(shí)，該變化在重復(fù)單位的鄰近核苷酸位置上。在另一個(gè)方面，該變化位于重復(fù)單位的不毗連的核苷酸位置上。總之，位于鄰近核苷酸位置上的錯(cuò)配在改變的核苷酸和3’末端核苷酸之間產(chǎn)生最多配對(duì)的堿基或互補(bǔ)殘基，這對(duì)于有效擴(kuò)增短重復(fù)序列(即3-6個(gè)堿基對(duì))是重要的。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一引物和第二引物還包含不與靶核酸雜交(即堿基配對(duì))的5’末端區(qū)域。該不配對(duì)的區(qū)域包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸，優(yōu)選范圍是3-60個(gè)核苷酸，最優(yōu)選范圍是4-30個(gè)核苷酸。當(dāng)引物被用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域的重復(fù)單位時(shí)，5’端不配對(duì)區(qū)域阻斷被復(fù)制的引物延伸產(chǎn)物的3’末端在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中從擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部重復(fù)單位起始核酸合成。
雖然5’端不配對(duì)區(qū)域可以是不與靶核酸雜交的任何序列，在優(yōu)選實(shí)施方案中，不配對(duì)的區(qū)域包含限制性位點(diǎn)、用于測(cè)序或起始延伸反應(yīng)(即擴(kuò)增)的特定序列(unique sequence)、或者用于檢測(cè)和測(cè)量擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的引物被設(shè)計(jì)成具有類似Tms。在此所用具有類似Tms的引物具有約10℃或更小的Tm差值，優(yōu)選5℃或更小，和更加優(yōu)選2℃或更小。采用具有相同或相似Tms的引物組(如引物對(duì))，使得可以采用在特定的擴(kuò)增條件下對(duì)兩條引物來說是最佳的并且產(chǎn)生類似擴(kuò)增效率的退火/延伸溫度。優(yōu)點(diǎn)在于可以使用相似濃度的引物，特別是低濃度，其限制不期望的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。比較而言，當(dāng)引物的Tms不同時(shí)，一條引物采用較高濃度來彌補(bǔ)擴(kuò)增效率的差異。較高的引物濃度在較少的PCR循環(huán)中產(chǎn)生不期望的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在一個(gè)方面，通過改變引物長度或通過選擇具有類似鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)含量的引物來制備具有相似Tms的引物。Tms通過上述方法來評(píng)價(jià)。在此所用“類似GC含量”是指一個(gè)引物組，其GC含量差別約10％或更低，更優(yōu)選差別約5％或更低，和最優(yōu)選差別約2％或更低，使得引物具有如上定義的相似Tms。在引物設(shè)計(jì)方法中，最先被評(píng)價(jià)與靶核酸雜交的區(qū)域的Tm和/或GC含量。對(duì)于具有上述非雜交5’末端區(qū)域的引物，對(duì)整條引物進(jìn)行額外的Tm和GC含量分析?？傊?，引物被設(shè)計(jì)成3’末端區(qū)域的GC含量具有較高相似性，由于該區(qū)域是通過聚合酶延伸的區(qū)域。
本發(fā)明的引物可被用于擴(kuò)增各種靶核酸。一個(gè)簡(jiǎn)單的引物組，如引物對(duì)，被用于擴(kuò)增單個(gè)靶核酸，或者多個(gè)引物組被用于擴(kuò)增大量靶核酸?？梢詫?duì)每個(gè)特定的引物組分別地進(jìn)行擴(kuò)增，或者在單個(gè)反應(yīng)容器采用引物組的組合，本領(lǐng)域通常知曉的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。當(dāng)在一個(gè)反應(yīng)中采用多種引物組，引物被設(shè)計(jì)來限制不期望的產(chǎn)物的形成和限制每個(gè)引物組中引物間的干擾。
由于本發(fā)明涉及用上述的引物來擴(kuò)增靶核酸，本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增靶核酸序列的方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括將包含基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與上述的第一引物和第二引物接觸，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶核酸。
此處“靶核酸”或“靶序列”或語法意義上的等同物是指雙鏈或單鏈核酸的核酸序列。靶序列可能是基因、調(diào)控序列、基因組DNA、cDNA、RNA包括mRNA和rRNA或者其它核酸的一部分。其可以是任意長度，應(yīng)當(dāng)理解，較長的序列更特異。在一些實(shí)施方案中，期望可以將樣本核酸切割或裂解成100-10,000堿基對(duì)的片段，在一些實(shí)施方案中，具有約500個(gè)堿基對(duì)的片段是優(yōu)選的。切割或裂解可以通過任何本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的方法進(jìn)行，包括機(jī)械的、化學(xué)的、和酶學(xué)的方法。因此，核酸可以進(jìn)行超聲處理、弗氏細(xì)胞壓碎(French press)、剪切或者用核酸酶(如DNA酶、限制性酶、RNA酶等)或者化學(xué)裂解試劑(如酸/哌啶(piperidein)，肼/哌啶，鐵-EDTA復(fù)合物，1，10-鄰二氮雜菲-銅復(fù)合物等)處理。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，靶序列可以是多種形式的。例如，其可以被含有在較大的核酸序列中，即全部或部分基因或mRNA，質(zhì)粒或基因組DNA的限制性片段，等。包含靶序列的樣本可以得自任何生物的任何組織，包括血液、大腦、骨髓、淋巴、肝臟、脾臟、乳房、上皮(如皮膚、口腔等)、或者其它組織，包括從活體解剖中獲得的組織。樣本還包括機(jī)體排泄物或液體，如唾液、尿液、糞便、腦脊髓液、精液、乳汁等。靶核酸的其它來源包括細(xì)菌、酵母、植物、病毒或其它含有核酸的致病的或非致病生物。核酸也可以是通過化學(xué)的或酶學(xué)的方法如PCR反應(yīng)人工制備的任何核酸。
靶序列可以采用熟知的技術(shù)制備。例如，樣本用去污劑、超聲波、電泳、變性劑等處理來破壞細(xì)胞、細(xì)菌或病毒。靶核酸如按需被純化。反應(yīng)的成分被同時(shí)或按照下面指出以任何次序順序加入。此外，各種試劑被加到反應(yīng)中來實(shí)現(xiàn)最佳雜交、擴(kuò)增和檢測(cè)。這些試劑包括鹽、緩沖液、中性蛋白、去污劑等。根據(jù)樣本制備方法和靶核酸的純化，其它試劑被加入來提高反應(yīng)效率，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗菌劑等。當(dāng)靶核酸為RNA時(shí)，這些核酸被轉(zhuǎn)化為DNA，例如通過用逆轉(zhuǎn)錄酶(如MoMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Tth逆轉(zhuǎn)錄酶等)處理，這在本領(lǐng)域是熟知的。
當(dāng)靶核酸是雙鏈核酸時(shí)，被變性來產(chǎn)生第一單鏈和第二單鏈以便引物的雜交。雖然根據(jù)雙鏈核酸的性質(zhì)可以采用堿性pH、變性劑(如甲酰胺)和其它技術(shù)，可以采用任意多個(gè)變性步驟如調(diào)節(jié)溫度為約95℃。
引物與靶核苷酸接觸使得第一引物能夠與靶核酸的第一條鏈雜交和第二引物能夠與靶核酸的第二條鏈雜交。采用各種雜交條件來形成雜合體，包括高度、中度和低度嚴(yán)緊的條件(見如，Sambrook，J.，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，2001；Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學(xué)中的現(xiàn)有方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons，updates to 2001；所有這些在此被引入作為參考)。嚴(yán)緊條件是序列依賴的，在不同條件下是不同的，包括引物長度、錯(cuò)配數(shù)量、G/C含量和離子強(qiáng)度。核酸雜交的教導(dǎo)在Tijssen，P.，“雜交原理和核酸分析策略的綜述”(Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic AcidAssays)，生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)與核酸探針雜交(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridizationwith Nucleic Acid Probes)，第24卷，Elsevier，阿姆斯特丹，1993)中提供。一般地，嚴(yán)緊條件被選擇為比特定溶液條件下(如離子強(qiáng)度、pH、核酸濃度)特定雜合體的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低5-10℃。Tm定義為在特定溶液條件下，平衡時(shí)50％與靶核酸互補(bǔ)的引物序列被雜交或?yàn)閱捂湹臏囟?。一般地，溶液條件是用于擴(kuò)增靶核酸的溶液條件。由于嚴(yán)緊程度通常區(qū)別在于雜交溫度和Tm，即使雜交的溶液條件發(fā)生改變，只要與Tm的溫度差別是恒定的，可以保持嚴(yán)緊程度。雜交條件也可能隨著核酸主鏈的類型如核糖核酸或肽核酸(PNA)主鏈而變化。
在引物與靶核酸雜交和擴(kuò)增反應(yīng)中，通常在存在靶核酸時(shí)能夠形成雜合體的嚴(yán)緊條件下進(jìn)行分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠改變溫度、鹽濃度、pH、有機(jī)溶劑、離液劑等參數(shù)或者其它變量來控制雜交的嚴(yán)緊性，還最小化引物與非特異性靶的雜交(如通過采用“熱啟動(dòng)”PCR和者“降落”PCR)。
在將引物與靶核酸接觸后，用擴(kuò)增酶通常是聚合酶來處理反應(yīng)。各種合適的聚合酶在本領(lǐng)域是已知的，其中包括Taq聚合酶、KlenTaq、Tfl聚合酶、DynaZyme等。一般地，雖然所有的聚合酶都可用于本發(fā)明，但是由于采用具有強(qiáng)3’-5’外切活性的聚合酶傾向于切除錯(cuò)配的3’末端核苷酸，優(yōu)選的聚合酶是缺乏3’-5’外切活性的熱穩(wěn)定聚合酶。也可以采用被構(gòu)建來降低或無功能性的3’-5’外切活性的聚合酶(如，Pfu(exo-)、Vent(exo-)、Pyra(exo-)等)。還可以采用用于最佳地延伸被雜交的引物的聚合酶的混合物。在另一個(gè)方面，用于本發(fā)明的聚合酶被配制成僅在適合于擴(kuò)增的溫度下具有活性。存在抑制聚合酶的抗體是合適的，抗體在擴(kuò)增溫度下被滅活，或者以使酶在達(dá)到擴(kuò)增溫度時(shí)才可獲得的方式封閉該酶。這些聚合酶制劑可以在單個(gè)反應(yīng)容器中混合所有成分，而阻止非靶核酸序列的引發(fā)。
在另一個(gè)方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預(yù)期，各種試劑可以被加到反應(yīng)中來提高聚合酶的持續(xù)合成能力，穩(wěn)定以防止聚合酶失活，降低引物的非特異性雜交，或者提高復(fù)制效率。這些添加劑包括但不限于二甲基亞砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇，或proteinacious試劑如大腸桿菌單鏈DNA結(jié)合蛋白、T4基因32蛋白、牛血清白蛋白、明膠等。在另一個(gè)方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用各種核苷酸類似物來擴(kuò)增特定的序列，如富含GC或重復(fù)序列。這些類似物其中包括c7-dGTP、羥甲基-dUTP、dITP、7-脫氮(deaza)-dGTP等。
按照本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法被廣泛地使用和描述(見如，美國專利4,683,195和4,683,202；在此引入作為參考)。簡(jiǎn)而言之，雙鏈的靶核酸被變性，通常在足以使該鏈變性的溫度下溫育，然后在存在過量引物下溫育，引物與單鏈靶核酸雜交(即退火)。DNA聚合酶延伸雜交的引物，產(chǎn)生新的靶核酸的拷貝。得到的雙鏈被變性，重復(fù)雜交和延伸的步驟。在存在與靶核酸互補(bǔ)的第二引物時(shí)，通過重復(fù)變性、退火和延伸的步驟，被這兩條引物所限定的靶核酸被指數(shù)性地?cái)U(kuò)增。引物延伸步驟的時(shí)間和溫度取決于聚合酶、被擴(kuò)增的靶核酸的長度和用于擴(kuò)增的引物序列。充分地?cái)U(kuò)增靶核酸所需的重復(fù)步驟數(shù)取決于每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增效率和靶核酸的起始拷貝數(shù)。這在本領(lǐng)域是熟知的，這些參數(shù)可以由技術(shù)人員調(diào)整以達(dá)到期望的擴(kuò)增水平。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明不受到用于擴(kuò)增過程的時(shí)間、溫度、緩沖條件和擴(kuò)增循環(huán)的變化的限制。
通過本領(lǐng)域熟知的方法來檢測(cè)和分析擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物在該產(chǎn)物的分離和/或純化后被分析，或者直接檢測(cè)在擴(kuò)增反應(yīng)中形成的產(chǎn)物。分離和純化的方法其中包括電泳，包括毛細(xì)管電泳(如在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠中)；層析(如親和層析、分子篩層析、反向?qū)游龅?；和雜交。被純化的產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行本領(lǐng)域熟知的擴(kuò)增。進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)物用熒光化合物直接鑒定，如用溴乙啶或SYBRTM綠，或者通過與標(biāo)記的核酸探針雜交。另外，被標(biāo)記的引物或被標(biāo)記的核苷酸被用于擴(kuò)增反應(yīng)來標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。標(biāo)記包括任何可檢測(cè)的成分，包括熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、電子標(biāo)記，和間接標(biāo)記如生物素或地高辛。當(dāng)采用間接標(biāo)記時(shí)，采用結(jié)合間接標(biāo)記的第二結(jié)合試劑來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。這些第二結(jié)合試劑包含與間接標(biāo)記結(jié)合的抗體、半抗原或其它結(jié)合配偶體(如抗生物素蛋白)。第二結(jié)合試劑優(yōu)選用熒光成分、放射性成分、酶等標(biāo)記。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物在擴(kuò)增反應(yīng)中通過實(shí)時(shí)定量PCR被檢測(cè)和量化，實(shí)時(shí)(real time)定量PCR的改變?cè)诒绢I(lǐng)域是熟知的。例如，TaqMan系統(tǒng)采用與被引物限定的核酸片段中的內(nèi)部序列中的序列雜交的探針引物，引物用于擴(kuò)增靶核酸(Heid，C.A.等，基因組研究(Genome Res.)6986-994(1996)；Holland，P.M.等，美國國家科學(xué)院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)887276-7280(1991)；引入作為參考)。該探針用兩種不同的熒光染料(即雙標(biāo)記熒光寡核苷酸探針)標(biāo)記，5’末端報(bào)道(reporter)染料(TAMRA)和3’末端熒光淬滅染料(FAM)。在PCR延伸階段通過DNA聚合酶的5’-3’外切核酶活性裂解探針，從淬滅劑附近釋放熒光分子，從而增強(qiáng)了熒光強(qiáng)度。
在另外一個(gè)方面，實(shí)時(shí)定量PCR可能基于雜交探針之間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)(Wittwer，C.T.生物技術(shù)(Biotechniques)22130-138(1997)；引入作為參考)。這種方法中，兩條寡核苷酸探針雜交到靶核酸效率的鄰近區(qū)域。上游的探針的3’末端用激發(fā)染料(excitor dye)(如FITC)標(biāo)記，而毗鄰雜交的下游探針的5’端用報(bào)道染料標(biāo)記。兩個(gè)探針雜交到被擴(kuò)增的核酸序列使得兩種染料處于足以使FRET發(fā)生的接近位置。這使得可以在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中監(jiān)測(cè)被擴(kuò)增的產(chǎn)物的數(shù)量。一種相似的方法用于分子束探針(Tyagi，S.國家生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)1649-53(1998)；引入作為參考)。分子束是在PCR生產(chǎn)特異性寡核苷酸的兩端分別包含淬滅染料和報(bào)道染料的寡核苷酸探針。染料還基于FRET起作用，因此可能還由激發(fā)染料和報(bào)道染料組成。5’末端和3’末端的短互補(bǔ)片段可以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其使寡核苷酸末端的染料十分接近，從而導(dǎo)致熒光淬滅或FRET。當(dāng)寡核苷酸通過分子束探針的內(nèi)部區(qū)域的互補(bǔ)序列雜交到PCR產(chǎn)物上，會(huì)影響寡核苷酸探針的熒光，從而可以監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的合成。
實(shí)時(shí)定量PCR還采用在PCR反應(yīng)中優(yōu)先地結(jié)合到雙鏈核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光染料，從而可以持續(xù)地檢測(cè)產(chǎn)物合成(Higuchi，R.等，生物工藝學(xué)(Biotechnology)111026-1030(1993)；Morrison，T.B.等，生物技術(shù)(Biotechniques)24954-962(1998))。適合的熒光染料其中包括溴乙啶、YOPRO-1TM(Ishiguro，T.，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)229207-213(1995))和SYBRTM綠染料(分子探針(Molecular Probes)，Eugene，OR，美國)。當(dāng)擴(kuò)增包含重復(fù)區(qū)域的靶核酸時(shí)，F(xiàn)RET和分子束探針不是優(yōu)選的，當(dāng)FRET或分子束探針被導(dǎo)向重復(fù)單位時(shí)，會(huì)雜交到引物的重復(fù)序列上，從而不能區(qū)分引物和被擴(kuò)增的產(chǎn)物。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，實(shí)時(shí)定量PCR用接近3’末端核苷酸結(jié)合了單一熒光團(tuán)(flurophore)的引物來進(jìn)行(Nazarenko，I.等，核酸研究(NucleicAcids Res.)30e37(2002)；Nazarenko，I.等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)302089-2195(2002)；LUXTM熒光引物，Invitrogen，Palo Alto，CA；在此引入作為參考)。這些引物的5′末端有能夠與3’末端區(qū)域雜交來產(chǎn)生平端發(fā)夾(即莖-環(huán))結(jié)構(gòu)的5-7個(gè)核苷酸區(qū)域，該結(jié)構(gòu)形成導(dǎo)致熒光團(tuán)的熒光淬滅。當(dāng)引物形成二聚物(duplex)時(shí)，如通過在模板上起始延伸，該淬滅被降低或消除，從而在樣本中測(cè)量PCR產(chǎn)物。由于只采用單一熒光團(tuán)(fluorphore)，在一個(gè)反應(yīng)中可以使用和檢測(cè)不同的熒光團(tuán)(flurophore)。因此，通過使用具有可區(qū)別的熒光團(tuán)的不同引物組，這些引物可以用于在一個(gè)反應(yīng)容器中擴(kuò)增和檢測(cè)大量不同靶核酸。如此處所討論，不同的靶核酸包括單拷貝基因和重復(fù)序列的組合。
適合用于實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的儀器可以用于定量PCR方法(ABI Prism7700，Applied Biosystems Division，Perkin Elmer，福斯特城，CA，美國；LightCyclerTM，Roche Molecular Biochemicals，印第安納波利斯，IN，美國)。
當(dāng)實(shí)時(shí)定量PCR用于檢測(cè)和測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，各種算法被用于計(jì)算樣本中的靶核酸的數(shù)量(見ABI Prism 7700軟件版本1.7；LightcyclerTM軟件版本3；引入作為參考)。量化包括使用具有已知拷貝數(shù)的靶核酸的標(biāo)準(zhǔn)樣本和從標(biāo)準(zhǔn)物的計(jì)算和閾值循環(huán)(Ct)中得到標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傊?，Ct是PCR循環(huán)或部分PCR循環(huán)，其中擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光偏離上述基線熒光數(shù)倍(Higuchi，R.等，同上)。實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)生7-8倍數(shù)量級(jí)的線性關(guān)系，可以在一個(gè)較寬的動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)測(cè)量靶核酸的拷貝數(shù)。靶核酸拷貝數(shù)的絕對(duì)數(shù)量可以從比較標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣本的Ct值得到。
靶核酸的拷貝數(shù)還可以通過比較定量實(shí)時(shí)PCR來確定。采用已知拷貝數(shù)或恒定拷貝數(shù)的核酸可以測(cè)定樣本中靶核酸的拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)物可以是單拷貝基因、已知拷貝數(shù)的核酸、或當(dāng)定量RNA拷貝數(shù)時(shí)為組成型地表達(dá)的看家基因(見Johnson，M.R.分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)278175-184(2000)；Boulay，J.-L.，等，生物技術(shù)(Biotechniques)27228-232(1999))。
上述組合物和方法可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶核酸的任何方法中。因此，本發(fā)明可用于檢測(cè)和監(jiān)控傳染病，例如用于檢測(cè)病原性細(xì)菌和病毒的存在(如病毒載量)。例如，靶病毒核酸包括而不限于HIV，HCV細(xì)胞巨噬化病毒、肝炎等載量。本發(fā)明還可用于監(jiān)控醫(yī)學(xué)治療。例如包括監(jiān)控施用抗生素后的細(xì)菌感染進(jìn)程。
本發(fā)明可應(yīng)用于描述細(xì)胞的功能狀態(tài)，特別是與疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞變化。例如，在卵巢或乳癌(breast cancer)的癌癥發(fā)展過程中擴(kuò)增特定的基因片段不僅與癌癥階段而且與存活率相關(guān)(見Kalioniemi，A.等，美國國家科學(xué)院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)912156-2160(1994))。因此，基因擴(kuò)增量化對(duì)于各種腫瘤具有診斷和預(yù)后的價(jià)值(Kawate，S.等，腫瘤學(xué)(Oncology)57157-163(1999)；Biechi，I.等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)78661-666(1998))。相反，遺傳元件的缺失(即缺乏雜合性或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性)還與特定疾病狀態(tài)相關(guān)，從而提供了有用疾病診斷的焦點(diǎn)。例如，在直腸癌中常常出現(xiàn)染色體區(qū)的18q21缺失，而在各種癌癥類型中位于染色體17pl3.1的抑制子p53基因常常缺失。(Largey，J.S.等，癌癥(Cancer)171933-1937(1993))。
在細(xì)胞功能和疾病中極其重要的是重復(fù)序列，特別是在許多生物基因組中發(fā)現(xiàn)的串聯(lián)重復(fù)序列。在真核細(xì)胞中，這些序列一般被分成三種主要類型衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。衛(wèi)星DNAs的重復(fù)長度約1到數(shù)千個(gè)堿基，構(gòu)成達(dá)到10億個(gè)堿基對(duì)簇的重復(fù)區(qū)域，例如真核細(xì)胞染色體中的異染色質(zhì)區(qū)中。這些序列主要與著絲粒和端粒相關(guān)。小衛(wèi)星序列是中度重復(fù)的，約9-100個(gè)堿基對(duì)重復(fù)的串聯(lián)重復(fù)排列，通常具有約0.5-30kb的平均排列長度。這些通常存在于常染色質(zhì)區(qū)，其大小變化大。微衛(wèi)星是短(即約2-6個(gè)堿基對(duì))重復(fù)的中度重復(fù)排列。這些重復(fù)的拷貝數(shù)在典型為約10-100個(gè)堿基的平均排列大小的群體中變化。在大多數(shù)情況下，重復(fù)范圍的變化通常與特定疾病相關(guān)。例如，三聯(lián)體重復(fù)CGG、CTG和GAA的拷貝數(shù)的增加與亨廷頓病(Huntington’s disease)、脆性X綜合征(Fragile X syndrome)、以及肌強(qiáng)直性營養(yǎng)障礙(myotonic dystrophy)相關(guān)。這些三聯(lián)體重復(fù)的放大程度通常與疾病的嚴(yán)重性和起始相關(guān)，使得繼承放大重復(fù)的后代具有更加嚴(yán)重的疾病或者，如果該疾病不是先天性的，會(huì)在較早時(shí)期發(fā)生。與串聯(lián)重復(fù)序列的放大相關(guān)的疾病不限于三核苷酸重復(fù)，包括較大的重復(fù)單位(Lafreniere，R.G.等，國家遺傳學(xué)(Nat.Genet.)15298-302(1997))。
串聯(lián)重復(fù)序列還具有重要的生物學(xué)功能。除了一些例外(如芽殖酵母)，絕大多數(shù)的植物、動(dòng)物和真菌的著絲粒具有大量串聯(lián)重復(fù)序列的排列。雖然這些序列的生理作用尚不清楚，一般認(rèn)為它們?cè)趉inetichore的裝配中起作用，以確保忠實(shí)有效的染色體分離。因此，確定重復(fù)數(shù)的可變性提供關(guān)于著絲粒的功能和調(diào)控以及與著絲粒功能紊亂相關(guān)的疾病的信息。
更加確定的細(xì)胞功能的重要性是包含線性真核染色體的端粒的串聯(lián)重復(fù)序列。端粒DNA或端粒區(qū)是位于染色體末端的染色體區(qū)，由范圍在5-26個(gè)堿基對(duì)的短序列重復(fù)單位的串聯(lián)排列構(gòu)成。不同生物的端粒區(qū)的重復(fù)單位或重復(fù)序列是不同的。這些重復(fù)序列在各種生物中是已知的，包括人和其它哺乳動(dòng)物、四膜蟲(Tetrahymena)、酵母、果蠅(Drosophila)和線蟲類。在人類中，端粒重復(fù)單位是5′-TTAGGG-3′，而四膜蟲的重復(fù)單位是5′-TTGGGG-3′。
端粒重復(fù)單位不僅是種屬間重復(fù)序列不同，而且在生物中重復(fù)單位數(shù)量也是變化的。已經(jīng)知道端粒的長度和完整性對(duì)于細(xì)胞生長和染色體的正確分離是重要的。例如，許多種癌癥的發(fā)展與端粒維持的激活相關(guān)，細(xì)胞老化是雖然正常的復(fù)制信號(hào)還存在而細(xì)胞已經(jīng)失去復(fù)制的能力的狀態(tài)，與端粒完整性的缺乏有關(guān)。例如，端?？s短引起細(xì)胞增生性老化，而端粒酶抑制會(huì)導(dǎo)致引起細(xì)胞凋亡(Zhang，X.等，基因發(fā)育(Genes Dev.)2388-2399(1999))。而且，敲除小鼠的端粒酶RNA導(dǎo)致發(fā)育缺陷、老化相關(guān)疾病和增加癌癥易感性(Rudolph，K.L.等，細(xì)胞(Cell)96701-712(1999)；Herrera，E.等，EMBO雜志(EMBO J.)182950-2960(1999))。
因此，測(cè)定特定重復(fù)序列的重復(fù)單位數(shù)量具有重要應(yīng)用，包括但不限于癌癥診斷、老化相關(guān)的疾病、克隆生物的整合、篩選遺傳疾病、和用于指向調(diào)控重復(fù)序列長度的酶(即端粒酶)和細(xì)胞路徑的試劑的藥物篩選。
因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供端粒長度的快速分析方法，通過用不會(huì)產(chǎn)生引物-二聚體但是當(dāng)雜交到端粒重復(fù)單位時(shí)能起始延伸的引物直接擴(kuò)增重復(fù)序列。由于各種生物的端粒具有不同的重復(fù)單位序列，擴(kuò)增特定生物的端粒將采用特異于該生物的重復(fù)單位的引物。在此采用人端粒序列來闡明本發(fā)明用于直接擴(kuò)增和量化串聯(lián)重復(fù)核酸序列的實(shí)際操作，但不限于在此描述的特定實(shí)施方案。
進(jìn)行確定端粒重復(fù)單位的數(shù)量時(shí)，選擇的引物與重復(fù)區(qū)域的重復(fù)單位互補(bǔ)。第一引物具有與靶核酸的第一條單鏈上的端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的序列，而第二引物具有與靶核酸的第二條單鏈上的端粒重復(fù)序列互補(bǔ)的序列，其中第一條鏈和第二條鏈基本上是互補(bǔ)的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一引物的核苷酸殘基被改變，在被改變的殘基與靶核酸的第一條鏈的每個(gè)端粒重復(fù)單位相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。當(dāng)引物相互雜交時(shí)，這些被改變的殘基還與第二引物的3’末端核苷酸產(chǎn)生錯(cuò)配。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第二引物的核苷酸殘基還類似地被改變，使得引物相互雜交導(dǎo)致第一引物和第二引物具有錯(cuò)配的3’末端核苷酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，被改變的核苷酸殘基在第一引物和第二引物上產(chǎn)生錯(cuò)配，來限制任何引物-二聚體產(chǎn)物的形成。在這種排列中，錯(cuò)配位于重復(fù)單位的鄰近的或非鄰近的核苷酸位置上。位于重復(fù)單位的鄰近核苷酸位置上的錯(cuò)配最大化3’末端核苷酸與每條引物的被改變的殘基的堿基配對(duì)的數(shù)量。附圖1中給出用于擴(kuò)增人端粒重復(fù)單位的引物示例。
將第一引物和第二引物與單鏈形式的重復(fù)區(qū)域接觸后，引物被聚合酶延伸，通過重復(fù)變性、退火和延伸的循環(huán)擴(kuò)增重復(fù)單位。在優(yōu)選實(shí)施方案中，5’末端區(qū)域變化非堿基配對(duì)的序列來限制從被擴(kuò)增的重復(fù)序列的內(nèi)部重復(fù)起始。
擴(kuò)增產(chǎn)物如上述被量化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，實(shí)時(shí)定量PCR用于確定靶核酸樣本中的端粒重復(fù)單位的拷貝數(shù)。用于確定和比較端粒重復(fù)單位數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)物包括使用單拷貝基因(如核糖體磷蛋白364B)或者已知拷貝數(shù)的靶核酸(如具有已知端粒重復(fù)單位數(shù)量的質(zhì)粒)。采用在此描述的方法，大量樣本的重復(fù)單位的拷貝數(shù)被量化來確定端粒重復(fù)單位的數(shù)量，以及端粒的平均長度。
測(cè)定端粒重復(fù)單位的數(shù)量可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、疾病預(yù)測(cè)和治療。由于端粒酶活性的激活與細(xì)胞無限增殖相關(guān)，本發(fā)明可用于確定各種類型癌癥細(xì)胞的端粒長度。細(xì)胞可以被持續(xù)地被分析來確定端粒的增加、減少或穩(wěn)定是否與疾病進(jìn)展相關(guān)。用于檢測(cè)的各種癌癥細(xì)胞類型包括乳房、肝臟、腦、骨骼、前列腺、淋巴細(xì)胞、黑素瘤、結(jié)腸癌等。
本發(fā)明還可以應(yīng)用于診斷與老化早期起始相關(guān)的疾病。例如，具有兒童早衰癥(Hunchinson Gilford progeria disease)的個(gè)體表現(xiàn)為與端粒長度損失相關(guān)的過早老化和成纖維細(xì)胞的增生能力下降(Alssopp，R.C.等，美國國家科學(xué)院匯編(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910114-10118(1992))，而患有先天性角化不良(dyskeratosis congenita)的患者由于缺失端粒酶RNA，表現(xiàn)為漸進(jìn)骨髓衰竭、異常皮膚色素沉著、黏膜白斑病(leukoplakia)和指甲營養(yǎng)不良(dystrophy)(見Vulliamy，T.自然(Nature)413432-435(2001))。因此，擴(kuò)增和量化端粒重復(fù)的數(shù)量可用于確定特定疾病與端粒長度變化的關(guān)系。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明用于監(jiān)控治療效果或用于篩選影響端粒長度或端粒酶活性的藥物候選。例如，由于細(xì)胞增生潛能與保持端粒完整性相關(guān)，本發(fā)明可用于監(jiān)控癌癥治療的效果。監(jiān)控端粒特征的能力給檢測(cè)特定治療和藥理學(xué)試劑的效果提供一個(gè)窗口。在另一個(gè)方面，本發(fā)明可用作篩選作用于調(diào)控端粒長度的生物學(xué)路徑，如端粒酶活性的候選引物的常規(guī)方法?？焖贁U(kuò)增端粒重復(fù)的能力提供了鑒定小分子、候選核酸和影響細(xì)胞中的端粒特性的肽試劑的高通量篩選方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，構(gòu)建引物的步驟和擴(kuò)增靶核酸序列的方法可以按照本文提供的選擇進(jìn)行變化。下面的實(shí)施例作為更加充分描述的使用方式和上述發(fā)明的最佳模式。但是，還應(yīng)當(dāng)可以理解，這些實(shí)施方案無論如何不是限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。本文引用的所有文獻(xiàn)被引入作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1直接擴(kuò)增人端粒重復(fù)序列基因組DNA通過標(biāo)準(zhǔn)方法從血液樣本中提取。用于比較用于端粒測(cè)定的定量PCR與Southern印跡方法的樣本由21位毫不相干的個(gè)體提供(11名女性和10男性，年齡在61-94歲)，他們來自猶它(utah家族，是世界上廣泛用于建立遺傳連鎖圖譜的Centre pour les Etudes du PolymorphismeHumaine(CEPH)collection的部分(White，R.等，自然(Nature)313101-105(1985))。被純化的DNA樣本在96-孔微板的10mM Tris-HCl，0.1mMEDTA，pH7.5(最終體積為300ul/孔)中稀釋到約1.75ng/ul，在熱循環(huán)中加熱到95℃5min，轉(zhuǎn)移到冰水浴中5min來迅速冷卻，以700×g離心，用粘性鋁箔封裝，在4℃下保存直到分析。
在分離的96孔平板上對(duì)提取的DNA樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。制備兩種PCR試劑的混合母液(master mix)，一種具有端粒(T)引物對(duì)，另一種具有單拷貝基因(S)引物對(duì)。根據(jù)反應(yīng)條件，30或10ul的T混合母液被加到第一塊平板的各個(gè)樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)物曲線孔中，30或10ul的S混合母液被加到第二塊平板的各個(gè)樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)物曲線孔中。對(duì)于每個(gè)個(gè)體，分析其T/S比，三個(gè)相同的20ulDNA樣本的等分試樣(每個(gè)試樣35ng)被加到平板1中，而另一三個(gè)等分試樣被加到平板2的相同孔位置上。對(duì)于每條標(biāo)準(zhǔn)物曲線，標(biāo)準(zhǔn)物DNA樣本在TE(10mM Tris、1mM EDTA，pH7.0)中被連續(xù)稀釋，以每次稀釋～1.68倍來產(chǎn)生從0.63ng/ul到5ng/ul的5種DNA濃度范圍，然后分布在20ul等分試樣，加到每個(gè)平板的標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中。然后平板用透明的粘性膜密封，以700×g離心，在黑暗中4℃下保存直到進(jìn)行PCR(0-3天后)。
PCR擴(kuò)增條件取決于所有的引物和被擴(kuò)增的DNA模板。在一組試驗(yàn)中，端粒重復(fù)序列用引物組tel1(5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3′)(SEQ IDNO1)和tel2(5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3′)(SEQ ID NO2)擴(kuò)增。PCR混合物中試劑的濃度為50ul的最終體積中含有150nM 6-ROX和0.2x SYBRTM綠I(Molecular Probes，Inc.)；15mM Tris-HCl，pH8.0；50mM KCl；2mM MgCl2；0.2mM各種dNTP；5mMDTT；1％DMSO；1.25單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems，Inc.)；270nM tel1引物；和900nM tel2引物。熱循環(huán)擴(kuò)增以95℃溫育10min開始來激活A(yù)mpliTaq Gold DNA聚合酶，接著以95℃×15s和54℃×2min進(jìn)行18個(gè)循環(huán)。
可選擇地，端粒特異性引物序列被優(yōu)化以具有相似Tms，特別通過設(shè)計(jì)引物來具有相似或相同的GC含量。引物組tel1b(5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′)(SEQID NO8)和tel2b(5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′)(SEQ ID NO9)的每一個(gè)引物在從3’末端的第6個(gè)堿基和其后朝向5’端方向的每第6個(gè)堿基攜帶特意導(dǎo)入的單個(gè)堿基取代，在重復(fù)序列的每第6個(gè)位置上總共有5個(gè)導(dǎo)入的堿基變化。當(dāng)引物雜交到靶端粒DNA上時(shí)，產(chǎn)生5個(gè)單一的堿基錯(cuò)配，但是該雜合體在每條引物的3’末端的最后5個(gè)堿基與靶端粒DNA序列具有最佳互補(bǔ)性。引物相互雜交導(dǎo)致6個(gè)位置中的4個(gè)上發(fā)生堿基配對(duì)，每條引物的3’末端殘基與另一條引物形成錯(cuò)配。具有這些Tm最優(yōu)化的引物的PCR條件是在每個(gè)反應(yīng)的30ul的最終體積中含有0.4x Sybr綠I，15mM Tris-HCI，pH8.0；50mM KCl；1.5mM MgCl2，1％DMSO，2.5mM DTT，200uM各種dNTP，0.75單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶，450nM tel1b引物，和450nM tel2b引物。熱循環(huán)擴(kuò)增為95℃×10min，接著以95℃15sec(變性)和56℃2min(退火/延伸)進(jìn)行18個(gè)循環(huán)。該分析條件不需要ROX染料?？傊?，三個(gè)PCR反應(yīng)用各種試驗(yàn)進(jìn)行。每個(gè)96孔端粒PCR平板含有具有2NTC孔的(無基因組DNA)排，和10個(gè)含有系列稀釋為5個(gè)濃度的參比DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的孔，每種濃度是雙份的，范圍在0.25ng/ml(最終濃度)到2ng/ml(最終濃度)。
編碼酸性核糖體磷蛋白PO的36B4基因被用于標(biāo)準(zhǔn)化端粒信號(hào)(Boulay等，生物技術(shù)(Biotechniques)27228-232(1999))。所用的引物是36B4u(5′-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3′)和36B4d(5′-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′)。PCR條件為在每個(gè)反應(yīng)的50ul最終體積中含有150nM 6-ROX和0.2x SYBRTM綠I(Molecular Probes，Inc.)；15mM Tris-HCl，pH8.0；50mM KCl；2mM MgCl2；200uM各種dNTP；5mM DTT；1％DMSO；1.25單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，Inc.)；300nM 36B4u引物；和500nM 36B4u引物。熱循環(huán)模式為95℃下溫育10min，接著以95℃×15s(變性)和56℃×1min(變性/延伸)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。在第二組條件下不需要ROX染料。
與擴(kuò)增端粒重復(fù)相似，對(duì)每個(gè)試驗(yàn)DNA樣本進(jìn)行三個(gè)36B4 PCR反應(yīng)。每一個(gè)96孔端粒PCR平板含有具有2NTC孔的排(無基因組DNA)和10個(gè)含有系列稀釋為5個(gè)濃度的參比DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的孔，每種濃度是雙份的，范圍在0.25ng/ml(最終濃度)到2ng/ml(最終濃度)。
所有的PCRs在ABI Prism7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems，Inc。，福斯特城，CA，美國)中進(jìn)行，裝備了熱循環(huán)儀來在每個(gè)PCR循環(huán)中激發(fā)和讀取熒光分子的發(fā)射。然后用ABI的SDS版本1.7軟件來獲得每個(gè)平板的標(biāo)準(zhǔn)曲線和確定對(duì)應(yīng)于各種樣本的T和S含量的標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋因子。
存在35ng人DNA時(shí)，端粒PCR產(chǎn)物可以通過以約9個(gè)PCR循環(huán)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。在25個(gè)循環(huán)后通過在瓊脂上電泳和用溴乙啶染色的分析顯示起始于76個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物到約400堿基對(duì)的產(chǎn)物的條帶(附圖4)，76個(gè)堿基對(duì)等價(jià)于端粒特異性引物的長度的總和。PCR拷貝數(shù)與第一個(gè)PCR循環(huán)的引物可以結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)成比例。去除基因組DNA導(dǎo)致在端?；騿慰截惢蛞锏?5個(gè)循環(huán)后沒有可檢測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
實(shí)施例2確定相對(duì)端粒長度平均端粒限制性片段(TRF)長度按照Slagboom等，美國人基因組雜志(Am.J.Hum.Genet.)55876-882(1994)的描述確定，在此引入作為參考。
大約0.5ug純化的全血DNA用Hae III限制性酶消化。然后被消化的樣本與DNA大小標(biāo)準(zhǔn)物混合，在瓊脂凝膠上電泳分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。該膜用32P末端標(biāo)記的寡核苷酸(TTAGGG)7雜交，洗滌以去除非特異性結(jié)合的探針，暴露于磷光平板(phosphor plate)1-5天，用磷光圖像儀(MolecularDynamics，Inc.)掃描該平板。然后去除斑點(diǎn)上的端粒探針，與放射性探針雜交來確定DNA大小標(biāo)準(zhǔn)，洗滌，暴露于磷光平板，掃描該平板。然后大小標(biāo)準(zhǔn)圖像和端粒條帶圖像被疊加來定位端粒條帶的大小間隔的位置。然后以平均TRF長度＝(∑ODi)/(∑ODi/Li)計(jì)算平均TRF長度，其中ODi是在間隔i中相對(duì)于背景的總放射值，Li是i的平均堿基對(duì)長度。整個(gè)操作進(jìn)行兩次；即從兩個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中得到對(duì)各個(gè)個(gè)體測(cè)定的兩個(gè)平均TRF長度值。
為了測(cè)定T/S值(端粒與單拷貝基因的比)，測(cè)定用端粒特異性(T)引物和單拷貝基因(S)特異性引物擴(kuò)增的樣本的Ct值-擴(kuò)增樣本所積累熒光超過設(shè)定的閾值的部分循環(huán)數(shù)，該閾值比背景熒光的大數(shù)倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。由于在每個(gè)PCR循環(huán)中，PCR產(chǎn)物含量基本上加倍，T/S比接近[2Ct(端粒)/2Ct(單拷貝基因)]-1＝2-ΔCt。平均ΔCt為-9.05(見附圖2)。也就是說，單拷貝基因的PCR需要比端粒PCR多約9個(gè)以上循環(huán)來產(chǎn)生相同的熒光信號(hào)，該信號(hào)通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)偏差1.48％。
相對(duì)T/S比是一個(gè)樣本的T/S相對(duì)于另一個(gè)樣本的T/S，表示為2-(ΔCt1-ΔCt2)＝2-ΔΔCt。該公式可以計(jì)算每種樣本的相對(duì)T/S比。21名毫不相干的患者的DNA樣本通過實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增和量化(見實(shí)施例2)。從PCR計(jì)算的相對(duì)T/S比的比較與通過Southern雜交測(cè)定的平均TRF長度十分相關(guān)(見附圖3)。Y軸截取值(intercept)約3.6kbp，近似于限制性酶識(shí)別位點(diǎn)與端粒六聯(lián)體重復(fù)的起始之間的近端區(qū)的平均長度(Hultdin，M.，核酸研究(Nucleic Acids.Res.)263651-3656(1998))。而且在毫不相干的相應(yīng)年齡和性別的成人中，通過相對(duì)T/S比測(cè)定的全血中的試驗(yàn)端粒長度在2.5的范圍內(nèi)變化。如果從每個(gè)報(bào)道的平均TRF長度(Hultdin，M.核酸研究(Nucleic AcidsRes.) 3651-3656(1998)；Vaziri，H.等，美國人基因組雜志(Am.J.Hum.Genet.)52661-667(1993))中減去3.4kbp的平均近端粒(subtelomeric)長度，這種可變性的范圍與其它關(guān)于在相應(yīng)年齡的成人中的TRF長度的變化幅度的研究十分吻合。
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增靶核酸的方法，包括a)將包含基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈上，其中當(dāng)被雜交到各自的鏈時(shí)所述被雜交的引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)在所述被改變的殘基與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配；和b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶核酸。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)在所述第二引物上的所述被改變的殘基與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
3.一種擴(kuò)增靶核酸的重復(fù)區(qū)域中重復(fù)單位的方法，包括a)將包含基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位上，其中當(dāng)被雜交到各自的鏈時(shí)所述被雜交的引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配；和b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶核酸。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其中所述第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在所述第二引物上的所述被改變殘基與所述第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
5.一種擴(kuò)增靶核酸的重復(fù)區(qū)域中重復(fù)單位的方法，包括a)將包含基本上互補(bǔ)的第一條鏈和第二條鏈的靶核酸與第一引物和第二引物接觸，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的一個(gè)以上重復(fù)單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的一個(gè)以上重復(fù)單位上，其中當(dāng)被雜交到各自的鏈時(shí)所述被雜交的引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的每個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配；和b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶核酸。
6.按照權(quán)利要求5的方法，其中所述第二引物的核苷酸殘基被改變以在所述第二引物的所述被改變殘基與所述第二條鏈的每個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
7.按照權(quán)利要求3、4、5或6的方法，其中所述第一引物和第二引物還包含不與所述重復(fù)單位雜交的5’末端序列。
8.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述錯(cuò)配位于所述重復(fù)單位的鄰近核苷酸位置上。
9.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述錯(cuò)配位于所述重復(fù)單位的非鄰近核苷酸位置上。
10.按照權(quán)利要求3、4、5或6的方法，其中所述重復(fù)單位包含六核苷酸重復(fù)。
11.按照權(quán)利要求3、4、5或6的方法，其中所述重復(fù)單位包含五核苷酸重復(fù)。
12.按照權(quán)利要求3、4、5或6的方法，其中所述重復(fù)單位包含四核苷酸重復(fù)。
13.按照權(quán)利要求4或6的方法，其中所述重復(fù)單位包含端粒重復(fù)單位。
14.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO1和所述第二引物包含SEQ ID NO2。
15.按照權(quán)利要求13的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO8和所述第二引物包含SEQ ID NO9。
16.一種按照權(quán)利要求3、4、5或6確定靶核酸的重復(fù)區(qū)域中重復(fù)單位的數(shù)量的方法，還包含測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的量(T)。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中所述測(cè)定是通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行。
18.按照權(quán)利要求16的方法，還包含a)擴(kuò)增已知拷貝數(shù)的靶核酸(S)；和b)確定T/S比來確定重復(fù)單位拷貝數(shù)。
19.一種按照權(quán)利要求18用于診斷癌癥的方法。
20.一種按照權(quán)利要求18用于診斷細(xì)胞老化的方法。
21.一種用于擴(kuò)增靶核酸的組合物，所述靶核酸包含基本上互補(bǔ)的第一條和第二條靶鏈，所述組合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈和所述第二引物雜交到第二條鏈，其中當(dāng)被雜交到它們各自的鏈時(shí)所述引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基改變以在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)在所述被改變的殘基與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
22.按照權(quán)利要求21的組合物，其中所述第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在第一引物和第二引物相互雜交時(shí)在所述第二引物上的所述被改變的殘基與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
23.一種用于擴(kuò)增靶核酸的重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)單位的組合物，所述靶核酸包含基本上互補(bǔ)的第一條和第二條靶鏈，所述組合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位上，其中當(dāng)被雜交到它們各自的鏈時(shí)所述引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
24.一種按照權(quán)利要求23的用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域中重復(fù)單位的組合物，其中所述第二引物的至少一個(gè)核苷酸殘基被改變以在所述第二引物上的所述被改變殘基與所述第二條鏈的至少一個(gè)重復(fù)單位的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
25.一種用于擴(kuò)增靶核酸的重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)單位的組合物，所述靶核酸包含基本上互補(bǔ)的第一條和第二條靶鏈，所述組合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物雜交到所述第一條鏈的重復(fù)單位上和所述第二引物雜交到所述第二條鏈的重復(fù)單位上，其中當(dāng)被雜交到它們各自的鏈時(shí)所述引物能夠引物延伸，和其中所述第一引物的核苷酸殘基被改變以在所述被改變的殘基與所述第一條鏈的各個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述被改變殘基還與所述第二引物的3’末端核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配。
26.一種按照權(quán)利要求25的用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域中重復(fù)單位的組合物，其中第二引物的核苷酸殘基被改變以在所述第二引物上的所述被改變殘基與所述第二條鏈的各個(gè)重復(fù)單位的相同核苷酸位置上的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锵嗷ルs交時(shí)所述第二引物上的所述被改變殘基還與所述第一引物的3’末端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。
27.按照權(quán)利要求21、22、23、24、25或26的組合物，其中所述第一和第二引物還包含不與所述重復(fù)單位雜交的5’末端序列。
28.一種按照權(quán)利要求24或26的用于擴(kuò)增重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)單位的組合物，其中所述重復(fù)單位包含端粒重復(fù)單位。
29.一種按照權(quán)利要求28的用于擴(kuò)增所述端粒重復(fù)單位的組合物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO1和所述第二引物包含SEQ ID NO2。
30.一種按照權(quán)利要求28的用于擴(kuò)增所述端粒重復(fù)單位的組合物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO8和所述第二引物包含SEQ ID NO9。
全文摘要
本發(fā)明提供采用被設(shè)計(jì)來限制非靶核酸被動(dòng)引發(fā)事件的核酸引物來擴(kuò)增靶核酸的組合物和方法。本發(fā)明可以擴(kuò)增和量化重復(fù)區(qū)域中的重復(fù)單位的數(shù)量，如端粒重復(fù)單位的數(shù)量。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1639352SQ03804867
公開日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者理查德·考索恩 申請(qǐng)人:猶他州大學(xué)