一株粘液真桿菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株粘液真桿菌及其應用。本發(fā)明所提供的粘液真桿菌具體為粘液真桿菌（Eubacterium?limosum）ZL-II，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.6846；本發(fā)明所提供的應用具體為所述粘液真桿菌（Eubacterium?limosum）ZL-II?CGMCC?No.6846在生產(chǎn)腸二醇中的應用。本發(fā)明所提供的粘液真桿菌（Eubacterium?limosum）ZL-II?CGMCC?No.6846在生物轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物制備植物雌激素類成分腸二醇中具有重要應用，本發(fā)明所提供的生產(chǎn)腸二醇的工藝簡單、生產(chǎn)成本低、無環(huán)境污染，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟效益。
【專利說明】一株粘液真桿菌及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株粘液真桿菌及其應用，特別涉及一株粘液真桿菌及其在生產(chǎn)腸二醇中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來植物雌激素類物質(zhì)因其廣泛的生理、藥理學作用已引起廣泛關(guān)注。腸二醇(enterodiol, END)是國際公認的植物雌激素，具有類雌激素和抗雌激素雙向調(diào)節(jié)作用，以及抑制腫瘤、抗氧化、預防和治療心血管疾病等多方面藥理活性。
[0003]腸二醇主要存在于哺乳動物體內(nèi)，亦被稱為哺乳動物木脂素。目前獲得腸二醇的主要途徑為化學合成方法，但化學合成法成本較高，且污染環(huán)境。研究結(jié)果表明人體腸道菌群能夠轉(zhuǎn)化植物中的多種木脂素類成分而生成為腸二醇，常見的木脂素類成分包括開環(huán)異落葉松樹脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside, SDG)>開環(huán)異落葉松樹月旨(secoisoIariciresinoI, SECO)>羅漢松月旨酌'(matairesinol,MAT)、落葉松樹脂醇(lariciresinol, LCS)> 松脂醇(pinoresinol, PRS)> 松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside, PDG)> 丁香樹月旨酌'(syringaresinol, SYG)> 牛蒡苷兀(arctigenin, ATG)>7-羥基羅漢松脂酌O-1iydroxymatariresinol, HYM)> 牛蒡子苷(arctiin, ARC)、芝麻脂素(sesamin)。富含 此類成分的主要植物資源有亞麻籽(flaxseed)、牛蒡子(ArctiiFructus)、海藻(seaweed)、油菜子(rapeseed)、黑小麥(triticale)、大豆(soybean)、燕麥(oat bran)、玉米糠(corn bran)、麩皮等。
[0004]亞麻籽被認為是含有腸二醇前體物質(zhì)最豐富的植物資源，榨油后的殘渣(亞麻籽柏)中SDG的含量可達到12~24mg/g。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株粘液真桿菌及其應用。
[0006]本發(fā)明所提供的粘液真桿菌是人體腸道活性菌，自中國人體的腸道內(nèi)容物中分離得到，具體為粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1I,該菌株已于2012年11月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.6846。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)腸二醇的菌劑。
[0008]本發(fā)明所提供的生產(chǎn)腸二醇的菌劑的活性成分為上述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1CGMCCN0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
[0009]所述生產(chǎn)腸二醇的菌劑中的三株菌可分別獨立包裝，使用時混合；也可以混合包裝。
[0010]上述菌劑在生產(chǎn)腸二醇(END)中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011]所述應用中，可以下述物質(zhì)中的至少一種作為底物:開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷、開環(huán)異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素；亞麻籽、牛蒡子、海藻、油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩。其中前11種物質(zhì)為11種化學成分，后9種物質(zhì)來自于9種植物。在實際應用中，根據(jù)需要對所述后9種物質(zhì)進行適當?shù)募庸?，如研磨粉碎獲得粗粉，從而利于反應的進行，使反應更加充分。
[0012]在本發(fā)明的一個實施例中，所述9種物質(zhì)經(jīng)研磨粉碎后獲得粗粉粒徑為200 μ m~1000 μ m。[0013]在所述應用中，具體為以上述三株菌的活性混合菌液進行底物轉(zhuǎn)化反應獲得腸二醇。所述活性混合菌液可由所述三株菌的混合菌液進行増菌獲得，也可由所述三株菌分別單獨増菌后再混合而獲得。所述増菌條件為25~40°C厭氧培養(yǎng)10-36小時。
[0014]本發(fā)明的又一個目的是提供一種活性成分為所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 的菌劑。
[0015]本發(fā)明還保護所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 或所述活性成分為所述粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I CGMCC N0.6846的菌劑在脫甲基中的應用。
[0016]在本發(fā)明中，所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum)ZL_II CGMCC N0.6846在脫甲基中的應用具體體現(xiàn)在將開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)經(jīng)所述脫甲基后轉(zhuǎn)化為4，4' -二羥基腸二醇(4，4' -dihydroxyenterodiol, DHEND)。
[0017]所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 或所述活性成分為所述粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1I CGMCC N0.6846 的菌劑在生產(chǎn) 4，4' -二羥基腸二醇中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018]在上述應用中，可以開環(huán)異落葉松樹脂酚作為底物。
[0019]在本發(fā)明上述所有的應用中，均采用厭氧培養(yǎng)的方式進行菌液培養(yǎng)，從而轉(zhuǎn)化底物。
[0020]所述厭氧培養(yǎng)的溫度可為25~40°C。在本發(fā)明的實施例中，具體為37°C。
[0021]為了使產(chǎn)物如腸二醇的產(chǎn)量達到峰值，通常需要在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng):1-10天時間。
[0022]本發(fā)明的還一個目的是提供一種生產(chǎn)腸二醇的方法。
[0023]本發(fā)明所提供的生產(chǎn)腸二醇的方法具體依次包括如下步驟:
[0024](I)將菌體含量均為5~9X 107cfu/mL的粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1ICGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847三株菌的菌液按照體積比1:1:1的比例混合，得到混合菌液；
[0025](2)取步驟(1)中得到的混合菌液，按照體積比1:10的比例接種到厭氧液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，得到増菌液；
[0026](3)將步驟(2)獲得的増菌液，按照體積比1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時向培養(yǎng)體系中加入如下(al)_ (a4)中任一底物，37°C厭氧培養(yǎng)3~10天(如8天)，從培養(yǎng)液中獲得腸二醇:
[0027](al)終濃度為 2(T40mg/mL (如 20mg/mL 或 40mg/mL)的亞麻籽柏；[0028](a2)終濃度為0.5mg/mL的開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷；
[0029](a3)終濃度為30mg/mL的底物A ;所述底物A為如下中的至少一種:牛蒡子、海藻、
油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩；
[0030](a4)終濃度為0.5g/mL的底物B ;所述底物B為如下中的至少一種:開環(huán)異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素。
[0031]在上述方法中，所述厭氧液體培養(yǎng)基由蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉粉、葡萄糖、氯化鈉、可溶性淀粉、半胱氨酸、磷酸二氫鉀、氯化血紅素、維生素Kl和水按照15.0g:5.0g:
5.0g:5.0g:5.0g:5.0g:3.0g:0.5g:2.5g:0.005g:0.0Olg:1L 的比例混合配制而成，pH7.3±0.2。
[0032]所述庖肉培養(yǎng)基由蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、NaH2PO4、葡萄糖、可溶性淀粉和水按照30.0g:5.0g:5.0g:5.0g:3.0g:2.0g:1L 的比例混合配制而成，pH 7.8。
[0033]當步驟(3)中為(al)所述底物時，步驟(1)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體為無碳源培養(yǎng)基；所述無碳源培養(yǎng)基由NaCl、NH4Cl, PBS和水按照3.0g:1.0g:100mL:900mL的比例混合配制而成，pH 6.4 ;所述PBS由KH2PO4' K2HPO4和水按照26.0g:18.5g:1L的比例混合配制而成。當步驟(3)中為(a2)_ (a4)所述底物時，步驟(1)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體為庖肉培養(yǎng)基或厭氧液體培養(yǎng)基。
[0034]本發(fā)明還涉 及一種分離純化發(fā)酵液中腸二醇的方法。厭氧培養(yǎng):TlO天后，離心取上清液，用大孔樹脂色譜柱進行分離純化，采用乙醇-水溶液或甲醇-水進行梯度洗脫，收集含有腸二醇的洗脫液，減壓濃縮干燥，得到腸二醇；所述大孔樹脂色譜柱具體可為XAD-2大孔樹脂或DlOl大孔樹脂。
[0035]本發(fā)明所提供的粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 在生物轉(zhuǎn)化天然產(chǎn)物制備植物雌激素類成分腸二醇中具有重要應用。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)腸二醇的工藝簡單、生產(chǎn)成本低、無環(huán)境污染，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟效益。
[0036]保藏說明
[0037]分類命名:粘液真桿菌
[0038]拉丁名:(Eubacteriumlimosum)
[0039]參椐的生物材料:ZL-1I
[0040]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0041]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0042]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0043]保藏日期:2012年11月20日
[0044]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.6846
[0045]分類命名:遲緩埃格特菌
[0046]拉丁名:(Eggerthellalenta)
[0047]參椐的生物材料:ZL-1II
[0048]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0049]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0050]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號[0051]保藏日期:2012年11月20日
[0052]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.6847
[0053]分類命名:單形擬桿菌
[0054]拉丁名:(Bacteroidesuniformis)
[0055]參椐的生物材料:Strain-1
[0056]保藏機構(gòu):中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0057]保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0058]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
[0059]保藏日期:2011年5月25日
[0060]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.4897
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1為ZL-1I菌株的16S rRNA基因序列同源性分析及鑒定結(jié)果。其中，StrainZL-1I菌株即表示ZL-1I菌株。
[0062]圖2為三株菌 的不同接種方式轉(zhuǎn)化亞麻籽柏產(chǎn)生腸二醇(END)的結(jié)果比較圖。其中，“單獨接菌”表示三株菌單獨増菌24h再混合后接種；“混合接菌”表示三株菌混合后増菌24h再接種。
[0063]圖3為以開環(huán)異落葉松樹脂酌.二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside, SDG)為底物的三株菌隨機組合培養(yǎng)48h的HPLC色譜圖。其中，Strain I表示單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 ；Strain ZL-1I 表不粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 ；Strain ZL-1II 表不遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
[0064]圖4為三株菌在開環(huán)異落葉松樹脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside，SDG)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生不同產(chǎn)物(SEC0，DHEND, END)過程中的作用。其中，Strain I表示單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 ；Strain ZL-1I 表不粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 ；Strain ZL-1II 表不遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
【具體實施方式】
[0065]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0066]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0067]下述實施例中所涉及的培養(yǎng)基如下:
[0068]厭氧液體培養(yǎng)基(購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司，產(chǎn)品目錄號CM1513)。成分(g/L):蛋白胨15.0 ;酵母粉5.0 ;大豆粉5.0 ;牛肉粉5.0 ;葡萄糖5.0 ;氯化鈉5.0 ;可溶性淀粉3.0 ;半胱氨酸0.5 ;磷酸二氫鉀2.5 ;氯化血紅素0.005 ;維生素K10.001, pH
7.3±0.2。
[0069]庖肉培養(yǎng)基:稱取32g庖肉培養(yǎng)基基礎(購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司，產(chǎn)品目錄號CM605)溶于1.0L蒸餾水中，搖勻，加石蠟油覆蓋，121° C高壓滅菌20min待用。所制得的庖肉培養(yǎng)基(IL)中含有如下組分:蛋白胨(30.0g)，牛肉粉(5.0g)，酵母粉(5.0g)，NaH2PO4 (5.0g)，葡萄糖(3.0g)，可溶性淀粉(2.0g)，pH 7.8。
[0070]無碳源培養(yǎng)基=NaCl(3.0g), NH4Cl(LOg), PBS (IOOmL)，去離子水 900 (mL)，pH
6.4。使用前分裝于IOmL連蓋塑料離心管，每管5mL ;表面覆蓋ImL液體石蠟；121°C高壓蒸汽滅菌 20min ;室溫放置備用。PBS =KH2PO4 (26.0g)，K2HPO4 (18.5g)，去離子水(IL)。
[0071]下述實施例中，所涉及的化合物標準品信息如下:
[0072]開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(Sigma Aldrich，N0.S0202)、開環(huán)異落葉松樹月旨酌'(Sigma Aldrich, N0.60372)、羅漢松月旨釀(Sigma Aldrich, N0.04157)、落葉松樹月旨酉享(Sigma Aldrich, N0.06892)、松月旨酉享(Sigma Aldrich, N0.40674)、松脂醇二葡萄糖苷(Sigma Aldrich, N0.10789)、丁香樹月旨釀(Sigma Aldrich, N0.6288)、牛蒡苷兀(SigmaAldrich, N0.1777)、7-羥基羅漢松脂酚(Sigma Aldrich, N0.42945)、牛蒡子苷(Sigma Aldrich, N0.sc-202064)、芝麻脂素(Sigma Aldrich, N0.S9314);腸二醇(SigmaAldrich, N0.45198)。
[0073]下述實施例中所涉及的樣本中腸二醇(END)、4，4' - 二羥基腸二醇(DHEND)和開環(huán)異落葉松樹脂酚(SECO)的HPLC檢測方法如下:
[0074]取200 μ L培養(yǎng)液,加入400 μ L水飽和正丁醇萃取,4800rpm/min離心10min,取上清液320 μ L于離心管中，氮氣吹干,加入200 μ L色譜甲醇，10000rpm/min離心3min,取上清液 20 μ L 進 HPLC 檢測。色譜柱:Zorbax SB-C18 (4.6_ X 25cm, 5 μ m,美國 Agilent 公司);保護柱 Zorbax SB-C18 (4.6mmX 12.5mm, 5 μ m,美國 Agilent 公司);流動相:水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫:(T30min (A:B體積比由100:0線性梯度變化至50:50)，3(T40min (A:B體積比由50:50線性梯度變化至0:100);流速1.0mL/min ;檢測波長280nm ;溫度25。。。
[0075]下述實施例中將涉及到腸二醇的含量測定，腸二醇的標準曲線為:
[0076]精密稱定2.08mg腸二醇對照品，加入IOmL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，配成208.0 μ g/mL對照品母液。將對照品母液逐級稀釋，分別得到濃度為208.(Tl.30 μ g/mL的對照品溶液。吸取上述溶液分別進樣20 μ L，進行HPLC分析。以腸二醇峰面積(Y)對腸二醇進樣量(X，mg/mL)進行回歸計算，得回歸方程:Y=9668X+13.17(R2=0.9990)，線性范圍為
1.30~208.0 μ g/mL。定量限(S/N=10)為 1.3 μ g/mL ;檢測限(S/N=3)為 0.33 μ g/mL。
[0077]實施例1、粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I的分離與鑒定
[0078]一、粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I 的分離
[0079]采集新鮮人或小鼠糞便標本，經(jīng)庖肉培養(yǎng)基增菌，得到腸道菌群樣本，接種到5mL無碳源培養(yǎng)基中，加入底物亞麻籽柏(粒徑為200μm-1000μm) lOOmg，37°C厭氧培養(yǎng)48h。取IOyL無碳源培養(yǎng)基菌液，10倍梯度稀釋。取10 —6倍稀釋液涂平板，37°C厭氧培養(yǎng)24h。挑取其中的單菌落，接種到5mL無碳源培養(yǎng)基中，加入底物亞麻籽柏(粒徑為200 μ m-1000 μ m) IOOmg,培養(yǎng)2天后進行HPLC檢測，篩選可以產(chǎn)生腸二醇的單菌落。取10 μ L活性菌的菌液加入庖肉液體培養(yǎng)基增菌，10_5倍稀釋液涂平板，厭氧培養(yǎng)48h后觀察，有白色且較大(Strain-1)、黃色(ZL-1I)和透明且較小(ZL-1II)三種不同顏色和形態(tài)的菌落。
[0080]二、粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I 的鑒定
[0081]1、細菌基因組DNA提取
[0082]取ZL-1I菌種0.5mL接種到厭氧液體培養(yǎng)基5mL培養(yǎng)20h，取ImL菌液進行基因組DNA提取。細菌基因組提取使用試劑盒(天根公司，目錄號DP209)，按照試劑盒說明書操作，得到120 μ L基因組提取液。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，證實細菌基因組DNA提取成功。
[0083]2、16S rRNA擴增及測序
[0084]⑴引物設計:采用腸道菌通用引物，由上海生工公司合成。
[0085]正向引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
[0086]反向引物:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
[0087](2) PCR反應體系:見表1。
[0088]表1.PCR擴增反應體系(50 μ L )
【權(quán)利要求】
1.一株粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1I,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.6847。
2.生產(chǎn)腸二醇的菌劑，其活性成分為權(quán)利要求1所述的粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1CGMCCN0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
3.權(quán)利要求2所述的菌劑在生產(chǎn)腸二醇中的應用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于:所述應用中，以下述物質(zhì)中的至少一種作為底物:開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷、開環(huán)異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素、亞麻籽、牛蒡子、海藻、油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩。
5.活性成分為權(quán)利要求1所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1ICGMCCN0.6846 的菌劑。
6.權(quán)利要求1所述的粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum)ZL-1I CGMCC N0.6846或權(quán)利要求5所述的菌劑在如下(a)或(b)中的應用: (a)脫甲基； (10生產(chǎn)4，4' -二羥基腸二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于:所述應用中作為底物的是開環(huán)異落葉松樹脂酚。
8.根據(jù)權(quán)利要求3、4、6和7中任一所述的應用，其特征在于:所述應用中，采用厭氧培養(yǎng)的方式進行培養(yǎng)，實現(xiàn)底`物的轉(zhuǎn)化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于:所述厭氧培養(yǎng)的溫度為25-40°C。
10.生產(chǎn)腸二醇的方法，依次包括如下步驟: (1)將菌體含量均為5~9X107cfu/mL的粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1ICGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847三株菌的菌液按照體積比1:1:1的比例混合，得到混合菌液； (2)取步驟(1)中得到的混合菌液，按照體積比1:10的比例接種到厭氧液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，得到増菌液； (3)取步驟(2)中的所述増菌液，按照體積比1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時向培養(yǎng)體系中加入如下(al)_ (a4)中任一底物，37°C厭氧培養(yǎng):TlO天，從培養(yǎng)液中獲得腸二醇: (al)終濃度為2(T40mg/mL的亞麻籽柏； (a2)終濃度為0.5mg/mL的開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷； (a3)終濃度為30mg/mL的底物A ;所述底物A為如下中的至少一種:牛蒡子、海藻、油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩； (a4)終濃度為0.5g/mL的底物B ;所述底物B為如下中的至少一種:開環(huán)異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素。
【文檔編號】C12P7/22GK103865822SQ201210532248
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月11日
【發(fā)明者】楊東輝, 劉樹林, 朱紅云, 李淼鑫 申請人:北京大學