一種生物合成制備glp-1及其類似物的方法
【專利摘要】一種生物合成分離制備胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其類似物(KGLP-1)的新方法。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，分別構(gòu)建了表達(dá)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST)的GST-GLP-1及GST-KGLP-1融合蛋白的基因工程大腸桿菌，并在融合蛋白中創(chuàng)新性的引進(jìn)了腸激酶酶切位點(diǎn)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白可通過谷胱甘肽親和層析，腸激酶酶切和超濾獲得GLP-1和KGLP-1的純品。本發(fā)明所制備的GLP-1及其類似物能夠有效的結(jié)合GLP-1受體并產(chǎn)生生物活性。本發(fā)明提供了一種制備GLP-1及其類似物的簡便快捷的生物合成的方法，該方法具有條件溫和、產(chǎn)物分離提取方便、工藝步驟簡單等優(yōu)點(diǎn)，有很好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。
【專利說明】一種生物合成制備GLP-1及其類似物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有GST標(biāo)簽和GLP-1及其類似物KGLP-1的融合蛋白的克隆表達(dá)；利用GST親和層析、腸激酶酶切和超濾獲得GLP-1及其類似物KGLP-1的方法；以及利用該技術(shù)在生物合成以及分離制備GLP-1及其類似物多肽KGLP-1方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]類胰高血糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)是一個含有37個氨基酸的胃腸激素，于1983年Bell等在對胰高血糖素原(proglucagon)基因進(jìn)行序列分析時發(fā)現(xiàn)的。GLP-1可以刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌、胃排空和食物攝取，從而引起細(xì)胞對葡萄糖的吸收和血清葡萄糖水平的下降。GLP-1被水解成GLP-1 (7-37)和GLP-1 (7-36)-酰胺,這兩者均為促胰島素劑(insulinotropic agent)。
[0003]當(dāng)前刺激胰島素釋放的藥物和胰島素的實(shí)際給藥可能會導(dǎo)致低血糖癥，而GLP-1能夠刺激胰島素分泌但沒有低血糖癥的危險，并且臨床研究表明GLP-1可能阻止糖尿病伴隨的β-細(xì)胞功能損傷的惡化進(jìn)程，因而GLP-1表現(xiàn)出作為非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)的治療方法的巨大潛能。但是，由于DPP-1V的降解作用和腎清除作用導(dǎo)致GLP-1的半衰期非常短，這種在體內(nèi)很短的半衰期很大程度上限制了其臨床用藥的可能。為了提高其體內(nèi)作用時間，目前主要有兩種方法，一種方法是開發(fā)DPP-1V抑制劑，另一種方法是采用多種不同的手段和方法修飾GLP-1化合物的結(jié)構(gòu)從而找到GLP-1的類似物。
[0004]目前研究表明，低分子量的多肽一般通過化學(xué)合成法制備。最廣泛使用的肽合成方法是固相肽合成法(SPPS)，但是由于受保護(hù)氨基酸的使用與過量反應(yīng)物的連續(xù)使用相結(jié)合，使得該方法相對昂貴。另外，固相多肽合成中每個氨基酸延長都需要充分的洗滌操作，通常摻入一個氨基酸涉及多達(dá)數(shù)次用NMP、DMF或DCM等這類溶劑的洗滌步驟。當(dāng)采用SPPS合成多肽如促胰島素劑、GLP-1類似物、GLP-1的截短類似物和GLP-1的衍生物時，合成期間二級結(jié)構(gòu)的形成常常導(dǎo)致各個合成步驟的效率降低，結(jié)果導(dǎo)致以低純度和收率生產(chǎn)出較大的肽或含有某些氨基酸序列的肽。而且在化學(xué)合成小肽的過程中，雜質(zhì)通常是在最終序列中失去一個或多個氨基酸的缺失肽。這些雜質(zhì)往往非常難與所需要的肽進(jìn)行分離，而導(dǎo)致最終產(chǎn)物被其污染。
[0005]我們發(fā)現(xiàn)了一種新型的GLP-1類似物，其結(jié)構(gòu)特征是在GLP-1的N端前面添加一個賴氨酸(KGLP-1)(—種改構(gòu) 的胰高血糖素樣肽-1的類似物和修飾物及其應(yīng)用，專利號:ZL200810152147.7)，KGLP-1不但顯示出天然GLP-1優(yōu)越的生物學(xué)特性(促進(jìn)胰島素的分泌和降血糖作用)，而且與天然的GLP-1相比，其對DPP-1V的穩(wěn)定性和體內(nèi)作用時間有明顯的提高，可用于糖尿病的治療和肥胖的輔助治療。前期研究中的KGLP-1通過化學(xué)合成的方法獲得，但化學(xué)合成方法制備KGLP-1的過程復(fù)雜且產(chǎn)量低，只能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的前期研究。KGLP-1的規(guī)?；苽湔系K很大程度上制約了 KGLP-1的后期研究開發(fā)和應(yīng)用。目前國內(nèi)外尚未見大規(guī)模獲得GLP-1和KGLP-1的生物合成、制備分離方法的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是利用生物合成的方法通過基因重組融合表達(dá)技術(shù)獲得攜帶GST標(biāo)簽的GLP-1及其類似物KGLP-1的融合蛋白，并經(jīng)GST親和層析純化，腸激酶酶切和超濾步驟除去GST標(biāo)簽蛋白，得到GLP-1或KGLP-1的純品肽。本發(fā)明可解決現(xiàn)有技術(shù)難以生物合成及分離GLP-1及其類似物KGLP-1的問題，并可實(shí)現(xiàn)GLP-1及其類似物KGLP-1大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，其制備工藝簡單，分離純化步驟容易，可降低其生產(chǎn)成本，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明首先提供了如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列(依次編碼GST標(biāo)簽、腸激酶酶切位點(diǎn)和GLP-1的融合蛋白GST-GLP-1)和如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列(依次編碼GST標(biāo)簽、腸激酶酶切位點(diǎn)和KGLP-1的融合蛋白GST-KGLP-1)。
[0008]其次，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，該載體是含有SEQ ID N0.1序列或SEQ IDN0.2序列，并可以在大腸桿菌中表達(dá)的pET系列載體。以及提供了一種重組菌株，該菌株是用含有SEQ ID N0.1序列或SEQ ID N0.2序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.Coli BL21菌株。
[0009]本發(fā)明同時提供了分別分離制備GLP-1或類似物KGLP-1的方法。該方法分別采用基因工程構(gòu)建SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，分別經(jīng)GST標(biāo)簽親和純化，并利用腸激酶特異性的酶切釋放出GLP-1或類似物KGLP-1活性肽以及GST標(biāo)簽蛋白。
[0010]所表述的基因工程構(gòu)建通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):通過PCR技術(shù)獲得GLP-1及KGLP-1的基因序列，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切、T4連接酶連接到pET系列表達(dá)載體上，并將重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21中。通過IPTG誘導(dǎo)，獲得GST-GLP-1或GST-KGLP-1融合蛋白的高表達(dá)。所表述的利用GST親和凝膠層析純化本發(fā)明中的融合蛋白的方法，包括以下步驟:細(xì)胞裂解、親和捕獲、洗滌、洗脫等步驟(附圖1)。具體條件如下:腸激酶用量為1.0至1.5IU/mg融合蛋白；酶切時間為8至24小時；酶切緩沖液為IOOmMTris-HCl，IOOmMMgCl2, IOmM DTT, 500mM NaCl,pH7.5。進(jìn)一步利用IOkD超濾膜截留GST標(biāo)簽蛋白，獲得GLP-1及其類似物KGLP-1活性肽。這`種活性肽的生產(chǎn)方法便于大規(guī)模制備，并可以應(yīng)用于其他多肽的制備。
[0011]本發(fā)明實(shí)例中采用HPLC-MS測定KGLP-1的N端氨基酸序列組成，采用高效液相色譜法來測定KGLP-1的含量，采用質(zhì)譜方法來測定KGLP-1的精確分子量，并采用CHO/GLP-1R/EGFP細(xì)胞受體模型，評價重組GLP-1及其類似物的生物活性。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果:
[0013]本發(fā)明提供了一種制備GLP-1及其類似物生物合成的新策略，并創(chuàng)新性的引入腸激酶酶切位點(diǎn)，通過酶切能夠獲得大量的GLP-1及其類似物KGLP-1。制備的重組多肽經(jīng)HPLC, HPLC-MS及MALD1-T0F鑒定，結(jié)果均與化學(xué)合成的標(biāo)準(zhǔn)品相一致。通過表達(dá)有GLP-1受體的細(xì)胞模型分析，制備的重組多肽顯示了良好的生物活性。該方法制備工藝簡單，原料價格便宜，制備方法能夠擴(kuò)大應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是實(shí)施例1-3，GLP-1及其類似物的克隆、表達(dá)和純化流程圖；
[0015]圖2是實(shí)施例3，GLP-1的誘導(dǎo)表達(dá)純化效果圖，其中，M為蛋白Marker，I為細(xì)胞裂解液，2為GST柱的穿柱液，3為GST柱的洗脫液(融合蛋白)，4為腸激酶酶切后的蛋白，5為純化的重組GLP-1，6為GLP-1標(biāo)準(zhǔn)品；[0016]圖3是實(shí)施例3，KGLP-1的誘導(dǎo)表達(dá)純化效果圖，其中，M為蛋白Marker，1，4為細(xì)胞裂解液，2為PBS條件下的GST穿柱液，3為PBS條件下的GST洗脫液(融合蛋白)，5為T20N100緩沖液條件下的GST穿柱液，6為T2ciNicici緩沖液條件下的GST洗脫液(融合蛋白)，7為腸激酶酶切后的蛋白，8為純化后的重組KGLP-1，9為KGLP-1標(biāo)準(zhǔn)品；
[0017]圖4是實(shí)施例3，融合蛋白酶切條件的考察，其中，a為酶切時間的考察，M為Marker, 1-8為酶切12h，10h，8h，6h，4h，2h，lh，0h的酶切效果圖，b為酶切緩沖液的考察，M為Marker，I為陰性對照，2_7為酶切緩沖液分別是SB，H，L，M，T，K的酶切效果圖(緩沖液的配方見附表1)；
[0018]圖5是實(shí)施例4，重組KGLP-1的鑒定，其中，a為純化的重組KGLP-1的HPLC分析圖，b為純化的重組KGLP-1的MALD1-T0F-MS分析圖；
[0019]圖6是實(shí)施例5，重組KGLP-1生物活性的鑒定，其中，a為陰性對照，CH0/EGFP/GLP-1R細(xì)胞加入空白培養(yǎng)基，b-f為CH0/EGFP/GLP-1R細(xì)胞分別加入含IOnmoI/L的KGLP-1標(biāo)準(zhǔn)品和純化的重組KGLP-1樣品系列稀釋(X IO2, X IO3, X IO4, X IO5)培養(yǎng)基中的綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1、GLP-1與GST標(biāo)簽融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
[0021]1、GLP-1小肽基因PCR擴(kuò)增:
[0022]本發(fā)明中的GLP-1小肽基因是以SEQ ID N0.3作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的。根據(jù)GLP-1的基因序列，設(shè)計含有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，
[0023]nGLP30-l:CGC GGATCCGACGATGACGATGACAAACACGCC ；
[0024]GLP3031-2:CCGCTCGAGTCAACGGCCTTTAACGAGCCACGC ；
[0025]以SEQ ID N0.3作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性10分鐘；940C I分鐘，60°C 15秒，72°C 15秒，共30個循環(huán)；72°C延伸I分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶。
[0026]2、基于大腸桿菌 BL21(DE3)Codon plus(E.coli BL21)菌株的 GST-GLP-l 融合表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建:
[0027]分別采用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切GLP-1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和帶有GST標(biāo)簽的PET-GST-3C載體，采用DNA回收試劑盒回收目的片段，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入E.co I iBL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞。選取陽性克隆，抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定，獲得含有編碼GST-GLP-1融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pGST-GLP-Ι的E.coli BL21原核表達(dá)系統(tǒng)。對上述構(gòu)建好的SEQ ID N0.1蛋白表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)序列分析，其結(jié)果與NCBI登陸的V01515相一致。
[0028]3.GST-GLP-1融合蛋白的表達(dá):
[0029]將上步構(gòu)建的重組菌株接種于5mL含有氨芐青霉素50 μ g/mL的LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母浸出粉，l%NaCl, pH7.4)培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0.6時，采用終濃度為0.2mmol/L的IPTG于37°C誘導(dǎo)2小時。離心收集的菌體，采用T2tlN1OO(PH8.0)緩沖液重懸，超聲波破碎處理5分鐘，使菌體充分裂解。Tricine-SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的表達(dá)情況。如圖2所示，重組大腸桿菌pGST-GLP-Ι經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有~30kD分子量大小的表達(dá)條帶，與SEQ ID N0.1融合蛋白預(yù)期大小相符。
[0030]實(shí)施例2、KGLP-1與GST標(biāo)簽融合蛋白的表達(dá)[0031 ] 1、KGLP-1小肽基因PCR擴(kuò)增:
[0032]本發(fā)明中的KGLP-1小肽基因是以pGST-GLP-Ι質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的。根據(jù)GLP-1的基因序列，設(shè)計含有BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，前引物在tag后面添加一個天冬氨酸(AAG)，
[0033]nKGLP31-l:CGCGGATCCGACGATGACGATGACAAG AAACAC ；
[0034]KGLP3031-2:CCGCTCGAG TCAACGGCCTTTAACGAGCCACGC ；
[0035]以pGST-GLP-Ι質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性10分鐘；94°C I分鐘，60°C 15秒，72°C 15秒，共30個循環(huán)；72°C延伸I分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標(biāo)條帶。
[0036]2、基于大腸桿菌BL21菌株的GST_KGLP_1融合表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建:
[0037]分別采用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切KGLP-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和帶有GST標(biāo)簽的PET-GST-3C載體，采用DNA回收試劑盒回收目的片段，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入E.coliBL21菌株的感受態(tài)細(xì)胞。選取陽性克隆，抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，獲得含有編碼GST-KGLP-1融合蛋白基因的重組質(zhì)粒pGST-KGLP-Ι的E.coli BL21原核表達(dá)系統(tǒng)。對上述構(gòu)建好的SEQ ID N0.2蛋白表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)序列分析，其結(jié)果與NCBI登陸的V01515的N端添加一個編碼賴 氨酸的氨基酸序列相一致(即KGLP-1，KGLP-1顯示出天然GLP-1優(yōu)越的生物學(xué)特性，而且對DPP-1V的穩(wěn)定性和體內(nèi)作用時間與GLP-1相比有明顯的提高)。
[0038]3、GST-KGLP-1融合蛋白的表達(dá):
[0039]將上步構(gòu)建的重組菌株接種于5mL含有氨芐青霉素50 μ g/mL的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0.6時，采用終濃度為0.2mmol/L的IPTG于37°C誘導(dǎo)2小時。離心收集的菌體，采用T2ciNicici (pH8.0)緩沖液重懸，超聲波破碎處理5分鐘，使菌體充分裂解。如圖3所示，重組大腸桿菌pGST-KGLP-Ι經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后有~30kD分子量大小的表達(dá)條帶，與GST-KGLP-1融合蛋白預(yù)期大小相符。
[0040]實(shí)施例3、GLP-1、KGLP-1 的純化
[0041]1、重組菌株菌液的獲得:
[0042]將含有pGST-GLP-Ι和pGST_KGLP_l質(zhì)粒的重組菌株分別接種于IOOmL含有氨芐青霉素50 μ g/mL的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)0.6時，采用終濃度為0.2mmol/L的IPTG于37°C誘導(dǎo)2小時。離心，分別收集上述含有pGST-GLP-Ι和pGST-KGLP-Ι質(zhì)粒的重組菌體，采用SB，H，L，M，T，K不同的緩沖液(配方見表1)重懸后，超聲波破碎30分鐘，使菌體充分裂解，離心取上清。用0.22 μ m微孔濾膜過濾，去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，分別獲得GST-GLP-1融合蛋白和GST-KGLP-1融合蛋白上清液。
[0043]表1
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，依次編碼GST標(biāo)簽、腸激酶酶切位點(diǎn)和GLP-1 的融合蛋白(GST-GLP-1)。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的SEQ ID N0.1序列，并可以在大腸桿菌中表達(dá)的PET系列載體。
3.一種重組菌株，其特征在于是用權(quán)利要求2的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的疋Coli BL21菌株。
4.一種如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，依次編碼GST標(biāo)簽、腸激酶酶切位點(diǎn)和KGLP-1 的融合蛋白(GST-KGLP-1)。
5.—種表達(dá)載體,其特征在于含有權(quán)利要求4所述的SEQ ID N0.2序列，并可以在大腸桿菌中表達(dá)的PET系列載體。
6.一種重組菌株，其特征在于是用權(quán)利要求5的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的疋Coli BL21菌株。
7.—種GLP-1及其類似物KGLP-1的分離方法，其特征是利用基因工程技術(shù)融合表達(dá)權(quán)利要求I或4的基因序列的GST-GLP-1或GST-KGLP-1融合蛋白，經(jīng)GST親和層析純化，腸激酶酶切和超濾步驟除去GST標(biāo)簽蛋白，得到GLP-1或KGLP-1的純品肽。
8.一種純化權(quán)利要求7所述重組GLP-1及其類似物KGLP-1的純化方法，其特征在于利用腸激酶特異性酶切經(jīng)GST親和層析純化后的權(quán)利要求1或4所述的GST-GLP-1或GST-KGLP-1融合蛋白，釋放出GLP-1或其類似物KGLP-1活性肽和GST標(biāo)簽蛋白；具體條件如下:腸激酶用量為1.0至1.5 IU/mg GST親和層析純化的融合蛋白；酶切時間為8至24小時；酶切緩沖液為 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2,10 mM DTT, 500 mM NaCl, pH 7.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化方法，其特征在于利用10kD超濾膜截留上述權(quán)利要求8所酶切下來的GST標(biāo)簽蛋白，離心濾過獲得GLP-1或其類似物KGLP-1活性肽。
10.一種權(quán)利要求7所述GL`P-1及其類似物KGLP-1的分離方法在生物合成以及分離制備多肽領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK103709253SQ201310737044
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】白鋼, 劉陽, 任麗梅, 侯媛媛, 白芳, 姜民, 高潔 申請人:南開大學(xué)