低分子量透明質(zhì)酸的制備方法及工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法及工程菌，本發(fā)明利用同源重組技術(shù)將獸疫鏈球菌中的乳酸脫氫酶編碼基因進(jìn)行無(wú)縫敲除，獲得ldh基因敲除的重組菌。本發(fā)明將敲除ldh基因的重組菌進(jìn)行發(fā)酵分析，將發(fā)酵液預(yù)處理后利用特性黏度法測(cè)定HA的分子量，得到平均分子量為0.4×106Da的HA，本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵就可以直接在發(fā)酵液中分離獲得低分子量的HA，成本低，易于形成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】低分子量透明質(zhì)酸的制備方法及工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于透明質(zhì)酸生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其是一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法及工程菌。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(HA)是一種高分子直鏈聚糖，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高級(jí)多糖，D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之間由β -1, 3-糖苷鍵相連，雙糖單位之間由β -1, 4-糖苷鍵相連。HA及其鹽廣泛分布于機(jī)體的各種組織中，具有特殊的生理功能，具體表現(xiàn)為:保水作用、潤(rùn)滑作用、對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用、對(duì)組織和血管生成的作用、對(duì)腫瘤的防治作用、對(duì)創(chuàng)傷愈合和止血等方面的作用，由于這些生理功能，HA被廣泛應(yīng)用于日化用品、食品保健、美容整形及醫(yī)藥等領(lǐng)域。
[0003]HA最早發(fā)現(xiàn)于動(dòng)物組織，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是鏈球菌莢膜的主要成分，HA的生產(chǎn)也相應(yīng)經(jīng)歷了組織提取和發(fā)酵生產(chǎn)兩個(gè)階段。與提取法相比，微生物發(fā)酵法不受動(dòng)物原料限制，適合規(guī)模化生產(chǎn)。隨著生物合成HA關(guān)鍵酶基因的克隆，構(gòu)建基因工程菌成為提高產(chǎn)量并控制分子量的研發(fā)熱點(diǎn)。
[0004]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸較之動(dòng)物組織提取法具有原料易得、成本低、有不同階段的分子量和更高的產(chǎn)量的優(yōu)點(diǎn)，使其成為透明質(zhì)酸發(fā)展的方向。
[0005]在獸疫鏈球菌中，一些用于HA合成的前體如1-P-葡萄糖、UDP-葡萄糖和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖 胺同時(shí)也用于合成細(xì)胞壁(約占細(xì)胞干重的20%，w/w)，即HA合成和細(xì)胞生長(zhǎng)之間存在著對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系，這是獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)HA的一個(gè)很重要的代謝特性，同時(shí)部分碳源(果糖)進(jìn)入糖酵解途徑(產(chǎn)能途徑)，其主要代謝產(chǎn)物為乳酸，乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和HA合成有較強(qiáng)的抑制作用，因此如何有效轉(zhuǎn)變細(xì)胞的產(chǎn)能途徑以降低乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和HA合成的抑制作用對(duì)于提高整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)強(qiáng)度和生產(chǎn)效率具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種低分子量透明質(zhì)酸的制備方法及工程菌，本方法利用同源重組技術(shù)獲得Idh的基因敲除菌株，不用插入篩選標(biāo)記，無(wú)縫定點(diǎn)敲除Idh基因，不影響其上游和下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，保證透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，其菌株發(fā)酵獲得平均分子量為
0.4 X IO6Da的透明質(zhì)酸。
[0007]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0008]一種乳酸脫氫酶編碼基因的左臂右臂連接序列，基因序列如序列3所示。
[0009]一種包含乳酸脫氫酶編碼基因的左臂右臂連接序列的載體。
[0010]而且，所述載體為pSET4s:: sacB:: ldh_LR,載體中包括sacB基因。
[0011 ] 一種將敲除載體轉(zhuǎn)入到宿主菌，特異性無(wú)縫敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldh，獲得乳酸脫氫酶基因功能缺失的工程菌株。[0012]而且，工程菌的宿主菌為獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)ATCC39920。
[0013]而且，所用發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖50g/L，酪蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，K2HP042g/L, NaCl1.5g/L, MgSO4.7Η200.4g/L。
[0014]而且，發(fā)酵條件:3L發(fā)酵液，接種量8%，370C，pH7.0，通氣量3vvm，發(fā)酵24h。
[0015]一種獸疫鏈球菌中Idh左臂806bp基因ldh-L，所述基因序列見(jiàn)序列I。
[0016]一種獸疫鏈球菌中Idh右臂831bp基因ldh-R，所述基因序列見(jiàn)序列2。
[0017]一種獸疫鏈球菌中Idh左臂右臂1637bp重疊基因ldh-LR，所述基因序列見(jiàn)序列
3。
[0018]一種含有Idh-LR基因的敲除載體。
[0019]一種敲除Idh基因的工程菌株。
[0020]而且，含有Idh-LR 基因的載體為 pSET4s::sacB:: ldh-LR。
[0021]而且，所述的工程菌株為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicusATCC39920。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0023]1、本發(fā)明利用同源重組技術(shù)獲得Idh的基因敲除菌株，不用插入篩選標(biāo)記，無(wú)縫定點(diǎn)敲除Idh基因，不影響其上游和下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，保證透明質(zhì)酸的產(chǎn)量，其菌株發(fā)酵獲得分子量為33-45萬(wàn)道爾頓的透明質(zhì)酸。
[0024]2、本發(fā)明將敲除Idh基因的工程菌進(jìn)行發(fā)酵分析，將發(fā)酵液預(yù)處理后利用特性黏度法測(cè)定HA的分子量，得到平均分子量為0.4 X IO6Da的HA。
[0025]3、本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵就可以直接在發(fā)酵液中分離獲得低分子量的HA，成本低，易于形成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明載體pSET4s::sacB的構(gòu)建圖譜；
[0027]圖2為本發(fā)明構(gòu)建載體pSET4s:: sacB的PCR驗(yàn)證圖，M =DNAMarker ;1:以Pcm-sacB片段為模板的陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增獲得Pcm_sacB片段,大小為1686bp ；2:陰性對(duì)照；3、4、6、7:Pcm-sacB片段沒(méi)有連接到載體pSET4s上的菌株；5、8、9:Pcm-sacB片段成功連接到載體pSET4s上的菌株，擴(kuò)增獲得Pcm-sacB片段，大小與陽(yáng)性對(duì)照同為1686bp ；
[0028]圖3為本發(fā)明敲除載體pSET4s:: sacB:: ldh-LR的構(gòu)建圖譜；
[0029]圖4為本發(fā)明構(gòu)建敲除載體pSET4s:: sacB:: ldh-LR的PCR驗(yàn)證圖,M:DNAMarker ；1:陰性對(duì)照；2:以Idh-LR片段為模板的陽(yáng)性對(duì)照，擴(kuò)增獲得Idh-LR片段，大小為1637bp ；
3、4:片段成功連接到載體上的菌株，擴(kuò)增獲得Idh-LR片段，大小為1637bp，與陽(yáng)性對(duì)照相同；
[0030]圖5為本發(fā)明Idh敲除菌株篩選的同源重組原理圖；
[0031]圖6為本發(fā)明Idh基因敲除菌株P(guān)CR驗(yàn)證圖，M =DNAMarker ；1:陰性對(duì)照；2:野生型；3~8、10:沒(méi)有發(fā)生同源重組的菌株；9、11~14:發(fā)生同源重組的菌株；
[0032]圖7為本發(fā)明將Idh敲除菌株發(fā)酵處理后利用特性黏度法測(cè)定HA分子量的圖譜。
【具體實(shí)施方式】[0033]下面結(jié)合實(shí)施例，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]本發(fā)明利用同源重組技術(shù)將獸疫鏈球菌中的乳酸脫氫酶編碼基因(lacticdehydrogenase, ldh)進(jìn)行無(wú)縫敲除,獲得乳酸脫氫酶基因功能缺失的工程菌株,本發(fā)明的內(nèi)容包括:構(gòu)建帶有sacB篩選標(biāo)記的敲除載體,構(gòu)建所述Idh敲除載體的方法,構(gòu)建Idh基因敲除菌株的方法。所述載體為pSET4s (GenBank:AB0556.1)，載體中包括sacB基因。
[0035]本發(fā)明所述的Idh-L來(lái)源于獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus),菌株保藏編號(hào)為ATCC39920，其核苷酸序列如序列I所示；ldh_R來(lái)源于獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus),菌株保藏編號(hào)為ATCC39920,其核苷酸序列如序列2所不。所述的Idh-LR是ldh-L、Idh-R連接在一起的序列，是以ldh-L、Idh-R為模板通過(guò)重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的，其核苷酸序列如序列3所示。所述的敲除載體pSET4s::sacB: =Idh-LR是分別將sacB片段、Idh-LR片段插入到初始載體pSET4s，構(gòu)建了敲除載體pSET4s::sacB::ldh-LR，并將它電轉(zhuǎn)進(jìn)入獸疫鏈球菌中，得到Idh基因敲除菌株。上述菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，取不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液進(jìn)行HA分子量的檢測(cè)，平均分子量為
0.4X IO6Da0
[0036]枯草芽孢桿菌sacB基因編碼分泌型蔗糖果聚糖酶，該酶能催化蔗糖水解和合成高分子量的果聚糖。高分子量果聚糖積累對(duì)細(xì)胞存在潛在的毒性作用，可造成細(xì)胞死亡。也就是說(shuō)，sacB基因使得細(xì)菌獲得蔗糖敏感的特性。本研究已發(fā)現(xiàn)在5%或5%以上的蔗糖存在下，sacB基因的表達(dá)可以導(dǎo)致獸疫鏈球菌ATCC399920死亡?；谶@種特性，sacB基因在遺傳上被作為一種反向篩選標(biāo)記應(yīng)用于獸疫鏈球菌的基因功能研究上。5%蔗糖存在下的致死作用(5%蔗糖存在下，菌全部死亡)。本發(fā)明具體操作步驟如下: [0037]一、載體 pSET4s:: sacB 的構(gòu)建
[0038]1、以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的基因組為模板，利用表1中的引物sacB-F和sacB-R通過(guò)PCR擴(kuò)增得到sacB基因。sacB核苷酸序列如序列4所示。
[0039]PCR 反應(yīng)體系為:2XPCRBuffer (含 Mg2+)10 μ 1，dNTP (2mM)2 μ 1，上游引物 sacB-F和下游引物sacB-R (10 μ Μ)各0.4 μ 1，模板0.2 μ 1，KODFxDNA聚合酶(購(gòu)自TOYOBO公司，貨號(hào)KFX-101)0.2μ 1，加無(wú)菌水至終體積為20 μ I。
[0040]2、以質(zhì)粒pSETl(GenBank:AB042426.1)為模板，利用表 I 中的引物Pcm-F和 Pcm-R通過(guò)PCR擴(kuò)增得到PcmDNA片段(Pcm為氯霉素啟動(dòng)子)。其核苷酸序列如序列5所示。
[0041]PCR 反應(yīng)體系為:2XPCRBuffer (含 Mg2+)10y I, dNTP (2mM)2y 1，上游引物 Pcm-F和下游引物Pcm-R (ΙΟμΜ)各0.4 μ 1，模板0.2 μ 1，KODFxDNA聚合酶0.2 μ 1，加無(wú)菌水至終體積為20 μ 10
[0042]3、以sacB、Pcm為模板，利用表1中的引物Pcm-F和sacB-R進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增獲得Pcm-sacB片段,大小為1686bp。
[0043]PCR 反應(yīng)體系為:2XPCRBuffer (含 Mg2+) 10 μ I, dNTP (2mM) 2 μ 1，引物 Pcm-F 和SacB-R (10 μ Μ)各(λ 4 μ I，模板 sacB 和 Pcm 各 0.2 μ 1，KODFxDNA 聚合酶 0.2 μ 1，加無(wú)菌水至終體積為20 μ I。
[0044]PCR反應(yīng)條件為:94 V預(yù)變性2min，98 V變性10s，58 °C退火30s，68 V延伸lmin50s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，68°C再延伸lOmin。其中55°C~72°C之間設(shè)置12個(gè)梯度。[0045]表1所用引物序列
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種乳酸脫氫酶編碼基因的左臂右臂連接序列，其特征在于:基因序列如序列3所/Jn ο
2.一種包含權(quán)利要求1所述的乳酸脫氫酶編碼基因的左臂右臂連接序列的敲除載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的乳酸脫氫酶編碼基因的左臂右臂連接序列的載體，其特征在于:所述載體為 pSET4s:: sacB::1dh-LR0
4.一種將含有權(quán)利要求2所述的敲除載體轉(zhuǎn)入到宿主菌，特異性無(wú)縫敲除乳酸脫氫酶編碼基因ldh，獲得乳酸脫氫酶基因功能缺失的工程菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的工程菌株，其特征在于:工程菌的宿主菌為獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920。
6.一種權(quán)利要求4、5之一所述的工程菌株生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于:所用發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖50g/L，酪蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，K2HP042g/L, NaCl1.5g/L，MgSO4.7H200.4g/L。
7.權(quán)利要求4-6之一所述的工程菌株生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于:發(fā)酵條件:3L發(fā)酵液，接種量8%，370C，pH7.0，通氣量3vvm，發(fā)酵24h。
【文檔編號(hào)】C12P19/26GK103993022SQ201310737033
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】劉浩, 孫夏青 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)