專利名稱：采用透明質(zhì)酸作為不同類別治療活性劑的載體分子的制作方法
采用透明質(zhì)酸作為不同類別治療活性劑的載體分子
現(xiàn)有技術(shù)
許多具有疏水特性因而在水中表現(xiàn)出低溶解度的藥物常與親水性聚 合物結(jié)合以增加其水溶性并增進(jìn)藥物的生物利用度。為此目的，使用了 大量顯示出生物相容性、生物可降解性的聚合物材料，其中部分材料是 生物活性的、具有充足的藥物負(fù)載能力以及具備藥物靶向能力。其實(shí)例
有聚谷氨酸、聚乙二醇、羧甲基葡聚糖和透明質(zhì)酸。然而，PLG、 PEG 和CMD缺乏生物活性及革巴向能力，而HA由于除生物活性外還具備將 藥物靶向疾病部位的能力因而優(yōu)于其他材料。許多肺瘤類型會(huì)過度表達(dá) CD44受體；HA可用于結(jié)合抗癌藥物并靶向給藥至患病部位。衍生化 HA的胞吞反應(yīng)已被證實(shí)可發(fā)生于CD44 HA受體過表達(dá)的細(xì)胞系中。熒 光標(biāo)記的HA-紫杉醇結(jié)合物已被證實(shí)對(duì)已知過表達(dá)HA受體的人癌細(xì)胞 具有選擇性毒性。HA肝臟受體(HARLEC)的存在表明HA可被用作載 體分子將藥物靶向肝臟組織。HA曾被證實(shí)可用于小鼠結(jié)腸腺癌的肝轉(zhuǎn) 移。
W00168105曾描述了 C-6伯羥基被二氬葉酸還原酶抑制劑(DHFR) 取代的HA制備方法。該結(jié)合是通過HA的選擇性面化反應(yīng)制備HA-6-囟素后再用DHFR置換卣素而得。該結(jié)合反應(yīng)還賦予了化合物抗增殖活 性，但含有卣素基團(tuán)殘留的問題仍然存在。
Carbo Res. 340, 2229-2235， 2005曾描述在多糖中選擇性引入離去基 團(tuán)，其中報(bào)告了在乙酰胺和氯化鋰的混合物中進(jìn)行纖維素的曱苯磺?；?反應(yīng)；其所選的條件可4吏其以封閉所述位點(diǎn)并在游離位點(diǎn)f 1入其他化學(xué) 基團(tuán)為目的的所有伯羥基完全磺?；?。
附圖簡(jiǎn)述


圖1:表示DDSs的化學(xué)式HA-6-氨甲喋呤、HA-6-布洛芬、HA-6-
青霉素G。
圖2:表示實(shí)施例9中所得HA-6-OMs的DOSYNMR圖if(在DOSY 的加權(quán)一維NMR語(yǔ)中，僅有剛性大分子存在，為聚合物的化學(xué)修飾提 供了證據(jù))。
圖3:表示HA-6-OMs的I3C NMR譜，出現(xiàn)DIEA成鹽峰。 圖4:表示實(shí)施例24中所得HA-6-MTX的DOSY NMR譜。 圖5:表示實(shí)施例24中所得HA-6-MTX的"CNMR譜。 圖6:表示實(shí)施例26中所得HA-6-布洛芬的DOSYNMR譜。 圖7:表示實(shí)施例26中所得HA-6-布洛芬的"CNMR譜。 圖8:表示實(shí)施例29中所得HA-6-青霉素G的DOSYNMR語(yǔ)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明第 一 方面提供了由透明質(zhì)酸(HA)和治療活性劑組成的藥物 輸送系統(tǒng)(DDS)，其中該活性劑與透明質(zhì)酸的W-乙?；?D-葡糖胺殘基 的C-6位共價(jià)結(jié)合，但除了如化學(xué)式(I)的活性劑而外
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其中
R2和R4分別代表-NH2、 -OH、 -OCH3、 d-Cs烷基、=0; X和Y 代表-C(R5)=、 -CH(R5)-、 -NH-、 -N=),其中Rs代表-H、 C廣C5烷基； Z代表-CH(R10)-、 -N(R10)-、 -O-, R10代表-H、 CrC5烷基、C!-C5 烯基、d-Cs炔基、有l(wèi)-3個(gè)雜原子的5-6元雜環(huán)，其中所述雜原子選自 氮、硫和氧；Ar代表l,4-苯基、與一個(gè)或多個(gè)5-6元芳香環(huán)稠合的1，4-苯基、與一個(gè)或多個(gè)5-6元雜環(huán)稠合的1，4-苯基，其中所述Ar可能被R2 取代；環(huán)A和b可分別各自為芳香環(huán)或非芳香環(huán)。
如化學(xué)式(I)的化合物是W001681 05中描述的二氫葉酸還原酶抑 制劑。
透明質(zhì)酸(本文也指HA)是由二糖重復(fù)單元組成，包4舌D-葡糖醛 酸和2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(W-乙?；?D-葡糖胺)，通過p(1—3)糖 苷鏈合；D-葡糖醛酸殘基可以以酸的形式存在，也可以以鹽的形式存在。 每個(gè)重復(fù)單元通過p(1—4)糖苦鏈彼此結(jié)合形成線性聚合物。 本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)透明質(zhì)酸涵蓋其酸的形式及成鹽形式。 術(shù)語(yǔ)透明質(zhì)酸通常用于描述總的一類具有不同分子量的HA分子級(jí) 分或所述化合物的水解級(jí)分。為了本發(fā)明目的，透明質(zhì)酸的平均分子量 優(yōu)選包括1萬(wàn)至100萬(wàn)，更優(yōu)選為2萬(wàn)至50萬(wàn)。
治療活性劑選自屬于多種不同治療種類的藥物鎮(zhèn)痛藥、抗高血壓 藥、麻醉藥、利尿藥、支氣管擴(kuò)張藥、釣通道阻滯藥、膽石威能藥、CNS 藥、雌激素、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、抗脂肪藥、抗焦慮藥、抗?jié)?藥、抗關(guān)節(jié)炎藥、抗心絞痛藥、抗生素、抗炎藥、抗病毒藥、溶血栓藥、 血管擴(kuò)張藥、解熱藥、抗抑郁藥、安定藥、抗肺瘤藥、粘液溶解藥、麻 醉拮抗劑、激素、抗驚厥藥、抗組胺藥、抗真菌藥、抗銀屑病藥。
這些治療活性劑含有親核基團(tuán)。親核基團(tuán)屬電子對(duì)供體基團(tuán)，例如 羧基、氨基、取代氨基、羥基、巰基、酰氨基團(tuán)；優(yōu)選為M基團(tuán)。
DDS中透明質(zhì)酸和活性劑之間的化學(xué)鍵結(jié)形式是酯、氨基、醚、硫 醚、酰胺。優(yōu)選為酯。
DDSs可為酸的形式，也可為鹽的形式。若為鹽的形式，可選擇與堿 金屬(優(yōu)選Na或K )、堿土金屬(優(yōu)選Ca或Mg )、過渡金屬(優(yōu)選Cu、 Zn、 Ag、 Au、 Co、 Ag)成鹽。成鹽反應(yīng)采用技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行。
根據(jù)需要，DDSs上的仲羥基也可經(jīng)衍生化形成下述基團(tuán)，所述基團(tuán) 選自-OR 、 -OCOR 、 -S02H 、 -OP03H2 、 -0-CO-(CH2)n-COOH 、 -0-(CH2)n-OCOR，其中n是l國(guó)4， R是C廣d。烷基、-麗2、 -NHCOCH3。 這些取代反應(yīng)均可通過本領(lǐng)域共知的方法很容易地完成，通常是為了調(diào) 節(jié)DDSs的親水特性而加以選用。
DDSs中治療活性劑的總量被定義為取代度(C6-DS);取代度可表示 為活性劑相對(duì)于DDS總重的重量。/。(C6-DSw)，或者表示為活性劑相對(duì)于 經(jīng)修飾的HA重復(fù)單元摩爾數(shù)的摩爾。/o(C6-DSm。i)。
在本發(fā)明的DDS中，C6-DSw優(yōu)選為0.1-60%之間，更優(yōu)選1-50%, 甚至更為優(yōu)選5-40%。
如實(shí)驗(yàn)部分所證實(shí)，本發(fā)明的DDSs其特征在于活性劑直接連接到 透明質(zhì)酸7V-乙?；?D-葡糖胺的伯羥基基團(tuán)上。HA的其他羥基不參與藥 物的化學(xué)連接。并且，DDSs性質(zhì)穩(wěn)定，不含可能對(duì)其發(fā)揮藥學(xué)用途產(chǎn)生 有害作用的非預(yù)期反應(yīng)副產(chǎn)物及雜質(zhì)。
他們保留了治療藥劑的藥理作用。因此，可成功用于治療DDS中特 定治療活性劑相應(yīng)的<壬<可病癥。
因此，本發(fā)明的另一方面是將所述的DDSs應(yīng)用于藥劑生產(chǎn)中以治 療各個(gè)治療藥物相對(duì)應(yīng)的病癥。所述病癥選自腫瘤、皮膚病、4艮屑病、 炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和感染性疾病。
本發(fā)明還有一方面是包括本發(fā)明DDSs與藥學(xué)可接受的輔料和/或稀 釋劑相混合的藥物組合物。藥物組合物可為液體形式或固體形式；可經(jīng) 口、胃腸道外、局部途徑給藥。尤其讓人感興趣的是包括所發(fā)明DDSs 的可注射藥物組合物。
本發(fā)明另一方面是制備HA和治療活性劑給藥系統(tǒng)的方法，其中治 療活性劑是除具有上述特征的如化學(xué)式(I)化合物之外。令人驚訝的發(fā) 現(xiàn)M應(yīng)不僅在具有化學(xué)式(I)結(jié)構(gòu)含兩個(gè)羧基和雜環(huán)的化合物中發(fā)生， 而且該反應(yīng)高度也適用于大量屬于不同治療類別的各種活性劑。
該方法包括以下反應(yīng)步驟 - (a)在游離形式或鹽形式透明質(zhì)酸的W-乙酰基-D-葡糖胺單元中的 C-6位點(diǎn)引入離去基團(tuán)以獲得HA-6-活化物；
(b)通過以治療活性劑上所含的親核基團(tuán)取代離去基團(tuán)(HA的C6 位點(diǎn))使得HA-6-活化的C6位與治療活性劑之間形成化學(xué)鍵，從而得到 HA-6-治療活性劑；
(c) 盡可能置換步驟(b)所得的HA-6-治療活性劑中任何未取代 的離去基團(tuán)；
(d) 回收HA-6-治療活性劑。
通過該方法，所得DDSs可能其C6-DSw優(yōu)選在0.1-60。/。之間，更優(yōu) 選1-50%,甚至更為優(yōu)選5-40%。
實(shí)施本發(fā)明的方法有兩種不同方式。在第一種方式中，將步驟(a) 所得HA-6-活化物從反應(yīng)混合物中分離，再才艮據(jù)步驟(b)與治療活性劑 反應(yīng)生成最后的HA-6-治療活性劑，也可任選是否經(jīng)過步驟(c)。
在實(shí)施本方法的第二種方式中，將步驟(a)所得含HA-6-活化物的 反應(yīng)混合物直接進(jìn)行步驟(b)反應(yīng)。施行反應(yīng)的第二種方式優(yōu)點(diǎn)在于避 免了對(duì)HA-6-活化物的分離步驟。
起始HA可以是游離形式或鹽的形式，其中平衡離子優(yōu)選是堿金屬 或堿土金屬或者是含氮平衡離子。在后者的情形中，平衡離子可能包含 雜環(huán)，該雜環(huán)選自p比梵、p比口秦、嘧咬、p比咯、p比哇、咪哇、三哇、四喳， 其可被一個(gè)或多個(gè)Cl-C6烷基取代。含氮平衡離子的優(yōu)選實(shí)施例是銨、 四丁銨(TBA)、吡啶鐵或^w-可力丁鎿(^m-collidinium)離子。
步驟(a)屬于選擇性反應(yīng)，通過將適當(dāng)試劑加入充分?jǐn)嚢璧腍A(游 離形式或鹽形式)溶于非質(zhì)子有機(jī)溶劑的混懸液或溶液中進(jìn)行反應(yīng)。
引入HA的葡糖胺單元C-6位點(diǎn)的離去基團(tuán)為任意電子對(duì)受體基團(tuán)， 它會(huì)在親核基團(tuán)取代過程中脫離。離去基團(tuán)選自磺酸根基團(tuán)、膦酸根基 團(tuán)(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亞硝酸根(N02-)、離素(優(yōu)選氯)、 硫酸根基團(tuán)、鹵代硫酸根基團(tuán)、硝酸根、卣代亞硫酸根(氯代亞硫酸根)。
若離去基團(tuán)為卣素，則卣化反應(yīng)按W09918133和WO0168105所述進(jìn)行。在g素基團(tuán)中氯族為優(yōu)選基團(tuán)，進(jìn)行囟化反應(yīng)的優(yōu)選試劑是甲磺
酰氯的a/;w-二甲基甲酰胺溶液。
該步反應(yīng)使得HA-6-活化物生成。
進(jìn)行步驟(b)是將步驟(a)所得HA-6-活化物或其鹽與治療活性 劑反應(yīng)。在該步反應(yīng)中，離去基團(tuán)被活性劑中含有的親核基團(tuán)取代，使 得在HA的C-6位點(diǎn)與活性劑之間形成共價(jià)鍵。所述鍵的化學(xué)性質(zhì)取決 于親核基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)。若親核基團(tuán)為歡基則可以形成酯鍵。在HA和 治療活性劑之間形成的其他化學(xué)鍵有氨基鍵、醚鍵、硫醚鍵、酰胺鍵。
步驟(c)是一個(gè)可選步驟，它可以是允許可行的未取代離去基團(tuán)進(jìn) 行置換的任何適當(dāng)反應(yīng)?？赏ㄟ^例如光分解反應(yīng)、還原反應(yīng)來完成這種 置換。在某些情形中步驟(c)不是必需的，因?yàn)槲慈〈碾x去基團(tuán)可能 在步驟(b)中由于反應(yīng)條件或在處理過程中已被破壞。
在步驟(d)中，通過常規(guī)技術(shù)對(duì)得到的HA-6-治療活性劑(DDS) 力口以回jR。
在本方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，離去基團(tuán)是磺?；?，因此所得活 化HA為HA-6-磺酰化物。該優(yōu)選反應(yīng)包括以下反應(yīng)步驟
(a) 向鹽形式HA的7v-乙酰基-D-葡糖胺單元C-6位點(diǎn)引入磺酸根 基團(tuán)，以獲得HA-6-磺酰化物；
(b) 通過以治療活性劑上的親核基團(tuán)置換磺酸根基團(tuán)(HA的C6 位)使得在HA-6-磺?；锏腃-6位點(diǎn)與治療活性劑之間形成化學(xué)鍵， 從而得到HA-6-治療活性劑；
(d)回收HA-6-治療活性劑。
在該實(shí)施方式中，步驟(a)的選擇性石黃?；磻?yīng)采用含有才/U威或無(wú)
才;u威(優(yōu)選有機(jī)堿)的烷基-或芳基-磺酰卣(優(yōu)選磺酰氯)作為磺酰化試
劑進(jìn)行。烷基-或芳基-磺酰卣優(yōu)選選自甲磺酰基(mesyl)、甲苯-對(duì)磺?；?(tosyl)、三氟曱磺酰基、三曱磺酰基、三丙磺?；?、l，l-磺酰基-咪唑等的 酰卣。
有機(jī)堿優(yōu)選選自各種有機(jī)胺，例如二異丙基乙胺、三乙胺。 溶劑選自二曱基甲酰胺、二曱乙酰胺、二甲基亞砜、甲酰胺。 常規(guī)的磺?；^程如下。將堿(優(yōu)選有機(jī)堿)加入鹽形式HA (優(yōu) 選其有機(jī)堿的鹽)的混懸液或溶液中，同時(shí)在氮?dú)饬飨聰嚢琛５渭尤苡?br> 適當(dāng)溶劑(優(yōu)選相同溶劑)的烷基-或芳基-磺酰氯。在經(jīng)過范圍在2-90 分鐘(優(yōu)選45-75 )的時(shí)間段之后，加入NaHC03使反應(yīng)猝滅，以去除反 應(yīng)過程中在HA仲羥基處形成的曱酸酯基團(tuán)。接著繼續(xù)反應(yīng)約10-20小 時(shí)，優(yōu)選18小時(shí)。反應(yīng)產(chǎn)物(HA-6-磺?；?既可通過現(xiàn)有技術(shù)如沉 淀、干燥從溶液中直接回收，也可在回收前對(duì)溶液進(jìn)行處理，而得到適 當(dāng)鹽形式的HA-6-磺?；?，例如HA-6-磺?；?TBA。
反應(yīng)條件應(yīng)溫和；事實(shí)上，反應(yīng)可在室溫或更低溫度下成功進(jìn)行， 不需冷卻-加熱循環(huán)，pH條件也應(yīng)溫和。
所用試劑需限量，合適的用量是在相對(duì)于HA重復(fù)單元有2-20摩爾 當(dāng)量(優(yōu)選4-12摩爾當(dāng)量)的有機(jī)胺(例如D正A)存在的情形下，使 用相對(duì)于HA重復(fù)單元l-10摩爾當(dāng)量(優(yōu)選2-6摩爾當(dāng)量)的磺酰面(例 如甲磺酰氯)。
在上述反應(yīng)條件下得到的透明質(zhì)酸-6-磺?；锼哂械娜〈?(DSn^)范圍在10%-91%摩爾/摩爾之間，優(yōu)選20-90%,甚至更優(yōu)選 40-80%。曱磺酰反應(yīng)對(duì)iV-乙?；?D-葡糖胺殘基伯位(C-6)的選擇性在50-100%之間(C6-DSm()1)。部分曱磺酰反應(yīng)也發(fā)生在仲位，例如W-乙酰 基-D-葡糖胺的C-4位點(diǎn)和D-葡糖醛酸殘基的C-2、 C-3位點(diǎn)。他們的結(jié) 構(gòu)和聚合物中甲磺?；鶊F(tuán)的取代度通過NMR光譜進(jìn)行確認(rèn)。
在磺?；磻?yīng)的優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(b)使得在HA和治療藥劑 上存在的g之間形成酯鍵。
在這個(gè)最后的實(shí)施方式中，步驟(a)如上所述進(jìn)行，步驟(b)通 常按下述程序進(jìn)行。
將含羧基的活性藥劑溶液加入含有堿金屬或堿土金屬(如碳酸銫) 的HA-5-磺酰化TBA鹽或鈉鹽形式(優(yōu)選TBA)的溶液中。反應(yīng)在40-90 。C之間進(jìn)行，優(yōu)選在80。C下持續(xù)攪拌，優(yōu)選處于氮?dú)饬髦袝r(shí)間范圍5-42 小時(shí)，優(yōu)選8-20小時(shí)(18小時(shí))。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行處理。
本發(fā)明另一方面是包括透明質(zhì)酸和化學(xué)式(I)化合物的藥物輸送系 統(tǒng)，化學(xué)式(I)化合物的羧基通過酯鍵的方式與透明質(zhì)酸的iV-乙?；?D-葡糖胺單元C-6位共價(jià)連接，所述DDS可采用下述特定方法獲得。該新 型DDSs包含與HA的C-6位直接相連的化學(xué)式(I)的化合物，其特征 在于HA重復(fù)單元中沒有其他幾基參與4建4妄，即既不與藥物，也不與其 他化學(xué)基團(tuán)鍵接。特別是該DDSs在HA單元的伯位和仲位均無(wú)殘留的 離去基團(tuán)(例如磺酸根基團(tuán))。用語(yǔ)"無(wú)"是指經(jīng)NMR測(cè)定，殘留的離 去基團(tuán)含量低于0.5%w/w。該特點(diǎn)維持了原始HA化學(xué)結(jié)構(gòu)的一致性并 保留了碳原子構(gòu)型，這些特性/方面對(duì)于保證其有效性和與特定受體的相 互作用非常重要。
不同的是，WO0168105描述的HA與氨曱喋呤的結(jié)合卻包含殘留氯 原子，這是在卣化步驟過程中引入多糖中的。
在各種具有化學(xué)式(I)的化合物中，優(yōu)選化合物是氨曱喋呤。氨曱
喋呤(MTX)如化學(xué)式(I)所示，其中R2和R4是-NH2; A環(huán)是芳香環(huán)； B環(huán)是芳香環(huán)；X和Y是-N=; Z是-N(CH3)-; Ar是1，4-苯基。DDSs 的C6-DSw優(yōu)選0.1-60%,更優(yōu)選1-50%,甚至更優(yōu)選5-40%,其MW在 10，000-500,000之間。
制備該DDS的方法包括以下反應(yīng)步驟
(a) 在游離形式或鹽形式透明質(zhì)酸的iV-乙?；?D-葡糖胺單元C-6 位點(diǎn)引入離去基團(tuán)以得到HA-6-活化物，該離去基團(tuán)選自磺酸根基團(tuán)、 膦酸根基團(tuán)(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亞硝酸根(N02-)、硫酸根 基團(tuán)、卣代硫酸根基團(tuán)、硝酸根、卣代亞硫酸根(氯代亞硫酸根)；
(b) 通過以化合物(I)上所含的羧基取代離去基團(tuán)(HA的C6位 點(diǎn))使得在HA-6-活化物的C6位點(diǎn)與如化學(xué)式(I)的化合物之間形成 酯鍵，從而得到HA-6-化學(xué)式(I)化合物；
(d)回收HA-6-化學(xué)式(I)化合物。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(a)為磺?；磻?yīng)，由于引入磺化基團(tuán)的 試劑是含有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿的烷基-或芳基-磺酰鹵，優(yōu)選磺酰氯。優(yōu)選試劑 為曱磺酰氯或甲苯-對(duì)-磺酰氯，有機(jī)堿是二異丙基乙胺或三乙胺。
DDS可采用上述方法按兩種不同方式獲得。在第一種方式中，將步 驟(a)所得HA-6-磺?；飶姆磻?yīng)混合物中分離，再按步驟(b)與如 化學(xué)式(I)的化合物進(jìn)行反應(yīng)，得到最后的HA-6-化學(xué)式(I)化合物。
在實(shí)施本方法的第二種方式中，步驟(a)所得含HA-6-磺?；锏?反應(yīng)混合物直接進(jìn)行步驟(b)反應(yīng)。施行反應(yīng)的第二種方式優(yōu)點(diǎn)在于避 免了對(duì)HA-6-磺酰化物的分離步驟。
實(shí)驗(yàn)部分
實(shí)施例1:結(jié)構(gòu)測(cè)定
通過NMR以3.10+3.32ppm區(qū)(HA鏈的1H和甲磺酸根的3H)峰 值對(duì)1.95ppm(HA鏈的3H)峰值積分，以確定HA-6-曱磺?；?HA-Ms) 中甲磺酸根的含量。
實(shí)施例2:結(jié)構(gòu)測(cè)定
通過NMR以7.8 ppm ( 2H )、 7.5ppm (2H) and 2.45ppm (3H)處的對(duì) 甲苯磺酸根峰值對(duì)1.95ppm (HA鏈的3H)峰值積分，以確定HA-6-對(duì) 曱苯磺?；?HA-Ts)中甲苯磺酸根的含量。
實(shí)施例3:結(jié)構(gòu)測(cè)定
通過NMR以6.0+8.6ppm區(qū)(MTX的5H)峰值對(duì)1.85+2.58 ppm區(qū) (HA鏈的3H和MTX的4H)峰值積分，以確定HA-6- MTX中氨甲喋 呤的含量。
實(shí)施例4:結(jié)構(gòu)測(cè)定
通過NMR以7.02+7.24ppm (4H)、 2.38ppm (2H)、 1.40ppm (3H)、 0.78ppm (6H)區(qū)的布洛芬峰值對(duì)1.95ppm ( 3H)處HA鏈峰值積分以確定 HA-6-布洛芬中布洛芬的含量。
實(shí)施例5:結(jié)構(gòu)測(cè)定
通過NMR以7.05+7.20ppm ( 5H )、 5.55ppm (1H)、 5.40 (1H)區(qū)青霉 素G峰值對(duì)1.95ppm ( 3H)處HA鏈峰值積分，以確定HA-6-青霉素G 中布洛芬的含量。
實(shí)施例6:根據(jù)氨甲喋呤藥典專著OJSP 23第頁(yè))采用HPLC以
堿水解前后樣品進(jìn)行分析以測(cè)定氨曱喋呤含量。測(cè)定條件是色語(yǔ) Dionex DX-600,色i普柱Phenomenex柱Synergi Hydro-RP80，柱尺 寸150x460mm，柱內(nèi)顆粒直徑4p，溫度40°C，洗脫液900/0 0.2M 磷酸氫二鈉/0.1M枸櫞酸(630:270)、 10%CH3CN，洗脫條件0.5 mL/min， 檢測(cè)二極管陣列(范圍200-780nm),定量檢測(cè)所選波長(zhǎng)302 nm,注 射體積25 4全測(cè)時(shí)間30分鐘。將HA-MTX按適當(dāng)濃度直接溶于 MilliQ水，制備用于測(cè)定游離氨甲喋呤的溶液。室溫下在0.1 M NaOH 中進(jìn)行堿水解2小時(shí)后測(cè)定總氨甲喋呤含量。溶液經(jīng)1 M鹽酸中和后過 濾(0.45 pm) (SartoriusMinisartRC25 17795Q),之后進(jìn)樣至HPLC系統(tǒng) 中。采用已知濃度的氨曱喋呤標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定校準(zhǔn)曲線。該方法可測(cè)出樣 品溶液中的MTX濃度，經(jīng)樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)化后得到DS重量％w/w。 實(shí)施例7:重均分子量(Mw)測(cè)定。
采用HP-SEC(高壓尺寸排阻色譜法)測(cè)定透明質(zhì)酸DDS的分子量。 測(cè)定條件是色譜HPLC泵980-PU (Jasco系列號(hào)B3901325)帶Rheodyne 9125注射器，色譜柱TSKPWxl(TosoBioscience)G6000+G5000+G3000 6、 10、 13pm粒徑，溫度40°C,流動(dòng)相0.15 MNaCl + 0.01%NaN3， 流速0.8 mL/min,檢測(cè)MALS (WYATT DAWN EOS—WYATT, USA), X二690 nm, (dn/dc = 0.167 mL/g)， UV分光光度計(jì)875-UV (Jasco，序列號(hào) D3693916),人=305 nm, Interferometric Refractive Index OPTILAB REX (WYATT，USA), X=690nm，靈敏度128x ，溫度35。C，注射體積:100 jul, 4全測(cè)時(shí)間60分鐘。
將HA-C1、 HA-OMs、 HA-MTX、 HA-結(jié)合不同藥物的待測(cè)樣品溶于 0.9 %NaCl,濃度約為1.0 mg/ml,保持?jǐn)嚢?2小時(shí)。接著溶液經(jīng)0.45
多孔濾器過濾，最后進(jìn)樣至色i普。該分析法可測(cè)定Mw (重均分子量)、 Mn (數(shù)均分子量)、PI (多分散性)。Mw和Mn值以g/mol表示。聚合物 樣品溶液的濃度通過折光率積分加以控制。
實(shí)施例8: 6-6>-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-6-Ms或HA-Ms)的制備
在氮?dú)庀孪?00 mg (0.806 mmol) HATBA鹽(MW 20，000)溶于20 ml 二甲基亞砜(DMSO)的溶液中攪拌加入l.llml (6.48mmol) 二異丙基乙胺 (DIEA)。接著室溫下滴加甲磺酰氯(MsCl)(314pL;4.03mmo1),從而形成 才登色溶液。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，把三分之一反應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03 溶液(50ml)中使反應(yīng)猝滅，pH9下攪拌過夜。所得溶液經(jīng)超濾后，置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮再經(jīng)冷凍干燥得到40mg灰白色固體(經(jīng)NMR檢測(cè)總 DS為83%摩爾/摩爾)。
剩余反應(yīng)混合液攪拌過夜再按上述操作進(jìn)行處理，得到90mg灰白 色固體(經(jīng)NMR檢測(cè)總DS為86%摩爾/摩爾)。
總產(chǎn)量130mgHA-Ms鈉鹽(40。/0)。
& NMR (D20) ppm: 1.95 (s, 3H， NHCOCH3)， 3.23 (s, 2.58H， MsO), 3.2+4.2 (m， 7.42H， HA鏈)，4.3+4.7 (m， 2H，端基+ 1.72H， CH-OMs); 13C NMR (D20) ppm: 23 (NHCOgH3)， 37 (MsO)， 55， 61 (CH2OH)， 68, 69.5 (CH2OMs)， 72, 74, 75, 76， 80, 83， 101， 103， 174, 175。
實(shí)施例9: 6-Q-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備
在氮?dú)庀孪?.00 g (8.06 mmol) HA TBA鹽(MW 20,000)溶于200 ml DMSO的溶液中攪拌加入13.9ml (81mmol)DIEA。接著室溫下滴加MsCl (3.2 ml; 41 mmol),從而形成橙色溶液。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，把反應(yīng)混合 液倒入飽和NaHCO3溶液(400ml)中使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至IL(終
pH:9.5)，持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中 濃縮。取小部分該濃縮物于旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中蒸發(fā)干燥(100 mg)供NMR檢 測(cè)；NMR氫傳測(cè)得總曱磺酸根DS為91%摩爾/摩爾，NMR氬譜測(cè)得伯 位甲磺酸根為58%摩爾/摩爾，C6位點(diǎn)選擇性為64%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 4.62g灰白色固體(HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例10: 6-(9-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?.50 g (4.03 mmol) HA TBA鹽(MW 20，000)溶于100 ml DMSO的溶液中攪拌加入5.6 ml (32.7mmol) DIEA。接著室溫下滴加 MsCl(1.3ml; 16.7mmol),從而形成橙色溶液。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，把反 應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03溶液(200ml)中以使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體 積至600ml (終pH: 9.2),持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置 旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分該濃縮物經(jīng)冷凍千燥(136mg)供NMR檢 測(cè)NMR氬語(yǔ)測(cè)得總甲磺酸根DS為79%摩爾/摩爾，NMR氬譜測(cè)得伯 位甲磺酸根為64%摩爾/摩爾，C6位選擇性為81%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 2.10g灰白色固體(HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例11: 6-0-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?.00 g (4.84 mmol) HA TBA鹽(MW 20，000)溶于100 ml DMSO的溶液中攪拌加入8.4 ml (48.4 mmol) DIEA。接著室溫下滴加 MsCl (1.92 ml; 24.2 mmol),從而形成橙色溶液。室溫?cái)嚢?5分鐘后，把 反應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03溶液(200ml)中《吏反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體 積至600ml (終pH: 9.5),持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置
旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分經(jīng)冷凍干燥(187mg)供NMR檢測(cè)NMR 氫鐠測(cè)得總甲磺酸根DS為76。/。摩爾/摩爾，NMR氫譜測(cè)得伯位甲磺酸根 為58%摩爾/摩爾，C6選擇性為76%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 2.561g灰白色固體(HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例12: 6-(9-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?.00 g (4.84 mmol) HA TBA鹽(MW 20,000)溶于DMSO (100 ml)的溶液中攪拌加入4.96ml (29.0mmo1) DIEA。接著室溫下滴加 MsCl(1.13ml; 14.5mmo1)，從而形成橙色溶液。室溫?cái)嚢?5分鐘后，把 反應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03溶液(200ml)中使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體 積至600ml (終pH: 9.5)并持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置 旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分經(jīng)冷凍干燥(248 mg)供NMR檢測(cè)NMR 氫譜測(cè)得總甲磺酸根DS為55%摩爾/摩爾，NMR氫譜測(cè)得伯位甲磺酸根 為41%摩爾/摩爾，C6選擇性為75%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 2.41g灰白色固體(HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例13: 6-(9-曱磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?.00 g (4.84 mmol) HA TBA鹽(MW 20，000)溶于DMSO (100 ml)的溶液中攪拌加入4.96ml (29.0mmo1) DIEA。接著室溫下在20 min內(nèi)滴加MsCl (1.13ml; 14.5mmol)溶于二氯甲烷(20ml)的溶液，從而形 成橙色溶液。之后立即把反應(yīng)混合液倒入飽和NaHCO3溶液(200ml)中使 反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至600ml (終pH: 9.5)并持續(xù)攪拌過夜。所得 溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分經(jīng)冷凍干燥 (172mg)供NMR檢測(cè)NMR氫語(yǔ)測(cè)得總甲磺酸根DS為85%摩爾/摩爾， NMR氫i普測(cè)得伯位甲磺酸根為50%摩爾/摩爾，C6選擇性為59%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 2.78g灰白色固體(HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例14: 6-0-曱磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備
向3.00 g (7.48 mmol) HA鈉鹽(MW 20，000)溶于DMSO (100 ml)的混 懸液中攪拌加入DIEA (12.8ml; 74.8mmol)和MsCl (2.90ml; 37.4mmo1), 在一分鐘之內(nèi)可觀察到形成深橙色。室溫?cái)嚢?小時(shí)15分鐘后，把反應(yīng) 混合液倒入飽和NaHC03溶液(200ml)中使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至 800ml (終pH: 9.5)并持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置旋轉(zhuǎn) 式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分經(jīng)冷凍干燥(0.15mg)供NMR檢測(cè)NMR氬 譜測(cè)得總甲磺酸才艮D(zhuǎn)S為5%摩爾/摩爾。
實(shí)施例15: 6-0-甲苯磺酰透明質(zhì)酸的制備
HA:TBA鹽(1.01S g; 1.64 mmol) (MW 20000)溶于30ml無(wú)水DMF的 溶液在室溫下用Et3N (3.2 mL; 23.0 mmol)和TsCl (2.24 g; 11.7 mmol)處 理；反應(yīng)混合液變?yōu)槌燃t色且溶液變稠。1小時(shí)后，6ml反應(yīng)混合液置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮為一半體積，所得樣品用丙酮沉淀。將少量固體溶于 DMSO-d6，進(jìn)行111 NMR和DOSY NMR光譜檢測(cè)，結(jié)果顯示曱苯磺酰 DS為16。/o摩爾/摩爾；回收得到曱?；飿悠?95mg。
丄H NMR (d6-DMSO) ppm: 1.95 (s， 3H， NHCOCH3), 2.45 (s, 0.49H，甲 苯磺酸根CH3)， 3.0+5.4 (m， 12.3H， HA鏈和端基)，7.5 (d， 0.34H，甲苯磺酸 芳族)，7.85 (d， 0.30H,甲苯磺酸芳族)，8.0+8.5 (m, 2.14H, O國(guó)CHO甲酯 基)。 其余反應(yīng)液加熱至50。C 1小時(shí)，在pH 9的飽和NaHC03溶液中使 反應(yīng)猝滅，攪拌24小時(shí)，中和后過濾去除固體。溶液再經(jīng)超濾并冷凍干 燥。進(jìn)行DMSO-d6的}HNMR和DOSYNMR光譜檢測(cè)，結(jié)果顯示曱苯 磺酰DS為12%摩爾/摩爾?；厥盏玫綐悠?5mg。
實(shí)施例16: 6-(9-對(duì)-甲苯磺酰透明質(zhì)酸的制備
HA:TBA鹽(1.053 g; 1.70 mmol) (MW 20000)溶于30ml無(wú)水DMF的 溶液，在O'C下用Et3N (3.2 mL; 23.0 mmol)和TsCl (2.24 g; 11.7 mmol) 處理；反應(yīng)混合液變?yōu)槌燃t色且溶液變稠。30分鐘后，將其置于室溫下， 放置1小時(shí)后，把反應(yīng)混合液置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮為一半體積，所得 樣品用丙酮沉淀。取少量固體溶于DMSO-d6,進(jìn)行& NMR和DOSY NMR光譜檢測(cè)，結(jié)果顯示甲苯磺酰DS為45%摩爾/摩爾；回收得到甲酰 4匕物纟羊品700mg。
& NMR (d6-DMSO) ppm.. 1.95 (s， 3H， NHCOCH3), 2.45 (s， 1.36H，甲 苯磺酸根CH3)， 3.0+5.4 (m， 13.0H， HA鏈和端基)，7.5 (d， 0.97H，甲苯磺酸 芳族)，7.85 (d, 0.90H，甲^s黃酸芳族)，8.0+8.5 (m， 2.33H, O國(guó)CHO曱酯 基)。
實(shí)施例17: 6-(9-曱磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?00mg (0.806mmo1) HA TBA鹽(MW 20,000)溶于20 ml DMSO的溶液中攪拌加入829pL (4.84mmo1) DIEA。接著在室溫下滴加 MsCl(188pL;2.42mmo1)，從而形成橙色溶液。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，把反 應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03溶液(40ml)中使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積 至100ml (終pH: 9.5)并持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。該溶液經(jīng)冷凍千燥后得到白色固體392mg。 NMR氫
譜測(cè)得總甲磺酸根DS為77%摩爾/摩爾，NMR碳謙測(cè)得伯位甲磺酸根為 59%摩爾/摩爾，06位點(diǎn)選擇性為77%。
實(shí)施例18: 6-(9-曱磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?00mg (0.806mmo1) HA TBA鹽(MW 20，000)溶于20 ml DMSO的溶液中攪拌加入414^L (2.42mmo1) DIEA。接著在室溫下滴加 MsCl (94pL; 1.21mmo1),從而形成橙色溶液。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，把反 應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03溶液(40ml)中使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積 至100ml (終pH: 9.5)并持續(xù)攪拌過夜。所得溶液在通風(fēng)櫥中超濾后置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。該溶液經(jīng)冷凍干燥后得到白色固體310mg。 NMR氫 譜測(cè)得總甲磺酸根DS為34。/。摩爾/摩爾，NMR碳譜測(cè)得伯位甲磺酸根為 22%摩爾/摩爾，C6位點(diǎn)選擇性為65%。
實(shí)施例19: 6-<9-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms〗的制備 在氮?dú)庀孪?00mg (0.806mmo1) HA TBA鹽(MW 20,000)溶于20 ml DMF的溶液中攪拌加入829|uL (4.84mmol) D正A。接著在室溫下滴加 MsCl(188jiL;2.42mmo1)，從而形成黃色溶液。室溫?cái)嚢鑜小時(shí)后，把反 應(yīng)混合液倒入飽和NaHC03溶液(40ml)中使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積 至100ml (終pH: 9.5);持續(xù)攪拌過夜。此后pH調(diào)高至lO,混懸液攪拌 3天，由此大部分固體被溶解。將其過濾后，所得溶液進(jìn)行超濾后置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。該溶液經(jīng)冷凍干燥后得到白色固體270mg。 NMR氫 鐠測(cè)得總甲磺酸根DS為42。/。摩爾/摩爾，NMR碳譜測(cè)得伯位曱磺酸根為 40%摩爾/摩爾，C6位點(diǎn)選擇性為95%。
實(shí)施例20: 6-Q-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在-10。C下氮?dú)庵邢?00mg (0.806mmol) HA TBA鹽(MW 20，000)溶
于20 ml DMF的溶液中攪拌加入829pL (4.84mmol) DIEA。接著滴加 MsCl (188pL; 2.42mmol)，所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合 液中加入飽和NaHC03溶液(40ml)使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至 100ml (終pH: 9.5);持續(xù)攪拌過夜。將pH調(diào)高至lO，混懸液攪拌3天， 由此大部分固體被溶解。所得溶液進(jìn)行超濾后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。 該溶液經(jīng)冷凍干燥后得到白色固體207mg。 NMR氫鐠測(cè)得總曱磺酸根 DS為37。/。摩爾/摩爾，NMR碳譜測(cè)得伯位甲磺酸根為37%摩爾/摩爾，C6 位點(diǎn)選擇性為100%。
實(shí)施例21: 6-(9-曱磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在氮?dú)庀孪?00mg (0.806mmo1) HA TBA鹽(MW 20，000)溶于20 ml N-甲基J-吡咯烷酮的溶液中攪拌加入W^L (4.84mmol) D正A。接著在 室溫下滴加MsCl (188jliL; 2.42mmo1)，從而形成黃色溶液。室溫?cái)嚢? 小時(shí)后，向反應(yīng)混合液中加入飽和NaHCO3溶液(40ml)使反應(yīng)猝滅，用 水調(diào)節(jié)總體積至100ml (終pH: 9.5);持續(xù)攪拌過夜。所得溶液進(jìn)行超濾 后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。該溶液經(jīng)冷凍干燥后得到白色固體310mg。 NMR氫譜測(cè)得總甲磺酸根DS為50%摩爾/摩爾，NMR碳譜測(cè)得伯位甲 磺酸根為31%摩爾/摩爾，C6位點(diǎn)選擇性為62%。
實(shí)施例22: 6-(9-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在-10。C下氮?dú)庵邢?00mg (0.806mmol) HA TBA鹽(MW 20,000)溶 于20 ml N-甲基-2-p比咯烷酮的溶液中攪拌加入829|iL (4.84mmol) D正A。 接著滴加MsCl (188pL; 2.42mmo1),所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向 反應(yīng)混合液中加入飽和NaHCO3溶液(40ml)使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體 積至100ml (終pH: 9.5);持續(xù)攪拌過夜。所得溶液進(jìn)行超濾后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。該溶液經(jīng)冷凍干燥后得到白色固體250mg。 NMR氫譜測(cè) 得總曱磺酸根DS為41。/。摩爾/摩爾，NMR碳鐠測(cè)得伯位甲磺酸根為39% 摩爾/摩爾，C6位點(diǎn)選擇性為95。/。。 HSQCNMR譜驗(yàn)證了該選擇性。 實(shí)施例23: 6-(9-甲磺酰透明質(zhì)酸(HA-Ms)的制備 在(TC下氮?dú)庵邢?00mg (0.806mmo1) HA TBA鹽(MW 20,000)溶于 20 ml N-甲基-2-p比咯烷酮的溶液中攪拌加入829juL (4.84mmo1) DIEA。接 著滴加MsCl(188pL;2.42mmo1)，所得混合液于0。C攪拌1小時(shí)。向反應(yīng) 混合液中加入飽和NaHCO3溶液(40ml)使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至 100ml (終pH: 9.5);持續(xù)攪拌過夜。所得溶液進(jìn)行超濾后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā) 器中濃縮。該溶液經(jīng)冷凍干燥后得到白色固體275mg。 NMR氬譜測(cè)得總 甲磺酸根DS為44。/。摩爾/摩爾，NMR碳譜測(cè)得伯位甲磺酸根為40%摩爾 /摩爾，C6位點(diǎn)選擇性為90%。
實(shí)施例24: 6-(9-氨甲喋呤基透明質(zhì)酸的制備
將實(shí)施例10制備的HA-OMs:TBA鹽(500mg; 0.73mmol)溶于DMSO (15 ml)的溶液用氨甲喋呤(833mg; 1.83mmol)溶于DMSO (10ml)并含固體 碳酸銫(596mg; L83mmol)的溶液進(jìn)行處理?；旌弦河?0。C氮?dú)庵袛嚢?18h,由于生成固體而致溶液顏色變深。此后將其冷卻至室溫，倒入100ml 水(pH6.5)中，用15ml飽和NaCl溶液進(jìn)行處理，攪拌1.5h。過濾除去固 體，溶液經(jīng)超濾、濃縮并冷凍干燥后得到黃褐色固體131mg。經(jīng)NMR 檢測(cè)MTX的DS: 40%摩爾/摩爾；13C NMR顯示有40% C6被修飾。經(jīng) HPLC檢測(cè)為32°/0 w/w,相當(dāng)于40%摩爾/摩爾。此外，NMR還發(fā)現(xiàn)由 于被MTX取代，除了某些C-6位點(diǎn)而外，化合物不含任何殘留的仲位 甲磺?；鶊F(tuán)并且HA的基本結(jié)構(gòu)無(wú)改變。該結(jié)果表明任何可能在甲磺酰
化反應(yīng)過程中引入仲位(C-4,C-2，,C-3，)的離去基團(tuán)(甲磺酸根)已在置換 反應(yīng)中的堿性條件下被水解，該水解反應(yīng)可能是直接水解，也可通過生 成2',3，-酸酐后以這些位點(diǎn)保持構(gòu)型不變的方式進(jìn)行水解來完成。對(duì)同一 樣品在保存3個(gè)月后再次在室溫下進(jìn)行NMR譜檢測(cè)，其提供的峰值和 強(qiáng)度與新鮮制備樣品得到的結(jié)果相同，由此表明取代度得以保持并且無(wú) 副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例25: HA-C1: TBA鹽的制備
在氮?dú)庀聦?0g透明質(zhì)烷鈉鹽混懸于900 mL無(wú)水二曱基酰胺中，于 20。C進(jìn)行機(jī)械攪拌。接著混懸液冷卻至-10。C,在30min內(nèi)加入97mL甲 磺酰氯。繼續(xù)于-10。C放置30min后，把溫度升至20。C。 lh后溫度逐漸 升至(在lh內(nèi))60°C,繼續(xù)攪拌18h。之后把反應(yīng)混合液分批倒入冰與 義灰酸鈉溶液(4 L,初始pH41)的混合物中并充分混合，按需加入1.5 M NaOH使pH值保持在9左右。所得褐色混懸液(終體積6 L)于pH 9.5 室溫?cái)嚢?8h,而后形成澄清溶液。該溶液經(jīng)過濾除去固體后進(jìn)行超濾(10 KDa截留濾膜)。所得溶液在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮至終體積1升，再用載 有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理。經(jīng)冷凍干燥后得到灰白色固體 HA-6-C1: TBA鹽46.7g (13C NMR測(cè)得DS為64%摩爾/摩爾)。
實(shí)施例26: HA-布洛芬的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例12制備的HA-Ms:TBA鹽(400mg; 0.64mmol)和布洛芬(333mg; 1.61mmol)攪拌溶于DMSO (16ml)中。加入固 體碳酸銫(264mg; 0.81mmo1)，混懸液加熱至70。C攪拌20h。把所得橙黃 色溶液倒入150ml水(pH為6.5)中，加入10ml飽和NaCl溶液。攪拌30min 后，溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體0.15g。 NMR氬語(yǔ)測(cè)
得DS: 27%摩爾/摩爾。
實(shí)施例27: HA-布洛芬的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例25制備的HA-C1:TBA鹽(lg; L6mmol)和 布洛芬(670mg; 3.2mmol)攪拌溶于DMSO (50ml)中。加入固體碳酸銫 (264mg; 0.81mmo1),混懸液加熱至80。C攪拌40h。把所得深黃色溶液倒 入100ml水(pH為8)中，再進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到淡褐色固體 g。 NMR氬譜測(cè)得DS: 20%摩爾/摩爾。
實(shí)施例28: HA-音霉素G的制備
將實(shí)施例12制備的HA-Ms:TBA鹽(400mg; 0.64mmo1)、 18-冠-6 (338 mg; 1.28mmol)和青霉素G鈉鹽(574mg; 1.61mmol)溶于DMSO (16ml)的 溶液加熱至70。C攪拌20h。
把所得黃色溶液倒入150ml水(pH為6.5)中，加入10ml飽和NaCl 溶液。攪拌30min后，溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體 0.29g。 NMR氬譜測(cè)得DS: 26%摩爾/摩爾。
實(shí)施例29: HA-青霉素G的制備
室溫下將實(shí)施例25制備的HA- C1:TBA鹽(lg; 1.6mmo1)、 18-冠-6 (840 mg; 3.2mmol)和青霉素G鈉鹽(1.13g; 3.2mmo1)攪拌溶于DMSO (50ml)。溶液加熱至80。C攪拌40h，之后倒入100ml水(pH為7.4)中，對(duì) 溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍千燥得到淺黃色固體lg (產(chǎn)率64% )。 NMR !U普測(cè)4f DS: 6%摩爾/摩爾。
實(shí)施例30: HA-白蛋白的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例25制備的HA- C1:TBA鹽(lg; 1.6mmol)和 人血清白蛋白(300mg)攪拌溶于DMSO (50ml)。加入固體碳酸銫(264mg;
0.81mmol),混懸液加熱至80。C攪拌40h。把所得褐色溶液倒入100ml 水(pH為9.5)中，對(duì)溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到淺褐色固體0.9g。 HPLC RP測(cè)得DS: 5%摩爾/摩爾。
實(shí)施例31: 6-0-氨曱喋呤基透明質(zhì)酸的制備
在氮?dú)庀聦A:TBA鹽(250mg; 0.403mmol; MW 20，000)攪拌下并輕 孩吏加熱溶于DMSO (10 ml);室溫加入三乙胺(452)nL; 3.22mmol)后滴加 MsCl (157|iL; 2.02mmo1),從而形成黃色溶液。室溫?cái)嚢鑜h后，再加入 0.50ml三乙胺，把反應(yīng)瓶與真空相連，輕微加熱至50°C (浴槽溫度)， 直到放氣停止。接著加入1.1 Og (2.43mmol)氨甲喋呤和792mg (2.43mmo1) 碳酸銫，混合液于8(TC攪拌過夜。把一半反應(yīng)混合液倒入pH6.3的水中 (20ml )使反應(yīng)猝滅。采用飽和NaHC03溶液調(diào)節(jié)pH到6.8,再加入10ml 飽和NaCl溶液。攪拌10min后，對(duì)溶液進(jìn)行超濾、于旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃 縮并冷凍干燥后得到黃色固體60mg。經(jīng)HPLC檢測(cè)MTX DS為11.6% w/w，并經(jīng)NMR檢測(cè)驗(yàn)證(12。/o摩爾/摩爾)，結(jié)果也顯示聚合物中僅留有 少量甲磺酸根。
其余反應(yīng)混合液于80。C繼續(xù)反應(yīng)24h (總共40h)后按上述操作進(jìn) 行處理，得到黃色固體103mg。經(jīng)HPLC檢測(cè)MTX的DS為14.4% w/w, 經(jīng)NMR檢測(cè)驗(yàn)證(15%摩爾/摩爾)，結(jié)果顯示聚合物無(wú)甲磺酸根殘留。 MW是269610， PI是10.5。將冷凍干燥的產(chǎn)物置于10ml碳酸鹽緩沖液(pH 10)中水解8h以切斷交聯(lián)酯鍵。經(jīng)中和及滲析后，冷凍干燥得到黃色固 體96mg。經(jīng)HPLC檢測(cè)產(chǎn)物中的MTXDS為12.6%w/w,同時(shí)經(jīng)NMR 檢測(cè)驗(yàn)證(13%摩爾/摩爾)；MW是27，120，PI是1.9。
實(shí)施例32: 6-0-氨曱喋呤基透明質(zhì)酸的制備
于-10。C N2流中向HATBA(50g，Mw70，000)溶于1000ml無(wú)水DMF 的溶液中在lh時(shí)間內(nèi)攪拌滴加甲磺酰氯(10當(dāng)量)?；旌弦菏覝胤胖?小 時(shí)，再加熱至60。C持續(xù)16小時(shí)。該處理獲得HA-CL 46.9 g,其氯含量 為4.2%w/w(13C-NMR)。
HA-C1 TBA鹽(20 g)溶于DMSO (1.25 L)的溶液加入MTX (29.3g) 和碳酸銫(21 g)于80。C處理40h,得到黃色固體5.6 g。
"C-NMR語(yǔ)證實(shí)iV-乙?；?D-葡糖胺第6位點(diǎn)的化學(xué)鍵64 ppm處 峰值被認(rèn)定是￡H20-MTX得出的，與親本氯衍生物相比，其強(qiáng)度相當(dāng)于 44ppm處峰值(Ol2Cl)所P爭(zhēng)低的值。MTX含量為18.8%w/w(HPLC);游 離MTX為0.1% w/w,水含量8.2% w/w; MW: ll，OOO; PI: 1.4。此外， NMR發(fā)現(xiàn)存在殘留氯，其含量為1.76%w/w。
實(shí)施例33: 6-(9-甲磺酰透明質(zhì)酸TBA鹽(HA-Ms:TBA)的制備
于-10。C N2流中向5.0g (8.1 mmol) HA:TBA (MW 5，000)溶于100 mL 無(wú)水DMF的溶液中攪拌加入3.1 mLDIEA(5.62 mL， 33.9 mmol)。接著滴 加MsCl (1.25 mL; 16.1 mmol),所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向反 應(yīng)混合液中加入飽和NaHC03溶液(200ml) 4吏反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體 積至1L;采用稀釋HCl溶液調(diào)節(jié)pH到10.5,持續(xù)攪拌過夜。所得溶液 進(jìn)行超濾后置旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分冷凍干燥(100mg)供NMR 檢測(cè)經(jīng)NMR檢測(cè)其伯位甲磺酸根為30。/。摩爾/摩爾，C6選擇性為100%。 (3.2 g;Mw: 6,925; P.I. 1.87)
實(shí)施例34: 6-0-曱磺酰透明質(zhì)酸TBA鹽(HA-Ms:TBA)的制備
于-10。C N2流中向10.0g (16.1mmo1) HA TBA鹽(MW 20，000)溶于 250 ml DMF的溶液中攪拌加入7.58ml (44.3mmol)DIEA。接著滴加MsCl (1.56mL; 20.1mmol)，所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合液中 加入飽和NaHCO3溶液(400ml)使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至2L;采 用稀釋HC1溶液調(diào)節(jié)pH到10.5,持續(xù)攪拌過夜。所得溶液經(jīng)超濾后置 旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分冷凍干燥(100mg)供NMR檢測(cè)經(jīng)NMR 檢測(cè)其伯位甲磺酸根為24%摩爾/摩爾，C6選擇性為100%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 白色固體9.92g (HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例35: HA-C1:鈉鹽的制備
在氮?dú)庀聦?g透明質(zhì)酸鈉鹽(MW 200，000)混懸于90 mL無(wú)水二曱基 甲酰胺中，于20。C進(jìn)行機(jī)械攪拌。接著混懸液冷卻至-10。C,在30min 內(nèi)加入9.7 mL曱磺酰氯。繼續(xù)于-10。C放置30min后，溫度升至20。C。 lh后溫度逐漸升至(在lh內(nèi))60°C，繼續(xù)攪拌18h。之后把反應(yīng)混合液 分批倒入冰與碳酸鈉溶液(400 mL，初始pH=ll)的混合物中并充分混合， 按需加入1.5 MNaOH使pH值保持在9左右。所得褐色混懸液(終體積 500 mL )于pH 9.5室溫?cái)嚢?8h，而后形成澄清溶液。該溶液經(jīng)過濾除 去固體后進(jìn)行超濾(IO KDa截留濾膜)。所得溶液經(jīng)濃縮并冷凍干燥后得 到灰白色固體的HA-6-C1:鈉鹽4.05g (13C NMR測(cè)得DS為17%摩爾/摩 爾)。MW是79,560， RI.是3.5。
實(shí)施例36: HA-C1:鈉鹽的制備
在氮?dú)庀聦?g透明質(zhì)酸鈉鹽(MW 500，000)混懸于90 mL干燥二甲基 酰胺中，于20。C進(jìn)行機(jī)械攪拌。接著混懸液冷卻至-10。C，在30min內(nèi)加 入9.7mL曱磺酰氯。繼續(xù)于-10。C放置30min后，溫度升至20。C。 lh后 溫度逐漸升至(在lh內(nèi))70°C,繼續(xù)攪拌21h。之后把反應(yīng)混合液分批
倒入冰與碳酸鈉溶液(400mL，初始pH-ll)的混合物中并充分混合，按需 加入1.5 M NaOH使pH值保持在9左右。所得褐色混懸液(終體積500 mL)于pH9.5室溫?cái)嚢?8h，而后形成澄清溶液。該溶液經(jīng)過濾除去固 體后進(jìn)行超濾(IO KDa截留濾膜)。所得溶液經(jīng)濃縮并冷凍干燥后得到灰 白色固體的HA-6-Cl:鈉鹽3.56g("CNMR測(cè)得DS為10%摩爾/摩爾)。 MW是53,830， P.I.是4.02。
實(shí)施例37: 6-(9-曱磺酰透明質(zhì)酸TBA鹽OIA-Ms:TBA)的制備 于國(guó)10。C氮?dú)庵邢?0.0g(16.1mmol)HATBA鹽(MW 180，000)溶于 500 ml DMF的溶液中攪拌加入9.16ml (53.4mmol) DIEA。接著滴加MsCl (1.87mL; 24.2mmol)，所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合液中 加入飽和NaHC03溶液(40011110使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至2L;采 用稀釋HCl溶液調(diào)節(jié)pH到10.5,持續(xù)攪拌過夜。所得溶液經(jīng)超濾后置 旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分冷凍干燥(150mg)供NMR檢測(cè)經(jīng)NMR 檢測(cè)其伯位曱磺酸根為30%摩爾/摩爾，C6選擇性為100%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 白色固體9.80g (HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例38: 6-0-甲磺酰透明質(zhì)酸TBA鹽(HA-Ms:TBA)的制備 于-10。C氮?dú)庵邢?0.0g (32.2mmo1) HA TBA鹽(MW 180,000)溶于 1000 ml DMF的溶液中攪拌加入36.7ml (214mmol) D正A。接著滴加MsCl (7.48rnL; 97mmol)，所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合液中加 入飽和NaHC03溶液(800mL)使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至4L;采用 稀釋HC1溶液調(diào)節(jié)pH到10.5，持續(xù)攪拌過夜。所得溶液經(jīng)超濾后置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分冷凍干燥(120mg)供NMR檢測(cè)經(jīng)NMR
檢測(cè)伯位曱磺酸根為55%摩爾/摩爾，C6選擇性為100%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 白色固體19.95g (HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例39: 6-(9-甲磺酰透明質(zhì)酸TBA鹽(HA-Ms:TBA)的制備 于-10。C氮?dú)庵邢?.00g (3.22mmo1) HA TBA鹽(MW 500,000)溶于 150 ml DMF的溶液中攪拌加入3.67ml (21.4mmol) DIEA。接著滴加MsCl (750nL; 9.7mmol),所得混合液于-10。C攪拌1小時(shí)。向反應(yīng)混合液中加 入飽和NaHCO3溶液(80mL)使反應(yīng)猝滅，用水調(diào)節(jié)總體積至1L;采用 稀釋HCl溶液調(diào)節(jié)pH到10.5,持續(xù)攪拌過夜。所得溶液經(jīng)超濾后置旋 轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮。取小部分冷凍干燥(90mg)供NMR檢測(cè)經(jīng)NMR檢 測(cè)伯位甲磺酸根為70%摩爾/摩爾，C6選擇性為100%。
其余溶液經(jīng)載有TBA的離子交換樹脂IRA-120處理后冷凍干燥得到 白色固體1.94g (HA-Ms:TBA鹽)。
實(shí)施例40: 6-(9-氨甲喋呤基透明質(zhì)酸的制備
將實(shí)施例34制備的HA-OMs:TBA鹽(8.0g; 12.9mmol)溶于DMSO (250 ml)的溶液用氨甲喋呤(14.66g; 32.3mmol)溶于DMSO (150ml)并含固 體碳酸銫(10.5g; 32.2mmol)的溶液進(jìn)行處理?；旌弦河?0。C氮?dú)庵袛嚢?20h。此后將其冷卻至室溫，倒入^ 友酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH到9.7且體 積至2L。攪拌18h后，溶液經(jīng)中和、過濾、超濾、濃縮并冷凍干燥后得 到黃色固體4.70g。經(jīng)NMR檢測(cè)MTX的DS: 7.5%摩爾/摩爾；MW是 27,960, RI.是1.92。
實(shí)施例41: 6-(9-氨甲喋呤基透明質(zhì)酸的制備
將實(shí)施例37制備的HA-OMs:TBA鹽(7.0g; 11.3mmol)溶于DMSO
(670 ml)的溶液用氨曱喋呤(12.79g; 28.1mmol)溶于DMSO (120ml)并含固 體碳酸銫(義15g; 28.1mmol)的溶液進(jìn)行處理?；旌弦河?5。C氮?dú)庵袛嚢?18h。此后將其冷卻至室溫，倒入碳酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH到8.8且體 積至2.5L。攪拌24h后，溶液經(jīng)中和、過濾、超濾、濃縮并冷凍干燥后 得到黃色固體4.30g。經(jīng)NMR檢測(cè)MTX的DS: 13%摩爾/摩爾；MW 是208,400， P.I.是2.18。
實(shí)施例42: 6-(9-氨甲喋呤基透明質(zhì)酸的制備
將實(shí)施例38制備的HA-OMs:TBA鹽(13.2g; 21.3mmol)溶于DMSO (1270 ml)的溶液用氨甲喋呤(24.13g; 53.1mmol)溶于DMSO (120ml)并含 固體碳酸銫(17.26g; 53.1mmol)的溶液進(jìn)行處理。混合液于75。C氮?dú)庵袛?拌18h。此后將其冷卻至室溫，倒入> 友酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH到10.0 且體積至5L。攪拌18h后，溶液經(jīng)中和、過濾、超濾、濃縮并冷凍干燥 后得到黃色固體6.52g。經(jīng)NMR檢測(cè)MTX的DS: 20%摩爾/摩爾；MW 是217,300， P.I.是2.02。
實(shí)施例43: 6-(9-氨曱喋呤基透明質(zhì)酸的制備
將實(shí)施例39制備的HA-OMs:TBA鹽(500mg; 0.74mmol)溶于DMSO (80 ml)的溶液用氨曱喋呤(1.01g; 2.23mmol)溶于DMSO (10ml)并含固體 碳酸銫(1.01g; 2.23mmol)的溶液進(jìn)行處理?；旌弦河?0。C氮?dú)庵袛嚢?22h。此后將其冷卻至室溫，倒入碳酸鹽緩沖液中，調(diào)節(jié)pH到10.0且體 積至400mL。攪拌18h后，溶液經(jīng)中和、過濾、超濾、濃縮并冷凍干燥 后得到黃色固體260mg。經(jīng)NMR檢測(cè)MTX的DS: 11%摩爾/摩爾；MW 是460,100， P丄是2.21。
實(shí)施例44: 6-(9-氨甲喋呤基透明質(zhì)酸的制備
將實(shí)施例33制備的HA-OMs鈉鹽(1.0g; 2.0 mmol)溶于DMSO (40 ml) 的溶液用氨甲喋呤(1.83 g; 4mmol)溶于DMSO (40ml)并含固體碳酸銫 (1.30g; 2mmol)的溶液進(jìn)行處理?；旌弦河?0。C氮?dú)庵袛嚢?0h。采用 Na2C03飽和溶液中和該溶液并調(diào)終體積至500 mL,經(jīng)過濾、超濾、濃 縮并冷凍干燥后得到黃色固體500mg。經(jīng)HPLC檢測(cè)MTX的DS: 7.8% w/w; MW是16,000, RI.是2.4。
實(shí)施例45: HA-布洛芬的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例20制備的HA-Ms:TBA鹽(500mg; 0.80mmol)和布洛芬(416mg; 2.01mmol)攪拌溶于DMSO (20ml)中。加入固 體碳酸銫(330mg; l.Olmmol),混懸液加熱至70。C攪拌20h。把所得溶液 倒入200ml水(pH為6.5)中，加入10ml飽和NaCl溶液。攪拌30min后， 溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體0.22g。 NMR氫譜測(cè)得DS: 30%摩爾/摩爾。
實(shí)施例46: HA-萘普生的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例20制備的HA-Ms:TBA鹽(500mg; 0.80mmol)和萘普生(463mg; 2.01mmol)攪拌溶于DMSO (20ml)中。加入固 體碳酸銫(330mg; l.Olmmol)，混懸液加熱至70。C攪拌20h。把所得溶液 倒入200ml水(pH為6.6)中，加入10ml飽和NaCl溶液。攪拌30min后， 溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體0.27g。 NMR氫譜測(cè)得DS: 28%摩爾/摩爾。
實(shí)施例47: HA-賴諾普利的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例20制備的HA-Ms:TBA鹽(500mg; 0.80mmol)和賴諾普利(887mg; 2.01mmol)攪拌溶于DMSO (25ml)中。加入
固體碳酸銫(655mg; 2.01mmol),混懸液加熱至70。C攪拌20h。把所得溶 液倒入200ml水(pH為6.5)中，加入10ml飽和NaCl溶液。攪拌30min 后，混合液經(jīng)過濾、超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體0.20g。 NMR 氬譜測(cè)得DS: 26%摩爾/摩爾。
實(shí)施例48: HA-萘咬酸鹽的制備
室溫下于氮?dú)庵袑?shí)施例20制備的HA-Ms:TBA鹽(500mg; 0.80mmol)和賴諾普利(467mg; 2.01mmol)攪拌溶于DMSO (20ml)中。加入 固體碳酸銫(330mg; l.Olmmol)，混懸液加熱至70。C攪拌20h。把所得溶 液倒入200ml水(pH為6.6)中，加入10ml飽和NaCl溶液。攪拌30min 后，溶液經(jīng)超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體0.26g。 NMR氬譜測(cè)得 DS: 30%摩爾/摩爾。
實(shí)施例49: HA-青霉素G的制備
將實(shí)施例20制備的HA-Ms:TBA鹽(400mg; 0.64mmo1)、 18-冠-6 (338 mg; 1.28mmol)和青霉素G鈉鹽(574mg; 1.61mmol)溶于DMSO (16ml)的 、溶液加熱至70。C攪拌20h。
把所得黃色溶液倒入150ml水(pH為6.5)中，加入10ml飽和NaCl 溶液。攪拌30min后，溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體 0.27g。 NMR氬譜測(cè)得DS: 31%摩爾/摩爾。 - 實(shí)施例50: HA-頭孢唑林的制備
將實(shí)施例20制備的HA-Ms:TBA鹽(400mg; 0.64mmo1)、 18-冠-6 (338 mg; 1.28mmol)和頭孢唑林鈉鹽(767mg; 1.61mmol)溶于DMSO (18ml)的 溶液加熱至70。C攪拌20h。
把所得黃色溶液倒入180ml水(pH為6.7)中，加入10ml飽和NaCl
溶液。攪拌30min后，溶液進(jìn)行超濾、濃縮并冷凍干燥得到白色固體 0.25g。 NMR氬譜測(cè)得DS: 29%摩爾/摩爾。
權(quán)利要求
1.由透明質(zhì)酸和治療活性劑組成的藥物輸送系統(tǒng)，其中該活性劑與透明質(zhì)酸的N-乙?；?D-葡糖胺殘基的C-6位共價(jià)結(jié)合，其中所述活性劑除化學(xué)式(I)活性劑之外:其中:R2和R4分別各自代表:-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O；X和Y代表:-C(R5)＝、-CH(R5)-、-NH-、-N＝)，其中R5代表:-H、C1-C5烷基；Z代表:-CH(R10)-、-N(R10)-、-O-，其中R10代表:-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、有1-3個(gè)雜原子的5-6元雜環(huán)，其中雜原子選自氮、硫和氧；Ar代表1，4-苯基、與一個(gè)或多個(gè)5-6元芳香環(huán)稠合的1，4-苯基、與一個(gè)或多個(gè)5-6元雜環(huán)稠合的1，4-苯基，其中所述Ar可能被R2取代；環(huán)A和b可分別各自為芳香環(huán)或非芳香環(huán)。
2.如權(quán)利要求1的DDS,其中透明質(zhì)酸和活性劑之間的化學(xué)鍵是酯 鍵、氨基鍵、醚鍵、硫醚鍵、酰胺鍵，優(yōu)選為酯鍵。
3.如權(quán)利要求1-2的DDS,其中治療活性劑選自屬于多種不同治療 種類的藥物鎮(zhèn)痛藥、抗高血壓藥、麻醉藥、利尿藥、支氣管擴(kuò)張藥、 鈣通道阻滯藥、膽石咸能藥、CNS藥、雌激素、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑、 抗脂肪藥、抗焦慮藥、抗?jié)兯帯⒖龟P(guān)節(jié)炎藥、抗心絞痛藥、抗生素、 抗炎藥、抗病毒藥、溶血栓藥、血管擴(kuò)張藥、解熱藥、抗抑郁藥、安定 藥、抗腫瘤藥、粘液溶解藥、麻醉拮抗劑、激素、抗驚厥藥、抗組胺藥、 抗真菌藥、抗4艮屑病藥。(優(yōu)選抗炎藥、抗生素、抗腫瘤藥)
4. 如權(quán)利要求1-3的DDS，其中活性劑的含量占DDS總重的0.1-60% w/w (優(yōu)選1-50%)。
5. 如權(quán)利要求1-4的DDS,其中透明質(zhì)酸的仲羥基經(jīng)衍生化形成基 團(tuán)選自-OR 、 -OCOR 、 -S02H 、 -OP03H2 、 -0-CO-(CH2)n-COOH 、 -0-(CH2)n-OCOR,其中n是l-4， R是C廣C^烷基、-NH2、 -NHCOCH3。
6. 如權(quán)利要求1-5的DDS,其可為酸性形式或與堿金屬或堿土金屬 或過渡金屬成鹽。
7. 將如權(quán)利要求1-6的藥物輸送系統(tǒng)用于生產(chǎn)藥劑。
8. 包含如權(quán)利要求1-7的藥物輸送系統(tǒng)并與藥學(xué)可接受的賦形劑和/ 或稀釋劑混合的藥物組合物。
9. 為可注射形式的如權(quán)利要求8的藥物組合物。
10. 制備如權(quán)利要求1-6的藥物輸送系統(tǒng)的方法，該方法包括以下 反應(yīng)步驟(a) 在游離形式或鹽形式透明質(zhì)酸的iV-乙?；?D-葡糖胺單元中的 C-6位引入離去基團(tuán)以獲得HA-6-活化物；(b) 通過以治療活性劑上所含的親核基團(tuán)置換離去基團(tuán)(HA的C6 位)使得HA-6-活化物的C6位與治療活性劑之間形成化學(xué)鍵，從而得到 HA-6-治療活性劑；(c) 從步驟(b)中所得的HA-6-治療活性劑上置換任意未取代離 去基團(tuán)；(d) 回收HA-6-治療活性劑。
11. 如權(quán)利要求10的方法，其中將步驟(a)所得HA-6-活化物從 反應(yīng)混合物中分離出，再根據(jù)步驟(b)與治療活性劑反應(yīng)。
12. 如權(quán)利要求10的方法，其中將步驟(a)所得含HA-6-活化物 的反應(yīng)混合物直接進(jìn)行步驟(b)反應(yīng)。
13. 如權(quán)利要求10-12的方法，其中引入HA的iV-乙?；?D-葡糖胺 單元C-6位的離去基團(tuán)選自磺酸根基團(tuán)、膦酸根基團(tuán)(三苯基膦酸根)、 氰化物(CN-)、亞硝酸根(N02-)、卣素(優(yōu)選氯)、硫酸根基團(tuán)、卣代硫 酸根基團(tuán)、硝酸根、囟代亞硫酸根(氯代亞硫酸根)。
14.制備如權(quán)利要求1-6的藥物輸送系統(tǒng)的方法，該方法包括以下 反應(yīng)步驟(a) 向鹽形式HA的W-乙酰基-D-葡糖胺單元C-6位引入磺酸根基 團(tuán)，以獲得HA-6-磺?；铮?b) 通過以治療活性劑上的親核基團(tuán)置換HA C6位的磺?；鶊F(tuán)， 使得HA-6-磺?；锏腃6位與治療活性劑之間形成化學(xué)鍵，從而得到 HA-6-治療活性劑；(c) 回收HA-6-治療活性劑。
15. 如權(quán)利要求14的方法，其中透明質(zhì)酸和治療活性劑之間的化 學(xué)鍵是酯鍵、氨基鍵、醚鍵、硫醚鍵、酰胺鍵。
16. 如權(quán)利要求15的方法，其中透明質(zhì)酸和治療活性劑之間的化 學(xué)鍵是酯鍵。
17. 如權(quán)利要求14-16的方法，其中用于引入磺酸根基團(tuán)的試劑是 含有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿(優(yōu)選有機(jī)堿)的烷基-或芳基-磺酰卣(優(yōu)選磺酰氯)。
18. 如權(quán)利要求17的方法，其中試劑為曱磺酰氯或甲苯-對(duì)-磺酰氯， 有機(jī)堿是二異丙基乙胺或三乙胺。
19. 包含透明質(zhì)酸和化學(xué)式(I)化合物的藥物輸送系統(tǒng)，其中，化 學(xué)式(I)化合物的羧基通過酯鍵的方式與透明質(zhì)酸的TV-乙?；?D-葡糖 胺殘基的C-6位共價(jià)連接，<formula>formula see original document page 6</formula>formula①獲得所述DDS的方法包括以下反應(yīng)步驟(a) 在游離形式或鹽形式透明質(zhì)酸的,乙?；?D-葡糖胺單元C-6 位引入離去基團(tuán)以得到HA-6-活化物，該離去基團(tuán)選自磺酸才艮基團(tuán)、膦 酸根基團(tuán)(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亞硝酸根(N02-)、硫酸根基 團(tuán)、卣代硫酸根基團(tuán)(優(yōu)選氯代硫酸根)、硝酸根、囟代亞硫酸根(氯代 亞硫酸根)；(b) 通過以化合物(I)上所含的羧基置換離去基團(tuán)(HA的C6位) 使得HA-6-活化物的C6位與化學(xué)式(I)的化合物之間形成酯鍵，從而 得到HA-6-化學(xué)式(I)化合物；(c) 回收HA-6-化學(xué)式(I)化合物。
20. 如權(quán)利要求19的DDS，其C6-DSw為1-50%之間，優(yōu)選5-40%。
21.如權(quán)利要求19-20的DDS，其中化學(xué)式(I)的化合物是氨甲喋呤。
22.如權(quán)利要求19-21的DDS，其中步驟(a)所得HA-6-活化從反應(yīng)混合物中分離，再按步驟(b)與治療活性劑反應(yīng)。
23. 如權(quán)利要求19-22的DDS，其中以步驟(a)所得含HA-6-活化 物的反應(yīng)混合物直接進(jìn)行步驟(b)反應(yīng)。
24. 如權(quán)利要求19-23的DDS,其中用于引入磺酸根基團(tuán)的試劑是 含有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿(優(yōu)選有機(jī)堿)的烷基-或芳基-磺酰卣(優(yōu)選磺酰氯)。
25. 如權(quán)利要求24的DDS,其中試劑為曱磺酰氯或甲苯-對(duì)-磺酰氯，有才;u威是二異丙基乙胺或三乙胺。
26. 將如權(quán)利要求19-25的DDS用于生產(chǎn)藥劑。
27. 包含如權(quán)利要求19-25的藥物輸送系統(tǒng)并與藥學(xué)可接受的賦形 劑和/或稀釋劑混合的藥物組合物。
28. 為可注射形式的如權(quán)利要求27的藥物組合物。
29. HA-6-活化物的獲得是通過在游離形式或鹽形式透明質(zhì)酸的W-乙?；?D-葡糖胺單元C-6位引入離去基團(tuán)，該離去基團(tuán)選自磺酸根基團(tuán)、 膦酸根基團(tuán)(三苯基膦酸根)、氰化物(CN-)、亞硝酸根(N02-)、硫酸根 基團(tuán)、閨代疏酸根基團(tuán)(優(yōu)選氯代硫酸根)、硝酸根、卣代亞硫酸根(氯 代亞硫酸根)。
30. 如權(quán)利要求29的HA-6-活化物，其中離去基團(tuán)是磺酸根基團(tuán)。
31. 如權(quán)利要求29-30的HA-6-活化物，其C6-DSm。!為10-91%之間。
32. 如權(quán)利要求29-30的HA-6-活化物，其C6-DS^為20-90%之間。
33. 如權(quán)利要求29-30的HA-6-活化物，其C6-DSmd為40-80%之間。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含透明質(zhì)酸和治療活性劑的藥物輸送系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101374531SQ200780003387
公開日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2007年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者埃爾米尼奧·穆拉諾, 斯特凡諾·諾爾貝多, 蘇珊娜·博西, 里亞·艾哈邁德·卡恩, 馬西莫·貝爾加明 申請(qǐng)人:歐蘭德制藥有限公司