高分子量透明質(zhì)酸的噴霧干燥的制作方法
【專利摘要】一種用于生產(chǎn)噴霧干燥的透明質(zhì)酸的方法，其包括：a）將透明質(zhì)酸噴霧干燥，其中噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的濃度在3.5g/l至7.0g/l的范圍內(nèi)；b）使噴霧干燥器進(jìn)料的溫度在0℃至100℃的范圍內(nèi)；且，其中噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量≥1200kDa。
【專利說明】高分子量透明質(zhì)酸的噴霧干燥
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多糖特別是透明質(zhì)酸或其鹽的噴霧干燥。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(HA)是一種天然的線性碳水化合物聚合物，屬于非硫酸化糖胺聚糖類。 其由P-1，3-N-乙酰葡糖胺和(6-1, 4-葡糖醛酸重復(fù)二糖單元組成，分子量(MW)達(dá)lOMDa。 HA見于透明軟骨、滑膜關(guān)節(jié)液和皮膚組織包括表皮和真皮層。
[0003]HA可提取自天然組織，包括脊椎動物的結(jié)締組織、人臍帶和雞冠。然而，現(xiàn)今優(yōu)選通過微生物方法制備透明質(zhì)酸，從而使傳播傳染性病原體的潛在風(fēng)險最小化，并提升產(chǎn)品一致性、質(zhì)量和可得性(US6，951，743)。
[0004]已鑒定HA在人體中的多種作用。它在生物有機(jī)體中發(fā)揮著重要作用，作為很多組織(如皮膚、腱、肌肉和軟骨)的細(xì)胞的機(jī)械支撐。HA參與關(guān)鍵生物過程，如組織潤燥 (moistening of tissue)以及潤滑。還猜測它在眾多生理功能如粘附、細(xì)胞運(yùn)動、癌癥、血管發(fā)生和傷口愈合中發(fā)揮作用。
[0005]由于HA獨特的物理和生物性質(zhì)(包括粘彈性、生物相容性和生物可降解性)，HA在大范圍的化妝品、眼科學(xué)、風(fēng)濕病學(xué)、藥物和基因傳遞、傷口愈合和組織工程學(xué)的當(dāng)前和開發(fā)應(yīng)用中得以采用。
[0006]W005/116531描述了一種噴霧干燥透明質(zhì)酸的方法(分子量為800kDa_參見實施例6)。
[0007]在對分子量比約1200kDa更高的透明質(zhì)酸進(jìn)行噴霧干燥時，可能出現(xiàn)明顯的分子
量損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及對高分子量透明質(zhì)酸進(jìn)行噴霧干燥的方法。該方法包括:
[0009]a)將透明質(zhì)酸噴霧干燥，其中噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的濃度在3.5g/l至 7.0g/1的范圍內(nèi)；
[0010]b)使噴霧干燥器進(jìn)料的溫度在(TC至100°C的范圍內(nèi)；且，
[0011]其中噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量≤1200kDa。
[0012]本發(fā)明的方法降低了經(jīng)噴霧干燥的透明質(zhì)酸產(chǎn)品的分子量損失。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明涉及對高分子量透明質(zhì)酸進(jìn)行噴霧干燥的方法。
[0014]誘明質(zhì)酸
[0015]“透明質(zhì)酸”是一種多糖，在本文中定義為由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)及葡糖醛酸 (GlcUA)的重復(fù)二糖單元組成的非硫酸化糖胺聚糖，其通過交替的(6-1, 4和(6-1, 3糖苷鍵連接在一起。透明質(zhì)酸也被稱作透明質(zhì)燒(hyaluronan)、透明質(zhì)酸鹽(hyaluronate)或HA。術(shù)語透明質(zhì)烷和透明質(zhì)酸在本文中可以互換使用。
[0016]雞冠是透明質(zhì)烷的重要商業(yè)來源。微生物是另外可選的來源。美國專利第
4,801, 539號公開了一種制備透明質(zhì)酸的發(fā)酵方法,其包含獸疫鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)的菌株。W003/054163公開了一種制備透明質(zhì)酸的發(fā)酵方法,其包含芽孢桿菌(Bacillus)宿主。 [0017]透明質(zhì)燒合酶被描述為來自脊椎動物、細(xì)菌病原體和藻類病毒(DeAngelis, P.L.,1999,Cell.Mol.Life Sc1.56:670-682)。W099/23227 公開了來自似馬鏈球菌 (Streptococcus equisimilis)的 I 組透明質(zhì)酸鹽合酶。W099/51265 和 W000/27437 描述了來自多殺性巴氏桿菌(Pasturella multocida)的II組透明質(zhì)酸鹽合酶。Ferretti等人公開了釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的透明質(zhì)燒合酶操縱子,其由三個基因hasA、 hasB和hasC組成，分別編碼透明質(zhì)酸鹽合酶、UDP葡萄糖脫氫酶和UDP葡萄糖焦磷酸化酶， (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.98，4658-4663，2001 )。W099/51265 描述了具有似馬鏈球菌透明質(zhì)烷合酶的編碼區(qū)的核酸片段。
[0018]由于重組芽孢桿菌細(xì)胞的透明質(zhì)烷直接表達(dá)至培養(yǎng)基中，可使用簡單的方法從培養(yǎng)基中分離透明質(zhì)烷。首先，從培養(yǎng)基中物理去除芽孢桿菌細(xì)胞和細(xì)胞碎片。如果期望，首先可將培養(yǎng)基稀釋，以降低培養(yǎng)基的粘性。用于從培養(yǎng)基去除細(xì)胞的許多方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如離心和微濾(microfiltration)。如果期望,然后可將剩余的上清液過濾，例如通過超濾，以濃縮透明質(zhì)烷并從中去除小分子污染物。去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片之后，通過已知機(jī)制從培養(yǎng)基簡單沉淀透明質(zhì)烷。鹽、醇或鹽和醇的組合可用于從濾液沉淀透明質(zhì)燒。
[0019]可以通過使用例如本發(fā)明的噴霧干燥法從任何溶液干燥透明質(zhì)烷，例如從濾液或從再溶解的溶液中干燥透明質(zhì)烷。
[0020]宿豐細(xì)朐
[0021]優(yōu)選的實施方式涉及第一方面的產(chǎn)品，其中以重組方式生產(chǎn)透明質(zhì)酸或其鹽，優(yōu)選通過革蘭氏陽性細(xì)菌或宿主細(xì)胞生產(chǎn)，更優(yōu)選通過芽孢桿菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)。
[0022]宿主細(xì)胞可以是任何適合于透明質(zhì)酸重組生產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞。芽孢桿菌宿主細(xì)胞可以是野生型芽孢桿菌細(xì)胞或其突變體?？稍诒景l(fā)明的實踐中使用的芽孢桿菌細(xì)胞包括但不限于，Bacillus agaraderhens、嗜喊芽抱桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽胞桿菌 (Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、堅強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽胞桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和蘇云金芽抱桿菌 (Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。W098/22598中記載了特別適于重組表達(dá)的突變枯草芽孢桿菌細(xì)胞。無被囊的(non-encapsulating)芽孢桿菌屬細(xì)胞在本發(fā)明中是特別有用的。
[0023]在優(yōu)選實施方式中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
[0024]牛.產(chǎn)[0025] 在本發(fā)明的方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于生產(chǎn)透明質(zhì)酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(如鏈球菌屬)或宿主細(xì)胞(如芽孢桿菌屬)。
[0026]例如，可在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。
[0027]使用本領(lǐng)域已知的步驟在包含碳源、氮源和無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或可以根據(jù)已公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。
[0028]可以按本領(lǐng)域已知的，例如使用改進(jìn)的咔唑方法(Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem.4:330-334)，來測定透明質(zhì)酸的水平。
[0029]分子量
[0030]可以按本領(lǐng)域已知的來測定透明質(zhì)酸的平均分子量。
[0031]特別地，可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法測定透明質(zhì)酸的平均分子量，例如由Ueno 等，1988, Chem.Pharm.Bull.36, 4971-4975;ffyatt, 1993, Anal.Chim.Acta272:1-40 ；和 Wyatt Technologies, 1999, “Light Scattering University DAWN Course Manual，，和 “DAWN EOS Manual，，Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California 所描述的那些方法。
[0032]透明質(zhì)酸的分子量測定也可采用GPC-R1-LS進(jìn)行，其中透明質(zhì)酸的分子量測定采用GPC聯(lián)用示差RI和多角度光散射檢測器進(jìn)行。
[0033]在優(yōu)選的實施方式中，噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量為至少1200kDa ； 特別地，噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至10，OOOkDa的范圍內(nèi)；優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至9，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至9，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至8，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至8，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至7，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在 1200kDa至7，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa 至6，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至 6，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至5，500kDa 的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至5，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至4，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至4，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至3，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至3，OOOkDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至2，900kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至2，800kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在 1200kDa至2，700kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa 至2，600kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至 2，500kDa的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至2，400kDa 的范圍內(nèi)；更優(yōu)選噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至2，300kDa的范圍內(nèi)；特別地，噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在1200kDa至2，200kDa的范圍內(nèi)。
[0034]在優(yōu)選的實施方式中，噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于15% ;例如，噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于14% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于13% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于12% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于11% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于10% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于9% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于8% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于7% ;噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于6% ;特別地， 噴霧干燥過程中透明質(zhì)酸的分子量損失低于5%。
[0035]HA 鹽
[0036]優(yōu)選的實施方式涉及包括透明質(zhì)酸的鹽的產(chǎn)品；特別是包含透明質(zhì)酸的無機(jī)鹽的產(chǎn)品；優(yōu)選包括透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅或透明質(zhì)酸鈷的產(chǎn)品。
[0037]衍?；腍A
[0038]根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行噴霧干燥的透明質(zhì)酸可以如本領(lǐng)域已知的進(jìn)行衍生化或修飾。
[0039]HA可以以多種不同方式進(jìn)行衍生化或修飾，例如，如在W02007/033677中所描述的，其中透明質(zhì)酸(HA)可與芳基或烷基琥珀酸酐(ASA)反應(yīng)，產(chǎn)生包括n個重復(fù)單元且在 PH8-9下具有結(jié)構(gòu)通式(I)的芳基/烷基琥珀酸酐HA衍生物:
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)噴霧干燥的透明質(zhì)酸的方法，包括:a)將透明質(zhì)酸噴霧干燥，其中噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的濃度在3.5g/l至7.0g/ I的范圍內(nèi)；b)使所述噴霧干燥器進(jìn)料的溫度在0°C至100°C的范圍內(nèi)；且其中所述噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量> 1200kDa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸是透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸的鹽選自透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、 透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸鈣、透明質(zhì)酸鎂、透明質(zhì)酸鋅和透明質(zhì)酸鈷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述噴霧干燥器進(jìn)料中的透明質(zhì)酸的分子量在 1200kDa 至 10，OOOkDa 的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸是衍生化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述衍生化的透明質(zhì)酸是芳基/烷基琥珀酸酐透明質(zhì)酸或丙烯酸酯化的透明質(zhì)酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用旋轉(zhuǎn)式霧化器或雙流體噴嘴(TFN)噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中使用以下條件進(jìn)行噴霧干燥:進(jìn)口溫度:100~200°C ;及出口溫度:40~95°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中噴霧干燥過程中的分子量損失少于15%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述噴霧干燥器進(jìn)料還包括活性成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述噴霧干燥器進(jìn)料還包括賦形劑。
【文檔編號】C08L5/08GK103562229SQ201280026410
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月30日
【發(fā)明者】K.特梅拉斯, P.巴赫 申請人:諾維信生物制藥丹麥公司