一種利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于：在反應(yīng)容器中加入配制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=Cl,CN或OR)、異丙醇、重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞，于溫度25℃～40℃下攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜方法（GC）檢測反應(yīng)進(jìn)程，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%～100％時結(jié)束反應(yīng)，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羥基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)。本發(fā)明反應(yīng)步驟簡單、成本較低、產(chǎn)品純度高，可大規(guī)模生產(chǎn)(3R,5S/R)-6-X-3,5-二羥基己酸叔丁酯2(X=Cl,CN或OR)的綠色生物制備方法。
【專利說明】一種利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物不對稱合成領(lǐng)域，具體涉及一種利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]他汀類藥物是目前世界上最暢銷的藥物大類，它對膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶3-羥基-3-甲基輔酶A (HMG-CoA)還原酶具有強烈的抑制作用，可抑制膽固醇的合成，是治療心血管疾病的重要藥物，特別是阿托伐他汀和羅素伐他汀近些年都進(jìn)入了全球最暢銷藥前十名。(3R，5S/R) -6-X-3, 5- 二羥基己酸叔丁酯2 (X=Cl，CN或0R)是合成此類降膽固醇藥物的關(guān)鍵手性中間體，可以通過化學(xué)法或生物法加以制備。目前國內(nèi)主要通過化學(xué)法生產(chǎn)，化學(xué)還原方法的反應(yīng)條件往往需要低溫(如-70 V )，及易燃的硼烷類化合物參與，成本高，純度低，污染尤其嚴(yán)重，對環(huán)境的影響非常大。相比較而言，生物法的反應(yīng)條件溫和，更加實用和環(huán)保。
[0003]目前生物法主要有酶法和全細(xì)胞催化兩種。例如美國專利US2008/0248539公開了一種利用來自于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酮還原酶及其突變株還原法生產(chǎn)(3R，5S)-6-氯-3，5-二羥基己酸叔丁酯的方法，該方法利用外源添加的葡萄糖脫氫酶和輔酶因子來維持反應(yīng)的進(jìn)行，而且在反應(yīng)中會產(chǎn)生葡萄糖酸，需用堿維持反應(yīng)的PH，增加了操作程序，影響反應(yīng)的原子經(jīng)濟(jì)性。國內(nèi)專利CN 102978249公開了一種酮還原酶生產(chǎn)(3R, 5R)-6-氰基-3，5- 二羥基己酸叔丁酯的方法，該方法添加的是凍干酶粉，而且添加了價格昂貴的輔酶因子，成本較高，無法進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。國內(nèi)專利CN 102643757公開了利用在土壤中篩選到的季也蒙畢赤酵母菌催化生產(chǎn)(3R，5R)-6-氰基-3，5- 二羥基己酸叔丁酯的方法，但天然菌株全細(xì)胞目的酶活低，雜酶種類多，催化存在著效率低，產(chǎn)物純度不聞等不足。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種反應(yīng)步驟簡單、成本較低、產(chǎn)品純度高，可大規(guī)模生產(chǎn)(3R，5S/R)-6-X-3, 5- 二羥基己酸叔丁酯2 (X=C1，CN或0R)的綠色生物制備方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:一種利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:在反應(yīng)容器中加入配制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底物(5S/R) -6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯I (X=C1，CN或0R)、異丙醇、重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜方法(GC)檢測反應(yīng)進(jìn)程，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%?100%時結(jié)束反應(yīng)，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得(3R，5S/R) -6-X-3, 5- 二羥基己酸叔丁酯2 (X=C1, CN或0R)。
[0006]所述的含有重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞的制備方法為:將含有酮還原酶(KRED)基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)4?8小時，將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD6tltl值達(dá)到0.8?1.2時，加入誘導(dǎo)劑，于22?32°C下繼續(xù)培養(yǎng)16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞。
[0007]進(jìn)一步地，所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，誘導(dǎo)終濃度為0.2?1.0mM，其中優(yōu)選異丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
[0008]進(jìn)一步地，所述的水相緩沖液濃度為20?200mM，為三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液，pH為6.0?8.0 ;其中更優(yōu)選三乙醇胺緩沖液，pH6.5?7.5。
[0009]所述所述的水相緩沖液為50mM三乙醇胺緩沖液，其配置方法為:稱取三乙醇胺7.45g, EDTA 1.48g，加去離子水700ml溶解后，加入濃HCl調(diào)pH至7.0，補加去離子水至100ml。
[0010]進(jìn)一步地，反應(yīng)起始時的反應(yīng)體系中，底物(5S/R) -6-X-3-羥基_5_羰基己酸叔丁酯1(X=C1，CN或0R)的濃度為10%?30% (w/v)，重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞的用量為底物質(zhì)量的10%?30% (w/w)，異丙醇的濃度為3%?12% (w/v)。根據(jù)一個優(yōu)選方面，反應(yīng)起始時的反應(yīng)體系中，底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯1(X=C1，CN or OR)的濃度為12%?20% (w/v)，反應(yīng)中無需添加輔酶因子。
[0011]進(jìn)一步地，在反應(yīng)體系中加入的Ca2+、Mg2+等二價金屬離子，濃度為0.5_20mM，不僅可以增加大腸桿菌細(xì)胞的通透性，而且這些離子還是酮還原酶的增強劑。其中更優(yōu)選Ca2+，根據(jù)一個具體方面，所述的反應(yīng)體系中所用的為CaCl2。
[0012]根據(jù)本發(fā)明，所用的底物(5S/R)-6-X_3-羥基_5_羰基己酸叔丁酯I (X=Cl，CN orOR)和其它使用到的原料均可商購獲得。此外，本發(fā)明中所述的酮還原酶(KRED)基因的信息為公知，可通過市售購買獲得。他人在實施本發(fā)明方法時可以按照本發(fā)明所述方法制備或購買。
[0013]由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢:本發(fā)明方法通過采用特定的重組酮還原酶，解決了傳統(tǒng)生物法中催化效率低以及成本高的問題；且該方法反應(yīng)不需破碎細(xì)胞，反應(yīng)體系無需添加有機溶劑，條件溫和，特別是，催化反應(yīng)過程不用加還原性輔酶因子，降低了生產(chǎn)成本，僅利用細(xì)胞本身的輔酶再生體系，反應(yīng)效率高、步驟少、簡便易操作，大大提高了效率和降低了反應(yīng)的成本，具有廣闊的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為重組大腸桿菌催化制備(3R，5S/R)-6-X-3, 5_ 二羥基己酸叔丁酯示意圖。

【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0016]以下實施例的反應(yīng)緩沖溶液的配制均為:50mM三乙醇胺緩沖液(pH7.0)，稱取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去離子水700ml溶解后，加入濃HCl調(diào)pH至7.0，補加去離子水至1000ml。
[0017]實施例1重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞的制備從轉(zhuǎn)化平板將含有酮還原酶(KRED)基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養(yǎng)7小時，將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于37°C下，搖床200rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D_值達(dá)到
1.0時，加入0.5mM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，于28°C下繼續(xù)培養(yǎng)20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞。
[0018]實施例2
從轉(zhuǎn)化平板將含有酮還原酶(KRED)基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養(yǎng)8小時，將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30°C下，搖床180rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D_值達(dá)到
0.8時，加入0.2 mM的乳糖，于22°C下繼續(xù)培養(yǎng)20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞。
[0019]實施例3
從轉(zhuǎn)化平板將含有酮還原酶(KRED)基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養(yǎng)4小時，將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于38°C下，搖床220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D_值達(dá)到
1.2時，加入1.0 mM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，于32°C下繼續(xù)培養(yǎng)16小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞。
[0020]實施例4利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法
在500mL三口燒瓶中依次加入50mM三乙醇胺緩沖液(ρΗ7.0) 240ml，所述的5OmM三乙醇胺緩沖液配置方法為:稱取三乙醇胺7.45g，EDTA 1.48g，加去離子水700ml溶解后，加入濃HCl調(diào)pH至7.0，補加去離子水至100ml ;然后依次加入12.5g異丙醇，42.3g底物(R)_6-氰基-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯，9.2g實施例1所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞，0.1Og無水CaCl2, 30°C下磁力攪拌開始計時反應(yīng)，反應(yīng)示意圖如圖1所示，16h取樣，GC分析監(jiān)測轉(zhuǎn)化率99.2%，產(chǎn)物(3R，5R) -6-氰基-3，5- 二羥基己酸叔丁酯的立體構(gòu)型純度為99.7%，其中底物及產(chǎn)物的具體分析條件為:色譜柱為0.3mm毛細(xì)管柱30m(DIKMA), FID檢測器。色譜柱溫度120 °C，氣化和檢測溫度均為280 °C，載氣為N2。產(chǎn)物立體構(gòu)型純度的分析條件為:色譜柱為CP-Chirasil-DEX CB手性毛細(xì)管柱，其余條件同上。反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，得到產(chǎn)物(3R, 5R) -6-氰基-3，5- 二羥基己酸叔丁酯34.8g。
[0021]實施例5
在500mL三口燒瓶中依次加入50mM三乙醇胺緩沖液(pH7.0) 240ml，然后依次加入13.2g異丙醇,41.7g底物(S) -6-氯-3-輕基-5-羰基己酸叔丁酯,8.6g實施例1所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞，0.08g無水CaCl2, 30°C下磁力攪拌開始計時反應(yīng)，反應(yīng)示意圖如圖1所示，16h取樣，GC分析監(jiān)測轉(zhuǎn)化率98.7%，產(chǎn)物(3R，5S) -6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯的立體構(gòu)型純度為99.5%，其中底物及產(chǎn)物的具體分析條件為:色譜柱為0.3mm毛細(xì)管柱30m(DIKMA)，F(xiàn)ID檢測器。色譜柱溫度120 °C，氣化和檢測溫度均為280 °C，載氣為N2。產(chǎn)物立體構(gòu)型純度的分析條件為:色譜柱為CP-Chirasil-DEX CB手性毛細(xì)管柱，其余條件同上。反應(yīng)結(jié)束后，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，得到產(chǎn)物(3R，5S)-6-氯-3，5- 二羥基己酸叔丁酯32.lg。
[0022]實施例6
實施例6與實施例4的區(qū)別在于，各物質(zhì)的添加量分別為:7.2g異丙醇，24g底物
(S)-6-氯-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯，2.4g實施例1所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞，0.013g 無水 CaCl2。
[0023]實施例7
實施例7與實施例4的區(qū)別在于，各物質(zhì)的添加量分別為:28.8g異丙醇，72g底物
(S)-6-氯-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯，21.6g實施例1所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞，0.53g無水CaCl2。
[0024]實施例8
實施例8與實施例4的區(qū)別在于，各物質(zhì)的添加量分別為:16.7g異丙醇，48g底物
(S)-6-氯-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯，7.2g實施例1所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞，0.16g無水MgCl2。
[0025]實施例9
實施例9與實施例4的區(qū)別在于，各物質(zhì)的添加量分別為:10.6g異丙醇，28.8g底物
(S)-6-氯-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯，7.2g實施例1所制備的重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞，0.04g無水CaCl2。
【權(quán)利要求】
1.一種利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:在反應(yīng)容器中加入配制好的所述水相緩沖液，然后依次加入底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯1、異丙醇、重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞，于溫度25°C?40°C下攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜方法檢測反應(yīng)進(jìn)程，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%?100%時結(jié)束反應(yīng)，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得(3R，5S/R)-6-X-3, 5-二羥基己酸叔丁酯2 ;其中X=C1，CN或OR。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:所述的含有重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞的制備方法為:將含有酮還原酶基因的重組大腸桿菌單菌落接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)4?8小時，將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.8?1.2時，加入誘導(dǎo)劑，于22?32°C下繼續(xù)培養(yǎng)16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:所述的誘導(dǎo)劑為異丙基_β -D-硫代半乳糖苷或乳糖，誘導(dǎo)終濃度為0.2?1.0mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:所述的誘導(dǎo)劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:所述的水相緩沖液濃度為20?200mM，為三乙醇胺緩沖液或磷酸鹽緩沖液，pH為6.0?8.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:所述的水相緩沖液濃度為PH6.5?7.5的三乙醇胺緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:所述的水相緩沖液為50mM三乙醇胺緩沖液，其配置方法為:稱取三乙醇胺7.45g，EDTA1.48g，加去離子水700ml溶解后，加入濃HCl調(diào)pH至7.0，補加去離子水至1000ml。
8.據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:反應(yīng)起始時的反應(yīng)體系中，底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯I的濃度為10%?30% (w/v)，重組酮還原酶的大腸桿菌細(xì)胞的用量為底物質(zhì)量的10%?30% (w/w),異丙醇的濃度為3%?12% (W/V)，其中X=C1，CN或0R。
9.據(jù)權(quán)利要求8所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:底物(5S/R)-6-X-3-羥基-5-羰基己酸叔丁酯I的濃度為12%?20% (w/v)，其中X=Cl, CNor OR0
10.據(jù)權(quán)利要求9所述的利用全細(xì)胞催化制備他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于:在反應(yīng)體系中加入Ca2+、Mg2+等二價金屬離子，濃度為0.5-20mM。
【文檔編號】C12P7/62GK104342460SQ201310345732
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司