利用家兔乳腺生物反應(yīng)器制備第八凝血因子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用家兔乳腺生物反應(yīng)器制備第八凝血因子的方法，包括以下步驟：將外接信號(hào)肽的B-domain缺失的重組人第八凝血因子cDNA插入質(zhì)粒載體中形成第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件，然后通過顯微注射或體細(xì)胞移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因家兔，獲得的轉(zhuǎn)基因家兔的當(dāng)代或后代母兔在泌乳期的乳汁中產(chǎn)生重組人第八凝血因子。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件在轉(zhuǎn)基因家兔乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)，以制備rhFVIII，轉(zhuǎn)基因家兔進(jìn)行快速的種群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，實(shí)現(xiàn)了rhFVIII的批量生產(chǎn)，都在很大程度上降低了生產(chǎn)成本，并且避免了使用血漿中提取的hFVIII感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，提高了用藥的安全性。
【專利說(shuō)明】利用家兔乳腺生物反應(yīng)器制備第八凝血因子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及于非人哺乳動(dòng)物制備重組蛋白藥物領(lǐng)域，特別涉及一種利用家兔乳腺生物反應(yīng)器制備第八凝血因子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血友病是人類最常見的一種出血性疾病，具有終身性，反復(fù)性和致命性，約每5000-10000個(gè)男性中就有一個(gè)是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，如輔酶凝血因子八(甲型血友病)，以及第九因子(乙型血友病)。由于血友病是由編碼循環(huán)血漿蛋白的單個(gè)X連鎖基因缺失引起，因此治療血友病的重點(diǎn)是合成或提煉具有正常功能的凝血因子代替這種錯(cuò)誤蛋白或缺失蛋白。
[0003]血友病的治療最初采用全血漿，之后采用從血漿中提取的高度純化第八因子(hFVIII)濃制劑?；颊呤褂煤笳咧委?，較低劑量可達(dá)到較好的療效。這種療法雖然可以有效控制出血，但可能會(huì)產(chǎn)生其它并發(fā)癥。血液制品的原料一般來(lái)源于捐獻(xiàn)者，由于檢驗(yàn)技術(shù)有限這些血液制品可能攜帶傳染病毒，如B型肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)，增加了患者感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]重組人凝血因子(rhFVIII)對(duì)凝血因子八缺失或低量分泌所致的遺傳性凝血機(jī)能缺陷具有糾正作用，專供防治甲型血友病患者的出血癥狀。僅2005年此藥物的全球銷售達(dá)到十四億美元。它還可用于治療創(chuàng)傷性出血、手術(shù)性出血、顱內(nèi)出血以及其他獲得性血液疾病，具有強(qiáng)大的市場(chǎng)潛力。有鑒于此，有必要提供一種高效制備重組人凝血因子的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種利用家兔乳腺生物反應(yīng)器制備第八凝血因子的方法，包括以下步驟:(I)將`外接信號(hào)基因的B-domain(結(jié)構(gòu)域)缺失的重組人第八凝血因子cDNA插入質(zhì)粒載體中形成第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件；(2)將乳腺表達(dá)構(gòu)件通過顯微注射直接注入家兔受精卵中，然后將家兔受精卵在FBS B2培養(yǎng)液和35°C~40°C、3%~7% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-20h，之后將分裂成2~8個(gè)細(xì)胞的家兔胚胎移植到受體家兔的輸卵管中，經(jīng)過妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家兔；(3)將乳腺表達(dá)構(gòu)件通過轉(zhuǎn)染至家兔供體細(xì)胞中，然后將經(jīng)過乳腺表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞核通過顯微操作移到去除染色體遺傳物質(zhì)的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，構(gòu)成克隆胚胎，將發(fā)育的克隆胚胎進(jìn)行胚胎移植，到同步發(fā)情的受體兔中妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家兔；(4)步驟(2)和步驟(3)獲得的轉(zhuǎn)基因家兔的當(dāng)代或后代母兔在泌乳期的乳汁中產(chǎn)生重組人第八凝血因子。由此，實(shí)現(xiàn)第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件在轉(zhuǎn)基因家兔乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)以制備rhFVIII，轉(zhuǎn)基因家兔進(jìn)行快速的種群繁殖，可大量分泌含有rhFVIII的乳汁，然后對(duì)乳汁進(jìn)行分離純化及檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了 rhFVIII的批量生產(chǎn)，都在很大程度上降低了生產(chǎn)成本，并且避免了使用血漿中提取的hFVIII感染病毒的風(fēng)險(xiǎn)，提高了用藥的安全性。
[0006]在一些實(shí)施方式中，步驟(1)中,質(zhì)粒載體為PBC1質(zhì)粒載體。由此,PBC1質(zhì)粒載體更佳適用于構(gòu)建乳腺表達(dá)構(gòu)件。
[0007]在一些實(shí)施方式中，步驟(1)中，乳腺表達(dá)構(gòu)件包括調(diào)控元件，調(diào)控元件為雞β球蛋白絕緣子、山羊β_酪蛋白啟動(dòng)子、TATA盒、酪蛋白外顯子1、酪蛋白內(nèi)含子1、β -酪蛋白外顯子2、β-酪蛋白外顯子7，8，9、β-酪蛋白內(nèi)含子7，8、β-酪蛋白基因組片段。由此,調(diào)控元件實(shí)使乳腺表達(dá)構(gòu)件實(shí)現(xiàn)在家兔乳腺的基因表達(dá)。
[0008]在一些實(shí)施方式中，步驟(1)中，乳腺表達(dá)構(gòu)件包括調(diào)控元件，調(diào)控元件為雞β球蛋I白絕緣子、山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子、TATA盒、β-酪蛋白外顯子1、β-酪蛋白內(nèi)含子1、β -酪蛋白外顯子2、β -酪蛋白外顯子7，8，9、β -酪蛋白內(nèi)含子7，8、β -酪蛋白基因組片段、CMV增強(qiáng)子。由此，調(diào)控元件實(shí)使乳腺表達(dá)構(gòu)件實(shí)現(xiàn)在家兔乳腺的基因表達(dá)。
[0009]在一些實(shí)施方式中，步驟⑴中，信號(hào)基因?yàn)閎GHployA。由此，bGHployA表達(dá)的信號(hào)肽起到較好的信號(hào)作用。
[0010]在一些實(shí)施方式中，步驟(2)中，乳腺表達(dá)構(gòu)件在顯微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I與Not I的限性內(nèi)切酶釋放細(xì)菌質(zhì)粒部分；
[0011]步驟(3)中，乳腺表達(dá)構(gòu)件在轉(zhuǎn)染至家兔細(xì)胞之前，利用Sal I與Not I的限性內(nèi)切酶釋放細(xì)菌質(zhì)粒部分。由此，細(xì)菌質(zhì)粒部分的釋放避免乳腺表達(dá)構(gòu)件在基因表達(dá)時(shí)出現(xiàn)干擾雜質(zhì)。
[0012]在一些實(shí)施方式中，步驟(3)中，卵母細(xì)胞為濾泡卵母細(xì)胞或輸卵管卵母細(xì)胞，家兔供體細(xì)胞為胚胎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的一種。由此，卵母細(xì)胞和家兔供體細(xì)胞的選擇可增加轉(zhuǎn)基因家兔的成活率。
[0013]在一些實(shí)施方式中，步驟(4)中，泌乳期包括人工誘導(dǎo)泌乳期和自然分泌的泌乳期。由此，泌乳期的增加可提高rhFVIII的產(chǎn)量。
[0014]在一些實(shí)施方式中，步驟(4)中，重組人第八凝血因子為B-domain缺失的重組人第八凝血因子。由此，B-domain缺失的重組人第八凝血因子可實(shí)現(xiàn)血友病的輔助治療及創(chuàng)傷性出血、手術(shù)性出血、顱內(nèi)出血以及其他獲得性血液疾病治療的治療。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為B-domain缺失的重組人第八凝血因子rhFVIII cDNA的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016]圖2 為 B-deleted rhFVIII cDNA 克隆的測(cè)定結(jié)果；
[0017]圖3為第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-rhFVIII的基因圖譜；
[0018]圖4為pBCl-rhFVIII克隆的測(cè)定結(jié)果；
[0019]圖5為pBCl-rhFVIII cDNA序列與基因庫(kù)bank cDNA序列的對(duì)比；
[0020]圖6為pBCl-rhFVIII的信號(hào)肽和連接肽；
[0021]圖7為pBCl-rhFVIII酶切片段電泳檢測(cè)結(jié)果；
[0022]圖8為第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-CMV-rhFVIII的基因圖譜；
[0023]圖9為去除細(xì)菌質(zhì)粒的pBCl-rhFVIII在乳腺上皮細(xì)胞MCF-7中的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá);
[0024]圖10為乳腺表達(dá)構(gòu)件注入家兔受精卵時(shí)受精卵的狀態(tài)圖；
[0025]圖11為家兔體細(xì)胞核移植技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因家兔的過程?！揪唧w實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合附圖對(duì)發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0027]實(shí)施例1準(zhǔn)備B-domain缺失的重組人第八凝血因子cDNA(B_deleted rhFVIIIcDNA)
[0028]重組人全序列第八凝血因子cDNA (rhFVIII cDNA)，含Al，A2，B，A3，Cl和C2domain,圖1 為連接有 bGHployA 的 B-deleted rhFVIII cDNA 的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中 “S，，表示信號(hào)基因bGHployA，B-deleted rhFVIII cDNA為人工合成。采用PCR檢測(cè)方法檢測(cè)B-deleted rhFVIII cDNA使用的引物為pBClhF8_fs，pBClhF8_Ar，pBClhF8_CF，pBClhF8_r，pBClhF8-fA，圖1中箭頭所示方向?yàn)橐锏姆较颉?br> [0029]將B-deleted rhFVIII cDNA 片段感染至 Zero Blunt TOPO 細(xì)菌(來(lái)源:Invitrogen, Cat:K2800-20)的感受態(tài)細(xì)胞中，B-deleted rhFVIII cDNA 片段的大小為4355bp，然后使細(xì)菌增殖并抽提質(zhì)粒進(jìn)行電泳測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖2所示，M為IKb DNAladder(lKb DNA 階梯對(duì)照，來(lái)源:NEB, Cat.N3232S)標(biāo)號(hào) 1，5，7，8，11，12，13，15 為質(zhì)粒(3519bp)，標(biāo)號(hào) 2,3,4,6,9,10,14,16 為重組質(zhì)粒(3519bp+4355bp)，因此，標(biāo)號(hào) 2,3,4,6,9，10，14，16為陽(yáng)性克隆，將克隆#2，3,6,9,16進(jìn)行DNA測(cè)序，其中，克隆#3的DNA序列與4355bp 的 B-deleted rhFVIII cDNA喊基序列 100%吻合，達(dá)到使B-deleted rhFVIII cDNA大量擴(kuò)增的目的，便于組裝到質(zhì)粒載體中。
[0030]實(shí)施例2第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-rhFVIII的制備
[0031]如圖3所示，pBCl質(zhì)粒連接雞β球蛋白絕緣子、山羊酪蛋白啟動(dòng)子、TATA盒、β-酪蛋白外顯子1、β-酪蛋白內(nèi)含子1、β-酪蛋白外顯子2，在質(zhì)粒載體的限制性內(nèi)切酶Xho I多克隆位點(diǎn)插入外接信號(hào)基因的B-deleted rhFVIII cDNA，再連接-酪蛋白外顯子7、8、9，β-酪蛋白內(nèi)含子7、 8，在3'端加載β-酪蛋白基因組片段，形成第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-rhFVIII，基因序列長(zhǎng)25989bp。pBCl質(zhì)粒DNA包含細(xì)菌(EolEl)起始片段，抗性基因AmpR啟動(dòng)子以及抗性基因AmpR。
[0032]其中，雞β 球蛋白絕緣子(Chicken beta-globin insulator),山羊 β -酪蛋白啟動(dòng)子(Goat beta-casein promoter), TATA 盒(TATA box), 酪蛋白外顯子
1(beta-casein exonl), β -酪蛋白內(nèi)含子 I (beta-casein intronl), β-酪蛋白外顯子
2(beta-casein exon2), β -酪蛋白外顯子 7、8、9 (beta-casein exon7、8、9)，β-酪蛋白內(nèi)含子 7、8 (beta-casein intron7、8), β -酪蛋白基因組片段(beta_casein3 ' genomicfragment)為乳腺表達(dá)構(gòu)件的調(diào)控元件。
[0033]實(shí)施例3第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-rhFVIII的擴(kuò)增及檢測(cè)
[0034]將第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-rhFVm轉(zhuǎn)入受體菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞中，將獲得的受體菌增值，以實(shí)現(xiàn)pBCl-rhFVIII的擴(kuò)增，采用PCR方法篩選出陽(yáng)性的克隆，引物SpBClhFSS-SNfj' -TGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTT-3' ,pbCl-sr:5/ -CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-Si，PCR片段大小為197bp。然后進(jìn)行電泳測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖4所示，篩選的120個(gè)克隆中，標(biāo)號(hào)38、47為陽(yáng)性克隆，其中，M為IOObp DNA ladder (來(lái)源:NEB,Cat.N0467S)。將克隆#38、47進(jìn)行DNA測(cè)序，克隆#47與基因bank cDNA的序列(NM000132.3)完全吻合，對(duì)比結(jié)果如圖5所示，其中，Seq_l為第八凝血因子的部分cDNA序列，Seq_2是基因庫(kù)中的序列。[0035] 將克隆#47進(jìn)行DNA測(cè)序，經(jīng)過分析獲得pBCl-rhFVIII全序列，如序列表所示，基因全長(zhǎng)25989bp，ATG啟始密碼子在8615，TGA終止密碼子在12965。由pBCl-rhFVIII的序列推斷出的1455個(gè)氨基酸，氨基酸序列與天然的B-domain缺失的序列完全吻合，第八凝血因子B-domain缺失的氨基酸序列，包含信號(hào)肽S:1~19，Al:20~391，A2:392~759，連接肽:760 ~766,A3:767 ~1140,Cl:1141 ~1294,C2:1295 ~1455。如圖 6 所示，pBCl-rhFVIII的信號(hào)肽為19個(gè)氨基酸，在B-domain缺失的部分有7個(gè)氨基酸的連接肽。
[0036]進(jìn)行DNA 測(cè)序的引物是 M13 質(zhì)粒載體 M13Reverse: caggaaacagctatgac ；M13Forward(-20):gtaaaacgacggcaag ；hFVIII 重組第八因子 cDNA hF VII1-A2f:tgccacaggaaatcagtctattgg ；hF VII1-A3f:tccgatttatggcatacacagatg ；hF VII1-A4f:ttccaagcctccaacatcatgcac ；hF VIII_C2r:atcattggtgccaacagatccac ;hFVIII_C3r:tgtactgtcacttgtctcccatgagc。
[0037]利用Sail限性內(nèi)切酶將環(huán)狀DNA切成線性的DNA(25.98kb)，利用XhoI限性內(nèi)切酶將插入的4.35kb的B-deleted rhFVIII cDNA片段釋放，產(chǎn)生21.63kb的載體片段，利用Sal I與Not I的限性內(nèi)切酶釋放5.88Kb的細(xì)菌質(zhì)粒部分與20.1kb的線性DNA，釋放的線性DNA包含乳腺的表達(dá)載體與插入的rhFVIII cDNA,該片段可以用于顯微注射到家兔的受精卵，培育第八凝血因子的轉(zhuǎn)基因兔，上述酶切片段的檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。
[0038]實(shí)施例4第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-CMV-rhFVIII的制備
[0039]如圖8所示，pBCl質(zhì)粒連接雞β球蛋白絕緣子、山羊酪蛋白啟動(dòng)子、TATA盒、β -酪蛋白外顯子1、β -酪蛋白內(nèi)含子1、β -酪蛋白外顯子2、CMV增強(qiáng)子序列，在質(zhì)粒載體的限制性內(nèi)切酶Xho I多克隆位點(diǎn)插入外接信號(hào)基因的B-deleted rhFVIII cDNA，再連接酪蛋白外顯子7、8、9，β-酪蛋白內(nèi)含子7、8，在3'端加載β-酪蛋白基因組片段，形成第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件pBCl-CMV-rhFVIII，基因序列長(zhǎng)25989bp。pBCl質(zhì)粒DNA包含細(xì)菌(EolEl)起始片段，抗性基因AmpR啟動(dòng)子以及抗性基因AmpR。
[0040]其中，雞β球蛋白絕緣子(Chicken beta-globin insulator),山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子(Goat beta-casein promoter), TATA 盒(TATA box), β-酪蛋白外顯子(beta-caseinexonl), β -酪蛋白內(nèi)含子 I (beta-casein intronl), β -酪蛋白外顯子 2 (beta-caseinexon2), CMV 增強(qiáng)子序列，β -酪蛋白外顯子 7、8、9 (beta-casein exon7、8、9), β-酪蛋白內(nèi)含子 7、8 (beta-casein intron7、8), β -酪蛋白基因組片段(beta-caseiW genomicfragment)為乳腺表達(dá)構(gòu)件的調(diào)控元件。
[0041 ] pBCl-CMV-rhFVI II 的克隆方法與 pBCl-rhFVI II 相同，將 pBCl-CMV-rhFVI 11 進(jìn)行DNA測(cè)序，經(jīng)過分析獲得pBCl-CMV-rhFVIII進(jìn)行DNA全序列，如序列表所示，基因全長(zhǎng)26582bp，ATG啟始密碼子在9208，TGA終止密碼子在13558，CMV增強(qiáng)子從8609到9201，總長(zhǎng)為593bp。
[0042]利用XhoI限性內(nèi)切酶可以將插入的cDNA片段釋放，利用SalI與Not I的限性內(nèi)切酶可以釋放5.876Kb的細(xì)菌質(zhì)粒部分，形成線性DNA用于制作轉(zhuǎn)基因家兔
[0043]pBCl-CMV-rhFVIII 與 pBCl-rhFVIII 的基因結(jié)構(gòu)相同，但 pBCl-CMV-rhFVIII 增加了一個(gè)增強(qiáng)子CMV。pBCl-CMV-rhFVIII與pBCl-rhFVIII的擴(kuò)增及檢測(cè)方法相同。
[0044]實(shí)施例5第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件在細(xì)胞中的表達(dá)
[0045]將去除細(xì)菌質(zhì)粒的pBCl-rhFVIII (20108bp)通過電轉(zhuǎn)染的方法感染乳腺上皮細(xì)胞MCF-7，培養(yǎng)三天后收集細(xì)胞與培養(yǎng)液，檢測(cè)細(xì)胞中表達(dá)的mRNA。采用RT-PCR (reversetranscription PCR,反轉(zhuǎn)錄 PCR)的檢測(cè)方法，使用引物 pBC Ι-sr:5' -CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3'和 pBClhF8S_SNf:5' -tgtggtgaactctctagacccaccgtt-3'(片段大小為195bp)進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增，去除細(xì)菌質(zhì)粒的pBCl-rhFVIII作為陽(yáng)性的對(duì)照，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為細(xì)胞的陰性對(duì)照，H20作為污染對(duì)照，在感染的細(xì)胞中出現(xiàn)預(yù)期的mRNA片段，證實(shí)轉(zhuǎn)入的pBCl-rhFVIII基因在MCF-7的細(xì)胞中得到了表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，+RT表示有反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)后的PCR反應(yīng)，-RT表示沒有反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)后的PCR反應(yīng)，作為RT的對(duì)照組。196bp的RT-PCR的產(chǎn)物表明擴(kuò)增的DNA是從mRNA中反轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)生的，即 pBCl-rhFVIII cDNA 的 mRNA 表達(dá)。
[0046]pBCl-CMV-rhFVIII cDNA在細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)與pBCl-rhFVIII相同，檢測(cè)結(jié)果證實(shí)證實(shí)轉(zhuǎn)入的pBCl-CMV-rhFVIII cDNA在MCF-7的細(xì)胞中得到了表達(dá)。
[0047]實(shí)施例6將第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件注入家兔受精卵(原核期胚胎)，培育成轉(zhuǎn)基因家兔
[0048]將30只性成熟出月齡以上)的供體家兔進(jìn)行超數(shù)排卵處理，具體為:連續(xù)三天對(duì)供體家兔實(shí)施頸皮下注射FSH(卵泡刺激素)，每天兩次，按劑量遞增的方式，三天的劑量分別為3mg，4mg，5mg，F(xiàn)SH處理完畢后，供體家兔與公兔交配兩次，并注射100IU hCG/供體(IU國(guó)際單位，hCG人絨毛促性腺激素)。hCG處理后18h，從供體家兔的輸卵管中沖洗出受精卵。受精卵經(jīng)15000g的條件離心8分鐘,如圖10中A和C所示,充分顯示雄性與雌性原核，圖10為顯微注射的過程，明顯確立了原核膨脹(如圖10中B和D所示)，注射用乳腺表達(dá)構(gòu)件為去除細(xì)菌質(zhì)粒的pBCl-rhFVIIIcDNA(20108bp)。
[0049]將注射過的受精卵移入2.5% FBS B2 (胎牛血清)培養(yǎng)液中，在38.5°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~15h以確定胚胎的成活率和分裂的狀況。將15~20個(gè)分裂成2-4細(xì)胞的胚胎移植到經(jīng)過同期發(fā)情處理的受體家兔的輸卵管中。結(jié)果顯示，妊娠率為70% (η =20)，在受孕的受體家兔中，15.2%的注射卵子發(fā)育成功并產(chǎn)下80只幼體。
[0050]對(duì)幼體進(jìn)行基因鑒定，每只幼體取下直徑0.5cm的耳組織，從耳組織中提取DNA，采用常規(guī)的PCR以及Southern blot方法，鑒定其整合外源性rhFVIII基因在注射兔的整合情況。經(jīng)鑒定80只幼體中有14轉(zhuǎn)基因家兔，為6只公兔和5只母兔，rhFVIII基因的整合率為17.5%，成活9個(gè)陽(yáng)性的幼體，為4只公兔和5只母兔。表1為培育轉(zhuǎn)基因家兔試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
[0051]表1
[0052]
【權(quán)利要求】
1.利用家兔乳腺生物反應(yīng)器制備第八凝血因子的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將外接信號(hào)基因的B-domain缺失的重組人第八凝血因子cDNA插入質(zhì)粒載體中形成第八凝血因子的乳腺表達(dá)構(gòu)件； (2)將所述乳腺表達(dá)構(gòu)件通過顯微注射直接注入家兔受精卵中，然后將家兔受精卵在FBS B2培養(yǎng)液和35°C~40°C、3%~VA CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10_20h，之后將分裂成2~8個(gè)細(xì)胞的家兔胚胎移植到受體家兔的輸卵管中，經(jīng)過妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家兔； (3)將所述乳腺表達(dá)構(gòu)件通過轉(zhuǎn)染至家兔供體細(xì)胞中，然后將經(jīng)過乳腺表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞核通過顯微操作移到去除染色體遺傳物質(zhì)的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，構(gòu)成克隆胚胎，將發(fā)育的克隆胚胎進(jìn)行胚胎移植，到同步發(fā)情的受體兔中妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家兔。 (4)步驟(2)和步驟(3)獲得的轉(zhuǎn)基因家兔的當(dāng)代或后代母兔在泌乳期的乳汁中產(chǎn)生重組人第八凝血因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述質(zhì)粒載體為PBC1質(zhì)粒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述乳腺表達(dá)構(gòu)件包括調(diào)控元件，所述調(diào)控元件為雞β球蛋白絕緣子、山羊酪蛋白啟動(dòng)子、TATA盒、β-酪蛋白外顯子1、酪蛋白內(nèi)含子1、酪蛋白外顯子2、β-酪蛋白外顯子7，8，9、β-酪蛋白內(nèi)含子7，8、β-酪蛋白基因組片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述乳腺表達(dá)構(gòu)件包括調(diào)控元件，所述調(diào)控元件為雞β球蛋白絕緣子、山羊酪蛋白啟動(dòng)子、TATA盒、β-酪蛋白外顯子1、酪蛋白內(nèi)含子1、酪蛋白外顯子2、β-酪蛋白外顯子7，8，9、β-酪蛋白內(nèi)含子7，8、β -酪蛋白基因組片段、CMV增強(qiáng)子。`
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述信號(hào)基因?yàn)閎GHployAo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述乳腺表達(dá)構(gòu)件在顯微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I與Not I的限性內(nèi)切酶釋放細(xì)菌質(zhì)粒部分； 步驟(3)中，所述乳腺表達(dá)構(gòu)件在轉(zhuǎn)染至家兔細(xì)胞之前，利用Sal I與Not I的限性內(nèi)切酶釋放細(xì)菌質(zhì)粒部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述卵母細(xì)胞為濾泡卵母細(xì)胞或輸卵管卵母細(xì)胞，所述家兔供體細(xì)胞為胚胎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述泌乳期包括人工誘導(dǎo)泌乳期和自然分泌的泌乳期。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述重組人第八凝血因子為B-domain缺失的重組人第八凝血因子。
【文檔編號(hào)】C12N15/873GK103555759SQ201310297925
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年7月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月5日
【發(fā)明者】薛非, 楊瀾, 安禮友, 成勇, 杜福良 申請(qǐng)人:蘭諾生物技術(shù)無(wú)錫有限公司