專利名稱：小麥葉片發(fā)育基因TaWRKY76及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及葉片發(fā)育基因——WRKY轉錄因子TaffRKY76及其應用。
背景技術：
葉型是一個與作物產(chǎn)量緊密相關的重要性狀。葉片的三維結構可以影響光合作用的光吸收，碳固定和氣體交換。適當卷曲的葉片是超級稻的一個重要特征。適當?shù)娜~片卷曲提高了光合作用效率，增強了干物質積累，增加產(chǎn)量，減少太陽光對葉片的傷害，降低干旱條件下的呼吸作用。因此揭示控制葉片卷曲的機制對作物育種和耐逆性具有重要的意義。葉片卷曲受激素和非激素等多個因素的調(diào)控，已有的研究表明生長素甲酯轉移酶AtIAMTl與葉片卷曲密切相關，但是AtIAMTl的調(diào)控機制還不清楚。WRKY基因家族是植物特有的基因家族，在抗病蟲害方面發(fā)揮重要作用，但是WRKY基因在葉片發(fā)育中的作用還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種葉片發(fā)育基因——小麥WRKY類蛋白基因TaWRKY76及其應用。本發(fā)明所述葉片發(fā)育基因——小麥WRKY類蛋白基因TaWRKY76，其特征在于:所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。本發(fā)明所述基因TaWRKY76在培育葉片卷曲植物中的應用。其中，所述植物優(yōu)選是水稻、豆類、薯類、青稞、小麥或擬南芥。實驗證實，將本發(fā)明從小麥中分離得到的WRKY基因——小麥TaWRKY76導入植物細胞，植物就可以獲得葉片卷曲的表型。例如:將小麥TaWRKY76轉化到擬南芥中以控制擬南芥葉片表型，使擬南芥葉片卷曲，以期提高光合作用。任何一種可以將外源基因導入植物中表達的載體都可以應用于本發(fā)明，本發(fā)明優(yōu)選的載體是PSTART。為了便于對轉基因植物或細胞系進行篩選，可以對含有所述基因TaffRKY76的植物表達載體進行加工，如可以加入選擇標記(⑶S等)或者具有抗性的抗生素標記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)等。本發(fā)明的有益效果是:利用現(xiàn)有的植物基因工程技術，本發(fā)明首次克隆得到了小麥WRKY類基因TaWRKY76，并通過根瘤農(nóng)桿菌介導的方法將該基因轉入擬南芥，經(jīng)過比較分析證明，轉基因植株的葉片呈現(xiàn)適當卷曲的表型，為提高光合作用提供了有利條件。預示本發(fā)明所述的基因可廣泛用于培育高產(chǎn)農(nóng)作物品種。


圖1:TaWRKY76基因全長cDNA 序列的擴增結果，其中a:為 λ DNA/(EcoR I +Hind III) Marker 不意b:在小麥品種山融3號中獲得的長度為1068bp的TaWRKY76cDNA全長。圖2:TaffRKY76在小麥葉片中特異性表達。圖3:TaffRKY76定位于細胞核，其中A:TaffRKY76在擬南芥原生質體中的亞細胞定位；B:TaffRKY76在洋蔥表皮中的亞細胞定位。圖4:TaffRKY76基因的轉錄激活活性分析，其中A:在SD-Trp單缺培養(yǎng)基上生長，B:在SD-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上不能生長。圖5:TaffRKY76連接到pSTART過表達載體，轉化擬南芥，擬南芥葉片呈現(xiàn)上卷的表型A:TaffRKY76轉基因擬南芥葉片表型；B:TaffRKY76轉基因擬南芥TaWRKY76表達量分析。圖6:TaffRKY76在擬南芥中過表達，使擬南芥葉片下表面的海綿組織比野生型葉片排列更緊密A:對照擬 南芥葉片橫切面；B:TaffRKY76轉基因擬南芥葉片橫切面；C:對照擬南芥葉片橫切面局部放大圖；D:TaffRKY76轉基因擬南芥葉片橫切面局部放大圖；圖1:TaffRKY76轉基因擬南芥相關marker基因定量PCR分析
具體實施例方式實施例1: TaWRKY76基因的克隆1.1小麥培養(yǎng):將山融3號和濟南177小麥種子發(fā)芽，用Hoagland培養(yǎng)液，21°C，長日照(光照16h/黑暗8h)，培養(yǎng)至2葉I心期，提取RNA ；1.2 總 RNA 的提取:試劑及器皿:RNAiso(TaKaRa)> 氯仿(Chloroform)、異丙醇(Isopropylalcohol)、無水乙醇(Ethanol)、DEPC水，所有塑料耗材均經(jīng)DEPC水處理24h后，123°C,40min高壓濕熱滅菌，然后放在烘箱65度烘干(大約2天)，玻璃器皿及金屬用具經(jīng)180°C高溫處理6h。I)取材:葉片0.05g，根(取材前用吸水紙吸干凈)0.07g放進2ml塑料離心管中，加入鋼柱一個，液氮速凍，振蕩器振蕩研磨；2)加入1.5ml Trizol提取液,迅速顛倒混勻，室溫放置5min,然后12000rpm,4°C離心IOmin (離心機用70%乙醇擦拭，4° C預冷)；3)取上清約1.5ml與另一個2.0ml離心管中，加入300 氯仿(上清液的1/5)，顛倒混勻，室溫靜置5min,然后12000rpm, 4°C離心15min ；4)取上清500 U I與新的1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇(500 U I)，顛倒混勻，室溫放置 5 IOmin, 12000rpm, 4°C離心 IOmin ；5)棄上清留白色沉淀，加入用DEPC水配制的70%乙醇Iml洗劑，12000rpm，4°C離心5min,重復一次；6)去上清，用200 Ul移液槍將乙醇吸干凈(不能碰到白色沉淀)，超凈臺中敞蓋約 IOmin ；7)加入適量DEPC處理過的超純水溶解(一般30 50 μ IDEPC水即可);8)用RNase自由的DNaseI處理后(方法見下面)，測定0D26(1、OD280, OD230值，確定RNA濃度和純度；9)取I μ gRNA EB膠電泳檢測RNA是否完好；10)用RNA直接作模板擴增小麥actin基因，檢測DNA是否去處干凈。1.3消化RNA中基因組DNA1)選用TaKaRa的DNaseI (RNase Free),在0.5ml離心管中配制下列反應體系，100 μ 1 體系:
權利要求
1.一種小麥葉片發(fā)育基因TaWRKY76，其特征在于:所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
2.權利要求1所述基因TaWRKY76在培育葉片卷曲植物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于:所述植物是水稻、小麥、薯類、青稞、豆類或擬南芥 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小麥葉片發(fā)育基因TaWRKY76，其中所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了所述基因TaWRKY76在培育葉片卷曲植物中的應用。實驗證實，將本發(fā)明所述小麥TaWRKY76導入植物細胞，植物即可獲得葉片卷曲的表型，為提高光合作用提供了有利條件，預示本發(fā)明的基因可廣泛用于培育高產(chǎn)農(nóng)作物品種。
文檔編號C12N15/84GK103173465SQ20131009788
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月25日 優(yōu)先權日2013年3月25日
發(fā)明者夏光敏, 秦楨 申請人:山東大學