專利名稱：：一種小麥試管苗葉片反復再生的方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種小麥試管苗葉片再生的方法，尤其涉及一種通過小麥試管苗葉片的組織培養(yǎng)使小麥試管苗反復再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：小麥(TriticumaestivumL)是我國的重要經(jīng)濟作物，是糧食的主要來源之一。為了改良小麥，目前所進行的小麥轉(zhuǎn)基因研究，都是將目的基因轉(zhuǎn)入細胞核。與細胞核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因具有表達量高、遺傳穩(wěn)定、環(huán)境友好等優(yōu)點。而作為作物遺傳改良新方向的葉綠體基因工程并未運用于小麥遺傳性狀的改良。這是由于小麥等禾谷類糧食作物很難利用綠色的葉組織進行反復再生，嚴重限制了其葉綠體轉(zhuǎn)基因工作的開展。國外的葉綠體基因工程應用主要集中在雙子葉植物(Danielletal.2005)，例如煙草、馬鈴薯、番茄和胡蘿卜等。這些植物之所以能夠成功獲得性狀穩(wěn)定遺傳的改良植株，一個最主要原因是最初獲得的葉綠體轉(zhuǎn)基因雜合體可以在篩選過程中使綠色葉片或者綠色愈傷組織反復再生，在反復再生和篩選過程中，逐漸淘汰未轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的細胞，最終獲得同質(zhì)化的轉(zhuǎn)化體——即葉綠體轉(zhuǎn)基因純合體(Grevich，J.J.2005)。而單子葉的禾谷類作物，如小麥、水稻等正是由于試管苗葉組織反復再生體系的缺乏，因而無法獲得葉綠體轉(zhuǎn)基因的純合體(SaMiLeeetal.2006)，也極大地限制了利用綠色葉片作為受體材料開展葉綠體轉(zhuǎn)基因研究。自從陳惠民等(1980)首次通過小麥種子苗葉片組織培養(yǎng)獲得再生苗以來，Ahuja(1982)、Alfinetta(1983)、Kopertekh(2003)、Chugh(2003)、郝建國(2003)、宣云(2004)等都通過不同的配方及培養(yǎng)條件獲得了葉片誘導的再生植株。但是，他們都是以種子苗基部做為實驗材料獲得的再生苗，也就是只進行了一輪的再生。目前國內(nèi)外尚未見到有通過胚性愈傷組織分化的試管苗(即再生苗)幼葉反復再生試管苗的報道。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種小麥試管苗幼葉反復再生的方法，以解決小麥試管苗反復再生難的問題。本發(fā)明所述反復再生體系指可以通過組織培養(yǎng)過程循環(huán)獲得再生苗的植物組織培養(yǎng)體系。本發(fā)明所述小麥試管苗葉片反復再生方法，步驟包括(l)胚性愈傷組織的誘導(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)(3)試管苗的獲得(4)試管苗葉片誘導愈傷組織(5)二次再生苗的誘導(6)誘導生根(7)二次再生苗的移栽；其中步驟(1)胚性愈傷組織誘導的方法是取開花后1416天的小麥未成熟麥穗，于體積比為75%酒精中浸38分鐘滅菌；然后將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚；再挑選直徑0.81.2mm的幼胚，盾片向上接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基I上，25士rC，黑暗培養(yǎng)23周；獲得胚性愈傷組織；5步驟(2)所述愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法是取步驟(1)獲得的愈傷組織，先切除其上由幼胚長出的胚芽，再把愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，光照強度為5565iimo1m—2s—、光照時間1014hd—、晝溫度25±rC進行晝夜光照周期培養(yǎng)，23周繼代一次；步驟(3)所述試管苗獲得的方法是將步驟(2)所述繼代一次以上的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基I，光照強度為75125iimo1m—2s—、光照時間1418hd—、晝溫度25士rC進行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)23周形成叢生試管苗；步驟(4)所述試管苗葉片誘導愈傷組織的方法是待步驟(3)培養(yǎng)的試管苗長到25cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部13mm的葉段放至愈傷組織誘導培養(yǎng)基II上，25士rC條件下暗培養(yǎng)34周，在葉段的切口處有34mm的愈傷組織團形成；步驟(5)所述二次再生苗誘導的方法是將步驟(4)中誘導形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基II上，按步驟(3)所述條件下進行晝夜光照周期培養(yǎng)34周，誘導出二次再生的試管苗；步驟(6)所述誘導生根的方法是將步驟(5)中獲得的二次再生苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，按步驟(3)所述的培養(yǎng)條件下進行晝夜光照周期培養(yǎng)34周，得生根植株；步驟(7)所述二次再生苗移栽的方法是將步驟(6)中生根的二次再生試管苗轉(zhuǎn)至20±1t:溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗24天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，相對濕度控制在50%60%之間，經(jīng)47天的適應之后，移至大田；其中所述混合育苗基質(zhì)的成分以體積比計為營養(yǎng)土蛭石=3:l，花盆高度為15cm，花盆中所放育苗基質(zhì)厚度為12cm。所述育苗基質(zhì)購于山東省農(nóng)業(yè)科學研究院。上述方法各步中采用的培養(yǎng)基及其配方如下(表1):表1小麥試管苗反復再生方法中各培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基名稱配方作用愈傷組織誘導培養(yǎng)基IMS基本成分+B5維生素+130170mg/L谷氨酰胺+180220mg/L水解酪蛋白+0.52mg/L2，4-D+68g/L瓊脂+2535g/L蔗糖，pH值5.75.9用于幼胚誘導愈傷組織胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基MS基本成分+B5維生素+130170mg/L谷氨酰胺+12mg/L2，4-D+68g/L瓊脂+2535g/L蔗糖，pH值5.75.9用于胚性愈傷組織繼代分化培養(yǎng)基IMS基本成分+B5維生素+130170mg/L谷氨酰胺+0.81.2mg/L6-BA+0.450.55mg/LIAA+57g/L瓊脂+1525g/L蔗糖，pH值5.65.8用于愈傷組織分化長苗6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，保持相對濕度在60%，經(jīng)6天的適應之后，移至大田。本發(fā)明的技術(shù)方案是先通過幼胚誘導胚性愈傷組織，然后通過胚性愈傷組織誘導分化獲得試管苗，再通過試管苗誘導愈傷組織并分化出二次再生苗，最后再把二次再生苗移栽獲得完整植株。經(jīng)試驗統(tǒng)計試管苗葉片誘導愈傷組織的頻率及二次再生苗的頻率分別達到了93%和66%以上，比之國內(nèi)外通過小麥種子苗葉片誘導愈傷組織的頻率72%(郝建國2003)及再生頻率11%(宣云2004)、加％(郝建國.加03)、36%(Kopertekh.加03)都有較大提高。反復再生體系是獲得葉綠體轉(zhuǎn)基因純合體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本發(fā)明所提供的小麥試管苗幼葉反復再生的方法成功解決了小麥試管苗反復再生難的問題，是國內(nèi)外首次通過小麥試管苗幼葉建立小麥試管苗反復再生體系，通過試管苗幼葉誘導愈傷組織并獲得了二次再生苗，使運用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得同質(zhì)化的葉綠體轉(zhuǎn)基因小麥成為可能。圖1幼胚誘導的愈傷組織。圖2愈傷組織分化的試管苗。圖3試管苗葉片誘導的愈傷組織。圖4試管苗葉片愈傷組織誘導的二次再生苗。圖5二次再生苗的移栽。具體實施例方式下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明作進一步說明實施例1取開花后14天的濟南177小麥未成熟麥穗，于體積比為75%酒精中浸5分鐘滅菌。將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚。選擇直徑lmm的幼胚，盾片向上接種于MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+20011^/1水解酪蛋白+lmg/L2，4-D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖的愈傷組織誘導培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，25t:，黑暗培養(yǎng)。2周獲得胚性愈傷組織，誘導率達到100%。將誘導的愈傷組織上從幼胚直接長出的胚芽切除，再把誘導產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上(PH值5.8)，光照強度為60molm—2s—、光照時間12hd—、恒溫度25t:進行晝夜光照周期培養(yǎng)，3周繼代一次。將繼代一次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+lmg/L6-BA+O.5mg/LIAA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2周形成叢生試管苗，分化率達到98%。待培養(yǎng)的叢生試管苗長到4cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部2mm的葉段放至MS基本成分+B5維生素+150mg/LL_天冬酰胺+2mg/L2，4-D+lmg/LNAA+8g/L瓊脂9+30g/L蔗糖的愈傷組織誘導培養(yǎng)基II上(pH值5.8)，25°C，暗培養(yǎng)4周，在葉段的切口處形成4mm的愈傷組織團，試管苗葉片愈傷組織誘導率達到97%。將試管苗葉片誘導形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+lmg/L6-BA+O.5mg/LIAA+10mg/LAgN03+lmg/LTIBA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基11上(pH值5.7)，光照強度為lOOiimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)3周誘導出二次再生的試管苗，試管苗葉片二次再生率達到72%。將二次再生苗轉(zhuǎn)至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分濃度減半)+MS維生素+0.2mg/LIAA+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上(pH值5.7)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)3周，獲得生根植株。將生根的二次再生試管苗移至2(TC溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗3天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，利用加濕器保持相對濕度在60%，經(jīng)6天的適應之后，移至大田，成活率達95%。實施例2取開花后15天的中國春小麥未成熟麥穗，于75%酒精中浸3分鐘滅菌。將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚。選擇直徑0.8mm的幼胚，盾片向上接種于MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+180mg/L水解酪蛋白+0.5mg/L2，4-D+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖的愈傷組織誘導培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，25t:，黑暗培養(yǎng)。2周獲得胚性愈傷組織，誘導率達到99%。將誘導的愈傷組織上從幼胚直接長出的胚芽切除，再把誘導產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+lmg/L2，4_D+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上(PH值5.8)，光照強度為60molm—2s—、光照時間12hd—、恒溫度25t:進行晝夜光照周期培養(yǎng)，2周繼代一次。將繼代一次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+0.8mg/L6-BA+O.45mg/LIAA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2周形成叢生試管苗，分化率達到91%。待培養(yǎng)的叢生試管苗長到2cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部lmm的葉段放至MS基本成分+B5維生素+130mg/LL_天冬酰胺+1.7mg/L2，4-D+O.5mg/LNAA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖的愈傷組織誘導培養(yǎng)基II上(pH值5.8)，24°C，暗培養(yǎng)3周，在葉段的切口處形成3mm的愈傷組織團，試管苗葉片愈傷組織誘導率達到90%。將試管苗葉片誘導形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+130mg/L谷氨酰胺+0.4mg/LTDZ+0.8mg/L6-BA+O.45mg/LIAA+5mg/LAgN03+0.5mg/LTIBA+5g/L瓊脂+15g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基II上(pH值5.7)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)，4周誘導出二次再生的試管苗，試管苗葉片二次再生率達到66%。將二次再生苗轉(zhuǎn)至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分濃度減半)+MS維生素+0.lmg/LIAA+4g/L瓊脂+15g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上(pH值5.7)，光照強10度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25。C進行晝夜光照周期培養(yǎng)，4周獲得生根植株。將生根的二次再生試管苗移至2(TC溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗2天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，利用加濕器保持相對濕度在50%，經(jīng)5天的適應之后，移至大田，成活率達90%。實施例3取開花后16天的核生3號小麥未成熟麥穗，于75%酒精中浸8分鐘滅菌。將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚。選擇直徑1.2mm的幼胚，盾片向上接種于MS基本成分+B5維生素+170mg/L谷氨酰胺+220mg/L水解酪蛋白+2mg/L2，4-D+8g/L瓊脂+35g/L蔗糖的愈傷組織誘導培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，25t:，黑暗培養(yǎng)。2周獲得胚性愈傷組織，誘導率達到100%。將誘導的愈傷組織上從幼胚直接長出的胚芽切除，再把誘導產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS基本成分+B5維生素+170mg/L谷氨酰胺+2mg/L2，4_D+8g/L瓊脂+35g/L蔗糖的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上(PH值5.8)，進行晝夜光照周期培養(yǎng)，光照強度為60mol*m—2s一1，光照時間12hd—、晝溫度25°C，3周繼代一次。將繼代一次的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生素+170mg/L谷氨酰胺+1.2mg/L6-BA+O.55mg/LIAA+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基I上(pH值5.8)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2周形成叢生試管苗，分化率達到95%。待培養(yǎng)的叢生試管苗長到5cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部3mm的葉段放至MS基本成分+B5維生素+170mg/LL-天冬酰胺+2.3mg/L2，4-D+l.5mg/LNAA+9g/L瓊脂+35g/L蔗糖的愈傷誘導培養(yǎng)基II上(pH值5.8)，25°C，暗培養(yǎng)4周，在葉段的切口處形成4mm的愈傷組織團，試管苗葉片愈傷組織誘導率達到87%。將試管苗葉片誘導形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至MS基本成分+B5維生+170mg/L谷氨酰胺+0.6mg/LTDZ+1.2mg/L6-BA+O.55mg/LIAA+15mg/LAgN03+l.5mg/LTIBA+7g/L瓊脂+25g/L蔗糖的分化培養(yǎng)基II上(pH值5.6)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25。C進行晝夜光照周期培養(yǎng)3周，誘導出二次再生的試管苗，試管苗葉片二次再生率達到70%。將二次再生苗轉(zhuǎn)至1/2MS基本成分(基本成分中除甘氨酸外其余成分濃度減半)+MS維生素+0.3mg/LIAA+5g/L瓊脂+25g/L蔗糖的生根培養(yǎng)基上(pH值5.7)，光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、恒溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)3周，獲得生根植株。將生根的二次再生試管苗移至2(TC溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗3天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，利用加濕器保持相對濕度在60%，經(jīng)7天的適應之后，移至大田，成活率達97%。本發(fā)明方法實施中所用小麥濟南177、中國春、核生3號均購自山東省農(nóng)業(yè)科學院，其中中國春小麥是國際通用的實驗用麥，濟南177和核生3號是山東省普遍種植的小麥品種。1權(quán)利要求一種小麥試管苗葉片反復再生方法，步驟包括(1)胚性愈傷組織的誘導(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)(3)試管苗的獲得(4)試管苗葉片誘導愈傷組織(5)二次再生苗的誘導(6)誘導生根(7)二次再生苗的移栽；其特征在于步驟(1)胚性愈傷組織誘導的方法是取開花后14～16天的小麥未成熟麥穗，于體積比為75％酒精中浸3～8分鐘滅菌；然后將未成熟麥粒從麥穗上剝下放至無菌培養(yǎng)皿中，腹溝向下將其夾住，用解剖針挑出幼胚；再挑選直徑0.8～1.2mm的幼胚，盾片向上接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基I上，25±1℃，黑暗培養(yǎng)2～3周；獲得胚性愈傷組織；步驟(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)的方法是取步驟(1)獲得的愈傷組織，先切除其上由幼胚長出的胚芽，再把愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，光照強度為55～65μmol·m-2·s-1，光照時間10～14h·d-1，晝溫度25±1℃進行晝夜光照周期培養(yǎng)，2～3周繼代一次；步驟(3)試管苗獲得的方法是將步驟(2)所述繼代一次以上的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基I，光照強度為75～125μmol·m-2·s-1，光照時間14～18h·d-1，晝溫度25±1℃進行晝夜光照周期培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3周形成叢生試管苗；步驟(4)試管苗葉片誘導愈傷組織的方法是待步驟(3)培養(yǎng)的試管苗長到2～5cm，將其從愈傷組織上切下，取其葉基部1～3mm的葉段放至愈傷組織誘導培養(yǎng)基II上，25±1℃條件下暗培養(yǎng)3～4周，在葉段的切口處有3～4mm的愈傷組織團形成；步驟(5)二次再生苗誘導的方法是將步驟(4)中誘導形成的愈傷組織從葉段上剝離，然后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基II上，光照強度為75～125μmol·m-2·s-1，光照時間14～18h·d-1，晝溫度25±1℃進行晝夜光照周期培養(yǎng)3～4周，誘導出二次再生的試管苗；步驟(6)誘導生根的方法是將步驟(5)中獲得的二次再生苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基，光照強度為75～125μmol·m-2·s-1，光照時間14～18h·d-1，晝溫度25±1℃進行晝夜光照周期培養(yǎng)3～4周，得生根植株；步驟(7)所述二次再生苗移栽的方法是將步驟(6)中生根的二次再生試管苗轉(zhuǎn)至20±1℃溫室條件下，打開培養(yǎng)瓶蓋，煉苗2～4天后用鑷子將苗夾出，用自來水洗去基部殘留的培養(yǎng)基，移栽到裝有混合育苗基質(zhì)花盆中，相對濕度控制在50％～60％之間，經(jīng)4～7天的適應，移至大田；其中上述混合育苗基質(zhì)的成分以體積比計為營養(yǎng)土∶蛭石＝3∶1，花盆高度為15cm，花盆中所放育苗基質(zhì)厚度為12cm；上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基II配方是MS基本成分+B5維生素+130～170mg/LL-天冬酰胺+1.7～2.3mg/L2，4-D+0.8～1.2mg/LNAA+7～9g/L瓊脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.7～5.9；上述分化培養(yǎng)基II配方是MS基本成分+B5維生素+130～170mg/L谷氨酰胺+0.4～0.6mg/LTDZ+0.8～1.2mg/L6-BA+0.45～0.55mg/LIAA+5～15mg/LAgNO3+0.5～1.5mg/LTIBA+5～7g/L瓊脂+15～25g/L蔗糖，pH值5.6～5.8；上述MS基本成分及B5維生素為2.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復再生方法，其特征在于步驟(1)培養(yǎng)條件為25°C，黑暗培養(yǎng)2周；其中愈傷組織誘導培養(yǎng)基I組成為MS基本成分+B5維生素+1461^/1谷氨酰胺+20011^/1水解酪蛋白+lmg/L2，4-D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。3.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復再生方法，其特征在于步驟(2)培養(yǎng)條件為以光照強度為60iimo1m—2s—、光照時間12hd—、晝溫度25。C條件進行晝夜光照周期培養(yǎng)，3周繼代一次；其中胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)基組成為MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+2mg/L2，4_D+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。4.如權(quán)利要求l所述的小麥試管苗葉片反復再生方法，其特征在于步驟(3)培養(yǎng)條件為以光照強度為lOOiimolm—2s—、光照時間16hd—、晝溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基I組成為MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+lmg/L6-BA+0.5mg/LIAA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.8。5.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復再生方法，其特征在于步驟(4)培養(yǎng)條件為25t:，黑暗培養(yǎng)4周；其中愈傷組織誘導培養(yǎng)基II組成為MS基本成分+B5維生素+150mg/LL-天冬酰胺+2mg/L2，4-D+lmg/LNAA+8g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5.8。6.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復再生方法，其特征在于步驟(5)培養(yǎng)條件為以光照強度為lOOiimolm—2s—、光照時間16hd—、晝溫度25。C進行晝夜光照周期培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基II組成為MS基本成分+B5維生素+146mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LTDZ+lmg/L6-BA+0.5mg/LIAA+10mg/LAgN03+lmg/LTIBA+6g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.7。7.如權(quán)利要求1所述的小麥試管苗葉片反復再生方法，其特征在于步驟(6)培養(yǎng)條件為以光照強度為100iimolm—2s—、光照時間16hd—、晝溫度25"進行晝夜光照周期培養(yǎng)3周；其中生根培養(yǎng)基組成優(yōu)選為1/2MS基本成分+MS維生素+0.2mg/LIAA+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH值5.7;其中所述MS維生素配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>全文摘要本發(fā)明涉及一種通過小麥試管苗葉片的組織培養(yǎng)使小麥試管苗反復再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領域：
，其步驟包括(1)胚性愈傷組織的誘導；(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)；(3)試管苗的獲得；(4)試管苗葉片誘導愈傷組織；(5)二次再生苗的誘導；(6)誘導生根；(7)二次再生苗的移栽。本發(fā)明所提供的小麥試管苗幼葉反復再生的方法成功解決了小麥試管苗反復再生難的問題，是國內(nèi)外首次通過小麥試管苗幼葉建立起小麥試管苗反復再生體系，使運用葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得同質(zhì)化的葉綠體轉(zhuǎn)基因小麥成為可能。經(jīng)試驗統(tǒng)計通過使用本方法試管苗葉片誘導愈傷組織的頻率及二次再生苗的頻率分別達到了93％和66％以上。文檔編號A01H4/00GK101699992SQ20091023081公開日2010年5月5日申請日期2009年11月25日優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日發(fā)明者侯丙凱,王文超,耿曉霞,胡洪群申請人:山東大學